O futuro das empresas de base tecnológica depende essencialmenteda maximização do seu desempenho nas relações que elas estabeleçam com seus mercados, e do equilíbrio entre as suas competências tecnológicas e mercadológicas. Neste contexto, o "braço" de mercado das empresas é constituído pelo marketing, que atua como função maximizadora. Na indústria brasileira de biotecnologia, além de incipiente, ele é desconhecido, constituindo-se num verdadeiro calcanhar-de-Aquiles do acoplamento entre oferta e demanda. Este trabalho retrata, pela primeira vez, o perfil das atividades da indústria brasileira de biotecnologia, centrado nas relações com o mercado e busca avaliar o estágio atual da relação existente entre as competências tecnológicas e as mercadológicas das empresas. Tem por objetivos propiciar informações essenciais e realizar um diagnóstico inicial sobre o tema, para que os personagens envolvidos possam tomar consciência de seus pontos fortes e fracos e, em decorrência, assumir posturas e elaborar planos para um reposicionamento e o desenvolvimento de competências específicas em suas relações com o mercado. A partir de estudo exploratório qualitativo, seguido de estudo descritivo com uma amostra de 54 empresas e dados do primeiro semestre de 1996, é feita a descrição das características gerais relativas à gestão e à tecnologia das empresas, sendo dada atenção especial às atividades de marketing. São analisadas as relações entre as competências técnicas e mercadológicas das empresas, apresentadas as decorrentes implicações, formuladas recomendações à indústria e sugeridas questões para futuras pesquisas. As organizações estudadas atuam essencialmente no mercado industrial e buisinessto- business, mostrando-se como technology push e praticando muito mais uma filosofia de gestão "produtos-orientada" do que "mercado orientada". Exercem somente em parte, as atividades essenciais da função marketing. A relação mercado-tecnologia mostra a supremacia da competência tecnológica sobre a mercadológica, indicando que, para ganhar maior competitividade, a maioria das empresas deve rever seu atual posicionamento, planejar e promover significativo desenvolvimento de competências mercadológicas específicas. / The future of the businesses of technological basis depends essentially on the maximization of its performance concerning the relationships that they establish with its markets, as well as the equilibriumamong its technological and commercialcompetences. In this context, the marketing "arm" of the companies is constituted by the marketing, wich acts as a maximizing function. In addition to being incipient, the the marketing of the Brazilian biotechnological industries are virtually unknown, becoming a real "Achilles Heel" ofthe coupling between supply and demando This paper conveys, for the first time, the profile of the marketing activities of the Brazilian biotechnological industry and aims at evaluating the present stage of the relationship between the technological and commercial competences of the companies involved. It has, as its objectives, to provide essential informatin and develop an initial diagnosis on the theme, so that the organizations involved may realize their strenghs and weaknesses and, as a consequence, take a strand point and elaborate plans for a repositioning and development of specificcompetences in their relationship to market. From the qualitative exploratory study, followed by a descriptive study with a samploing of 54 companies comprised from data from the first semester of 1996, a description of the gemal characteristics is made, concerning the management and technology ofthe companies. Special attention is givenn to the activities ofthe composition of marketing, to the informatin system, to the activities of segmentation, to the positioning as well as planning. The relatioship between the technical and commercial competences of companies ara analysed, the deriving implications are presented, the recommendations to industry are formulated and the issues for further research are suggested. The organizations studied act essentially in the industrial market and business-tobusiness segmnent, showing itself as technology push and practicing much more a philosophy product-oriented management than a market-oriented one. They perform, in part, the essential marketing functions. The relatioship of market and technology shows the supremacy of tecnhological competence over commercial side, indicating tOOt,in order to become more competitive, the majority of the companies should review ther present positioning and plan and promote meaningful development of specific commercial competences.

O ferro é elemento essencial para quase todos os organismos, participando de reações importantes no metabolismo das plantas, incluindo a fotossíntese. A homeostase desse metal não é completamente entendida em organismos vegetais, sendo que tanto o excesso quanto a deficiência são deletérios. O arroz (Oryza sativa L. ssp. indica) é normalmente cultivado em terrenos irrigados, o que pode levar ao excesso de ferro. Neste trabalho, nós utilizamos a técnica de Análise Diferencial de Representações (RDA) para isolar seqüências cuja expressão é aumentada ou diminuída pelo excesso de ferro. Foram isoladas 24 seqüências aumentadas e 15 inibidas. Onze seqüências tiveram seu padrão de expressão confirmado como sendo ativadas pelo excesso de ferro, de 14 testadas. Nenhuma seqüência teve seu padrão confirmado como sendo inibido pelo excesso de ferro. Dentre as seqüências confirmadas como diferencialmente expressas, foram encontrados genes relacionados à fotossíntese, resposta a estresse, degradação de proteínas, metabolismo de açúcares e aminoácidos e fatores de transcrição. Vários desses genes estão associados a senescência em outros trabalhos, indicando que a planta sob excesso de ferro pode estar entrando na rota que leva à senescência. Também foi encontrado um fator de transcrição da família WRKY cuja expressão é mais acentuada no 3º dia de tratamento, com diminuição gradual até o 9º dia. Esse dado pode indicar que essa proteína pode estar envolvida na resposta inicial ao estresse, sendo um candidato a regulador da resposta.

A eritropoietina (EPO) é um hormônio que pertence a um grupo de fatores de crescimento hematopoiético, controlando a proliferação e a diferenciação de células da medula óssea. Ela age induzindo a elevação da produção de células vermelhas, aumentando a quantidade de hemoglobina e o oxigênio circulante. Este hormônio é principalmente secretado pelo rim, e é amplamente usado na medicina no tratamento de anemias, desordens renais e cardíacas, tumores e diversas outras doenças. A EPO recombinante tem sido produzida em células de mamíferos (COS-1 e CHO) em culturas in vitro e tem sido expressa experimentalmente em células de insetos, leveduras e bactérias. Até o momento, há somente uma descrição da expressão transgênica desta proteína em plantas sem, no entanto, sucesso na regeneração de plantas saudáveis e férteis. No presente trabalho, plantas transgênicas de arroz (Oryza sativa) e tabaco (Nicotiana tabaccum) contendo o gene da EPO foram geradas, nas quais foi avaliada a expressão gênica e detectada a presença da proteína recombinante. O gene recombinante da EPO utilizado foi sintetizado baseado na técnica de “overlapping” de nucleotídeos. Um fragmento de 582 pb correspondente ao cDNA da EPO foi clonado e submetido a seqüenciamento automático. Uma mutação no nucleotídeo 252 (G A) foi identificada, o que não modificou o aminoácido codificado pelo códon, uma glicina. O fragmento foi transferido para o vetor de expressão pWUbi.tm1, o qual contém o promotor do gene da ubiquitina e o terminador tm1'. Este cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pWBVec4a, que foi transformado nas cepas AGL1 e LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Estas cepas foram utilizadas na transformação de arroz e de tabaco, respectivamente. A integração do transgene no genoma da planta foi comprovada por PCR. A expressão da EPO nas plantas de tabaco foi detectada por RT-PCR convencional e quantitiativa, e a presença da proteína foi avaliada por SDS-PAGE e Western blot, provando o sucesso da obtenção de plantas transgênicas de tabaco expressando EPO. Foi obtida por auto-fecundação a geração T1, a qual apresentou segregação mendeliana. Nenhuma das plantas avaliadas apresentou qualquer tipo de deformidade ou mal-formação. Não foi possível a obtenção de plantas de arroz transgênicas devido à deficiência das mesmas no processo de regeneração, possivelmente em conseqüência da super-expressão do transgene em função do promotor escolhido. / Erythropoietin (EPO) is a hormone that belongs to a group of growth hematopoeitic factors, which control the proliferation and differentiation of marrow bone´s cells. It acts inducing the production of blood red cells, increasing the amount of circulating hemoglobin and oxygen. This hormone, mostly secreted by kidneys, is widely used in medicine as a treatment for anaemia, kidney and heart disorders, tumors and numerous diseases. Recombinant EPO has been produced in mammalian cells (COS-1 and CHO) cultured in vitro and has been also experimentally inserted into insect, yeast and bacterial cells. Up to now, to the best of our knowledge, there is only one description of transgenic expression of this protein in plants but without success in the generation of healthy, fertile plants. In the present work we evaluated the expression of human EPO in plants such as rice (Oryza sativa) and tobacco (Nicotiana tabaccum). The recombinant EPO gene was synthesized based on the nucleotide “overlapping” technique. A fragment of 582 bp corresponding to the EPO cDNA was cloned and then submitted to automatic sequencing. At that time, a mutation on nucleotide 252 (G A) was identified. It did not modify the encoded amino acid of the codon, a glycine. This fragment was transferred to the expression vector pWUbi.tm1, armed with the promoter of the ubiquitin gene and the terminator tm1’. This expression cassette was transferred to the binary vector pWBVec4a, which was then transformed into strains ALG1 and LB4404 of Agrobacterium tumefaciens. These strains were employed in the transformation of rice and tobacco, respectively. Transgenic integration into plant genomes was evaluated by PCR. The expression of EPO in tobacco plants was detected by conventional and quantitative RTPCR and the presence of the protein was evaluated by SDS-PAGE and western blot, successfully proving the generation of transgenic tobacco plants expressing EPO. By selfcrossing it was obtained a collection of T1 plants, which presented mendelian segregation of the transgene, and none of the plants presented any kind of miss-formation or deformity. It was not possible to obtain rice transgenic plants due to their deficiency in the regeneration process, possibly due to the transgene over-expression driven by the ubiquitin promoter.

Os carrapatos estão distribuídos por todo mundo e impactam tanto a saúde animal quanto humana. A espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal parasita que afeta a bovinocultura nas regiões tropicais e subtropicais do globo, causando grandes prejuísos econômicos. Os métodos de controle estão baseados no uso de acaricidas químicos, o que resulta na seleção de populações resistentes e no risco de poluição do meio ambiente e dos alimentos. As vacinas têm-se mostrado um método de controle factível, e representam uma alternativa ao uso de acaricidas químicos. No entanto, dez anos após a disponibilização da primeira vacina comercial contra carrapatos, ainda não foi encontrada uma formulação capaz de alcançar a proteção necessária para dispensar o uso de agentes químicos. Sendo assim, estudar a biologia do parasita e conhecer mecanismos de importância fisiológica pode ser uma boa estratégia para encontrar moléculas alvo que possam ser usadas como antígenos no desenvovimento de uma vacina eficaz. Com este objetivo, nesta tese foi estudada a reprodução em carrapatos e avaliada a eficácia de uma enzima evolvida neste processo como antígeno vacinal. Foram abordados os processos de vitelogênese e de embriogênese. Em uma primeira etapa, usando carrapatos da espécie Amblyomma hebraeum como modelo, foi investigada a atuação do hormônio 20- hidroxiecdisona (20E) e de fatores adicionais, presentes na hemolinfa, na captação de vitelogenina (Vg) pelos oócitos. Neste trabalho, verificamos que existem diferentes estratégias de controle da captação de Vg pelo ovário nos carrapatos Ixodide, e que para que ocorra capatação de Vg pelos oócitos de A. hebraeum é necessaário um fator adicional presente na hemolinfa das fêmeas. Uma vez que o desenvolvimento do embrião depende da disponibilidade do material do vitelo estocado nos oócitos, a segunda parte da tese explorou uma cisteíno endopeptidase envolvida na degradação de vitelina (Vt) em ovos do carrapato R. microplus denominada Vitellin Degrading Cysteine endopeptidase (VTDCE). As enzimas da classe das cisteíno endopeptidases estão amplamente distribuidas nas fêmeas deste carrapato. Os estudos com VTDCE mostraram que esta é uma enzima de origem materna, com provável síntese extraovariana e transporte pela hemolinfa, até ser internalizada pelos oócitos. A VTDCE está presente durante todo o desenvolvimento embrionário, assim como em larvas. Interessantemente, esta cisteíno endopeptidase apresenta a propriedade de se associar a Vt por um outro sítio, além do sítio ativo. A VTDCE é a enzima mais eficiente na degradação de vitelina (Vt) em ovos de R. microplus, e devido a sua importância fisiológica, a VTDCE foi testada como antígeno em experimento de vacinação de bovinos e desafio com larvas de R. microplus. Os parâmetros mais afetados nos carrapatos alimentados em bovinos vacinados, com relação aos controles, foram o peso das fêmeas ingurgitadas (19,3 %) e a fertilidade dos ovos (17,6 %). Relacionado os parâmetros análisados, vimos que este antígeno confere uma proteção de 21% aos animais imunizados quando infestados por R. microplus. A proteção parcial alcançada pela VTDCE pode ser complementar a de outros antígenos no desenvolvimento de um coquetel antigênico contra carrapatos, uma vez que nenhum antígeno encontrado até o momento foi capaz de oferecer a proteção necessária para ser empregado individualmente na composição de uma vacina. Estudos como os realizados nesta tese contribuem para o melhor entendimento da biologia dos carrapatos, assim como para o desenvolvimento de novos e melhores métodos de controle desses parasitas. / Ticks are distributed worldwide impacting human and animal health. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main parasite that affects livestock in tropical and subtropical regions of world, causing large economical losses. Tick control methods are based on the application of chemical acaricides, which has resulted in selection of resistant ticks and a potential risk of environmental pollution and food contamination. Vaccines have been shown to be a feasible tick control method that offers a cost-effective, environmentally friendly alternative to chemical control. However, ten years after the commercialization of the first vaccine against ticks, to identify tickprotective antigens remains a limiting step in the development of an efficient formulation that would avoid the use of chemical acaricides. In face of this situation, to study the parasite biology and understanding physiological important mechanisms could be a good strategy to find new targets to be used in an efficient vaccine. In order that, this thesis subject was to investigate the reproduction process in ticks and to evaluate the efficiency of an enzyme involved in this process as vaccinal antigen. The process of vitellogenesis and embryogenesis were studied. In the first part, using Amblyomma hebraeum ticks as model, the role of 20- hydroxiecdisone and additional hemolymph borne factors in vitellogenin (Vg) uptake by oocytes were investigated. Our findings showed that there are different strategies to control Vg uptake by ovary in Ixodide ticks. Additionally, for Vg uptake in A. hebraeum ovaries, a vitellogenin uptake factor (VUF) present in female hemolymph is required. As embryo development depends on the availability of yolk material stored into the oocytes, in the second part we studied a cysteine endopeptidase involved in Vt digestion in R. microplus eggs, named vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE). Cysteine endopeptidase enzymes are widely distributed in these tick females. Studies with VTDCE demonstrate that it is a maternal derived endopeptidase involved in a route including extraovarian synthesis, transport, and ovary uptake, before internalization by oocytes. VTDCE is present during all tick development, as well as in larva. Interestingly, this cysteine endopeptidase is able to associate with Vt in another site than the active site. VTDCE showed to be the most efficient Vt hydrolytic enzyme in R. microplus eggs. So, supported by its physiological role, VTDCE was used as antigen in bovine vaccination and R. microplus challenge experiment. The most affected biological parameters in ticks fed on vaccinated animals were weight of engorged ticks (19.3 %), and egg fertility (17.6 %). Relating the biological parameters analyzed, bovine vaccination with VTDCE as antigen resulted in an overall protection of 21%. Therefore, this partial protection could be complementary in the formulation of an antigenic cocktail against tick, once there is not one single protein that achieves the protection level necessary for an efficient and practical vaccine development. Studies like that contribute to the better understanding of tick biology, as well as to the development of new and more efficient methods of control.

GVB é um patógeno agrícola composto por RNA de fita simples de senso positivo, com extremidades 3’ poliadeniladas e tem seu diagnóstico feito por testes biológicos, imunológicos e moleculares. Juntamente com outros vírus, causa a síndrome do “complexo rugoso”, que impede a pega da enxertia, destruindo o floema e matando a planta precocemente. A produção de anticorpos contra uma proteína do capsídeo e o desenvolvimento de teste imunológico são os objetivos deste trabalho. A clonagem da região codificante da proteína do capsídeo do Grapevine Virus B foi obtida por PCR, utilizando primers específicos para região codificante e com sítios de restrição para endonucleases BamHI e NdeI, obtendo-se um amplicon de 594 pb. Este fragmento foi clonado no vetor de expressão pET19b e transformado em Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). Para a expressão da proteína rGVB1a (24 kDa com cauda de histidina), estabeleceu-se uma indução de 1 mM de IPTG (isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside), mantida sob agitação a 250C por 18 horas. A expressão foi analisada por SDS-PAGE 13% e a presença da rGVB1a foi confirmada por Western blot, usando anticorpo monoclonal anti-histidina. A rGVB1a expressada foi purificada por cromatografia de afinidade a cauda de histidina em resina sepharose-Ni2+. A proteína purificada foi utilizada para imunizar um coelho e sete lotes de três camundongos para obtenção de soro policlonal e monoclonal contra a proteína recombinante. A fusão de células de linfócitos B com mielomas SP2/0 foi realizada, obtendo-se um hibridoma produtor de anticorpo IgG2a que em testes de ELISA e Western blot reconhecem a proteína recombinante. Adicionalmente, testes de Western blot utilizando extrato total de plantas sintomáticas e assintomáticas foram realizados para verificar se estes soros reconheciam a proteína nativa. / GVB is an agricultural pathogen composed by a single-stranded positive sense RNA with poliadenilated 3’ end and its diagnosis is based on biological, immunological and molecular tests. Together with another virus, it causes the rugose wood complex disease which prevents grafting, destroying the phloem and killing the plant early. The objectives of this work are the production of antibodies against the coat protein and the development of an immunological test. Cloning of a coat protein coding gene from Grapevine Virus B was performed by PCR, using specific primers for the coding region with restriction sites for BamHl and Ndel endonucleases, obtaining an amplicon of 594 bp. This fragment was cloned into the pET19b expression vector and transformed with Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). For expression of rGVB1a protein (24 kDa with histidine tail) a protocol with 1 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside), and shaking for 18 hours at 25ºC was established. The expression was analyzed by SDS-PAGE 13% and the presence of rGVB1a was confirmed by Western-blot, using an anti-histidine monoclonal antibody.rGVB1a expressed was purified by histidine tail Ni2+ Sepharose affinity chromatography. Purified protein was used to immunize a rabbit and seven lots of mice to obtain policlonal serum and monoclonal antibody against the recombinant protein. Cell fusions of lymphocyte B and SP2/0 were performed and a hybridoma producer of IgG2a antibody was obtained. This hybridoma recognized the recombinant protein in ELISA and Western blot tests. Additionally, Western blot using the extract of symptomatic and assymptomatic plants were developed to investigate if these serum recognize the native protein.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas constantemente pelo metabolismo aeróbico. Em situações de estresse biótico ou abiótico, a produção é aumentada e a toxicidade das ERO pode conduzir a diversos danos celulares. As ERO atuam também como moléculas sinalizadoras regulando a expressão de genes de defesa a estresses, senescência, morte programada da célula, crescimento e desenvolvimento da planta, entre outros processos metabólicos. Uma vez que as ERO são tóxicas e também participam de eventos de sinalização, as células vegetais requerem mecanismos que regulem finamente a concentração intracelular destas moléculas. A ascorbato peroxidase (APx) é uma enzima fundamental do metabolismo antioxidante, catalisando a decomposição do H2O2. Em arroz, a APx é codificada por oito genes, cujas isoformas são caracterizadas por sua localização subcelular: citosólica, peroxissomal, mitocondrial ou cloroplástica. O objetivo deste trabalho foi caracterizar funcionalmente as APx citosólicas (OsAPx1 e OsAPx2) e peroxissomais (OsAPx3 e OsAPx4). A estratégia utilizada foi o silenciamento pós-transcricional por RNA de interferência (RNAi) dos genes individualmente e de ambos os genes codificantes de isoformas do mesmo compartimento subcelular. A redução da expressão de cada gene, assim como de ambos os genes de um compartimento, resultou na produção de diferentes sinais. As plantas RNAi mostraram diferentes fenótipos e padrões de expressão transcricional dos genes da família OsAPx. Analisando as plantas silenciadas para os genes OsAPx1 e OsAPx2 sob estresse com radiação UV e altas doses de alumínio, foi observada compensação por outras enzimas antioxidantes e aclimatação, possivelmente sinalizados pelos níveis mais elevados de H2O2. Estes resultados indicam que cada isoforma de OsAPx pode apresentar funções específicas na célula. / Reactive Oxygen Species (ROS) are continually produced by aerobic metabolism. Under biotic and abiotic stresses, the production is enhanced and the ROS toxicity can lead to cell damage. ROS act also as signalling molecules and are able to regulate the expression of resistance genes, senescence, programmed cell death, plant growth and development, among other metabolic processes. By the fact that ROS are cytotoxic and make part of signalling events, plant cells need mechanisms to tightly regulate the intracellular concentration of these molecules. Ascorbate peroxidase (APx) is a fundamental enzyme of the antioxidant metabolism, it catalyses the H2O2 decomposition. In rice, APx are encoded by a small multigene family, and the different isoforms are classified according to their subcellular localization: cytosolic, peroxisomal, mithocondrial or chloroplastic. The present work aimed to characterize the function of cytosolic (OsAPx1 and OsAPx2) and peroxisomal (OsAPx3 and OsAPx4) APx isoforms. The strategy was the post-transcription silencing by interference RNA (RNAi) of single genes and both genes of the same subcellular localization. The reduced expression of each gene or both genes from the same compartment resulted in the development of different signals. RNAi plants showed changes in the phenotype and in the transcriptional expression of the OsAPx gene family. The analyses of OsAPx1 and OsAPx2 silenced plants under stresses with UV radiation and aluminum revealed that the lack of APx was compensated by other antioxidant enzymes and the acclimation could be signaled by the increased level of H2O2. These results indicate that each isoform of APx should have specific functions in the cell.

Infecções por Chlamydia trachomatis estão entre as mais freqüentes doenças sexualmente transmissíveis (DST) em todo o mundo, apresentando grande importância epidemiológica. A identificação deste patógeno pode ser difícil e um método de detecção baseado na amplificação de ácidos nucleicos é altamente desejável, por sua acurácia e rapidez. O presente estudo avaliou a acurácia, sensibilidade e especificidade de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) in “house” em amostras de urina de homens com e sem sintomas de DST comparados a um teste comercial, o COBAS Amplicor CT/NG (Roche, Suiça). Foram utilizados primers específicos para amplificar um segmento do plasmídio críptico de C. trachomatis gerando um fragmento de 201 pb, cuja seqüência foi confirmada por clivagem enzimática e seqüenciamento automático. A especificidade analítica dos primers foi confirmada frente ao DNA de diferentes microrganismos patogênicos e não patogênicos da microbiota urogenital masculina. A detecção limite do DNA clamidial pela PCR in house após hibridização (Southern blot), foi de 1 pg. O COBAS Amplicor CT/NG foi considerado o teste de referência por ser automatizado e conter um programa de controle interno da reação para identificar inibição da DNA polimerase. Entre as 37 amostras testadas positivas para C. trachomatis pelo COBAS Amplicor, 33 foram confirmadas positivas pela PCR in house. Foram detectados inibidores da reação nas 4 amostras que apresentaram resultados falso-negativos, utilizando-se a técnica de contaminação da reação com o DNA clamidial (spiked) e um controle interno da reação com primers que amplificam a β-globina do DNA humano. Após congelamento e descongelamento para eliminar prováveis substâncias inibidoras lábeis, as 4 amostras foram re-testadas, resultando na positividade de mais 2 amostras, completando 35 amostras positivas pela PCR in house. Entre as 74 amostras testadas negativas para C. trachomatis pelo COBAS Amplicor, 72 foram confirmadas negativas pela PCR in house. Das 2 amostras prováveis falso-positivas, apenas 1 permaneceu positiva, após re-teste. Dos 111 pacientes analisados, 108 apresentaram resultados idênticos nos dois testes, o equivalente a uma acurácia = 97,3%, sensibilidade = 94,6% e especificidade = 98,6%. A alta sensibilidade e especificidade apresentada pela PCR in house, demonstra a possibilidade de triar e diagnosticar C. trachomatis em urina de homens, importante reservatório da infecção clamidial para as mulheres. / Chlamydia trachomatis infections are among the most commum sexually transmitted diseases and of great epidemiological importance world-wide. Identification of this pathogen can be difficult, and it is highly desirable to have a rapid and accurate nucleic acid amplification based detection method. The present study was designe to evaluate the accuracy, sensitivity and specificity of a in house plasmid-based polymerase chain reaction (PCR) and hybridization on first void urine specimens from symptomatic and asymptomatic men, compared with a commercial test the PCR COBAS Amplicor CT/NG (Roche, Switzerland), for detection of C. trachomatis (CT). Specific primers for the cryptic plasmid of C. trachomatis were designed to amplify a 201 bp fragment confirmed by enzymatic cleavage and automatic sequencing. The analytic specificity was determined by submitting to the intended protocol, the DNA of normal and pathogenic urogenital microbiota, the specific primers anneling was confirmed. The detection limit of the PCR and the Southern blot hibridization, was mesured in 1 pg of chlamydial DNA. The COBAS Amplicor CT/NG was considered the reference test, it contains a internal control (IC) programme to identify DNA polymerase inhibition. Among 37 positive specimens tested by COBAS Amplicor, 33 were confirmed positive by in house PCR and inhibitors of PCR were demonstrated in the 4 possibly false-negative samples performing DNA chlamydial spiking experiments and using a positive internal control of human β-globin DNA. The specimens were freezedthowed and re-tested to remove labile inhibitors, but 2 samples remained negative. Among 74 negative specimens by COBAS Amplicor, 72 were confirmed negative by in house PCR. The 2 problaby false-positive samples were re-tested and just one remained positive. The final results of the two tests were identical for 108 of the 111 pacients, accuracy = 97,3% ; sensitivity = 94,6% and specificity = 98,6%. This study shows that the in house plasmid-based PCR is fasible for detection of Chlamydia trachomatis in male urine specimens. This test presented high accuracy, sensitivity and specificity, offering great potencial for the screening of men, an important reservoir of infection chlamydial for women.

As plantas superiores sintetizam uma ampla variedade de compostos, denominados classicamente metabólitos secundários, que as ajudam a se adaptar ao seu ambiente. Um subconjunto de metabólitos secundários são os alcalóides. Essas substâncias nitrogenadas de baixo peso molecular desempenham funções variadas nas plantas, podendo apresentar propriedades antibióticas, repelentes de herbívoros ou alelopáticas. O alcalóide monoterpeno indólico braquicerina, de estrutura inédita, foi extraído da planta arbustiva Psychotria brachyceras (Rubiaceae). Esse composto revelou ação específica como antiinflamatório em testes de quimiotaxia, possuindo, portanto, potencial valor farmacológico. Trabalhos anteriores revelaram que a molécula possui significativas propriedades antioxidantes e antimutagênicas, e que a concentração foliar desse alcalóide é induzida por dano mecânico e radiação ultravioleta (UV). Neste trabalho, demonstramos os resultados de uma série de experimentos desenvolvidos com o objetivo de entender o papel de braquicerina em P. brachyceras frente a esses estresses. Uma parte dos experimentos foi desenvolvida paralelamente com amostras de Psychotria carthagenensis da mesma região, que não acumula alcalóides e é mais sensível a UV do que P. brachyceras, além de ser alvo significativo de herbívoros em seu ambiente natural. O comportamento de algumas classes de metabólitos secundários reconhecidas como importantes na resposta a ferimento e radiação UV é descrito em amostras de P. brachyceras submetidas a esses tratamentos. A aplicação de dano mecânico e de radiação ultravioleta não alterou os níveis de compostos fenólicos e flavonóides totais, respectivamente. A única classe de metabólitos que sofreu regulação nessas condições foram antocianinas, que tiveram sua concentração induzida em experimentos de exposição à UV; porém, os teores induzidos em P. brachyceras foram muito menores do que àqueles basais em P. carthagenensis. Os dados sugerem um papel predominante do alcalóide frente a esses estresses. O potencial tóxico/repelente da braquicerina foi testado em bioensaios que utilizaram herbívoros generalistas. O alcalóide isolado não foi capaz de inibir o consumo das amostras pelos animais, o mesmo ocorrendo com extratos de P. brachyceras. Porém, extratos de P. carthagenensis inibiram a alimentação do molusco Helix aspersa, provavelmente pela presença de taninos. A atividade protetora do alcalóide foi testada em discos foliares de P. carthagenensis expostos à UV. A aplicação de braquicerina diminuiu a degradação de clorofilas causada pela radiação. Ensaios de atividade antioxidante in vitro e in vivo demostraram que o alcalóide é ativo em relação ao ânion superóxido e ao peróxido de hidrogênio, espécies ativas de oxigênio importantes no estresse por ultravioleta e dano mecânico, respectivamente. Além disso, foi verificado que epidermes foliares acumulam braquicerina. Os dados sugerem uma atividade predominantemente antioxidante ou moduladora de estresse oxidativo para o alcalóide. Essa atividade de detoxificação pode fazer parte de uma estratégia de tolerância da planta tanto em relação ao ultravioleta quanto ao ferimento/herbivoria e pode ser importante em outras condições adversas. / Higher plants synthesize a wide range of compounds, classically known as secondary metabolites, which help plants adapt to their environment. A class of secondary metabolites are the alkaloids. These nitrogen-containing low molecular weight substances play several roles in plants as antimicrobial, herbivore deterrents or allelopathic agents. The monoterpene indole alkaloid brachycerine, which has a unique structure, was extracted from the shrub Psychotria brachyceras (Rubiaceae). This compound showed antinflamatory activity in chemotaxis assays, indicative of pharmacological potential. Previous work described antioxidant and antimutagenic effects for brachycerine, and the regulation of its leaf tissue concentration upon ultraviolet (UV) radiation exposure and mechanical damage stress. In this thesis, we report the data from a series of experiments in an attempt to understand the roles of brachycerine in P. brachyceras with regard to wounding and UV stresses. Some experiments were carried on using samples from Psychotria carthagenensis shrubs of the same region, a plant devoid of detectable alkaloids. P. carthagenensis leaves are UV-sensitive if compared to P. brachyceras and are often found damaged by herbivores in field-grown plants. The contents of secondary metabolites with known functions in wounding and UV responses are described from experiments in which P. brachyceras samples were submitted to these treatments. The only group of secondary metabolites regulated by these stresses was that of anthocyanins in UV treated samples; however, induced content of these metabolites were always much lower than the basal ones in P. carthagenensis. The data indicated a major role for brachycerine in UV and wound responses. Toxic/deterrent properties of brachycerine were tested in bioassays with generalist herbivores. The alkaloid failed to deter herbivore feeding, however, samples treated with P. carthagenensis extracts were less consumed by the snail Helix aspersa, and this may be due to the presence of tannins. UV-protecting activity was tested in brachycerine-treated P. carthagenensis leaf disks exposed to UV radiation. Brachycerine treatment protected disk samples from UV-driven chlorophyll loss. In vitro and in vivo assays detected antioxidant activity of brachycerine towards superoxide anion and hydrogen peroxide, reactive oxygen species related to UV and wounding stress, respectively. In addition, it was shown that leaf epidermal layers accumulate brachycerin. The results suggest an antioxidant or oxidative stress modulator role for brachycerine in P. brachyceras. This detoxifying activity may be part of a tolerance strategy in relation to UV and wounding stresses, and perhaps to other environmental pressures.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Sociais, Centro de Pesquisa e Pós-Graduação Sobre as Américas, Programa de Pós-Graduação em Estudos Comparados Sobre as Américas, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-16T16:32:29Z No. of bitstreams: 1 SEI2017_MariaTherezaMacedoPedroso.pdf: 2918829 bytes, checksum: 26deab8f6199ce7a7617877d075cfad6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-05-18T14:25:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 SEI2017_MariaTherezaMacedoPedroso.pdf: 2918829 bytes, checksum: 26deab8f6199ce7a7617877d075cfad6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-18T14:25:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SEI2017_MariaTherezaMacedoPedroso.pdf: 2918829 bytes, checksum: 26deab8f6199ce7a7617877d075cfad6 (MD5) / O tema mais amplo da tese é analisar o processo de inovação no setor econômico agropecuário. Trata-se de pesquisa que descreve e sistematiza alguns aspectos da história rural dos Estados Unidos, a qual é tomada como “contexto de comparação” para estudar em maior profundidade a trajetória do desenvolvimento tecnológico do setor agropecuário do Brasil. Em especial, foi selecionado um foco específico centrado nos “produtos biotecnológicos transgênicos poupadores de agroquímicos” e, sobre esse foco, dois casos particulares foram escolhidos, nos dois países – primeiramente, o mamão papaya transgênico desenvolvido no estado estadunidense do Havaí e, como contraponto brasileiro, o feijão transgênico desenvolvido pelos pesquisadores da Embrapa, em Brasília. As variedades produzidas a partir dos experimentos biotecnológicos são resistentes aos vírus que são conduzidos por insetos. Se não fosse assim, seriam pragas combatidas por inseticidas, nos cultivos onde as variedades não são transgênicas. Um resultado imediato dessas plantas transgênicas, portanto, é a redução no uso de agroquímicos, promovendo cultivos mais sustentáveis e com custos de produção mais baixos. O objetivo central da tese foi analisar trajetórias normativas verificadas nos dois casos, interpretando as instituições e suas respectivas incidências sobre o desenvolvimento e os resultados das iniciativas de produção das duas variedades transgênicas, assim como os diversos aspectos relacionados ao processo de inovação, inclusive o papel de manifestações sociais, que são significativas no caso brasileiro. O principal resultado da análise comparativa foi demonstrar resultados substantivamente diferentes até aqui alcançados, não no plano propriamente científico (nesse caso, os resultados são convergentes), mas no que diz respeito à inovação, pois o mamão papaya transgênico foi produzido e imediatamente disponibilizado para os agricultores, enquanto o feijão transgênico produzido pela Embrapa vem encontrando barreiras quase intransponíveis para chegar às plantações dos agricultores como produto comercial. A pergunta principal da pesquisa, portanto, destinou-se a interpretar os motivos que explicam esta diferença de resultados e, para isso, se utilizou, sobretudo, do arsenal teórico do neoinstitucionalismo histórico para propor explicações para o problema central que orientou a pesquisa. São apontadas diversas características, comparados os dois casos, que podem explicar resultados diferentes para situações iniciais similares, embora a análise se restrinja exclusivamente à face formal de parte do aparato institucional estudado na tese. / The broad objective of this thesis is to analyze the innovation process in the agricultural sector. It is a research that describes and systematizes some aspects related to the rural history of the United States, which is taken here as a “context for comparison” thus offering a larger scope to study in depth the trajectory of technological development in the Brazilian agricultural sector. It was especially selected a specific focus centered on “transgenic biotechnological products that save the consumption of agrochemicals” and, on top of this topic, two particular cases, in particular, were chosen in both countries – firstly, the transgenic papaya developed in the North-American state of Hawaii and secondly, as a Brazilian counterpart, the transgenic black bean produced by researchers based at the public corporation for agricultural research (Embrapa), in the capital city of Brasília. Both varieties produced after biotechnological experiments resist to different viruses that are transmitted by insects. If not transgenic plants, these insects would be controlled using agrochemicals. An immediate result, therefore, is the reduction in the use of these chemicals, thus promoting more sustainable crops with lower costs of production. The core objective of the thesis was analyzing normative trajectories experienced in both countries, interpreting institutional matrices and their corresponding incidence over the development and results of initiatives leading to the production of transgenic varieties, as well as the numerous aspects that constitute the innovation process. That includes social manifestations, which are so relevant in the Brazilian case. The main concluding finding of this comparative analysis was to demonstrate and explain the substantially different results so far reached, not in the sphere of proper scientific endeavors (which are largely convergent in the two cases), but in relation to the materialization of the innovation process. It was so because the transgenic papaya was produced and immediately made available for the farmers whereas the transgenic black beans developed by Embrapa has been confronted by nearly unsurmountable obstacles in order to reach the farmers’ plantations as a commercial product. The main research question was thus the interpretation of these differences in practical results. To answer it, the thesis was founded especially the theoretical arsenal of historical neo-institutionalism to propose an appropriate set of arguments to deal with the central research problem. Several characteristics are suggested and discussed, in both cases, which may explain those different results for initial similar situations. It must be emphasized, however, that the thesis was restricted only to the formal face of institutional apparatuses.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-10-20T17:07:12Z No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-24T12:11:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-24T12:11:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5) Previous issue date: 2017-10-24 / A caracterização de peptídeos encriptados em proteínas pode ser uma estratégia que possibilita diversas aplicações na biotecnologia, que vão desde o desenvolvimento de novos fármacos até a produção de plantas geneticamente modificadas. O presente estudo tem como objetivo geral a prospecção, bem como, o desenho de novas moléculas a partir de peptídeos encriptados em proteínas que possam apresentar atividades biológicas. Dessa forma, foram desenhados dois peptídeos que apresentam dupla atividade (opioide e hipotensora). Tais peptídeos foram sintetizados isoladamente e também de maneira que formassem uma única cadeia polipeptídica, dando origem a uma pequena proteínas de 35 resíduos contendo duas pontes dissulfeto denominada MTOXI. O objetivo do desenho da MTOXI é a otimização da atividade frente à ação de proteases, permitindo uma liberação possivelmente controlada de peptídeos. Tanto os peptídeos separadamente, quanto a proteína MTOXI foram sintetizados por meio de síntese química em fase sólida, seguida da purificação em cromatografia líquida em alta eficiência. O grau de pureza e a confirmação foram determinados por espectrometria de massa, MALDI e ESI. Os peptídeos foram testados em camundongos por via intraperitoneal, com intuito de avaliar sua possível atividade antinociceptiva nos testes da placa quente (Hot Plate) e teste de retirada da cauda (Tail Flick). Os testes in vivo demonstraram que os peptídeos sintéticos PSLEM 11011 e 11012 apresentaram atividade antinociceptiva com perfil de atividade mais lento e duradouro em relação à morfina. A proteína MTOXI foi digerida com tripsina, em quadruplicatas, sendo avaliado o perfil de proteólise e liberação dos fragmentos peptídicos durante uma hora. O ensaio da digestão foi analisado por LC-MS incluindo os controles positivo (digestão da proteína reduzida) e negativo. A área de cada fragmento no respectivo tempo foi determinada. Os peptídeos bioativos permaneceram íntegros durante o processo de digestão e apresentaram aumento na área ao longo do tempo, o que sugere que a estratégia desenvolvida é promissora para a liberação controlada de peptídeos e para otimização do perfil de atividade. Posteriormente foi iniciada a expressão de peptídeos antimicrobianos encriptados no genoma de Arabidopsis thaliana (planta modelo) para serem reinseridos no genoma da própria planta com o objetivo de diminuir a suscetibilidade da planta contra o fungo Botrytis cinerea. A utilização de peptídeos encriptados para desenhar peptídeos e proteínas com atividade biológica mostrou-se promissora para futuras aplicações biotecnológicas. / The characterization of encrypted peptides from source proteins can be a strategy that enables several biotechnological applications, ranging from the development of new drugs to the production of genetically modified organisms. The following work aimed at prospecting and designing new molecules using peptides encrypted in proteins that may present biological activities. Thus, two peptides with dual activity (opioid and hypotensive) were designed and subsequently inserted into a small protein (MTOXI) with two dissulfide bridges, in order to optimize activity against the action of proteases and allowing a controlled release of the peptides. The peptides and the MTOXI protein were synthesized by chemical solid-phase synthesis using the fmoc strategy, followed by High Performance Liquid Cromatography (HPLC) purification. The purity and sequence confirmation were determined by MALDI and ESI mass spectrometry. The peptides were intraperitoneally injected in mice with the purpose of evaluating the antinociceptive activity via Hot plate and Tail Flick tests. In the in vivo assays, the synthetic peptides PSLEM 11011 and PSLEM 11012 presented antinociceptive activity with a later and long-lasting activity profile compared to morphine. The MTOXI protein was digested with trypsin, in four replicates, and the proteolysis profile and peptide fragment release analyzed during 5, 10, 15, 30, 45 and 60 minutes. The digestion assay was analyzed in each time by LC-MS, including the positive (reduced protein digestion) and negative controls. Determination of the area of each fragment in the respective time was obtained and disulfide pair formation identified. Bioactive peptides remained intact during the digestion process and showed increased area over time, which suggests that the developed strategy for the controlled release of peptides and optimization of activity profile is promising. Later, the identification and selection of peptides with antimicrobial physicochemical properties, encrypted in the genome of Arabidopsis thaliana was conducted. These peptides were reintroduced into A. thaliana´s own genome aiming at reducing plant susceptibility to the pathogen Botrytis cinerea. The use of encrypted peptides to design peptides and proteins with biological activity has shown promise for future biotechnological applications.