Les lectines sont des protéines ubiquitaires qui se lient spécifiquement et de manière réversible aux sucres sans les modifier. Elles peuvent déchiffrer le glycocode : les informations stockées dans les sucres à la surface d'une cellule. Les lectines sont impliquées dans de nombreux processus biologiques tels que la cohésion cellulaire, le développement, la signalisation cellulaire, la défense ou les infections microbiennes. Elles peuvent présenter des propriétés exploitables, par exemple antiprolifératives, antivirales ou antitumorales et sont des outils recherchés en glycobiologie. Le règne fongique a suscité un large intérêt ces dernières années, car il est une source prometteuse et largement inexplorée pour les lectines ayant de nouvelles spécificités et/ou activités. Les données structurales sont encore limitées pour les lectines fongiques et ce projet vise notamment à combler cette lacune en étudiant deux familles de lectines reconnaissant des marqueurs glycosidiques associés aux cancers. Via une approche multidisciplinaire, l'interaction de ces lectines avec leur ligand au niveau atomique a été disséquée et des modifications ont été réalisées pour les rendre plus spécifiques pour un motif particulier. Les lectines recombinantes sauvages ou mutées ont été exprimées dans Escherichia coli puis purifiées par des méthodes chromatographiques classiques. La spécificité et l'affinité ont été déterminées par différentes techniques telles que l'hémagglutination, les puces à sucre et la microcalorimétrie de titration. La caractérisation structurale a été effectuée par cristallographie aux rayons X et a permis de définir les déterminants de la protéine et du ligand indispensables à l'interaction et d'aider à la conception et à l'évaluation structurale de mutants. Enfin, des analyses sur cellules et tissus cancéreux ont confirmé leur potentiel en tant qu’outils de marquage, ce qui permet d’envisager leur utilisation pour des applications biomédicales ou biotechnologiques. / Lectins are ubiquitous proteins which bind specifically and reversibly carbohydrates without modifying them. They can decipher the glycocode: information stored in carbohydrates found at the surface of any cell. Lectins are involved in many biological processes such as cell cohesion, development, cell signaling, defense or microbial infections. They can present exploitable properties such as antiproliferative, antiviral or antitumor and are interesting tools in glycobiology. The fungal kingdom has attracted wide interest in the recent years since it is a promising and largely unexplored source for lectins for novel specificity and activities. Structural data are still limited for fungal lectins and this project aims to fill this gap of knowledge whilst studying new lectins specific for two glycosidic cancer markers. Via a multidisciplinary approach, we dissected the interaction of those lectins with their ligand at the atomic level or modified them to optimized their specificity or affinity. Recombinant wild-type and mutated lectins were expressed in Escherichia coli and then purified by classical chromatography methods. The specificity and affinity were determined by different techniques such as hemagglutination, glycan arrays, and microcalorimetry. Finally, structural characterization was performed by X‐ray crystallography in order to localize the sugar binding site, to obtain the specific protein and ligand determinants necessary for the interaction and to help for the design and structural evaluation of mutants. Finally, analysis on cancer cells and tissues confirmed their potential as labelling tools thereafter for biomedical or biotechnological applications.

Dans la cellule, les protéines évoluent dans un environnement très dense et interagissent ainsi avec un grand nombre de partenaires spécifiques et non-spécifiques qui entrent en compétition. L’objectif de ma thèse est de caractériser les propriétés physiques et évolutives des surfaces protéiques pour comprendre comment la pression de sélection s’exerce sur les protéines, façonnant leurs interactions et régulant ainsi cette sévère compétition.Pour cela, j’ai développé une méthodologie permettant de caractériser la propension des protéines à interagir avec les protéines de leur environnement, par des approches de docking. La cartographie moléculaire permettant la visualisation et la comparaison des propriétés de la surface des protéines, j’ai donc mis en place un nouveau cadre théorique basé sur une représentation des paysages énergétiques d'interaction par des cartes d'énergies. Ces cartes (en deux dimensions) reflètent de manière synthétique la propension des surfaces protéiques à engager des interactions avec d’autres protéines. Elles sont donc d’un grand intérêt pratique pour déterminer les régions des surfaces protéiques les plus enclines à engager des interactions avec d’autres molécules.Ce nouveau cadre théorique a permis de montrer que les surfaces des protéines comprennent des régions de différents niveaux d'énergies de liaison (régions chaudes, intermédiaires et froides pour les régions d'interaction favorables, intermédiaires et défavorables respectivement).Une partie importante de la thèse a consisté à caractériser les propriétés physico-chimiques et évolutives de ces différentes régions. L'autre partie a consisté à appliquer cette méthode sur plusieurs systèmes : complexes homomériques, protéines du cytosol de S. cerevisiae, familles d'interologues. Ce travail ouvre la voie à un grand nombre d'applications en bioinformatique structurale, telles que la prédiction de sites de liaison, l’annotation fonctionnelle ou encore le design de nouvelles interactions.En conclusion, la stratégie mise en place lors de ma thèse permet d’explorer la propension d’une protéine à interagir avec des centaines de partenaires d'intérêts, et donc d'investiguer le comportement d’une protéine dans un environnement cellulaire spécifique. Cela va donc au-delà de l'utilisation classique du docking "binaire" puisque notre stratégie fournit une vision systémique des interactions protéiques à l’échelle des "résidus". / In the crowded cell, proteins interact with their functional partners, but also with a large number of non-functional partners that compete with the functional ones. The goal of this thesis is to characterize the physical properties and the evolution of protein surfaces in order to understand how selection pressure exerts on proteins, shaping their interactions and regulating this severe competition.To do this I developed a framework based on docking calculations to characterize the propensity of protein surfaces to interact with other proteins. Molecular cartography enables the visualization and the comparison of surface properties of proteins. I implemented a new theoretical framework based on the representation of interaction energy landscapes by 2-D energy maps. These maps reflect in a synthetic manner the propensity of the surface of proteins to interact with other proteins. These maps are useful from a practical point view for determining the regions of protein’s surface that are more prone to interact with other proteins. Our new theoretical framework enabled to show that the surface of proteins harbor regions with different levels of propensity to interact with other proteins (hot regions, intermediate and cold regions to favorable, intermediate and unfavorable regions respectively).A large part of this thesis work consisted in characterizing the physico-chemical properties and the evolution of these regions. The other part of this thesis work consisted in applying this methodology on several study systems: homomeric complexes, cytosolic proteins from S. cerevisiae, families of interologs. This work opens the way to numerous practical applications in structural bioinformatics, such as binding site prediction, functional annotation and the design of new interactions.To conclude, the strategy implemented in this work enable the exploration of the propensity of a protein to interact with hundred of protein partners. It thus enables the investigation of the behavior of a protein in a crowded environment. This application goes beyond the classical use of protein docking as a, because our strategy provides a systemic point of view of protein interactions at an atomic resolution.

L’Adénylate cyclase (CyaA), produite par B. pertussis, agent responsable de la coqueluche, est un des principaux facteurs de virulence de la bactérie. La toxine est une grande protéine multi-domaine qui est synthétisée comme un précurseur inactif, proCyaA. Ce précurseur est converti dans la forme active après une acylation spécifique. Après la sécrétion, la toxine envahir les cellules eucaryotes par un mécanisme unique qui implique la translocation de son domaine catalytique dans le cytosol des cellules eucaryotiques. Cette mécanisme est toujours pas clair et nombreuses questions restent ouvertes. Dans la présente étude, nous avons étudié les propriétés structurales et fonctionnelles des différentes espèces de (pro)CyaA en solution et inséré dans la membrane. Nous avons observé que le repliement de (pro)CyaA dans la forme monomérique dépend de la présence de calcium et de l'acylation post-traductionnelle. En outre, nous avons observé que la présence du calcium améliore fortement la stabilité de la protéine. De plus, nous avons identifié un segment hydrophobe dans CyaA, mais pas dans proCyaA, qui intervient dans les premières étapes du repliement de la protéine. L'analyse macroscopique a révélé que CyaA est plus stable et compacte par rapport à proCyaA. Nous avons aussi observé que les deux toxines sont capables de perméabiliser les membranes in vitro, mais que seulement la toxine monomérique et acyle est capable d'exercer des activités de membranes efficaces dans la cellule (hémolyse, translocation de AC et production de cAMP). Nous proposons que la toxine monomérique est la seul espèce compétent et fonctionnel. / Adenylate cyclase is one of the major virulence factors produced by Bordetella pertussis, the causative agent of whopping cough. The toxin is a huge multi-domain protein synthesized as an inactive precursor, proCyaA, which is converted into the active form upon a specific acylation. Once secreted across the bacterial cell envelope, the toxin invades eukaryotic cells through a unique mechanism that involves the direct translocation of its catalytic domain inside the cytosol of the target cells. This mechanism is still not clear and many questions remain open. In the present study we investigated the structural and functional properties of various (pro)CyaA species in solution and upon membrane-insertion. We found that the (re)folding of CyaA into a monomeric form critically depend upon the presence of calcium and the post-translational acylation. We observed that calcium binding strongly improves the stability of the protein. Moreover we identified a hydrophobic segment in CyaA, but not in proCyaA, which is involved in the early stages of the refolding process. Macroscopic analysis showed that CyaA is more stable and compact as compared to proCyaA. We also observed that both toxins are able to permeabilize membranes in vitro, although only the monomeric and acylated toxin is able to exert efficient membrane activities in cellula (i.e., hemolysis, AC translocation and cAMP production). We propose that the monomeric species is the functional competent and active state and that the acyl chains play not only a structural role but are also essential for the functional activities of the toxin.

Le transporteur d'ADP/ATP est une protéine de la membrane interne mitochondriale qui joue un rôle physiologique majeur en catalysant l'échange d'un ADP cytoplasmique contre un ATP néo-synthétisé dans la matrice mitochondriale. Cette protéine peut être inhibée de manière très spécifique par deux poisons naturels, le carboxyatractyloside (CATR) et l'acide bongkrekique (BA) qui stabilisent la protéine dans deux états conformationnels distincts adoptés au cours du mécanisme de transport. Afin de mieux appréhender cette dynamique fonctionnelle, une étude du transporteur d'ADP/ATP bovin en complexe avec le CATR ou le BA dans le détergent Triton X-100 a été réalisée par échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse. Ces travaux se sont déroulés en 4 parties. La première a consisté à adapter cette technique à l'étude des protéines membranaires intégrales. En effet, la présence de détergents, nécessaires au maintien en solution de l'état natif de ces protéines, n'a pas permis jusqu'ici de les étudier par cette approche. Pour pallier cette difficulté, un protocole automatisé de chromatographie liquide permettant l'élimination du Triton X-100 a été mis au point. Les cinétiques de deutération des différents complexes ont alors pu être analysées dans le deuxième volet de cette étude. Les données obtenues ont permis de proposer des modèles conformationnels du transport de nucléotides à travers la membrane interne mitochondriale, dans lesquels le transporteur présenterait une cavité ouverte tour à tour vers l'espace intermembranaire et vers la matrice. Afin d'apporter d'autres éléments de réponse sur ce mécanisme de transport et de s'affranchir de différents problèmes liés à l'utilisation des détergents, des essais de deutération du transporteur d'ADP/ATP bovin dans les mitochondries ont été entrepris et représentent le troisième volet de ces travaux. Cette approche, qui nécessite encore plusieurs améliorations, a permis d'obtenir les premières données de deutération d'une protéine membranaire dans son environnement natif. Le transporteur d'ADP/ATP est aussi impliqué dans des pathologies humaines plus ou moins graves. Dans une dernière partie, l'étude de ces mutations a été abordée en réalisant chez la levure Saccharomyces cerevisiae une étude phénotypique et biochimique de plusieurs mutants du transporteur de l'amibe Dictyostelium discoideum correspondant aux mutations humaines. Cette étude a mis en évidence un problème dans le mécanisme intrinsèque de transport, induit par la mutation V291M, qui pourrait être à l'origine de la pathologie associée.

Résumé : c-Myc est un facteur de transcription (FT) dont les niveaux cellulaires sont dérégulés dans la majorité des cancers chez l’homme. En hétérodimère avec son partenaire obligatoire Max, c-Myc lie préférentiellement les séquences E-Box (CACGTG) et cause l’expression de gènes impliqués dans la biosynthèse des protéines et des ARNs, dans le métabolisme et dans la prolifération cellulaire. Il est maintenant bien connu que c-Myc exerce aussi son potentiel mitogène en liant et inhibant différents FTs impliqués dans l’expression de gènes cytostatiques. Entre autres, c-Myc est en mesure d’inhiber Miz-1, un FT comportant 13 doigts de zinc de type Cys2-His2 (ZFs) impliqué dans l’expression de plusieurs gènes régulateurs du cycle cellulaire comprenant les inhibiteurs de CDK p15[indice supérieur INK4], p21[indice supérieur CIP1] et p57[indice supérieur KIP2]. Plus récemment, il fut démontré qu’en contrepartie, Miz-1 est aussi en mesure de renverser les fonctions activatrices de c-Myc et de prévenir la prolifération de cellules cancéreuses dépendantes de c-Myc. Ces différentes observations ont mené à la suggestion de l’hypothèse intéressante que la balance des niveaux de Miz-1 et c-Myc pourrait dicter le destin de la cellule et a permis d’établir Miz-1 comme nouvelle cible potentielle pour le développement d’agents anti-cancéreux. Malgré le fait que ces deux protéines semblent centrales à la régulation du cycle cellulaire, les mécanismes moléculaires leur permettant de s’inhiber mutuellement ainsi que les déterminants moléculaires permettant leur association spécifique demeurent assez peu documentés pour le moment. De plus, la biologie structurale de Miz-1 demeure à être explorée puisque qu’aucune structure de ses 13 ZFs, essentiels à sa liaison à l’ADN, n’a été déterminée pour l’instant. Les travaux réalisés dans le cadre cette thèse visent la caractérisation structurale et biophysique de Miz-1 dans le contexte de la répression génique causée par le complexe c-Myc/Miz-1. Nous présentons des résultats d’éxpériences in vitro démontrant que Miz-1 interagit avec c-Myc via un domaine contenu entre ses ZFs 12 et 13. De plus, nous démontrons que Miz-1 et Max sont en compétition pour la liaison de c-Myc. Ces résultats suggèrent pour la permière fois que Miz-1 inhibe les activités de c-Myc en prévenant son interaction avec son partenaire obligatoire Max. De plus, ils laissent présager que que Miz-1 pourrait servir de référence pour le développement d’inhibiteurs peptidiques de c-Myc. Finalement, nous avons réalisé la caractérisation structurale et dynamique des ZFs 1 à 4 et 8 à 10 de Miz-1 et avons évalué leur potentiel de liaison à l’ADN. Les résultats obtenus, couplés à des analyses bio-informatiques, nous permettent de suggérer un modèle détaillé pour la liaison spécifique de Miz-1 à son ADN consensus récemment identifié. / Abstract : c-Myc is a transcription factor (TF) deregulated in the majority of human cancers. In heterodimer with its obligatory partner Max, c-Myc preferentially binds E-Box DNA sequences (CACGTG) and activates genes involved in protein and RNA biogenesis, metabolism and cell proliferation. It is now well established that c-Myc can also bind and inhibit some TFs involved in the expression of cytostatic genes to exert its mitogenic potential. Among those, the inhibition of Miz-1 by c-Myc is the best characterized case. Miz-1 is a TF containing 13 Cys2-His2 zinc fingers (ZFs) that is involved in the expression of many cell cycle regulators such as the CDK inhibitors p15[superscript INK4], p21[superscript CIP1] et p57[superscript KIP2]. More recently, it was shown that, on the other hand, Miz-1 is also able to reverse the transcriptional activator functions of c-Myc and to prevent the proliferation of c-Myc-dependent cancer cells. These observations led to the interesting hypothesis that the balance of c-Myc and Miz-1 levels could determine cell fate and establish Miz-1 as an interesting target for the design of novel cancer drugs. Although those proteins seem central to the regulation of the cell cycle, the molecular mechanisms allowing them to inhibit each other and the molecular determinants allowing their specific association remain poorly understood. Moreover, the structural biology of Miz-1 remains to be explored considering that none of its 13 ZF structures, essential to its DNA binding, have been determined so far. The work presented in this thesis aim at characterizing the structural biology of Miz-1 in the context of the transcriptional repression caused by the c-Myc/Miz-1 complex. We present results from in vitro experiments showing that a domain comprised between the 12th and 13th ZFs of Miz-1 is involved in its binding to c-Myc. Moreover, we demonstrate that Miz-1 and Max compete to engage c-Myc. These results suggest for the first time that Miz-1 inhibits c-Myc by a sequestration mechanism preventing its association with its obligatory partner Max. Moreover, they argue that Miz-1 could serve as a reference for the development of c-Myc specific peptide inhibitors as a new approach for cancer drug design. Finally, we realized the structural and dynamical characterization of Miz-1 ZFs 1 to 4 and 8 to 10 and the characterization of their DNA binding potential. The results collected, coupled to bioinformatics analysis, allowed us to suggest a model for Miz-1 specific binding to its consensus DNA sequence recently unveiled.

LEAFY (LFY) est un facteur de transcription central pour le développement des plantes, en particulier pour la floraison chez les angiospermes. LFY est très conservée, même chez les espèces ne portant pas de fleurs. On dispose de nombreuses données génétiques sur LFY et son réseau de régulation chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, mais les mécanismes moléculaires impliqués dans son fonctionnement ne sont pas entièrement élucidés. LFY possède deux domaines conservés : un domaine de liaison à l'ADN et un domaine de fonction inconnue en position N-terminal. L'objectif a été de comprendre le rôle du domaine N-terminal et d'étudier l'évolution de la spécificité de liaison à l'ADN de LFY. Nous avons obtenu la structure cristallographique du domaine N-terminal de LFY et découvert qu'il s'agissait d'un domaine SAM (Sterile Alpha Motif) permettant l'oligomérisation de la protéine. Nous avons validé l'importance de cette propriété pour la fonction florale de LFY chez A. thaliana. Nous avons ensuite montré, par des analyses in vitro et in vivo en ChIP-seq que l'oligomérisation influençait la liaison à l'ADN en permettant une liaison coopérative sur plusieurs sites de liaison, en assurant la sélectivité de la protéine vis-à-vis de l'ADN et en permettant l'accès de la protéine à des régions génomiques où la conformation de la chromatine est normalement défavorable à la liaison. Cette étude intégrative a permis de mieux comprendre le fonctionnement de LFY. Des modifications dans les réseaux de régulation de l'expression des gènes sont source de nouveauté et d'évolution. LFY étant très conservée et ne faisant pas partie d'une famille multigénique, nous nous sommes demandé si sa spécificité de liaison à l'ADN avait évoluée. Nous avons montré que LFY était apparue chez les algues multicellulaires et que sa spécificité avait connue au moins deux changements majeurs au cours de l'évolution. Nous avons expliqué ces modifications au niveau moléculaire par des approches de biologie structurale et de biochimie. Nous avons identifié une espèce chez qui LFY a une spécificité relâchée et nous proposons qu'une telle forme ait pu permettre les transitions d'une spécificité à une autre. / LEAFY (LFY) is a key transcription factor for plant development, particularly for flowering in angiosperms. LFY is highly conserved in plants, including non-flowering species. Despite a wealth of genetic data about LFY and its regulatory network in the model plant Arabidopsis thaliana, how the protein works at the molecular level is not fully understood. It has two conserved domains: a DNA binding domain and a N-terminal domain of unknown function. My two main projects were to understand the role of the N-terminal domain and to study LFY DNA binding specificity evolution. We obtained LFY N-terminal domain crystal structure and discovered it was a Sterile-Alpha-Motif (SAM) mediating LFY oligomerisation. We validated the importance of that property for flower development in A. thaliana. Using both in vitro analyses and a ChIP-seq experiment, we pointed out that oligomerisation is required for proper DNA binding. It enables cooperative binding on several LFY binding sites, increases the protein selectivity towards DNA and allows LFY to access genomic regions where the chromatin conformation normally prevents binding. This integrative study provides a better understanding of how LFY works. The rewiring of transcriptional networks provides a rich source of evolutionary novelty. As LFY is highly conserved and single copy in most plant genomes, we asked whether its DNA binding specificity had evolved. We showed that LFY was present since multicellular algae and that it underwent at least two major shifts in DNA-binding specificity during plant evolution. We provided a structural explanation for the two newly identified DNA binding modes and we identified a LFY form with a relaxed specificity that could have served as an intermediate between evolutionary transitions.

Les moteurs moléculaires sont des protéines capables de produire une force : elles transforment l'énergie chimique de l'hydrolyse de l'ATP en énergie mécanique. Cette thèse se focalise sur l'étude d'une famille de moteurs moléculaires, les myosines, qui se déplacent le long des filaments d'actine et assurent d'importantes fonctions cellulaires.La myosine VI est une myosine très particulière car elle est la seule à se déplacer vers l'extrémité négative des filaments d'actine. Elle est produite dans la cellule sous forme auto-inhibée, inactive. Dans la cellule, son activité est également régulée par plusieurs protéines interagissant avec la queue C-terminale de la myosine VI. Ces protéines, présentes à des endroits précis de la cellule, recrutent la myosine VI et dictent l'action qu'elle doit effectuer. Des analyses de SAXS, de dispersion de la lumière, de microscopie, d'interaction et de mutagénèse ont permis de mieux comprendre le mécanisme régulant l'adoption de l'état auto-inhibé, ainsi que son activation par le calcium. L'interaction avec différents partenaires a été caractérisée. GIPC1, le partenaire le plus étudié, promeut de façon indirecte la dimérisation et l'activation de la myosine VI.Pendant ma thèse, j'ai également été impliqué dans deux autres projets qui s'inscrivent dans la logique du projet de thèse et qui ont mené à la publication de quatre articles. Deux chapitres, plus brefs, sont donc dédiés à ces projets. Le deuxième chapitre porte sur la régulation de l'activité de la myosine VII par ses partenaires cellulaires. Finalement, le troisième chapitre est dédié à l'étude de la modification allostérique de l'activité des myosines par des petites molécules. / Molecular motors are essential agents of force production in the cells: they convert the chemical energy released by the hydrolysis of ATP into mechanical work. This thesis focuses on myosins, a family of molecular motors responsible for actin-based motility. Myosin VI is unique among all of the myosin superfamily members in that it moves in the opposite direction of all other known myosins. Previous work revealed myosin VI tail ability to fold back, constituting a potential auto-inhibited state that prevents motor activity. Several myosin VI partners, binding to the C-terminal tail of the myosin, have been identified and shown to recruit the motor for different functions. In the first chapter of this thesis, the mechanism allowing the regulation of myosin VI activity has been studied using biochemical and biophysical analysis (SAXS, light scattering, microscopy, binding assays and mutagenesis). GIPC1, the most studied myosin VI partners, promotes myosin dimerization and activation. During my PhD, I have been also involved in two other projects, in line with my thesis project, that have led to the publication of four articles. Two shorter chapters are therefore devoted to these projects. The second chapter of my thesis explores myosin VII activity regulation by its cellular partners. Finally, the third chapter is devoted to the allosteric regulation of myosins activity by small molecules.

LEAFY (LFY) est un facteur de transcription central pour le développement des plantes, en particulier pour la floraison chez les angiospermes. LFY est très conservée, même chez les espèces ne portant pas de fleurs. On dispose de nombreuses données génétiques sur LFY et son réseau de régulation chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, mais les mécanismes moléculaires impliqués dans son fonctionnement ne sont pas entièrement élucidés. LFY possède deux domaines conservés : un domaine de liaison à l'ADN et un domaine de fonction inconnue en position N-terminal. L'objectif a été de comprendre le rôle du domaine N-terminal et d'étudier l'évolution de la spécificité de liaison à l'ADN de LFY. Nous avons obtenu la structure cristallographique du domaine N-terminal de LFY et découvert qu'il s'agissait d'un domaine SAM (Sterile Alpha Motif) permettant l'oligomérisation de la protéine. Nous avons validé l'importance de cette propriété pour la fonction florale de LFY chez A. thaliana. Nous avons ensuite montré, par des analyses in vitro et in vivo en ChIP-seq que l'oligomérisation influençait la liaison à l'ADN en permettant une liaison coopérative sur plusieurs sites de liaison, en assurant la sélectivité de la protéine vis-à-vis de l'ADN et en permettant l'accès de la protéine à des régions génomiques où la conformation de la chromatine est normalement défavorable à la liaison. Cette étude intégrative a permis de mieux comprendre le fonctionnement de LFY. Des modifications dans les réseaux de régulation de l'expression des gènes sont source de nouveauté et d'évolution. LFY étant très conservée et ne faisant pas partie d'une famille multigénique, nous nous sommes demandé si sa spécificité de liaison à l'ADN avait évoluée. Nous avons montré que LFY était apparue chez les algues multicellulaires et que sa spécificité avait connue au moins deux changements majeurs au cours de l'évolution. Nous avons expliqué ces modifications au niveau moléculaire par des approches de biologie structurale et de biochimie. Nous avons identifié une espèce chez qui LFY a une spécificité relâchée et nous proposons qu'une telle forme ait pu permettre les transitions d'une spécificité à une autre.

Les protéines à bromodomaines (BCPs) sont notamment impliquées dans la régulation de la transcription de gènes et la signalisation cellulaire. Leur dérégulation conduit au développement pathologies, telles que les maladies inflammatoires, cardiovasculaires et plus particulièrement les cancers. Les BCPs sont capables de reconnaitre les lysines acétylées de protéines histones via leur module BromoDomaine(s) (BDs). Parmi les huit familles de BCPs, mon projet de thèse s’intéresse à la famille « BET ». Celle-ci, comprend quatre protéines constituées de deux BDs en tandem, formant deux sous-familles BD1 et BD2. L’architecture de la cavité centrale des BDs, qualifiée de « druggable », a permis l’émergence de ces protéines en tant que nouvelles cibles épigénétiques prometteuses. À ce jour, une vingtaine d’essais cliniques ont été initiés pour des molécules « pan-BET », inhibant l’ensemble des membres de cette famille. Cependant, l'inhibition « pan-BET » est problématique au niveau clinique puisqu’elle impacte de nombreuses voies de transcription et engendre l’apparition de cellules résistantes. Mon projet de thèse s’intègre au challenge actuel qui est de développer des inhibiteurs plus sélectifs, par exemple envers l’une des sous-familles BD1 ou BD2 ou plus idéalement envers un seul BD de la famille BET. Le développement de « sondes épigénétiques sélectives » ciblant des BDs de la famille BET, devrait permettre de décrypter leur rôle et leur mécanisme d’action dans les divers processus biologiques. L’identification de « candidat médicament » devrait aboutir à de nouvelles thérapies ciblées et de pallier les résistances liées à l’utilisation de molécules pan-BET inhibitrices. / Bromodomain-containing proteins (BCPs) are especially involved in the regulation of gene transcription and cell signalling. Their dysregulation lead to the development of pathologies, such as inflammatory, cardiovascular diseases, and more particularly cancers. BCPs involved in the recognition of acetylated lysine of the histone tails, through their BromoDomain(s) module(s) (BDs). Among the eight families of BCPs, my thesis project focuses on the “BET” family. This family comprises four proteins which are composed of a tandem of two BDs each belonging to the BD1 or the BD2 subfamily. The architecture of the central cavity of the BDs, qualified as "druggable", allows the emergence of these proteins as new promising epigenetic targets. To date, about twenty clinical trials targeting different types of cancer have been initiated for "pan-BET" molecules that target all the members of this family. However, "pan-BET" inhibition is clinically problematic because it impacts many transcriptional pathways and causes the appearance of resistant cells. My thesis project is part of the current challenge is to develop more selective inhibitors, for example towards the BET-BD1 subfamily or the BET-BD2 subfamily or ideally towards one single BD inside the BET family. The development of such "selective epigenetic probes" targeting BET family BDs should allow deciphering their role and mechanism of action in various biological processes. Identifying "drug candidates" should lead to new targeted therapies and overcome the resistances related to the use of pan-BET molecules.

L’utilisation de détergents est inévitable pour les études structurales des protéines membranaires. Dodecylphosphocholine (DPC) est un des détergents les plus utilisés pour ce type d’études employant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution. L’effet des détergents sur la structure et la dynamique des macromolécules est une problématique importante, mais peu étudiée à ce jour. Dans cette étude nous avons caractérisé la dynamique à l’échelle de la milliseconde, la liaison des substrats ainsi que des propriétés structurales de trois protéines membranaires différentes solubilisées dans des micelles de DPC. Ces protéines font partie de la famille des transporteurs mitochondriaux et nous avons choisi les séquences de la levure (ORC1, GGC1, AAC3). Nous avons détecté de la dynamique à l’échelle de la milliseconde qui est distribuée d’une manière asymétrique à travers la structure. En contradiction avec des propos de la littérature, nous montrons que cette dynamique n’est pas corrélée à la fonction, puisqu’elle n’est pas modifiée par des mutations qui inhibent le transport effectué par ces protéines quand elles sont reconstituées dans des liposomes. En plus, nous avons pu montrer que leur spécificité par rapport aux substrats, n’est pas conservée quand ces transporteurs sont reconstitués dans du DPC, mettant en question leur fonctionnalité dans ce détergent. La RMN a aussi permis de démontrer que les structures tertiaire et secondaire sont perturbées dans les micelles avec quelques hélices transmembranaires apparaissant exposées au solvant. Nous avons donc conclu que la présence du détergent a un effet fort sur les trois transporteurs mitochondriaux de notre étude et probablement d’autres protéines similaires, en les rendant très flexible. Nos résultats indiquent un probable effet général de ce détergent sur les protéines membranaires, comme nous le discutons dans une analyse détaillée de quelques études de protéines membranaires décrites dans la littérature. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons adressé une question fondamentale de la dynamique des protéines: comment se comportent les protéines dans des cristaux ? Nous avons étudié la dynamique de l’ubiquitine cristalline à l’échelle de la milliseconde afin de comprendre l’influence de la maille cristalline sur ce type de mouvement. Pour ce faire, nous avons employé la RMN à l’état solide et des simulations de dynamique moléculaire de la protéine dans différents réseaux cristallins distincts. Il est intéressant à noter que dans ces cristaux on détecte toujours des processus locaux d’échange dynamique sur une échelle de temps de la milliseconde. Cependant, en comparant les résultats obtenus avec différentes formes cristallines, nous constatons que les paramètres thermodynamiques des différents états en échange et les vitesses d’interconversion entre ces dernières sont significativement modifiés par les contacts cristallins. De plus, nous avons détecté des mouvements globaux de type «rocking» des ces molécules à l’état cristallin qui surviennent également à l’échelle de la milliseconde. Ceci suggère que les mouvements globaux et locaux sont corrélés. Cette observation ouvre la discussion de l’importance de ce type de mouvements pour la qualité et l’interprétation des données des expériences de diffraction des rayons-X. / The use of detergents is often unavoidable in the structural studies of membrane proteins. Dodecylphosphocholine (DPC) is one of the most commonly used detergents for such studies in solution state NMR spectroscopy. The effect of detergent on structure and dynamics remains an important and poorly understood question. In this study we have investigated millisecond dynamics, substrate binding and structural features of three different yeast proteins from mitochondrial carrier family (GGC1, ORC1 and AAC3) in DPC micelles. We have detected millisecond dynamics, which are asymmetrically distributed across the structure. Contrary to previous claims, we show that these dynamics are unrelated to function, as they are not affected by the substitutions which abolish mitochondrial carrier transport in proteoliposomes. Furthermore, we could show that the very well-defined substrate specificity of these proteins in membranes is abolished when they are reconstituted in DPC, questioning their functionality. Structural investigations have revealed that both tertiary and secondary structures of these carriers are perturbed in DPC micelles, with some TM helices showing substantial solvent exposure. We have concluded from these observations that DPC detergent strongly perturbs these, and likely other mitochondrial carriers by rendering them very flexible. Our findings point to a possibly general effect of this detergent on membrane proteins, as we discuss with examples of previously studied membrane proteins. In the second part we have addressed a fundamental question of protein dynamics: how do proteins move inside crystals? We have investigated ms dynamics in a crystalline ubiquitin to gain the insight on the impact of the crystalline lattice on such motions, using solid-state NMR and ms long MD simulations of explicit crystal arrangements. Interestingly a local dynamic exchange process on a ms time scale is still present in crystals. However, by comparing different crystal forms we establish that the thermodynamics of the exchanging states and their interconversion rate constants are significantly altered by the crystal contacts. Furthermore, we detect overall "rocking" motion of molecules in the crystal, occurring on a tens-of-ms time scale, and provide evidence that overall and local motion are coupled. We discuss the implications of ms dynamics on the data quality in X-ray diffraction experiments.