Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-08-02T18:30:16Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Thiago Véras Cavalcanti Firmino.pdf: 1092318 bytes, checksum: 50dae88dbca7c74c9478dfe47efd7484 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-03T21:04:05Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Thiago Véras Cavalcanti Firmino.pdf: 1092318 bytes, checksum: 50dae88dbca7c74c9478dfe47efd7484 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:04:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Thiago Véras Cavalcanti Firmino.pdf: 1092318 bytes, checksum: 50dae88dbca7c74c9478dfe47efd7484 (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / FACEPE / O objetivo deste trabalho foi imobilizar covalentemente concanavalina-A (Con-A) à nanopartículas magnéticas do tipo magnetita-PANI para purificação da β-galactosidase a partir do fungo Penicillium islandicum URM5073. As condições de imobilização da Con-A e purificação da β-galactosidase, foram aperfeiçoadas através de planejamento fatorial fracionado 2⁶⁻², cuja análise foi realizada em função de duas respostas: quantidade de lectina imobilizada às nanopartículas e β-galactosidase retida na lectina imobilizada, com variáveis independentes a concentração de proteínas, o pH de solução, quantidade de suporte (mg), tempo de reação com o glutaraldeído, concentração do glutaraldeído e tempo de imobilização. A análise estatística mostrou os efeitos estimados das variáveis sobre o processo de imobilização da concanavalina-A em resposta a quantidade de proteína ligada ao suporte. De acordo com esta análise duas variáveis influenciaram significativamente a imobilização de concanavalina-A em suporte magnético, concentração de proteína e pH da reação. A concentração de proteína mostrou efeito positivo significativo, sugerindo que um aumento no valor deste parâmetro aumenta a imobilização de concanavalina-A às nanopartículas. No entanto, pH mostrou efeito negativo significativo, sugerindo que uma redução no valor do parâmetro aumenta a quantidade de proteína fixada ao suporte. A análise de amostras a partir da purificação de β-galactosidase do extrato bruto de Penicillium islandicum, a enzima comercial de Aspergillus oryzae e a β-galactosidase comercial contaminada com caseína e albumina foi realizada usando os dados obtidos a partir da dosagem de proteínas pelo método de dosagem de Lowry e realizada uma eletroforese SDS-PAGE. Esta metodologia indicou que a enzima purificada revelou uma redução de bandas de proteínas, sendo a β-galactosidase indicada com uma massa molecular aproximadamente de 100 kDa. Uma patente será depositada com base nos resultados obtidos da imobilização de Con-A em nanopartículas magnéticas e sua aplicação na purificação de β-galactosidase. / The aim of work was to immobilize concanavalin-A (Con-A) covalently to magnetic nanoparticles of magnetite-PANI type for purification of β-galactosidase produced by the fungus Penicillium islandicum URM5073. The conditions of Com A immobilization and β-galactosidase purification, were optimized by factorial design 2⁶⁻², whose analysis was performed according to two dependent variables: amount of lectin immobilized on nanoparticles and β-galactosidase retained in lectin. The Pareto chart analysis showed the estimated effects of variables on the process of Con-A immobilization in response to amount of protein bound to support. According this analysis, two significantly variables influence the immobilization of concanavalin-A on magnetic nanoparticle, the protein concetration and pH reaction. The protein concentration showed a significant positive effect, suggesting that an increase in the value of this parameter increases the immobilization of concanavalin-A to the nanoparticles. However, pH showed significant adverse effects, suggesting that a reduction in the value of the parameter increases the amount of protein attached to the support. The analysis of samples from the purification of β-galactosidase crude extract fermented by Penicillium islandicum, commercial Aspergillus oryzae enzyme and β-galactosidase contaminated commercial casein and albumin was performed using the data obtained from the protein content Lowry dosage method and used for SDS-PAGE electrophoresis. This method indicated that the purified enzyme showed a reduction of protein bands, with the β-galactosidase indicated with a molecular mass of approximately 100 kDa. A patent shall be paid based on the results of Con-A immobilized on magnetic nanoparticles and its application in β-galactosidase purification.

Recientemente se ha usado la técnica de fotólisis de destello láser para el estudio de las interacciones fármaco/proteína, demostrando que el estado excitado triplete es muy sensible al medio que le rodea y que, por tanto, puede ser utilizado como sonda para estudiar la unión fármaco-proteína. Teniendo esto en cuenta, se propuso profundizar en el conocimiento de las interacciones fármaco-proteína mediante ésta técnica, extendiendo el estudio a albúminas séricas de otras especies también usadas en experimentos con fármacos, así como a otras proteínas transportadoras como puede ser AAG. En primer lugar, se llevo a cabo la síntesis del glucurónido del FBP (FBPGluc) y su posterior caracterización fotofísica para luego realizar un estudio de interacción de FBP, FBPMe y FBPGluc con albúminas de diversas especies con el fin de detectar diferencias respecto a ASH. Esto se llevo a cabo con ambos enantiómeros para detectar una posible estereodiferenciación en su interacción con la proteína. Analizando las curvas de desactivación obtenidas deducimos que, efectivamente, existen diferencias en la unión del fármaco y sus derivados a las ASs respecto a ASH, tanto en el número de sitios de unión, como en los valores de tiempo de vida de triplete del sustrato dentro de la proteína. Además, se encontró estereodiferenciación en algunos de los sistemas esstudiados. A continuación se procedió a estudiar la actividad glucuronidasa de las diferentes albúminas sobre FBPGluc, aprovechando las diferencias en los tiempos de vida de triplete de éste respecto a FBP. Observamos como el proceso de hidrólisis tiene lugar a mayor velocidad dentro de la proteína y a temperatura fisiológica. Como otra aplicación interesante de ésta metodología se procedió al estudio de interacción de cada sustrato con ASH y AAG presentes simultáneamente. / Bueno Alejo, CJ. (2009). Interacciones fármaco-proteína en estados excitados [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6565

El estudio de la unión de un ligando con un receptor es de particular relevancia en el desarrollo de fármacos, donde se persigue encontrar un ligando con elevada afinidad hacia un determinado receptor. El ligando se une al receptor en el denominado “sitio de unión”. El proceso de unión puede dividirse en 2 etapas: i) difusión del ligando a través del receptor hasta el sitio de unión, y ii) la selección de aquella conformación (bioactiva) que cumple con las características geométricas y fisicoquímicas que le permiten unirse al receptor. En la presente memoria se ha estudiado la difusión molecular del ligando a través de la matriz proteica hasta el sitio de unión, así como la selección de la conformación bioactiva implicada en el reconocimiento ligando-receptor. En la primera parte se ha desarrollado una metodología Multinivel que proporciona un método eficiente para la exploración conformacional de moléculas tipo fármaco, permitiendo identificar estructuras estables y su población relativa. Hace uso de una exploración conformacional a nivel RM1 y posterior refinamiento a nivel más robusto de teoría: B3LYP y MP2. Se consigue así un buen balance costo/calidad para la estimación precisa de la población relativa de los confórmeros relevantes. Para compuestos en solución se utiliza la metodología de solvente continuo MST. Esto hace necesario derivar una nueva versión parametrizada del modelo MST para el hamiltoniano RM1. El modelo parametrizado ha probado proveer estimaciones precisas de la energía de solvatación para compuestos neutros. El tratamiento de compuestos iónicos es más delicado, dado que existe una dependencia fuerte entre el factor de escalado utilizado para modular la frontera electrostática entre el solvente y el soluto y el grupo ionizable. El uso de un factor de escalado adaptado al entorno químico provee una estrategia computacional viable para obtener estimaciones precisas de la energía de solvatación para compuestos cargados. Los resultados obtenidos para la histamina neutra son alentadores considerando la complejidad conformacional y tautomérica que presenta y coinciden con la mayoría de los estudios previos. En la segunda parte, se ha estudiado el impacto de las distorsiones de la planaridad del grupo hemo en la afinidad por O(2). Se halló que éstas pueden modular la afinidad de una globina por ligandos bimoleculares. Las distorsiones resultan en una disminución de la afinidad por O(2).con excepción del modo breathing, que implica la compresión-expansión del grupo hemo en el plano. El “breathing” positivo del hemo de la protoglobina “Methanosarcina Acetivorans” (MaPgb) podría contribuir a la alta afinidad por O(2) reportada dado que no presenta efecto distal, habitualmente responsable de la alta afinidad hallada en otras globinas. Por otra parte, la accesibilidad del ligando a esta proteína se logra a través de un sistema de túneles novedoso definido entre las hélices G y B (túnel 1) y B y E (túnel 2). El túnel 2, a diferencia del 1, está siempre abierto. Phe(145)G8 se halla en 2 conformaciones: abierta y cerrada, que regula la migración de ligandos a través del 1. La dimerización y la presencia de ligando unido al hemo facilitan la apertura del 1. La presencia del ligando unido al hemo es detectada por Phe(93)E11, y transmitida a Phe(145)G8 a través del cambio de las hélices B y E. Esto proporciona una explicación a los estudios cinéticos de Cristiano Viappiani. Cabe pensar que las conformaciones de ligación lenta y rápida reflejan la apertura del túnel 1 cuando se ha fijado un primer ligando en el grupo hemo. MaPgb podría participar en un proceso bimolecular, donde la entrada de un ligando facilitara de un segundo. / The study of ligand-receptor interaction is relevant to drug design. In this work we have studied: ligand diffusion through the receptor to the active site and selection of the bioactive conformation implied in ligand-receptor recognition In the first part we have developed a Multilevel methodology to efficiently explore the conformational space of drug-like molecules. It is based on a conformational search at a RM1 level and a “a posteriori” refinement with B3LYP and MP2. For molecules in solution a parametrization of the MST solvation model for RM1 was needed. Precise free energies of solvation have been obtained with the new set of parameters for neutral compounds. For ionic compounds there is a strong dependence with the scale factor used to modulate the electrostatic frontier between solvent and solute. The use of environment-adapted scale factor provides a suitable strategy. The results obtained for neutral histamine are encouraging considering its conformational and tautomeric complexity and agree with most of the previous studies. In the second part, we have studied the impact of heme distortions on its O2 affinity. Distortions reduce affinity with the exception of the breathing mode (compressionexpansion) Positive breathing found in “Methanosarcina Acetivorans” protoglobin (MaPgb) could contribute to the reported high O(2) affinity since there is no distal effect, generally responsible of high affinity in globins. A new tunnel system defined between G and B helices (tunnel 1) and B and E helices (tunnel 2) allows ligand access. Contrary to tunnel 1, tunnel 2 is always open. Phe(145)G8 is found in open and closed conformations that regulate migration through tunnel 1. Dimerization and the presence of a heme-bound ligand facilitate opening of tunnel 1. The bound ligand is detected by Phe(93)E11 and transferred to Phe(145)G8 through changes in helices B and E. This could shed light on the kinetic studies by Cristiano Viappiani. Slow and fast conformations could reflect the opening of tunnel 1 when another ligand is bound. MaPgb could be involved in a bimolecular process where the entrance of a ligand would facilitate binding of a second one.

La Espectrometría de Masas mediante ionización en Plasma Acoplado Inductivamente (ICP-MS) es una técnica de análisis elemental que permite cuantificar la mayor parte de los elementos de la tabla periódica de forma rápida y a niveles de ultratraza. A lo largo de la última década, y debido a sus características analíticas, el ICP-MS se ha utilizado como sistema de detección en inmunoensayos para la determinación de bioméculas. A pesar de los avances que se han producido, este tipo de estrategias todavía no están exentas de inconvenientes. Entre los retos que aún están por resolver, se encuentran: (i) desarrollo de metodologías para la determinación de haptenos (biomoléculas de bajo peso molecular < 10 kDa), (ii) falta de criterio para seleccionar el tipo de inmunoensayo más adecuado para una aplicación bioanalítica dada, sobre todo cuando se trabaja con haptenos; y (iii) escaso aprovechamiento del potencial del ICP-MS (sensibilidad, límites de detección, capacidad de análisis multielemental, etc.). En la presente Tesis Doctoral se han desarrollado nuevos métodos de análisis de biomoléculas con detección mediante ICP-MS tratando de solucionar los inconvenientes citados con anterioridad. Los métodos se han aplicado al análisis de tóxinas en alimentos y de biomarcadores oncológicos en fluidos biológicos (suero). En primer lugar, debido a la gran preocupación existente por la seguridad alimentaria y el efecto de la alimentación sobre la salud humana, se ha desarrollado una nueva metodología para la cuantificación de la aflatoxina M1 (hapteno) en muestras de leche que cumpliera con los niveles de seguridad requeridos por las actuales políticas internacionales. Por otro lado, se han comparado diferentes formatos de inmunoensayos competitivos para la determinación de esta misma aflatoxina en leche. Además se ha estudiado el efecto de la naturaleza química y del tamaño de las nanopartículas (es decir, Ag / Au, 80 nm / 40 nm) empleadas en los inmunoensayos sobre los parámetros analíticos. Finalmente, se presenta un nuevo enfoque con el objeto de aumentar la sensibilidad de los inmunoensayos homogéneos con detección mediante ICP-MS, con la introducción de un alto número de etiquetas por anticuerpo monoclonal mediante el empleo de polímeros como portadores de múltiples iones lantánidos. Esta metodología se ha aplicado a la determinación simultánea de 4 biomarcadores de cáncer (CEA, sErbB2, CA 15.3 y CA 125) en suero humano.