Les protéines membranaires (PMs) sont les composants fonctionnels principaux des membranes biologiques. Les processus cellulaires fondamentaux sont régulés à l’aide des PMs. Malgré leur importance et leur intérêt scientifique et pharmaceutique, les structures des PMs ne représentent qu’une partie mineure des structures 3D répertoriées. Les PMs humaines sont des cibles particulièrement intéressantes mais parmi plus de 7000 PMs humaines, seules 30 structures ont été élucidées.Les raisons principales qui rendent les PMs très difficiles à étudier sont leur faible abondance et leur nature hydrophobe. En effet, le niveau d’expression des PMs dans leur environnement naturel est habituellement faible et la surexpression hétérologue aboutit souvent à une protéine inactive.Les connexines font partie de la famille des PMs intégrales de vertébrés. Elles sont largement exprimées dans tout le corps et sont impliquées dans les processus essentiels à un fonctionnement physiologique normal. En s’oligomérisant elles établissent des canaux intercellulaires qui forment des jonctions lacunaires. La communication des jonctions lacunaires joue un rôle essentiel dans la fonction des tissus et le développement des organes. Ainsi, les mutations génétiques des connexines provoquent des désordres héréditaires. Les connaissances actuelles portent principalement sur la physiologie des connexines et la perméabilité des pores. Difficiles à produire pure, homogène et en quantité suffisante pour la cristallisation, l’unique structure de résolution atomique de jonction lacunaire est un polymère de la connexine 26. La connexine 43 (Cx43), protéine de jonction lacunaire la mieux étudiée, est exprimée dans tout le corps humain. Les études structurales de microscopie électronique ont montré que le domaine cytoplasmique C-terminal de Cx43 (Cx43CT) est flexible et diminue la qualité de diffraction des cristaux 2D. La troncation de la majorité de Cx43CT améliore la résolution des segments transmembranaires de Cx43. Tronqué au niveau du résidu 263, le mutant Cx43-263T est néanmoins capable de former des cristaux 2D et de s’assembler en jonctions lacunaires. L’œuvre présenté est consacré à l’étude de Cx43, Cx43-263T et Cx43CT.L’optimisation des codons du gène de la connexine et la minimisation de la stabilité de la structure secondaire d’ARNm ont considérablement augmenté l’expression de Cx43 et Cx43-263T. De nouvelles procédures de purification de Cx43-263T et Cx43 ont été élaborées. La protéine purifiée a été reconstituée en polymère amphiphile amphipol A8-35 et caractérisée par des approches de SEC, DLS et SAXS. Des techniques indépendantes ont montré l’auto-assemblage de Cx43-263T fonctionnelle en hexamères.Cx43 homogène a été surexprimée dans E. coli, purifiée et caractérisée par SEC, DLS, DSC et SAXS. L’oligomérisation a été mesurée en fonction de la concentration.Cx43-263T et Cx43 fusionnées à la protéine Mistic ont été surexprimées dans E. coli. La séparation de Mistic de la connexin a été testée avec différentes protéases, jonctions, conditions de clivage et soit in vivo soit in vitro. Toutes les constructions ainsi générées ont démontré une haute résistance aux protéolyses spécifiques. Mistic (membrane integrating sequence for translation of integral membrane protein constructs) est une séquence de protéine de B. subtilis, qui permet l'adressage des PMs intégrales dans la membrane. Mistic a été surexprimée chez E. coli et la protéine homogène a été purifiée avec divers détergents. Alors que la structure tertiaire de Mistic, solubilisée avec de l'oxyde de lauryldimethylamine, est déjà déterminée, la structure native de Mistic dans un milieu lipidique, qui permettrait de comprendre sa fonction, n’est pas encore disponible. Dans le travail présenté ici, Mistic a été reconstituée dans des lipides différents et utilisée pour des essais initiaux de cristallisation in meso. Mistic a de plus été utilisée pour la production d’anticorps anti-Mistic. / Membrane proteins (MPs) are major functional components of biological membranes. Keycellular processes are regulated with the help of MPs. Despite high importance and greatscientific and pharmaceutical interest, structures of MPs represent only a tiny fraction of all3D structures in Protein Data Bank. Human MPs are particularly challenging targets. Out ofmore than 7000 human MPs, structures of only about 30 were elucidated.The main reasons which make MPs so difficult to study are their low natural abundance andhydrophobic nature. Expression level of MPs in their natural sources is usually rather low.Heterologous overexpression often leads to inactive protein.Connexins comprise a family of vertebrate integral MPs that are widely expressed throughoutbody and involved in a wide variety of processes essential for normal physiological function.They are able to oligomerize and form intercellular channels which compose gap junctions.Gap junctional communication plays crucial role in normal tissue function and organdevelopment. Connexin gene mutations cause a number of inherited disorders.By now a wealth of knowledge is available about physiology of connexins and their channelpore permeability. However, atomic resolution structure of gap junction channel formed byonly one connexin family member (connexin 26) was determined. This is mostly explained bydifficulty to produce sufficient for crystallization amount of pure and homogenous protein.Connexin 43 (Cx43) is the best-studied gap junction protein, and it is widely expressedthroughout the human body. Initial structural studies by electron microscopy have shown thatflexible C-terminal cytoplasmic domain of Cx43 (Cx43CT) worsens diffraction quality of 2Dcrystals. Removal of most of the Cx43CT improved resolution of transmembrane segments ofCx43. Truncated at residue 263 mutant of Cx43 (Cx43-263T) still was able to form2D crystals and assembled into gap junctions. Thus, the present work is dedicated to the studyof three forms of Cx43, namely Cx43-263T, Cx43CT, and full-length Cx43.Performed in our work connexin gene optimization for E.coli codon bias and minimization ofstability of mRNA secondary structure significantly enhanced expression of Cx43 and Cx43-263T. Procedures for Cx43-263T and Cx43 purification were developed. The purified proteinwas reconstituted into amphipathic polymer amphipol A8-35 and characterized by SEC, DLS,and SAXS. Applied independent techniques showed self-assembling of purified Cx43-263Tinto hexamers demonstrating its functionality.Cx43CT was overexpressed in E.coli and purified to homogeneity. The protein wascharacterized by SEC, DLS, TSA, and SAXS. The concentration-dependent oligomerizationwas established.In the beginning of our project Cx43-263T and Cx43 were overexpressed in E. coli usingMistic fusion protein. A number of constructs providing various linkers and proteaserecognition sites were generated. To remove Mistic from the produced proteins in vivo and invitro cleavage were tested. All generated constructs demonstrated high resistance to specificproteolysis in wide range of conditions.Mistic (membrane integrating sequence for translation of integral membrane proteinconstructs) from B. subtilis was overexpressed in E.coli and purified to homogeneity usingdifferent detergents. While the tertiary structure of solubilized in lauryldimethylamine oxideMistic was determined earlier, the native structure of Mistic in lipid environment elucidatingits function is not available yet. In the present work Mistic was reconstituted into differentlipids and used for initial in meso crystallization trials. Additionally, Mistic was used forproduction of anti-Mistic antibodies.

L'auteur n'a pas fourni de résumé en français / L'auteur n'a pas fourni de résumé en anglais

Les histones désacétylases (HDACs) sont les principales cibles des médicaments épigénétiques anticancéreux actuellement approuvés par la FDA. Les HDACs jouent aussi un rôle important dans l'homéostasie des pathogènes eucaryotes. Par conséquent, une stratégie pour lutter contre les maladies négligées causées par ces pathogènes est de modifier les médicaments épigénétiques actuellement approuvés qui ciblent les HDACs. HDAC8 de Schistosoma mansoni (smHDAC8) est une cible médicamenteuse valable pour traiter la schistosomiase, deuxième maladie négligée mortelle après le paludisme. Les différences structurales entre les poches catalytiques des HDAC8 humaine et smHDAC8 ont permis la conception d'inhibiteurs sélectifs des schistosomes qui se lient dans une poche sélective unique à HDAC8. Ce travail de thèse montre comment cibler sélectivement des isoformes HDAC l'aide de structures à résolution atomique, et ouvre la porte à l'étude du mode d'action de HDAC8 au niveau fondamental. / Histone deacetylases (HDACs) are the major targets of currently FDA-approved anti-cancer epigenetic drugs. HDACs also play an important role in the homeostasis of eukaryotic pathogens. Hence, a strategy to tackle neglected diseases caused by these pathogens is to modify currently approved epigenetic drugs targeting HDACs. HDAC8 from Schistosoma mansoni (smHDAC8) was shown to be a valid drug target to treat schistosomiasis, second deadliest tropical disease after malaria. Structural differences between human HDAC8 and smHDAC8 catalytic pocket enabled the design of schistosome-selective inhibitors that bind in a HDAC8 selective pocket, which is unique to HDAC8 among the highly conserved HDAC isozymes. This thesis work shows how to target selectively related isoforms with the help of atomic resolution structures, and opens the door to the investigation of the mode of action of HDAC8 at the fundamental level.

L’initiation de la transcription chez les eucaryotes nécessite le recrutement de l'ARN polymérase II (Pol II) et des facteurs de transcription généraux sur les promoteurs de gènes formant le complexe de préinitiation (PIC). Des activateurs se lient en amont du promoteur et stimulent l’ouverture de la chromatine et la formation du PIC en recrutant des complexes coactivateurs. SAGA est un tel coactivateur, conservé chez les eucaryotes, connu pour modifier les histones de tous les gènes et impliqué dans la transcription par Pol II. Dans ce travail, j’ai analysé l'organisation moléculaire de SAGA par microscopie électronique. J'ai (i) étudié l'architecture et les interactions des sous unités du module d’acétylation des histones et l’ai localisé dans SAGA; (ii) obtenu la première carte cryo-EM du complexe SAGA chez la levure et analysé sa flexibilité; (iii) défini le site d'interaction entre TBP et SAGA et montré que le complexe subit un changement conformationnel lors de cette liaison. / Transcription initiation in eukaryotes requires the recruitment of RNA polymerase II (Pol II) and general transcription factors to the promoters of protein coding genes in order to form a PreInitiation Complex (PIC). Sequence specific activators bind up stream of the promoter, stimulating chromatin opening and PIC formation via recruitment of coactivator complexes. SAGA is such a coactivator, conserved in all eukaryotes, known to modify the histones on all expressed genes in yeast and human and involved in Pol II transcription. In this work I have analyzed SAGA’s molecular organization mostly by electron microscopy. I have (i) studied the architecture and sub unit interactions of SAGA histone acetylation (HAT) module and localized it in the full SAGA complex; (ii) obtained the first cryo-EM map of yeast SAGA and analyzed its flexibility; (iii) defined the interaction site of SAGA with TBP protein and shown that the complex under goes a large conformational change upon TBP binding.

Les ADN topoisomérases de type 2 (Top2) sont des protéines universelles et essentielles à la vie cellulaire. Elles ont pour fonction de réguler de manière fine l’équilibre topologique de l’ADN. Chez l’homme, les Top2 (HsTop2) sont des cibles thérapeutiques de première importance en oncologie. Des molécules telles que l’étoposide et la doxorubicine font partie des traitements anticancéreux les plus utilisés en clinique à l’heure actuelle, elles agissent en stabilisant les complexes Top2/ADN/inhibiteurs qui sont transformés en lésions permanentes dont l’accumulation entraîne la mort cellulaire. Mon travail de thèse porte sur la caractérisation fonctionnelle et structurale des isoformes des HsTop2 entières en complexe avec des composés thérapeutiques. Mon projet de thèse comporte trois axes principaux et complémentaires : (i) La production et la caractérisation fonctionnelle in vitro des isoformes recombinantes. Nous avons optimisé et simplifié les protocoles de surexpression des deux isoformes dans la levure et avons également mis au point leur expression dans les cellules de mammifère. (ii) une étude structurale par cryo-microscopie électronique sur les HsTop2 entières en complexe avec des composés thérapeutiques et des oligonucléotides. Ces premiers travaux ont permis l’obtention d’une carte tridimensionnelle de l’enzyme entière qui servira de base pour l’étude de l’architecture des HsTop2 au sein de complexes protéiques de plus grande taille. (iii) des expériences de protéomique chimique permettant de mettre à jour les cibles secondaires potentielles de l’étoposide et de la doxorubicine dans des extraits cellulaires de lignées cancéreuses. / The type 2 DNA topoisomerases are universal proteins essential for cell survival. These enzyme fine tune the topological equilibrium of the DNA in cells. The human proteins are major targets of therapeutics drugs used in oncology. Molecules like etoposide and doxorubicin are among the most effective anticancer drugs used in chemotherapy treatments; they form stable Top2/DNA/drugs complexes which are then transformed in permanent DNA damages. This thesis project focuses on the functional and structural characterization of these complexes using 3 main strategies:(i) the production and the in vitro functional characterization of the recombinant isoforms. We optimized and simplified the production and purification procedures and overexpressed both isoforms in mammalian cells. (ii) a structural study by cryoelectron microscopy on the full enzyme complex with DNA and therapeutic drugs. We obtained a 3D density map that will be used for further studies on the architecture of large HsTop2 associated complexes. (iii) ChemoProteomic experiments on cancer cell lines to highlight the potential etoposide and doxorubicin secondary targets.

La cryo-microscopie électronique a connu une révolution majeure ces dernières années, liée à des évolutions technologiques importantes, tant au niveau des microscopes, que des caméras ou des logiciels de traitement d’images. Ainsi, avec l’arrivée de microscopes électroniques plus stables mécaniquement et électroniquement, il est possible d’enregistrer plusieurs milliers d’images de façon automatique en quelques jours, et par conséquent d’obtenir un jeu initial d’images conséquent des particules des complexes protéiques étudiés. Sauf que maintenant, il ne s’agit plus d’image au sens strict, mais de film. En effet, les nouvelles caméras, dites à détection directe d’électrons, permettent de décomposer l’image en plusieurs fractions d’images au cours de l’exposition, et ce, avec une sensibilité dix fois supérieure par rapport à celle des anciennes caméras. L’analyse de ces fractions d’images a permis de montrer que les particules protéiques, bien que piégées dans une mince pellicule de glace, bougeaient sous l’effet du faisceau d’électrons. L’alignement des fractions et leur sommation permettent ainsi de corriger ces mouvements, améliorant la qualité du signal contenu dans chaque image. Ainsi, alors que pendant des dizaines d’années, les informations structurales extraites des images des microscopes électroniques étaient limitées à la moyenne résolution, c’est à dire entre 5 et 15 Å de résolution, nous voyons apparaître depuis ces deux-trois dernières années, de très nombreuses cartes de densités électroniques de complexes protéiques issues de la microscopie électronique, à des résolutions inférieures à 4 Å, permettant de construire des modèles atomiques à l’aide d’outils jusqu’alors réservés à la cristallographie aux rayons X. C’est dans ce contexte, que j’ai étudié par cryo-microscopie électronique et traitement d’images, l’organisation structurale de trois virus de plante :- Le virus de la mosaïque de l’arabette (ArMV), un Nepovirus uniquement transmis par le nématode Xiphinema diversicaudatum, qui est responsable de la maladie du court-noué de la vigne. -Le virus de la tâche de la fève (BBSV), un Comovirus transmis par les coléoptères, responsable de la dégénération chez les légumineuses.- Le virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), un Caulimovirus servant de virus modèle pour l’étude de la transmission des virus non circulants.Les virus sont des parasites endocellulaires obligatoires, dont l’efficacité dépend de leur capacité de réplication au sein de la cellule infectée et de leur transmission vers de nouveaux hôtes. En raison de l’immobilité des plantes, les phytovirus font souvent appel à des vecteurs pour la transmission plante à plante, qui sont principalement des insectes, des nématodes, des champignons ou des acariens. Les phytovirus sont généralement responsables d’une baisse importante de croissance de la plante et des fruits, voire de la mort de l’hôte infecté. Les dégâts ainsi causés engendrent des pertes de rendement dans les cultures partout dans le monde, se traduisant par d’énormes pertes économiques pour les cultivateurs. Ce travail de thèse présente les structures atomiques de l’ArMV et du BBSV obtenues par cryo-microscopie électronique, ainsi que les premiers résultats obtenus sur la structure de la capside du CaMV, et sa protéine de transmission P2. / A revolution has taken over the world of cryo-electron microscopy for the last years, by dint of a major breakthrough both in technology, with the rise of new microscopes and cameras, and in image processing. With the advent of high-end microscopes, mechanically and electronically more stable, one can expect to record an initial data set of thousand images in few days, thanks to automated acquisition. Besides, the new direct electron detectors can not only record images, but also movies with a better sensitivity than the one we used to have. The movie processing revealed the existence of a beam-induced motion occurring during acquisition. The correction of the motion through frame alignment improves significantly the quality of data. Thus, cryo-electron microscopy was only limited to a middle resolution range (5 to 15 Å) until two or three years ago, when several density maps above 4 Å started to appear, allowing the building of atomic model using tools that were only restricted to X-ray crystallography.In this context, I have studied the structural organization of three plant viruses, using cryo-electron microscopy and image processing:- Arabis Mosaic Virus (ArMV), it’s a Nepovirus only transmitted by the nematode Xiphinema diversicaudatum, responsible for disease of vineyards.- Broad Bean Stain Virus (BBSV), it’s a Comovirus transmitted by beetles, responsible for the degeneration of leguminous plants.- Cauliflower Mosaic Virus (CaMV), it’s a Caulimovirus used as model to characterize the transmission of non circulative viruses.Viruses are obligate intracellular parasites, which efficiency is directly related to its replicative capacity inside the infected cell, and its transmission to new hosts. Due to the immobility of plants, plant viruses often use vectors for the transmission plant to plant, which are mainly insects, nematodes, fungi or mites. Plant viruses are generally responsible for a significant decrease in plant and fruit growth, and even the death of the plant. The plant viruses are devasting fields worldwide, causing huge loss in crop yield each year. This study highlights the atomic structures of ArMV and BBSV, as well as the first data about the CaMV capsid and its transmission protein.

Le transport intracellulaire de cargos est un processus critique au sein des cellules eucaryotes, et notamment au niveau des neurones, pour contrôler différentes fonctions dont la maturation et la transmission synaptique. La kinésine-1 est un moteur moléculaire capable de transporter différents types de cargos, comme des organelles, des vésicules ou des assemblages macromoléculaires le long des microtubules. La kinésine-1 est un hétérotétramère constitué d’un homodimère de chaînes lourdes (KHC) associé à deux chaînes légères (KLC) ; les deux chaînes, KHC et KLC étant capables de recruter des cargos. L’un des premiers cargos de la kinésine-1 à avoir été identifiés sont les protéines JIP3/4 (JNK-Interacting Protein 3/4) ; elles jouent aussi un rôle de protéines adaptatrices pour le transport d’autres cargos de la kinésine-1. La kinésine-1 recrute les protéines JIP3/4 de deux façons distinctes et indépendantes (i) via KHC et (ii) via KLC. Le recrutement de JIP3/4 par KHC et KLC est capable, via des mécanismes moléculaires distincts, d’activer la motilité de la kinésine-1 et donc de contrôler le transport intracellulaire dans lequel elle est impliquée et les fonctions associées au sein des neurones.Au cours de mon travail de thèse, j’ai contribué à caractérisé par des approches bio-informatiques, biochimiques/biophysiques et structurales, les deux modes de recrutement des protéines JIP3/4 par la kinésine-1 : (i) via KHC et (ii) via KLC. Ce travail a permis d’apporter des nouveaux éléments pour comprendre le mode de recrutement de ces protéines cargos/adaptatrices par la kinésine-1, mais aussi de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de son activation par les protéines JIP3/4. / The intracellular transport of cargos is a crucial process on eukaryotic cells, and notably in neurons, in order to regulate different functions as cell’s maturation and synaptic transmission. The Kinesin-1 is a molecular motor capable of transporting different types of cargos as organelles, vesicles and macromolecular assemblies along the microtubules. It is a heterotetramer composed by a homodimer of heavy chains (KHC) bound to two light chains (KLC), where both KHC and KLC are capable of cargos recruitment. One of the first identified cargos of Kinesin-1 is JIP3/4 (JNK-Interacting Protein 3/4), which are also adaptor proteins, intermediating the transport of other cargos. Kinesin-1 recruits JIP3/4 by two different and independent modes, (i) via KHC and (ii) via KLC. Therefore, JIP3/4 recruitment by KHC and KLC activates the motility of Kinesin-1, by distinct mechanisms, allowing the intracellular transport of cargos and the associated functions in neurons. During my PhD, I contributed to the characterization of the dual binding mode of Kinesin-1 and JIP3/4 by bioinformatical, biochemical/biophysical and structural approaches. This work allowed a better understanding of the cargos’ recruitment by Kinesin-1, as well as the molecular mechanisms of Kinesin-1 activation by JIP3/4.

TCTP est une petite protéine globulaire (20~kDa) qui interagit avec de nombreux partenaires et qui est impliquée dans diverses fonctions cellulaires et physiologiques, avec un rôle bien documenté dans la réversion tumorale qui est un phénomène rare et spontané où une cellule cancereuse perd tout ou partie de son phénotype malin et retrouve des caractéristiques associées aux cellules bénignes telles que la sensibilité à l'apoptose. Dans les cellules cancéreuses, TCTP inhibe la dégradation de MDM2, diminuant ainsi les niveaux de p53 et favorisant le maintien et la progression du cancer. TCTP contient également un motif BH3-like connu pour réguler les membres de la famille Bcl-2 et elle interagit directement avec Bcl-xL et Mcl-1 pour renforcer leurs propriétés anti-apoptotiques. Dans la structure TCTP, le motif BH3-like n'est pas facilement accessible pour une interaction avec un partenaire. Conformément à son importance dans le maintien de la tumeur, TCTP est une cible pharmacologique validée dans le traitement du cancer et fait l’objet d’essais cliniques en cours avec une molécule d'abord connue comme anti-depresseur, la sertraline. Cependant, on en sait peu sur la structure de TCTP en complexe avec ses partenaires, ce qui entrave le développement de médicaments et ne permet pas de comprendre comment TCTP peut s'adapter à une telle variété de partenaires. Ainsi, nous avons étudié le mécanisme moléculaire par lequel TCTP s'associe à des protéines et à des ligands en utilisant diverses méthodes biophysiques (RMN, SAXS, CD, SEC, DSF...). Nous avons démontré que la protéine TCTP se lie à Bcl-xL et à Mcl-1 dans le sillon de liaison des motifs BH3. Dans les complexes, la région BH3-like est engagée dans l'interface intermoléculaire et la structure centrale de TCTP est déstabilisée dans un état de globule fondu (molten-globule). Nous avons en outre montré que seule une forme mineure pré-existante de TCTP, à savoir TCTP*, est compétente pour les interactions avec les partenaires Bcl-xL et Mcl-1. Dans TCTP*, la région BH3-like est détachée du domaine structuré et elle est accessible aux protéines Bcl-xL/Mcl-1 tandis qu'on retrouve un état globule fondu dans la partie globulaire de TCTP*. Nous avons également collecté des données d'interaction préliminaires entre TCTP et la sertraline, des ARN, la protéine YB-1 se liant à l'ARN et le domaine N-terminal de MDM2. Enfin, nous avons caractérisé TCTP phosphorylé (pTCTP) au résidu S46 en utilisant la Plk-1 car cette modification a un impact sur les interactions et est un marqueur de l'aggressivité tumorale. En résumé, ces travaux ont établi la versatilité de TCTP en terme de structure et ont montré que cette versatilité est indispensable pour exercer ses fonctions cellulaires. En conséquence, ceci devrait être pris en compte dans les stratégies de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblant TCTP. / TCTP is a small (20~kDa) globular protein that interacts with many partners with consequences in various cellular and physiological functions, with well-documented roles in tumoral reversion program. Cells that undergo such program spontaneously loose their malignant phenotype and recover characteristics associated with benign cells, such as apoptosis. In cancer cells, TCTP inhibits MDM2 degradation, thus decreasing p53 levels and favoring tumor maintenance and progression. TCTP also contains a BH3-like motif known to regulate Bcl-2 family members and TCTP directly interacts with Bcl-xL and Mcl-1 to reinforce their pro-survival properties. In TCTP structure, the BH3-like motif is not readily accessible for interaction. Consistently with its importance in tumor maintenance, TCTP is a validated pharmacological target in cancer treatment with ongoing clinical trials using the TCTP-targeting antidepressant drug sertraline. However, little is known about TCTP structure in complex with partners, thus impeding the development of drugs and the understanding of how TCTP could adapt to its myriad of partners. Thus, we investigated the molecular mechanism by which TCTP associates with proteins and ligands using various biophysical methods (NMR, SAXS, CD, SEC, DSF...). We have demonstrated that full length TCTP binds to Bcl-xL and Mcl-1 in their BH3-binding groove. In the complexes, the TCTP BH3-like region is engaged in the intermolecular interface and the core TCTP structure is destabilized into a molten-globule (MG) state. We further showed that only a minor pre-existing form of TCTP, namely TCTP*, is competent for interactions with the Bcl-2 protein partners. In TCTP*, the BH3-like region is unpinned and accessible to Bcl-xL/Mcl-1 proteins and the core structure is also in MG state. We also collected preliminary interaction data between TCTP and sertraline, RNA, the RNA binding YB-1 protein and the MDM2 N-terminal domain. Finally, we characterized the Plk-1-mediated S46 phosphorylated TCTP (pTCTP), a marker of tumor aggressivity and its interaction properties. Overall, this work established the structural versatility of TCTP that is mandatory to exert its cellular functions and this versatility should be taken into account in drug-design strategies targeting TCTP.

Un médicament, ou tout autre petite molécule biologique, agit sur l’organisme via des interactions chimiques qui se produisent avec d’autres macromolécules telles que les protéines qui régissent le fonctionnement des cellules. La détermination de l’ensemble des cibles, c’est à dire de l’ensemble des macromolécules susceptibles de lier une même molécule, est essentielle pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des effets d’un médicament. Cette connaissance permettrait en effet de guider la conception d’un composé pour éviter au mieux les effets secondaires indésirables, ou au contraire découvrir de nouvelles applications à des molécules connues. Les avancées de la biologie structurale nous permettent maintenant d’avoir accès à un très grand nombre de structures tridimensionnelles de protéines impliquées dans ces interactions, ce qui motive l’utilisation d’outils in silico (informatique) pour complémenter ou guider les expériences in vitro ou in vivo plus longues et plus chères.La thèse s’inscrit dans le cadre d’une collaboration entre le laboratoire DAVID de l’Université de Versailles-Saint-Quentin, et l’entreprise Bionext SA qui propose une suite logicielle permettant de visualiser et d’étudier les interactions chimiques. Les travaux de recherches ont pour objectif de développer un algorithme permettant, à partir des données structurales des protéines, de déterminer des cibles potentielles pour un composé donné. L’approche choisie consiste à utiliser la connaissance d’une première interaction entre un composé et une protéine afin de rechercher par similarité d’autres protéines pour lesquelles on peut inférer la capacité à se lier avec le même composé. Il s’agit plus précisément de rechercher une similarité locale entre un motif donné, qui est la région permettant à la cible connue de lier le composé, et un ensemble de protéines candidates.Un algorithme a été développé, BioBind, qui utilise un modèle des surfaces des macromolécules issu de la théorie des formes alpha afin de modéliser la surface accessible ainsi qu’une topologie sur cette surface permettant la définition de régions en surface. Afin de traiter le problème de la recherche d’un motif en surface, une heuristique est utilisée consistant à définir des motifs réguliers qui sont une approximation de disques géodésiques et permettant un échantillonnage exhaustif à la surface des macromolécules. Ces régions circulaires sont alors étendues à l’ensemble du motif recherché afin de déterminer une mesure de similarité.Le problème de la prédiction de cibles est ramené à un problème de classification binaire, où il s’agit pour un ensemble de protéines données de déterminer lesquelles sont susceptibles d’interagir avec le composé considéré, par similarité avec la première cible connue. Cette formalisation permet d’étudier les performances de notre approche, ainsi que de la comparer avec d’autres approches sur différents jeux de données. Nous utilisons pour cela deux jeux de données issus de la littérature ainsi qu’un troisième développé spécifiquement pour cette problématique afin d’être plus représentatif des molécules pertinentes du point de vue pharmacologique, c’est-à-dire ayant des propriétés proches des médicaments. Notre approche se compare favorablement sur ces trois jeux de données par rapport à une autre approche de prédiction par similarité, et plus généralement notre analyse confirme que les approches par docking (amarrage) sont moins performantes que les approches par similarité pour le problème de la prédiction de cibles. / The action of a drug, or another small biomolecule, is induced by chemical interactions with other macromolecules such as proteins regulating the cell functions. The determination of the set of targets, the macromolecules that could bind the same small molecule, is essential in order to understand molecular mechanisms responsible for the effects of a drug. Indeed, this knowledge could help the drug design process so as to avoid side effects or to find new applications for known drugs. The advances of structural biology provides us with three-dimensional representations of many proteins involved in these interactions, motivating the use of in silico tools to complement or guide further in vitro or in vivo experiments which are both more expansive and time consuming.This research is conducted as part of a collaboration between the DAVID laboratory of the Versailles-Saint-Quentin University, and Bionext SA which offers a software suite to visualize and analyze chemical interactions between biological molecules. The objective is to design an algorithm to predict these interactions for a given compound, using the structures of potential targets. More precisely, starting from a known interaction between a drug and a protein, a new interaction can be inferred with another sufficiently similar protein. This approach consists in the search of a given pattern, the known binding site, across a collection of macromolecules.An algorithm was implemented, BioBind, which rely on a topological representation of the surface of the macromolecules based on the alpha shapes theory. Our surface representation allows to define a concept of region of any shape on the surface. In order to tackle the search of a given pattern region, a heuristic has been developed, consisting in the definition of regular region which is an approximation of a geodesic disk. This circular shape allows for an exhaustive sampling and fast comparison, and any circular region can then be extended to the actual pattern to provide a similarity evaluation with the query binding site.The target prediction problem is formalized as a binary classification problem, where a set of macromolecules is being separated between those predicted to interact and the others, based on their local similarity with the known target. With this point of view, classic metrics can be used to assess performance, and compare our approach with others. Three datasets were used, two of which were extracted from the literature and the other one was designed specifically for our problem emphasizing the pharmacological relevance of the chosen molecules. Our algorithm proves to be more efficient than another state-of-the-art similarity based approach, and our analysis confirms that docking software are not relevant for our target prediction problem when a first target is known, according to our metric.

Les récepteurs nucléaires (RNs) sont des facteurs de transcriptions se liant à des séquences spécifiques d'ADN et activant la transcription de gènes en réponse à la fixation de ligands spécifiques. Parmi tous les RNs impliquées dans l'étiologie des cancers, les récepteurs liés aux œstrogènes ERR jouent un rôle important dans les cancers du sein, de l'ovaire, du colon, de l’endomètre et la prostate. Ce RN est dit orphelin car il ne possède pas de ligand naturel connu à ce jour. Par une approche de biologie structurale intégrative combinant cryo-microscopie électronique, bioinformatique et évolution, mon travail de thèse s'est focalisé sur l'étude structurale de ERR et sur l'origine et l'évolution des RNs. Dans ce contexte, 3 outils informatiques ont été développés. Les résultats obtenus ont permis d'une part la révision des connaissances fondamentales sur l'origine des récepteurs nucléaires et leur évolution. D'autre part, l'étude structurale de ERR a permis d'acquérir de nouvelles données sur la topologie des récepteurs nucléaires stéroidiens fixés sur un élément de réponse ERRE/ERE ainsi que sur le mécanisme allostérique de la liaison du coactivateur PGC-1α sur le dimère de ERR. La résolution du complexe à l'échelle atomique par cryo-microscopie électronique permettra d'ouvrir la voie vers la conception de nouvelles molécules thérapeutiques. / Nuclear receptors (NRs) are transcription factors which bind to specific DNA sequences and activate gene transcription in response to the binding of specific ligands. Among all of the RNs involved in the etiology of cancers, ERR estrogen receptors play an important role in breast, ovarian, colon, endometrial and prostate cancers. This NR is said to be orphan because it does not have a natural ligand known to date. Using an integrative structural biology approach combining cryo-electron microscopy, bioinformatics and evolution, my PhD work focused on the structural study of ERR and the origin and evolution of RNs. In this context, three informatic tools have been developed. The results obtained allowed, on the one hand, the revision of fundamental knowledge on the origin of nuclear receptors and their evolution. On the other hand, structural study of ERR allow us to acquire new data on topology of steroid nuclear receptors fixed on an element of ERRE / ERE response as well as on the allosteric mechanism of the binding of the coactivator PGC-1α on the dimer of ERR. The resolution of the complex at the atomic scale by cryo-electron microscopy will open the way towards the design of new therapeutic molecules.