L’utilisation de techniques de microscopie optique de plus en plus performantes a permis des avancées considérables en neurobiologie. Néanmoins, la population de neurones mise en jeu lors de la formation de la mémoire, ainsi que sa dynamique restent à ce jour très peu connues. L’objectif de la thèse est de développer puis d’utiliser deux types de microscopies originales couplées à des sondes fluorescentes de dernière génération (sondes calciques G-CaMP6f et sonde voltage ArcLight) pour l’étude in vivo des réseaux neuronaux impliqués dans la mémorisation chez la drosophile. Le choix du modèle Drosophila melanogaster pour cette étude neurobiologique est justifié par plusieurs atouts uniques : un cerveau peu volumineux, des capacités d’apprentissage remarquables, la possibilité d’analyser un réseau neuronal dans sa globalité avec une résolution cellulaire et la disponibilité d’outils génétiques très perfectionnés pour son étude. Le premier type de microscopie conçu est celui dite à illumination structurée de type HiLo permettant d'obtenir une coupe optique en profondeur. Nous avons alors étudié le rôle de divers récepteurs, tels que les récepteurs dopaminergiques et gabaergiques dans la transmission de l'information punitive jusqu'aux neurones des corps pédonculés. Nous avons également mis en évidence une non-homogénéité spatiale des neurones de type α/β des corps pédonculés en termes d’excitation et d’inhibition en réponse à une stimulation punitive pour une profondeur d’analyse d'environ 10 à 20 µm. Cette profondeur limite étant imposée par les aberrations, nous avons alors implémenté une boucle d’optique adaptative dans notre microscope. Cela a permis de réaliser des analyses morphologiques jusqu’à 50 µm de profondeur. Le second type de microscopie développé est la microscopie multiconfocale de type « spinning disk » dans le but d’imager l’ensemble des corps cellulaires des neurones des corps pédonculés. Le développement de ce projet n'est pas achevé, ce qui n’a pas encore permis de répondre à des questions biologiques d’intérêt. / Cellular and neural network dynamics involved in memory formation remain poorly known despite the progress brought by advanced optical microscopies to neurobiology. The use of Drosophila melanogaster as a model organism constitute one of the most promising approaches due to its unique features: a small brain size, outstanding learning capabilities, very powerful genetic tools and the possibility to analyze a whole neural network with a cellular resolution. To this aim, we implemented two types of optical fluorescence microscopes coupled to cutting-edge fluorescent biosensors, calcic G-CaMP6f and voltage ArcLight probes. We used HiLo structured illumination, a technique able to provide axial optical sectioning, deep in the brain, to study the role of dopaminergic and gabaergic molecular receptors in the transmission of aversive stimulus to mushroom bodies neurons. We also evidenced a non-uniform response of type α/β mushroom bodies neurons under electrical stimulation at 10 to 20 µm depth of analysis. To penetrate deeper in the brain, we added an adaptive optics feedback loop into our microscope in order to overcome aberrations issues. We were then able to rebuild optical sections down to 50 µm depth. The second type of microscopy we developed is a multiconfocal microscope using spinning disk. The aim was to image all the mushroom bodies neurons, at the level of their cell bodies, with a cellular resolution. Since this project is at its beginning, it did not allow us to answer to advanced biological questions yet.

La disponibilité et la persistance à l'échelle locale des métaux lourds pourraient être critiques notamment pour l'usage futur des zones agricoles ou urbaines, au droit desquelles de nombreux sites industriels se sont installés dans le passé. La gestion de ces situations environnementales complexes nécessitent le développement de nouvelles méthodes d'analyse peu invasives (capteurs environnementaux), comme celles utilisant des biosenseurs bactériens, afin d'identifier et d'évaluer directement l'effet biologique et la disponibilité chimique des métaux. Ainsi dans ce travail de thèse, nous avons cherché à identifier, à l'aide d'outils mathématiques de l'algèbre multilinéaire, les réponses de senseurs bactériens fluorescents dans des conditions environnementales variées, qu'il s'agisse d'un stress engendré par la présence à forte dose d'un métal ou d'une carence nutritive engendrée par son absence. Cette identification est fondée sur l'analyse quantitative à l'échelle d'une population bactérienne de signaux multidimensionnels. Elle repose en particulier sur (i) l'acquisition de données spectrales (fluorescence) multi-variées sur des suspensions de biosenseurs multicolores interagissant avec des métaux et sur (ii) le développement d'algorithme de décomposition tensoriels. Les méthodes proposées, développées et utilisées dans ce travail s'efforcent d'identifier « sans a priori» a minima, la réponse fonctionnelle de biosenseurs sous différentes conditions environnementales, par des méthodes de décomposition de tenseurs sous contraintes des signaux spectraux observables. Elles tirent parti de la variabilité des réponses systémiques et permettent de déterminer les sources élémentaires identifiant le système et leur comportement en fonction des paramètres extérieurs. Elles sont inspirées des méthodes CP et PARALIND . L'avantage de ce type d'approche, par rapport aux approches classiques, est l'identification unique des réponses des biosenseurs sous de faibles contraintes. Le travail a consisté à développer des algorithmes efficaces de séparations de sources pour les signaux fluorescents émis par des senseurs bactériens, garantissant la séparabilité des sources fluorescentes et l'unicité de la décomposition. Le point original de la thèse est la prise en compte des contraintes liées à la physique des phénomènes analysés telles que (i) la parcimonie des coefficients de mélange ou la positivité des signaux source, afin de réduire au maximum l'usage d'a priori ou (ii) la détermination non empirique de l'ordre de la décomposition (nombre de sources). Cette posture a permis aussi d'améliorer l'identification en optimisant les mesures physiques par l'utilisation de spectres synchrones ou en apportant une diversité suffisante aux plans d'expériences. L'usage des spectres synchrones s'est avéré déterminant à la fois pour améliorer la séparation des sources de fluorescence, mais aussi pour augmenter le rapport signal sur bruit des biosenseurs les plus faibles. Cette méthode d'analyse spectrale originale permet d'élargir fortement la gamme chromatique des biosenseurs fluorescents multicolores utilisables simultanément. Enfin, une nouvelle méthode d'estimation de la concentration de polluants métalliques présents dans un échantillon à partir de la réponse spectrale d'un mélange de biosenseurs non-spécifiques a été développée / Availability and persistence of heavy metals could be critical for future use of agricultural or urban areas, on which many industrial sites have installed in the past. The management of these complex environmental situations requiring the development of new analytical methods minimally invasive, such as bacterial biosensors, to identify and directly assess the biological effects and the chemical availability of metals. The aims of this thesis was to identify the responses of fluorescent bacterial sensors various environmental conditions, using mathematical tools of algebra multi-linear, whether stress caused by the presence of high dose of a metal or a nutrient deficiency caused by his absence. This identification is based on quantitative analysis of multidimensional signals at the bacterial population-scale. It is based in particular on (i) the acquisition of multivariate spectral data on suspensions of multicolored biosensors interacting with metals and (ii) the development of algorithms for tensor decomposition. The proposed methods, developed and used in this study attempt to identify functional response of biosensors without \textsl{a priori} by decomposition of tensor containing the spectral signals. These methods take advantage of the variability of systemic responses and allow to determine the basic sources identifying the system and their behavior to external factors. They are inspired by the CP and PARALIND methods. The advantage of this approach, compared to conventional approaches, is the unique identification of the responses of biosensors at low constraints. The work was to develop efficient algorithms for the source separation of fluorescent signals emitted by bacterial sensors, ensuring the sources separability and the uniqueness of the decomposition. The original point of this thesis is the consideration of the physical constraints of analyzed phenomena such as (i) the sparsity of mixing coefficients or positivity of sources signals in order to minimize the use of a priori or (ii) the non-empirical determination of the order of decomposition (number of sources).This posture has also improved the identification optimizing physical measurements by the use of synchronous spectra or providing sufficient diversity in design of experiments. The use of synchronous spectra proved crucial both to improve the separation of fluorescent sources, but also to increase the signal to noise ratio of the lowest biosensors. This original method of spectral analysis can greatly expand the color range of multicolored fluorescent biosensors used simultaneously. Finally, a new method of estimating the concentration of metal pollutants present in a sample from the spectral response of a mixture of non-specific biosensor was developed

La cascade d’évènements permettant la contraction de la fibre musculaire striée squelettique en réponse à l’activité électrique de sa membrane plasmique est regroupée sous le terme de couplage excitation-contraction (EC). Le couplage EC a lieu au niveau des triades, domaines nanoscopiques au niveau desquels les invaginations transversales de la membrane plasmique (tubules-T) sont en contact étroit avec deux citernes terminales adjacentes de réticulum sarcoplasmique (RS). Plus précisément, lors de l’excitation d’une fibre musculaire, un potentiel d’action se propage dans toute la surface de la membrane plasmique et en profondeur de la cellule via les tubules-T. Cette dépolarisation y est détectée par les protéines membranaires sensibles au potentiel Cav1.1 qui en retour, par couplage mécanique, déclenchent l’ouverture des canaux calciques du RS que sont les récepteurs de la ryanodine de type 1 (RYR1s). Ceci est à l’origine de l’augmentation massive de Ca2+ intracellulaire qui déclenche l’activation des myofilaments et donc la contraction. La compréhension des mécanismes de contrôle et de régulation des canaux RYR1s reste encore aujourd’hui limitée. En particulier, la mesure de l’activité physiologique de ces canaux dans la fibre musculaire intacte est toujours réalisée de manière très indirecte. Par ailleurs le rôle éventuel de variations de potentiel de la membrane du RS pendant l’activité musculaire n’a jamais été révélé. Une connaissance approfondie de ces phénomènes est pourtant essentielle à la compréhension de la fonction musculaire squelettique normale et pathologique. Dans ce contexte, l’objectif général de mon projet de thèse a été de mettre au point et utiliser des biosenseurs fluorescents localisés spécifiquement à la membrane des citernes terminales du RS de fibres musculaires différenciées – par leur fusion à une séquence d’adressage appropriée. Grâce à la combinaison des techniques d’électrophysiologie et d’imagerie de la fluorescence des biosenseurs sur fibres musculaires isolées, nous avons pu étudier l’activité du RS au cours de la fonction musculaire. Plus particulièrement, mon travail de thèse aborde deux problèmes biologiques principaux : le potentiel de membrane du RS et la signalisation calcique du RS au cours du couplage EC. Le premier objectif a visé à caractériser les changements de potentiel de la membrane du RS pendant l’activation du couplage EC. Pour cela, nous avons utilisé des biosenseurs de FRET de la famille Mermaid. Nos résultats montrent qu’il n’y a pas de changement substantiel du potentiel transmembranaire du RS pendant l’activation du couplage EC. Ces données confirment – pour la première fois en condition physiologique – que le flux de Ca2+ à travers les canaux RYR1s est équilibré par des contre-flux ioniques compensatoires qui permettent le maintien du potentiel de membrane du RS. Ceci assure la pérennité du flux de Ca2+ et contribue à l’efficacité du couplage EC. Le deuxième objectif a visé à détecter les variations de concentration en Ca2+ à proximité immédiate des canaux RYR1s. Pour cela, nous avons utilisé le biosenseur fluorescent sensible au Ca2+ GCamP6f. Le biosenseur adressé à la membrane du RS fournit un accès unique à l’activité individuelle de populations distinctes de canaux RYR1s au sein de différentes triades d’une même fibre musculaire. Au-delà de la caractérisation détaillée des propriétés des sondes GCaMP6f dans cette préparation, nos résultats montrent la stupéfiante synchronisation de l’activité de libération de Ca2+ des triades d’une même fibre musculaire au cours du couplage EC. Les résultats ouvrent des perspectives particulièrement intéressantes pour les études de situations pathologiques d’altération de l’activité des canaux RYR1s / Excitation-contraction (EC) coupling in skeletal muscle corresponds to the sequence of events through which muscle fiber contraction is triggered in response to plasma membrane electrical activity. EC coupling takes place at the triads; these are nanoscopic domains in which the transverse invaginations (t-tubules) of the surface membrane are in closed apposition with two adjacent terminal cisternae of the sarcoplasmic reticulum membrane (SR). More precisely, EC coupling starts with action potentials fired at the endplate, propagating throughout the surface membrane and in depth into the muscle fiber through the t-tubules network. When reaching the triadic region, action potentials activate the voltage-sensing protein Cav1.1. In turns, Cav1.1 directly open up the type 1 ryanodine receptor (RYR1) in the immediately adjacent SR membrane, through intermolecular conformational coupling. This triggers RYR1-mediated SR Ca2+ release which produces an increase in cytosolic Ca2+ triggering contraction. Current understanding of the mechanisms involved in the control and regulation of RYR1 channels function is still limited. One reason is related to the fact that detection of RYR1 channel activity in intact muscle fibers is only achieved with indirect methods. Also, whether SR the membrane voltage experiences changes during muscle activity has so far never been experimentally assessed. Yet, deeper knowledge of these processes is essential for our understanding of muscle function in normal and disease conditions. In this context, the general aim of my PhD project was to design and use fluorescent protein biosensors specifically localized at the SR membrane of differentiated muscle fibers, by fusing them to an appropriate targeting sequence. Thanks to a combination of single cell physiology and biophysics techniques based on electrophysiology and biosensor fluorescence detection, we were able to study the SR activity during muscle fiber function. Specifically, my PhD work focused on two major issues: SR membrane voltage and SR calcium signaling during EC coupling. The first aim of my work was to characterize SR membrane voltage changes during muscle fiber activity. For this, we used voltage sensitive FRET-biosensors of the Mermaid family. Results show that the SR trans-membrane voltage experiences no substantial change during EC coupling. This provides the first experimental evidence, in physiological conditions, for the existence of ion counter-fluxes that balance the charge deficit associated with RYR1-mediated SR Ca2+ release. Indeed, this process is essential for maintaining the SR Ca2+ flux upon RYR1 channels opening and thus critically important for EC coupling efficiency. The second objective of my work aimed at detecting the changes in Ca2+ concentration occurring in the immediate vicinity of the RYR1 Ca2+ release channels during muscle fiber activation. For this, we took advantage of one member of the recent generation of genetically encoded Ca2+ biosensor: GCaMP6f. The SR-targeted biosensor provides a unique access to the individual activity of RYR1 channels populations within distinct triads of a same muscle fiber. Beyond allowing a detailed characterization of the biosensor properties in this preparation, results highlight the remarkable uniformity of SR Ca2+ release activation from one triad to another, during EC coupling. These results open up stimulating perspectives for the investigation of disease conditions associated with defective behavior of RYR1 channels.

La fonction de reproduction est sous le contrôle de la neurohormone hypothalamique GnRH qui régule la synthèse et la libération des gonadotropines hypophysaires. La GnRH agit par l’intermédiaire d’un récepteur couplé aux protéines G exprimé à la surface des cellules gonadotropes, le récepteur de la GnRH (RGnRH). Ce récepteur, chez les mammifères, a la particularité d’être dépourvu de queue C terminale ce qui le rend insensible aux systèmes classiques de désensibilisation. Ainsi, les mécanismes qui régulent l’efficacité et la spécificité de sa signalisation demeurent mal connus. Nous avons recherché des partenaires d’interaction du RGnRH, jusqu’alors inconnus, avec l’idée que ces protéines en interagissant avec les domaines intracellulaires du récepteur influenceraient son couplage aux voies de signalisation. Nos travaux ont permis d’identifier le premier partenaire d’interaction du RGnRH : la protéine SET. Par des expériences de « GST pull down », nous avons montré que SET interagit directement avec le RGnRH via le premier domaine intracellulaire du récepteur. Cette interaction implique des séquences riches en acides aminés basiques sur le récepteur et les domaines N- et C-terminaux de SET. Nous avons également montré, par co-immunoprécipitation, que le RGnRH dans sa conformation native interagit avec la protéine SET dans les cellules gonadotropes alphaT3-1 et, par immunocytochimie, que les deux protéines colocalisent à la membrane plasmique. En développant au laboratoire des outils biosenseurs permettant de mesurer avec une grande sensibilité et en temps réel les variations intracellulaires de calcium et d’AMPc, nous avons mis en évidence que le RGnRH se couple non seulement à la voie calcique mais aussi à la voie AMPc dans la lignée alphaT3-1, apportant pour l’AMPc la première démonstration d’un tel couplage. En utilisant différentes stratégies expérimentales visant à diminuer ou au contraire favoriser l’interaction du récepteur avec SET (ARN antisens, peptide correspondant à la première boucle intracellulaire du récepteur, surexpression de SET), nous avons montré que SET induit une réorientation de la signalisation du RGnRH de la voie calcique vers la voie AMPc. Nos résultats concernant l’activité du promoteur du gène du Rgnrh nous conduisent à postuler que SET pourrait favoriser l’induction par la GnRH de gènes régulés via la voie AMPc et notamment celui codant le RGnRH. Nos travaux mettent également en évidence que la GnRH régule non seulement l’expression de la protéine SET dans les cellules gonadotropes mais aussi son degré de phosphorylation favorisant ainsi sa relocalisation dans le cytoplasme des cellules alphaT3-1. Ceci suggère que la GnRH exerce une boucle de régulation permettant d’amplifier l’action de SET sur la signalisation de son propre récepteur. Enfin, nous avons mis en évidence que l’expression de SET est fortement augmentée dans l’hypophyse au moment du prœstrus chez le rat, apportant ainsi la première démonstration d’une variation de SET dans un contexte physiologique. Étant donné que le couplage du RGnRH à la voie de signalisation AMPc est augmenté au moment du prœstrus, nos résultats suggèrent que SET pourrait jouer un rôle important in vivo en favorisant ce couplage à ce stade particulier du cycle œstrien. / Reproductive function is under the control of the hypothalamic neurohormone GnRH, which regulates the synthesis and the release of pituitary gonadotropins. GnRH acts on a G-protein coupled receptor expressed at the surface of pituitary gonadotrope cells, the GnRH receptor (GnRHR). This receptor, in mammals, is unique because it is devoided of the C terminal tail, which makes it insensitive to classical desensitization processes. Therefore, the mechanisms that regulate the efficacy and the specificity of its signaling are still poorly known. We searched for interacting partners of GnRHR with the idea that these proteins by interacting with the intracellular domains of the receptor could influence receptor coupling to its signaling pathways. Our work identified the first interacting partner of GnRHR: the protein SET. By GST pull down assays, we showed that SET interacts directly with GnRHR through the first intracellular loop of the receptor. This interaction involves sequences enriched in basic amino acids in the receptor and both N- and C terminal domains of SET. We also showed, by co-immunoprecipitation, that GnRHR in its native conformation interacts with the endogenous SET protein in gonadotrope alphaT3-1 cells and, by immunocytochemistry that the two proteins colocalize at the plasma membrane. By developing in the laboratory biosensors tools that allow to measure with high sensitivity and in real-time intracellular variations in calcium and cAMP concentrations, we demonstrated that GnRHR couples not only to the calcium pathway but also to the cAMP pathway in alphaT3-1 cell line, providing for cAMP the first demonstration of such coupling. Using several experimental strategies to reduce or increase receptor interaction with SET (small interfering RNA, peptide corresponding to the first intracellular loop of the receptor, overexpression of SET), we have shown that SET induces a switch of GnRHR signaling from calcium to cAMP pathway. Our results concerning the activity of the Gnrhr gene promoter led us to postulate that SET could favor the induction by GnRH of genes regulated through the cAMP pathway, notably those encoding the GnRHR. Our study also showed that GnRH regulates not only SET protein expression in gonadotropes, but also its phosphorylation level leading to its relocation in the cytoplasm of alphaT3-1 cells. This suggests that GnRH induces a regulatory loop to amplify SET action on signaling of its own receptor. Finally, we demonstrated that SET expression is markedly increased in the pituitary gland at prœstrus in female rats, providing the first demonstration of a variation of SET expression in a physiological context. Given that GnRHR coupling to the cAMP pathway is increased at prœstrus, our results suggest that SET may play an important role in vivo by promoting such coupling at this particular stage of the estrus cycle.

La disponibilité et la persistance à l'échelle locale des métaux lourds pourraient être critiques notamment pour l'usage futur des zones agricoles ou urbaines, au droit desquelles de nombreux sites industriels se sont installés dans le passé. La gestion de ces situations environnementales complexes nécessitent le développement de nouvelles méthodes d'analyse peu invasives (capteurs environnementaux), comme celles utilisant des biosenseurs bactériens, afin d'identifier et d'évaluer directement l'effet biologique et la disponibilité chimique des métaux. Ainsi dans ce travail de thèse, nous avons cherché à identifier, à l'aide d'outils mathématiques de l'algèbre multi-linéaire, les réponses de senseurs bactériens fluorescents dans des conditions environnementales variées, qu'il s'agisse d'un stress engendré par la présence à forte dose d'un métal ou d'une carence nutritive engendrée par son absence. Cette identification est fondée sur l'analyse quantitative à l'échelle d'une population bactérienne de signaux multidimensionnels. Elle repose en particulier sur (i) l'acquisition de données spectrales (fluorescence) multivariées sur des suspensions de biosenseurs multicolores interagissant avec des métaux et sur (ii) le développement d'algorithme de décomposition tensoriels. Les méthodes proposées, développées et utilisées dans ce travail s'efforcent d'identifier " sans \textsl{a priori} " (\textsl{a minima}), la réponse fonctionnelle de biosenseurs sous différentes conditions environnementales, par des méthodes de décomposition de tenseurs sous \hyphenation{con-train-tes} des signaux spectraux observables. Elles tirent parti de la variabilité des réponses systémiques et permettent de déterminer les " sources " élémentaires identifiant le système et leur comportement en fonction des paramètres extérieurs. Elles sont inspirées des méthodes CP et PARALIND . L'avantage de ce type d'approche, par rapport aux approches classiques, est l'identification unique des réponses des biosenseurs sous de faibles contraintes. Le travail a consisté à développer des algorithmes efficaces de séparations de sources pour les signaux fluorescents émis par des senseurs bactériens, garantissant la séparabilité des sources fluorescentes et l'unicité de la décomposition. Le point original de la thèse est la prise en compte des contraintes liées à la physique des phénomènes analysés telles que (i) la parcimonie des coefficients de mélange ou la positivité des signaux "source", afin de réduire au maximum l'usage d'a priori ou (ii) la détermination non empirique de l'ordre de la décomposition (nombre de sources). Cette posture a permis aussi d'améliorer l'identification en optimisant les mesures physiques par l'utilisation de spectres synchrones ou en apportant une diversité suffisante aux plans d'expériences. L'usage des spectres synchrones s'est avéré déterminant à la fois pour améliorer la séparation des sources de fluorescence, mais aussi pour augmenter le rapport signal sur bruit des biosenseurs les plus faibles. Cette méthode d'analyse spectrale originale permet d'élargir fortement la gamme chromatique des biosenseurs fluorescents multicolores utilisables simultanément. Enfin, une nouvelle méthode d'estimation de la concentration de polluants métalliques présents dans un échantillon à partir de la réponse spectrale d'un mélange de biosenseurs non-spécifiques a été développée.