Made available in DSpace on 2015-04-30T14:03:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000467370-Texto+Completo-0.pdf: 6072599 bytes, checksum: 169f7ff123882c0b088732b04ad1956d (MD5) Previous issue date: 2014 / Schistososmiasis is a chronic endemic infection caused by parasites of the genus Schistosoma, and it occurs in 74 countries in Africa, South America and Asia. The three main agents of this infection in humans are: Schistosoma mansoni and Schistosoma japonicum, that cause the hepatic-intestinal disease, and Schistosoma haematobium, responsible for the genitourinary infection. Despite the effective treatment like praziquantel, schistososmiasis remains as the second most prevalent parasitic disease in the world. Diagnosis of the intestinal schistososmiasis is achieved through the direct visualization of the eggs in fecal samples. The current method recommended by the World Health Organization in epidemiological studies is the Kato-Katz method. Despite it being simple and cheap, in areas of low endemicity this technique loose sensibility, leading to the occurrence of false-negative cases and underestimation of the prevalence in the studied area. Helmintex™ is a coproparasitological method highly sensitive that allows the isolation of Schistosoma eggs from 30 grams of feces, based in the interaction between the eggs and paramagnetic microspheres in a magnetic field. However, this method demands time and specialized equipment, being of difficult manipulation in work field. The mechanism that promotes the interaction between the paramagnetic spheres with the Schistosoma eggs is not known. Considering the necessity of sensitive diagnostic tools of easy applicability in epidemiological studies in low endemicity areas, this work has the purpose to study the surface physical-chemical characteristics of S. mansoni and S. japonicum eggs, in order to enhance the efficiency of the Helmintex™ method. S. mansoni and S. japonicum eggs were isolated from livers of experimentally infected mice. The eggs were submitted to morphological and structural analysis using Scanning and Transmission Electron Microscopy and elemental analysis using Energy Disperssion Spectroscopy. The magnetic susceptibility was determined using SQUID (Superconducting Quantum Interference Device) and the concentration of the chemical elements was determined through Atomic Emission Spectroscopy. Experiments to elucidate the interaction properties of the eggs of the eggs and the microspheres were conducted incubating the eggs from both species with different paramagnetic microspheres. The results show that the egg surface of both species is recovered by a dense layer of microspines, being those shorter and less spaced in S. mansoni. The eggs spontaneously bind the particles, with a greater preference for magnetic material. S. japonicum eggs have a higher affinity for paramagnetic microspheres than S. mansoni eggs. The presence of streptavidin in the surface of the microspheres enhances the affinity of both species for non-magnetic material, however it decreases the affinity for paramagnetic microspheres. Despite the presence of iron in the eggshell of S. mansoni and S. japonicum, the origin of the interaction does not seem to be magnetic, but, based in the difference of electrostatic charges present in the surface of the eggs and the microspheres. The continuity of this study is important to determine the physical-chemical characteristics of eggs from human feces, and it can lead to the upgrading and optimization of the Helmintex™ method. Studies using Atomic Force Microscopy are in progress. / A esquistossomose é uma infecção crônica endêmica causada por parasitos do gênero Schistosoma, e ocorre em países 74 países na África, América do Sul e Ásia. Os três principais agentes desta infecção em humanos são: Schistosoma mansoni e Schistosoma japonicum, causadores da doença hepato-intestinal, e Schistosoma haematobium, responsável pela infecção genitourinária. Apesar de haver tratamento efetivo como o praziquantel, a esquistossomose permanece como a segunda infecção parasitária mais prevalente no mundo. O diagnóstico da esquistossomose intestinal é feito através da direta visualização dos ovos em amostras fecais. O método atualmente recomendado pela Organização Mundial de Saúde em estudos epidemiológicos é o método de Kato-Katz. Apesar de simples e barato, em áreas de baixa endemicidade esta técnica perde sensibilidade, levando à ocorrência de casos falso-negativos e subestimação da prevalência da área estudada. O Helmintex® é um método coproparasitológico altamente sensível que permite o isolamento de ovos de Schistosoma à partir de 30 gramas de fezes, baseado na interação entre os ovos e esferas paramagnéticas em um campo magnético. Entretanto, este método demanda tempo e equipamentos especializados, sendo de difícil manipulação em estudos de campo.O mecanismo que promove a interação das esferas paramagnéticas com os ovos de Schistosoma não é conhecido. Tendo em vista a necessidade de ferramentas diagnósticas sensíveis e de fácil aplicabilidade em estudos epidemiológicos em áreas de baixa transmissão, este trabalho tem por objetivo estudar características físico-químicas da superfície dos ovos de S. mansoni e S. japonicum, afim de aprimorar a eficiência do método Helmintex®. Ovos de S. mansoni e S. japonicum foram isolados de fígados de camundongos experimentalmente infectados. Os ovos foram submetidos à analise morfológica e estrutural utilizando Microscopia Eletrônica de Varredura e Transmissão e análise elementar utilizando Espectroscopia por Dispersão de Energia. A susceptibilidade magnética foi determinada utilizando-se o SQUID (Superconducting Quantum Interference Device) e a concentração dos elementos químicos foi determinada através de Espectroscopia por Emissão Atômica. Experimentos para elucidar as propriedades de interação dos ovos e das microesferas foram conduzidos incubando ovos de ambas as espécies com diferentes microesferas paramagnéticas. Os resultados mostram que a superfície do ovo de ambas as espécies é recoberta por uma camada densa de microespinhos, sendo estes mais curtos e menos espaçados em S. mansoni. Os ovos espontaneamente ligam-se às partículas, com maior preferência por material magnético. Os ovos de S. japonicum possuem maior afinidade pelas microsesferas paramagnéticas do que os ovos de S. mansoni. A presença de estreptavidina na superfície das microesferas aumenta a afinidade de ambas as espécies por microesferas não-magnéticas, porém diminui a afinidade por microesferas paramagnéticas. Apesar da presença de ferro na casca do ovo tanto de S. mansoni quanto de S. japonicum, a origem da interação não parece ser magnética, e sim, baseada na diferença de cargas eletrostáticas presentes na superfície dos ovos e das microesferas. A continuidade deste estudo é importante para determinar as características físico-químicas de ovos provenientes de fezes humanas, e pode levar ao aprimoramento e otimização do método Helmintex®. Estudos utilizando-se Microscopia de Força Atômica encontram-se em andamento.

Made available in DSpace on 2015-04-30T14:03:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000467140-Texto+Completo-0.pdf: 2666780 bytes, checksum: 69d9316002f8596f9f09b6c05ceb6081 (MD5) Previous issue date: 2015 / Tuberculosis (TB) is the leading cause of bacterial infectious disease mortality. The etiological agent, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is responsible for 1. 5 million deaths and 9 million people infected in 2013. The World Health Organization (WHO) estimates that one-third of the world´s population is infected with latent form of Mtb. Thus, there is a continuous need to find promising molecular targets for the development of anti-TB agents. The shikimate pathway produces an important precursor of aromatic compounds in bacteria, fungi, plants and apicomplexan parasites, chorismate. The pathway comprises seven enzymes, which convert erythrose-4-phosphate and phosphoenolpyruvate into chorismate, the precursor for the synthesis of aromatic amino acids, folic acid, ubiquinone, and many other aromatic compounds. This pathway is essential for growth of Mtb. The aroD gene, that codes for 3-dehydroquinate dehydratase (DHQase), catalyzes the reversible reaction of 3-dehydroquinate into 3-dehydroshikimate and the aroE gene, that codes for the NADP(H) dependent shikimate-5-dehydrogenase (SD), catalyzes the reduction of 3-dehydroshikimate into shikimate. The aim of the present study was to identify new dug-like molecules as inhibitors for MtbDHQase and MtbSD using structure-based modeling and virtual screening. The availability of the crystal structure bound with an inhibitor of MtbDHQase was explored using pharmacophore models based on interaction energy and docking to yield diverse leads. For MtbSD, due the absence of crystal structure and reported inhibitors, the tridimensional structure was achieved by molecular modelling. Structure-based pharmacophore and virtual screening of the in house database containing 3000 unique molecules retrieved twelve hit compounds with good docking score and interaction pattern for MtbDHQase. For MtbSD, the commercially available database Asinex, with 500,000 molecules, were used and seventeen compounds were selected based in its docking score, interaction pattern with amino acids in the active site, number of hydrogen bonds and GOLD score. MtbDHQase inhibitors were tested and, after inhibition assay, series of chemical modifications were made in the lead compound. The top two derivate presented IC50 values of 17. 1 and 31. 5 μM as well as MIC values of 25 and 6. 25 μg/mL and cytotoxicity below 15% at 100 μM respectively. The MtbSD compounds selected as possible inhibitors will be tested for inhibition, MIC value and cytotoxicity. / A Tuberculose (TB) é a principal causa de mortalidade devido a infecções bacterianas. Seu agente etiológico, o Mycobacterium tuberculosis (Mtb) foi responsável por 1,5 milhões de mortes e por 9 milhões de pessoas infectadas em 2013. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que um terço da população mundial está infectada com a forma latente do Mtb. Assim, há uma contínua necessidade de buscar alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de agentes anti-TB. A via do chiquimato produz um importante precursor de compostos aromáticos em bactérias, fungos, plantas e parasitas do filo Apicomplexa, o corismato. A via é composta por sete enzimas, as quais convertem eritrose-4-fosfato e fosfenolpiruvato em corismato, o precursor para a síntese de aminoácidos aromáticos, ácido fólico, ubiquinonas e muitos outros compostos aromáticos. Esta via é essencial para o crescimento do Mtb.O gene aroD, que codifica a enzima 3-desidroquinato desidratase (DHQase), catalisa a reação reversível do 3-desidroquinato em 3-desidrochiquimato e o gene aroE, que codifica a enzima dependente de NADP(H) chiquimato-5-desidrogenase (SD), catalisa a redução do 3-desidrochiquimato em chiquimato. O objetivo do presente estudo foi identificar novas moléculas como inibidores para a MtbDHQase e MtbSD utilizando modelagem baseada em estrutura e triagem virtual. A disponibilidade da estrutura cristalográfica ligada a um inibidor da MtbDHQase foi explorada utilizando modelos farmacóforos baseados na energia de interação e docagem para gerar diversos protótipos. Para a MtbSD, devido à ausência de estrutura cristalográfica e de inibidores, foi realizado através de modelagem molecular, um modelo da estrutura. A abordagem do farmacofórico baseado na estrutura, juntamente com a triagem virtual da base de dados in house contendo 3000 estruturas inéditas geraram compostos escolhidos com bom valor de docagem e padrão de interação com aminoácidos do sítio ativo. Para a MtbSD, foi utilizada a base de dados Asinex, que contém 500000 moléculas. Dezessete compostos foram encontrados baseados nos seus valores de docagem, no padrão de interação com os aminoácidos do sítio ativo, no número de interações de hidrogênio e no valor de GOLD. Os inibidores da MtbDHQase foram testados e, após os ensaios de inibição, foram realizadas diversas derivações químicas no composto protótipo. Os dois melhores compostos derivados apresentaram um valor de IC50 de 17,1 e 31,5 μM, um valor de MIC de 25 e 6,25 μg/mL e citotoxicidade abaixo de 15% a 100μM, respectivamente. Os compostos selecionados como possíveis inibidores para a MtbSD serão futuramente testados quanto a sua inibição, valor de CIM e citotoxicidade.

Orientador : Elso Drigo Filho / Banca: Regina Maria Ricotta / Banca: Antonio Caliri / Banca: José Abdalla Helayël-Neto / Banca: Mário José de Oliveira / Resumo : Neste trabalho a equação de Schrödinger associada a equação de Fokker-Planck é estudada através do formalismo de supersimetria. O procedimento usado é buscar a função de onda através da determinação do superpotencial. Quando esta função não pode ser determinada exatamente, procuram-se soluções aproximadas que podem ser usadas no método variacional. Através do formalismo supersimétrico é possível construir uma hierarquia de Hamiltonianos efetivos, e deste modo determinar as autofunções aproximadas e os autovalores variacionais. A equação de Fokker-Planck é analisada envolvendo dois potenciais biestáveis unidimensionais, um simétrico e outro assimétrico. Os resultados obtidos são comparados com aqueles encontrados por outros métodos. Finalmente, um potencial com características adequadas para o estudo do enovelamento de proteína é analisado. As funções de onda e os autovalores de energia obtidos variacionalmente são utilizados para o cálculo da probabilidade de transição. Algumas quantidades dinâmicas do processo são descritas. / Abstract: In this work the Schrödinger and Fokker-Planck equation are studied through the supersymmetric formalism. The method introduced here is based on an ansatz for the superpotential and it gives the analytical wave function. When this function cannot be determined exactly the formalism supplies a trial function to be used in the variational method. Using the supersymmetric formalism it is possible to build an effective hierarchy of Hamiltonians, then for a given potential, the approximated eigenfunctions and variational eigenvalues are determined. We analyze the Fokker-Planck equation with two one-dimensional bistable potential, symmetric and asymmetric. The results are compared with the values found by others methods. Finally, a potential with characteristics adapted for the study of the protein folding is analyzed. The wave functions and the eigenvalues of energy are used for the calculation of the transition probability. Some dynamic variables used in the description of the process are discussed. / Doutor

Orientador: Walter Filgueira de Azevedo Júnior / Banca: Thelma de Aguiar Pertinhez / Banca: Diógenes Santiago Santos / Banca: Eduardo Brandt de Oliveira / Banca: Mário Sérgio Palma / Doutor

Orientador: Marcio Francisco Colombo / Coorientador: Chien Ho / Banca: Marinônio Lopes Cornélio / Banca: Marcelo Andrés Fossey / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Marcelo Matos Santoro / Resumo: A influência de ânions sobre as características estruturais e funcionais de hemoglobinas (Hb) vem sendo alvo de pesquisas de nosso laboratório nos últimos anos. Estudos anteriores mostraram que a ligação preferencial de ânions como o Cl- e fosfatos orgânicos (2,3-DPG, IHP) entre outros à desoxi-Hb humana (HbA), modula o equilíbrio entre dois estados alostéricos desoxigenados possíveis, estados To e Tx, livre e complexado com ânions, respectivamente. Medidas funcionais utilizando o método de estresse osmótico, que determina o número de moléculas de água que se liga a superfície da Hb, acompanhando a oxigenação, mostraram que o estado To é um estado com hidratação e afinidade ao oxigênio intermediárias ao Tx e ao oxi-R. Assim, a oxigenação da Hb demanda um modelo considerando estes três estados, To, Tx e R, modulados pela presença de ânions em solução. O íon cloreto é um dos ânions de maior importância fisiológica. A presença de sítios específicos para sua ligação, bem como seu sistema de ligação para a Hb, contudo, são controversos. Evidências estruturais e funcionais apontaram os resíduos arginina 141 e 92 da cadeia alfa como possíveis sítios de ligação de cloreto à Hb. Para investigar essa hipótese, realizamos estudos funcionais variando atividade de água e pH (efeito Bohr), em função da presença de cloreto com hemoglobinas mutantes para essas posições. As hemoglobinas selecionadas foram Chesapeake (R92L), J-Cape Town (R92Q), desArg (141Δ) e Chesapeake desArg (R92L,141Δ). Aspectos estruturais dessas Hbs foram obtidos através de espectroscopia 1H RMN. Todas as Hbs estudadas apresentaram afinidade maior ao oxigênio quando comparadas à HbA, para todas as condições experimentais. Estudos de variação da atividade de água em função da concentração de cloreto mostraram que a única... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The influence of anions on structural and functional properties of hemoglobins (Hb) has been studied by our research group for the last few years. Former studies have shown that the preferential binding of anions, such as Cl and organic phosphates (2,3-DPG, IHP) among others to human deoxy-Hb (HbA), modulates the equilibrium between two possible deoxy states: To and Tx, free and complexed with anions respectively. Functional measurements using the osmotic stress method, which allows the determination of the number of water molecules that binds to the protein surface upon the change in protein conformation induced by oxygenation, showed that To state has intrinsic affinity and hydration intermediate of those of Tx and oxy-R . Hence, Hb oxygenation requires a three state model, considering To, Tx and R, modulated by the presence of anions in solution. Chloride is one of the most important physiological ions and the presence of specific binding sites of this anions is controversial. Structural and functional evidence have pointed to Arginines 141 and 92 as possible binding sites for chloride to Hb. To investigate this hypothesis, we have performed functional studies, changing the water activity and pH (Bohr effect), in function of chloride concentration with recombinants Hbs for these positions. The selected hemoglobins are Chesapeake (R92L), J-Cape Town (R92Q), desArg (141Δ) eandChesapeake desArg (R92L,141Δ). Structural features were obtained through 1H NMR spectroscopy. All Hbs studied have higher affinity than HbA for all experimental conditions. Water activity studies in function of chloride concentration showed that the only Hb that can be adjusted with the three state model is Hb desArg, whereas the other Hbs don't present the Tx state, fact confirmed by the number of water molecules bound to each... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000395749-Texto+Completo-0.pdf: 1423043 bytes, checksum: ca56d3788b6dc3481d9aed7040fc6130 (MD5) Previous issue date: 2007 / O melanismo em mamíferos decorre principalmente da atividade de dois genes: MC1R (Melanocortin-1 Receptor), cujo produto induz a produção de eumelanina (pretomarrom); e ASIP (Agouti Signaling Protein), que codifica um peptídeo antagonista que promove a produção de feomelanina (pigmento claro). A combinação do efeito destes dois locos faz com que o pêlo cresça escuro com bandas subapicais amarelas. No presente estudo investigamos a diversidade nucleotídica e os padrões de variabilidade presentes no gene ASIP, principalmente nas regiões codificadoras dos éxons 2 e 3 e em regiões não codificadoras dos íntrons 2 e 3 em alguns mamíferos, com ênfase em felídeos (Mammalia, Carnivora, Felidae). Através do alinhamento entre as espécies analisadas nesse estudo foi possível construir três bases de dados que foram divididas em diferentes blocos conforme as regiões de alinhamento. A análise comparativa de seqüências permitiu a caracterização de diferentes blocos de seqüência conservada, assim como a identificação de uma inserção SINE presente apenas no gato doméstico, de uma região repetitiva hipervariável em todos os felídeos analisados, e também de variantes moleculares (SNPs) em Felis catus e Leopardus geoffroyi. Nenhum dos polimorfismos identificados nesta espécie estava localizado em regiões exônicas ou apresentou associação a fenótipos de coloração, indicando que as regiões analisadas não estão envolvidas na indução do melanismo nesta espécie.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431140-Texto+Completo-0.pdf: 1654374 bytes, checksum: 1465b8ac4be5cfbe78bdaa126071ddf5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Guanosine monophosphate (GMP) reductase catalyzes the reductive deamination of GMP to inosine monophosphate (IMP). GMP reductase plays an important role in the conversion of nucleoside and nucleotide derivatives of guanine to adenine nucleotides. In addition, as a member of the purine salvage pathway, it also participates in the reutilization of free intracellular bases. Here we present cloning, expression and purification of Escherichia coli guaC-encoded GMP reductase to determine its kinetic mechanism, as well as chemical and thermodynamic features of this reaction. Initial velocity studies and isothermal titration calorimetry demonstrated that GMP reductase follows an ordered bi-bi kinetic mechanism, in which GMP binds first to the enzyme followed by NADPH binding, and NADP+ dissociates first followed by IMP release. The isothermal titration calorimetry also showed that GMP and IMP binding are thermodynamically favorable processes. The pH-rate profiles showed groups with apparent pK values of 6. 6 and 9. 6 involved in catalysis, and pK values of 7. 1 and 8. 6 important to GMP binding, and a pK value of 6. 4 important for NADPH binding. Primary deuterium kinetic isotope effects demonstrated that hydride transfer contributes to the rate-limiting step, whereas solvent kinetic isotope effects arise from a single protonic site that plays a modest role in catalysis. Multiple isotope effects suggest that protonation and hydride transfer steps take place in the same transition state, lending support to a concerted mechanism. Pre-steady-state kinetic data suggest that product release does not contribute to the rate-limiting step of the reaction catalyzed by E. coli GMP reductase. / A enzima guanosina monofosfato (GMP) redutase catalisa a deaminação redutiva do GMP à inosina monofosfato (IMP). GMP redutase possui um papel importante na conversão dos nucleosídeos e nucleotídeos derivados de guanina a nucleotídeos de adenina. Além desse fato, como parte da via de salvamento de purinas, também participa da reutilização de bases livres intracelulares. Nesse trabalho, mostramos a clonagem, a expressão e a purificação da GMP redutase codificada pelo gene guaC de Escherichia coli a fim de determinar seu mecanismo cinético; bem como as características químicas e termodinâmicas da reação catalisada. Estudos de velocidade inicial e titulação de calorimetria isotérmica demonstraram que a GMP redutase possui um mecanismo cinético bi-bi ordenado, no qual o GMP liga primeiro à enzima, seguido pela ligação do NADPH; o NADP+ se dissocia primeiro, seguido pela liberação do IMP. A titulação calorimétrica também mostrou que a ligação do GMP e IMP são processos termodinamicamente favoráveis. Perfis de pH demonstraram grupos com valores de pK aparentes de 6,6 e 9,6 envolvidos na catálise, valores de pK de 7,1 e 8,6 importantes para ligação do GMP e um valor de pK de 6,4 importante para ligação do NADPH. Efeito isotópico primário demonstrou que a transferência do hidreto contribui para a etapa limitante da reação, enquanto que os efeitos isotópicos do solvente provêm de um único local de protonação que possui um papel modesto na catálise. Efeito isotópico múltiplo sugere que as etapas de protonação e transferência do hidreto ocorrem no mesmo estado de transição, fornecendo evidência de um mecanismo concerted. Os dados de cinética em estado pré-estacionário indicam que a liberação do produto não contribui para a etapa limitante da reação catalisada pela GMP redutase de E. coli. Em conjunto, os resultados mostram que a reação catalisada pela GMP redutase segue um mecanismo sequencial e ordenado, onde a transferência do hidreto e do próton ocorrem no mesmo estado de transição. Os resultados aqui apresentados foram os primeiros a evidenciar o mecanismo cinético da GMP redutase, bem como, os resíduos fundamentais para catálise e/ou ligação, além de fornecer informações sobre o estado de transição da reação.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000412868-Texto+Completo-0.pdf: 709463 bytes, checksum: 24e54fc3c08be35252a751617c52ca4d (MD5) Previous issue date: 2009 / The epithelium-specific Ets factor, family member 3 (ESE-3), has been shown to play roles in determination of the early differentiated fate in stratified squamous epithelia, expression of a receptor for tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, and airway inflammation of respiratory disorders such as asthma and cystic fibrosis. The Ets domain proteins have been proposed to bind to purine-rich central core 5’-GGAA-3’ sequence with larger affinity than 5’-GGAT-3’. Here we describe surface plasmon resonance equilibrium and kinetics analyses of Ets domain ESE-3 binding to Drosophila E74 gene promoter sequence (a consensus Ets binding site) containing either 5’-GGAA-3’ or 5’-GGAT-3’core sequence. Competition assays are also described. The results showed that there is no large difference in equilibrium binding affinity between Ets domain ESE-3 and either 5’-GGAA-3’ or 5’-GGAT-3’. However, analysis of kinetic data indicates that larger association rate and lower dissociation rate constant values account for the slightly higher affinity of Ets domain ESE-3 for 5’-GGAA-3’-containing DNA sequence. The role of dynamics in protein-DNA recognition is discussed and a mechanism is proposed in which free Ets domain ESE-3 exists as two isomers in solution that undergoes a slow protein isomerization step, which is followed by a fast DNA binding process. Besides, data of spectrofluorimetric experiments give evidence to include a further step in the proposed mechanism. / Tem se mostrado que a proteína ESE-3 (Fator específico de epitélio, do inglês epithelium-specific Ets factor, family member 3) desempenha importantes papéis na determinação do destino inicial da diferenciação do epitélio escamoso estratificado, na indução da expressão do receptor para um ligante que induz à apoptose, relacionado com necrose tumoral, e em processos inflamatórios de doenças respiratórias, tais como a asma e a fibrose cística. Tem se proposto que proteínas com domínio Ets ligam-se com maior afinidade a seqüências com núcleo central rico em purinas 5’-GGAA-3’ do que em seqüências com núcleo central 5’-GGAT-3’. Neste trabalho, nós descrevemos análises cinéticas e em equilíbrio do domínio Ets de ESE-3 ligando-se ao sítio de ligação Ets presente na região promotora do gene E74 de Drosophila, contendo tanto as bases centrais 5’-GGAA-3’ quanto 5’-GGAT-3’, utilizando a técnica de ressonância plasmônica de superfície. Também descrevemos ensaios de competição. Os resultados mostraram que não há grande diferença na afinidade de ligação do domínio Ets de ESE-3 entre as seqüência contendo 5’-GGAA-3’ ou 5’-GGAT-3’. No entanto, as análises dos dados cinéticos indicam que há maior valor da constante de velocidade de associação e menor valor para a constante de velocidade de dissociação, que contam para uma afinidade levemente mais alta do domínio Ets de ESE-3 por seqüências de DNA contendo as bases centrais 5’-GGAA-3’.O papel da dinâmica do reconhecimento do DNA realizado pela proteína é discutido e é proposto o mecanismo no qual o domínio Ets de ESE-3 livre existe como dois isômeros em solução que sofrem um passo lento de isomerização, que é seguido por um rápido processo de ligação ao DNA. Além disso, os dados obtidos pelos experimentos de espectrofluorimetria dão uma evidência para a inclusão de mais um passo no mecanismo proposto.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000430842-Texto+Completo-0.pdf: 2935464 bytes, checksum: 65b5bce8dd872e39bf663fce3ac30b27 (MD5) Previous issue date: 2011 / Nature as a source of inspiration has been shown to have a great beneficial impact on the development of new computational methodologies. In this scenario, analyses of the interactions between a protein target and a ligand can be simulated by biologically inspired algorithms. In this work, bioinspired algorithms, evolutionary algorithms specially, are applied to molecular docking simulations that can be used in the search for new drugs. These docking algorithms were applied to sirtuins, which compose an important family of proteins, nicotine adenine dinucleotide (NAD) deacetylases that regulate gene silencing, transcriptional repression, recombination, the cell apoptosis division cycle, chromosomal stability, and cellular responses to DNA-damaging agents. These proteins are emerging as molecular targets for pharmaceutical development of drugs for treating human diseases. On the basis of the structural importance of these proteins, in this work we carried out the molecular homology modeling of human SIRT1, using Thermotoga maritima Sir2 crystallographic structure as template. Furthermore, we also performed a virtual screening procedure for SIRT1 model against two databases. One based on a nicotinamide derivatives and the other composed of molecules from Sigma-Aldrich vendor. Based on the virtual screening results we used the lowest free binding energy (Plant Score) molecules to select the bet hits. We employed a Similarity Ensemble Approach Tool (SEA) for assessing the ligand structure and protein pharmacological activity relationships. Our results indicate some molecules presented high affinity against SIRT1, which suggest new of SIRT1 inhibitors. These molecules show a high number of pharmacological activity references. Our results suggest new compounds for development of SIRT1 inhibitors with potential therapeutic application. / A natureza como fonte de inspiração provou ter grande impacto benéfico no desenvolvimento de novas metodologias computacionais. Neste cenário, análises de interações entre uma proteína alvo e um ligante podem ser simuladas por algoritmos inspirados biologicamente (BIA). Neste trabalho, os algoritmos inspirados biologicamente, especialmente algoritmos evolutivos, são aplicados a simulações de docking molecular, que podem ser usadas na busca de novos fármacos. Estes algoritmos de docking foram aplicados a sirtuínas, que compõem uma importante família de proteínas - desacetilases dependentes de NAD - que regulam o silenciamento genético, inibição transcricional, estabilidade cromossômica, ciclo de divisão celular e apoptótico e resposta célular a agentes causadores de danos no DNA. Essas proteínas tem sido alvos moleculares emergentes no desenvolvimento farmacêutico de medicamentos para o tratamento de doenças humanas. Em função da importância estrutural das proteínas, neste trabalho foi realizada a modelagem por homologia molecular de SIRT1 humana, utilizando-se a estrutura cristalográfica de Sir2 de Thermotoga maritima como modelo. Além disso, foi aplicado o procedimento de virtual screening para a SIRT1 modelada contra duas bases de dados. Uma foi baseada em estruturas derivadas da nicotinamida e outra composta por moléculas da Sigma-Aldrich. Com base nos resultados obtidos no virtual screening, foram utilizados os acoplamentos com valores mais baixos de energia livre de ligação (Plant Score) para a seleção das melhores moléculas. Foi empregada a Similarity Ensemble Approach Tool (SEA), uma abordagem estratégica para analisar as relações entre as estruturas e a atividade farmacológica. Os resultados indicam que algumas moléculas apresentaram alta afinidade com a SIRT1, sugerindo novos inibidores de SIRT1, e essas moléculas mostram um elevado número de referências de atividades farmacológicas. Nossos resultados sugerem novos compostos inibidores de SIRT1 que apresentam potencial aplicação terapêutica.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000401340-Texto+Completo-0.pdf: 549118 bytes, checksum: 0b891fb7ecb8b42c15bbd983f6da4c5e (MD5) Previous issue date: 2008 / Introduction: Current pollution and emission of toxic gases is leading to a gradual deterioration of the ozone layer that filters out a large portion of the ultraviolet (UV) emission. It has been shown that UV radiation significantly alters the structure of the skin, including nerve endings. Due to the increasing number of skin diseases as a result of UV exposure, it is necessary to evaluate the effectiveness of new skin care formulations with broad-spectrum sunscreens. Previous studies have not been able to quantify the damage induced by UV radiation on peripheral nerve endings. Objectives: To identify the nerve endings in the skin, quantify the effects of UV radiation on nerve endings and evaluate de neuroprotective effects of new skin care formulation to UV exposure Materials and methods: biopsies of skins were obtained from 35 healthy young adults, undergoing plastic surgery, and immediately treated (10 min) with three emulsions: Cream1, Cream2 (placebo) and commercially available sun protection factor (SPF) 15. Samples treated with the emulsions or control (untreated) were exposed to UVA and UVB for 60 min. Skin tissues were frozen and 15- m cryostate sections were produced. Peripheral nerve endings were identified by immunofluorescence using a monoclonal antibody anti-human CD56 (NCAM). The cell damage was identified from the automatic pixel selection (green - FITC) of captured images. Results: several cellular nervous structures were identified in the skin, including free nerve endings, innervations of the hair follicle and sebaceous glands. The UVA and UVB decreased significantly (40-60%) the density of nerve endings in the skin of control, samples treated with placebo or SPF 15 (all p < 0. 001). No morphological changes were observed in the free nerve endings exposed to UV radiation. Samples treated with Cream1 completely blocked the effects of UV radiation on nerve endings (p > 0. 05). Discussion: The quantification of cellular damage induced by UV radiation enables the identification of new skin care compounds with neuroprotective properties. The underlying mechanisms of UV-induced cellular damage as well as the neuroprotective actions should be further investigated in future studies. / Introdução: Atualmente, devido à poluição e emissão de gases tóxicos, há uma degradação gradual da camada de ozônio que filtra uma grande parcela das emissões UV. A radiação UV altera significativamente as estruturas da pele, incluindo as terminações nervosas. Em decorrência do crescente aumento de doenças de pele relacionadas à exposição UV, faz-se necessária a avaliação da efetividade de novos princípios ativos com finalidade de proteção contra as radiações. Estudos anteriores não foram capazes de quantificar o dano induzido pela radiação UV nas terminações nervosas. Objetivos: identificar as terminações nervosas na pele humana, quantificar os efeitos das radiações UV sobre as terminações nervosas e verificar o efeito de princípios ativos neuroprotetores à exposição UV. Materiais e Métodos: biópsias de pele, de 35 adultos saudáveis, sob cirurgia plástica, foram obtidas e imediatamente tratadas com três emulsões: Creme1, Creme2 (placebo) e FPS 15. As amostras tratadas com as emulsões ou controle (sem creme) foram submetidos à exposição UVA e UVB por 60 min. Secções de 15 m foram produzidas no criostato a partir de tecidos congelados e as estruturas nervosas foram identificadas por imunofluorescência utilizando um anticorpo monoclonal anti-CD56 (NCAM) humano. O dano nas terminações foi identificado a partir da seleção automática de pixels (verde – FITC) das imagens capturadas. Resultados: foram identificadas várias estruturas nervosas na pele, incluindo terminações livres, inervações do folículo piloso e glândulas sebáceas. As radiações UVA e UVB reduziram, significativamente (40-60%), a densidade das terminações nervosas na pele nas amostras controle, tratadas com placebo ou FPS 15 (p<0. 001). Não foram observadas diferenças morfológicas das terminações nervosas expostas a radiação UV. As amostras tratadas com o Creme1 bloquearam completamente os efeitos da radiação UV sobre as terminações nervosas (p > 0. 05). Discussão: A quantificação dos danos celulares induzidos pela radiação UV possibilita a identificação de compostos ativos com propriedades neuroprotetoras. Os mecanismos de dano celular bem como as atividades neuroprotetoras merecem ser identificadas nos próximos estudos.