Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:24:13Z : No. of bitstreams: 1 000827083.pdf: 2845300 bytes, checksum: a10a6bf4878453b759ee7bad0b028e37 (MD5) / A investigação biotecnológica acompanhada da aplicação das enzimas, combinada com o uso da engenharia genética tem sido realizada em micro-organismos para a produção de enzimas para fins industriais. Entre estas enzimas, as fitases microbianas, que catalisam a hidrólise do fitato (mio-inositol hexaquisfosfato) a mio-inositol e fosfato inorgânico, têm sido amplamente utilizadas na alimentação animal. Neste contexto, o fungo R. microsporus var. microsporus foi selecionado como bom produtor de fitases, com maiores níveis de produção encontrados na Fermentação por Biofilmes (FB) (261,30 U/mg), utilizando bagaço de cana de açúcar como fonte de carbono adicional. A morfologia do biofilme sobre suporte inerte foi analisada por MEV observando-se múltiplas hifas interligadas formando um conjunto ordenado na presença de inúmeros canais que permitem a troca eficiente de nutrientes e oxigenação. A fitase extracelular obtida foi purificada 4,18 vezes com recuperação de 4,78%, obtendo-se uma única banda de 34 kDa em SDS PAGE 12%. A temperatura ótima de atividade para a enzima purificada foi de 55ºC e o pH ótimo 4,5, sendo estável entre 30 °C e 40 °C por 120 min. Apresentou baixa estabilidade ao pH com atividade residual acima de 50% entre pH 3,0 e 5,0 por 60 min. A fitase foi ativada por íons Ca2+ e inibida por K+. A enzima foi capaz de hidrolisar fitato de sódio (Km de 0,72 mM e Vmax de 94,55 U/mg). O extrato bruto contendo fitase foi seco em Spray Dryer com diferentes adjuvantes (farelo de milho, farelo de soja, fubá, amido e maltodextrina). O farelo de soja possibilitou a maior recuperação da atividade fitásica (60%), assim como o fubá (59,5%). Considerando o uso destes dois adjuvantes, o pH ótimo de atividade para a fitase contida no extrato seco foi 4,5 e 8,5, respectivamente e a temperatura ótima de atividade de 45-50 °C. Quando utilizado fubá, a estabilidade foi mantida... / Biotechnological research, and the application of enzymes in combination with the use of genetic engineering has been carried out in microorganisms for the production of enzymes for industrial purposes. Among these enzymes, microbial phytases, which catalyze the hydrolysis of phytate (myo-inositol hexakisphosphate) to myo-inositol and inorganic phosphate, have been widely used in animal feed. In this context, the fungus R. microsporus var. microsporus was selected as a good producer of the phytase with higher production levels when grown on Biofilm Fermentation (FB) (261,30 U/mg), using sugarcane bagasse as carbon additional source. The morphology of biofilms on inert support was examined by SEM observing interconnected hyphae forming an ordered array in the presence of many channels which enables efficient exchange of nutrients and oxygen. The extracellular phytase was purified 4.18 fold with 4.78% recovery. A single protein band was obtained in 6% PAGE and confirmed by 12% SDS-PAGE as a single protein band with 34 kDa. The optimum temperature for activity was 55 °C and the optimum pH 4.5. It was completely stable at temperatures between 30 °C and 40 °C for 120 min had low pH with a residual activity of over 50% between pH 3.0 and 5.0 for 60 min. The enzyme was activated by Ca2+ and inhibited by Zn2+. The enzyme was able to hydrolyze sodium phytate with a Km=0.72 mM, Vmax= 94.55 U/mg of protein. The crude extract containing phytase was dried using Spray Dryer with different adjuvants. Soybean meal and corn meal allowed the best recovery of phytase activity 60% and 59.5%, respectively. Considering the use of these two adjuvants, the optimum pH of activity for phytase in the dry extract was 4.5 and 8.5, respectively, and the optimum of temperature of 45-50 °C. When used corn meal, the stability was maintained above 90% at pH 2.5-10.0 for 60 min. The dry phytase (corn meal) was applied to the feed...

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-06. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:35Z : No. of bitstreams: 1 000843884.pdf: 1475946 bytes, checksum: 6f51d0f969e5f4ac156a68ba477a8f29 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A produção de etanol combustível a partir de resíduos lignocelulósicos, como tecnologia emergente, conhecida como bioetanol de segunda geração, está sendo bastante pesquisada em virtude de uma preocupação com o desenvolvimento de fontes energéticas renováveis e mais limpas. Neste contexto as indústrias vinícolas têm destaque, já que o subproduto gerado por elas, bagaço e engaço, por exemplo, é de lenta decomposição. Ao mesmo tempo em que há buscas por novos substratos, há também por micro-organismos capazes de fermentar monossacarídeos presentes nestes resíduos para produzir bioetanol, e também que estes consigam fermentar em consórcio sem que haja competição entre eles para o melhor aproveitamento destas fontes de carbono. Neste trabalho foram realizadas fermentações pela bactéria Zymomonas mobilis CCT 4494 e pela levedura Candida tropicalis em hidrolisados ácidos dos resíduos de uvas das espécies Isabel e Bordô, para isto, foi utilizada a concentração de ácido sulfúrico de 1,5% com aquecimento em autoclave a 121 ºC e 1 kgf/cm2. Foram realizadas também, fermentações utilizando meios semi-sintéticos com glicose e xilose (50 g/L) como substratos para a Z. mobilis e C. tropicalis, respectivamente. Nas fermentações realizadas pela bactéria Z. mobilis, utilizando tanto a mistura (50% bagaço e 50% engaço) dos resíduos quanto apenas o engaço não houve detecção de etanol por cromatografia gasosa. Com o meio semi-sintético, em 8 horas de fermentação, foram produzidos 17,0 g/L de etanol. Durante as fermentações efetuadas pela levedura C. tropicalis, houve produção de etanol de 1,04 g/L e 5,89 g/L em 6 horas de fermentação utilizando a mistura dos resíduos e o engaço, respectivamente e, 18,56 g/L em 8 horas em meio semi-sintético. No consórcio dos micro-organismos, a produção de etanol, utilizando primeiramente a mistura e depois o engaço foi de 0,72 g/L e 1,15 g/L, ambas em 8 horas... / The production of fuel ethanol from lignocellulosic residues, as an emerging technology, known as second-generation bioethanol is being extensive research because of a concern with the development of renewable and cleaner energy sources. In this context, the wine industry has highlighted, since the by-product generated by them, bagasse and stems, for example, is the slow decomposition. While there search for new substrates, there are also micro-organisms capable of fermenting monosaccharides present in these residues to produce bioethanol, and also that they are able to ferment in a consortium without competition between them for better use of these carbon sources . In this work were carried out fermentations by Zymomonas mobilis CCT 4494 bacteria and the yeast Candida tropicalis in hydrolyzed acid waste grape species Isabel and Bordô, for this, we used the sulfuric ...

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-04Bitstream added on 2014-08-13T18:00:11Z : No. of bitstreams: 1 000764397.pdf: 797747 bytes, checksum: 6a89fbc6b7371005e020d9f2b9ab35ec (MD5) / A Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) é uma neoplasia de linfócitos B maduros, de curso clínico heterogêneo, com alguns pacientes necessitando de tratamento imediato e outros vivendo sem tratamento por décadas. Por essa característica, se faz necessária a identificação de marcadores prognósticos acessíveis e de valor clínico. O objetivo principal foi avaliar retrospectivamente os indicativos prognósticos de progressão da doença (ZAP-70, CD38, ploidia de DNA e Fase S) em pacientes portadores de LLC, frente a sua evolução clínica. Como objetivos secundários, foram comparadas as metodologias de análise de ZAP-70 por citometria de fluxo(CF) ISO Método e Análise em Tubo Único, assim como as técnicas de análise de conteúdo de DNA pelo modelo matemático (ModFit LT™) e estratégia de gating boleano (Infinicyt™). Na cauística foram incluídos 27 pacientes que possuíam disponíveis os dados clínicos e laboratoriais em estudo e que concordaram e preencheram o termo de consentimento livre e esclarecido. A avaliação da situação clínica foi feita uma única vez, e assim como os resultados das expressões de CD 38 e ZAP 70, foi realizada através de revisão de prontuário médico. A análise do conteúdo de DNA por CF foi avaliada pelos dois métodos supracitados, a partir de arquivos do laboratório de citometria de fluxo da instituição. Como resultados, não se observou relação das expressões de ZAP-70 e CD38 com o estado clínico dos pacientes. Em relação à análise de índice de DNA e Fase S, não houve diferença estatística (p=0,69 e p=0,08 respectivamente utilizando-se os softwares ModFit LT™ e Infinicyt™). Também foi encontrado que os dados obtidos na análise de DNA indicam a possibilidade de utilização da Fase S na avaliação prognóstica dessa série de pacientes. Todos os três fatores estudados são considerados prognósticos. Não houve relação dos marcadores estudados com a evolução ... / The Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is a mature B lymphocytes malignancy, on heterogeneous clinical course, where some patients require immediate treatment and others live for decades without treatment. For this peculiarity, it’s required the identification of prognostic markers and clinical value. The main objective was to retrospectively, evaluate the prognostic indicator of the disease progression (ZAP- 70, CD38, DNA ploidy and S phase) in patients under CLL, facing the clinical evolution. As secondary purposes, methodologies were compared to ZAP- 70 analysis by flow cytometry (FC) ISO Method and Single-Tube Analysis, as well as technical analysis of DNA content by the mathematical model (ModFit LT ™) and boolean gating principle (Infinicyt ™ ). On the registration of the cases observed, there were included 27 patients under the clinical and laboratory data who had available and filled in the term consenting agreement. The evaluation of the clinical situation was made only once, and the results of expressions and CD38 and ZAP 70, were held by reviewing medical records. The analysis of DNA content by CF was evaluated by the above two methods files from a laboratorial flow cytometry institution. As a result, no relation of the expressions of CD38 and ZAP- 70 with the clinical status of the patients was observed. Concerning the analysis of DNA index and S phase, there wasn’t any statistical difference (p = 0.69 and p = 0.08 respectively using the ModFit LT ™ and Infinicyt ™ software ). It was also found that the data obtained in the analysis of DNA indicates the possibility of using the S phase in the prognostic evaluation of those patients. Conclusion: all the three factors studied are considered prognostic. There was no relation of the markers studied to the clinical course of patients. To correlate these data with clinical follow-up of those patients, it is necessary a longer period of time

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-01-30Bitstream added on 2014-08-27T15:57:12Z : No. of bitstreams: 1 000777532.pdf: 1116769 bytes, checksum: 22614337236b0dca0f19d04f2be2d13d (MD5) / Estudando a utilização de coprodutos agroindustriais para aplicação na aquicultura utilizou-se fígado suíno (FS) e resíduo do processamento da tilápia (RT) (Oreochromis niloticus) na produção de diferentes hidrolisados enzimáticos para aplicação na nutrição animal. As matérias primas FS e RT foram hidrolisadas com complexos enzimáticos Alcalase® (A) e Brauzyn® (B), resultando em quatro hidrolisados: FA (FS com A), FB (FS com B), TA (RT com A) e TB (RT com B). Foi utilizado delineamento experimental fatorial 2x2 inteiramente casualisado, sendo o primeiro fator as matérias-primas, RT e FS, o segundo as enzimas, Alcalase® e Brauzyn® e três repetições em escala industrial. A hidrólise ocorreu em reator encamisado com controle de temperatura, contendo a relação enzima/substrato de 1:200 (p/p), durante 60 minutos. Após o processamento dos hidrolisados foram avaliados sua composição centesimal, perfil de aminoácidos totais e livres e perfil de ácidos graxos e sua aplicação em dietas para peixes. Para avaliar o uso de diferentes hidrolisados proteicos sobre o desempenho zootécnico, parâmetros metabólicos, hepáticos e composição centesimal de juvenis de pintado Real® (Pseudoplatystoma sp), foram distribuídos em delineamento experimental inteiramente casualizado 200 peixes (7,23 ± 0,12 g) em 20 tanques (500 L) com cinco dietas: controle, sem inclusão de hidrolisado (CO); e com inclusão de 20% de hidrolisados: Hidrolisado de fígado suíno com Alcalase® (FA); Hidrolisado de fígado suíno com Brauzin® (FB); Resíduo de tilápia com Alcalase® (TA); Resíduo de tilápia com Brauzin® (TB), totalizando cinco tratamentos e quatro repetições. Durante o período experimental a média de temperatura, pH e oxigênio dissolvido foram equivalentes a 28,5 ± 0,4 ºC, 7,40 ± 0,26 e 6,21 ± 0,32 mg L-1, respectivamente. Produtos hidrolisados com Alcalase® apresentaram ... / This study evaluates the use of agro-industrial byproducts in aquaculture. To this end, pig liver (PL) and tilapia (Oreochromis niloticus) processing byproduct (TR) were used to produce different hydrolysates for use in animal nutrition. The raw materials PL and TR were hydrolyzed with Alcalase® (A) and Brauzyn® (B) enzyme complexes, resulting in four hydrolysates: PA (PL with A), PB (PL with B), TA (TR with A) and TB (TR with B). The experimental design was completely randomized, 2x2 factorial, where the first factor was the raw materials, PL and TR; and the second, the enzyme complexes, Alcalase® and Brauzyn®, with three replications in industrial scale. The hydrolysis reactor, containing the enzyme/substrate material at 1:200 ratio (w/w), was jacketed for temperature control, and the reaction lasted 60 minutes. After processing, the hydrolysate was analyzed to determine the proximate composition; total and free amino acids and fatty acids profile; and, its use in fish diets. The use of different protein hydrolysates in fish diet was evaluated by the growth performance parameters; metabolic and liver parameters; proximate composition of juvenile pintado real® (Pseudoplatystoma sp). Following a completely randomized design with five treatments and four replications, 200 fish (7.23 ± 0.12 g) were distributed in 20 tanks (500 L) and fed the control diet, without hydrolyzed (CO); two diets added 20% of Alcalase® hydrolysates, PA and TA; and two diets with 20% Brauzin® hydrolysate, PB and TB. During the experimental period the average temperature, pH and dissolved oxygen values were 28.5°C ± 0.4; 7.40 ± 0.26; and 6.21 ± 0.32 U mg L-1, respectively. The Alcalase® hydrolysates had a higher amount of free amino acids compared to the other hydrolysates, regardless of the byproduct used. The tilapia residue hydrolysates had higher mean lipid contents, especially monounsaturated fatty ...

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-04Bitstream added on 2014-11-10T11:58:48Z : No. of bitstreams: 1 000777302_20150930.pdf: 1498999 bytes, checksum: 8443b57c3d8c6bc673c540fd2e6cad01 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-09-30T10:42:09Z: 000777302_20150930.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-30T10:42:57Z : No. of bitstreams: 1 000777302.pdf: 2953419 bytes, checksum: 80ddcb8c8d04fd2cac9f2d44be7c50b1 (MD5) / Streptomyces clavuligerus produces various beta-lactam compounds, especially the cephamycin C. Some authors suggest that the nature and concentration of carbon and nitrogen added to the culture medium may favor the production of larger quantities of the antibiotic. Lysine plays an important role in Streptomyces clavuligerus, acting on its catabolism, via cadaverine, and secondary metabolism, in which it is converted via 1-piperideine-6-carboxylate to alpha-aminoadipic acid, a beta-lactam antibiotic precursor. The role of lysine as a cephamycin C inducer, when added to production medium at concentrations above 50 mM, has been widely explored in the literature. Moreover there are some reports on the positive influence of multifunctional diamines and antibiotic precursor compounds such as alpha-ketoglutarate. However, there is not studies on the combined influence of these inducers on beta-lactam antibiotic production. Thus, this Thesis explores such influences to devise a culture medium economically viable and which promotes the production of cafamicina C. For this, we evaluated the effect of culture medium (synthetic, semi-synthetic or complex), carbon source (starch or maltose) and different modes of operation (batch or continuous culture). Was adopted the Response Surface Methodology to investigate the interaction of lysine with putrescine or 1,3-diaminopropane and its influence on cephamycin C biosynthesis of Streptomyces clavuligerus. The addition of lysine (100 mM) in basal medium (without additives) led to an cephamycin C production of 120 mg/L, an increase of 445% in the production of this antibiotic. However, there was a residual of 30 mM at the end of cultivation, becoming the process uneconomical. The addition of putrescine (0.2 g/L) and lysine (40 mM) in the culture medium with maltose as a carbon source, showed a production around 150 mg/L in the intermittent cultivation mode. However, in this mode of operation, the increased ...

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-19Bitstream added on 2014-11-10T11:58:48Z : No. of bitstreams: 1 000773278_20180219.pdf: 476686 bytes, checksum: 6e5775b02410b85dbee6fa185b69ccfc (MD5) Bitstreams deleted on 2018-02-23T13:06:32Z: 000773278_20180219.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2018-02-23T13:07:23Z : No. of bitstreams: 1 000773278.pdf: 3882989 bytes, checksum: 75667e8c9a8c2a3a7f503d07d51be90f (MD5) / As fontes naturais de minérios sulfetados vêm se esgotando rapidamente devido à demanda por metais nas indústrias de bens de produção e de consumo. O cobre é um dos metais de maior interesse econômico. Cerca de 70% deste metal é encontrado na natureza na forma de calcopirita (CuFeS2), contudo é o mineral que possui maiores limitações em sua extração. Dentre os processos de extração têm-se a biolixiviação, que utiliza micro-organismos capazes de promoverem a solubilização de metais pela oxidação de sulfetos metálicos, apresentando vantagens em relação às técnicas já utilizadas, principalmente de cunho econômico e ambiental. Neste contexto, o presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a influência do potencial de óxido-redução na solubilização de cobre a partir da calcopirita. Para isso, foram realizados ensaios de oxidação de íons ferrosos na presença e ausência do mineral. A bactéria utilizada nos ensaios foi a Acidithiobacillus ferrooxidans - LR, espécie acidófila mais estudada e mais encontrada em ambientes de mina. A amostra de calcopirita, proveniente da localidade de La Chorrera, na Colômbia, foi analisada por difração de raios-X (DRX) e evidenciou a presença dominante de calcopirita. Os ensaios de oxidação foram realizados em frascos, agitados a 150 rpm, a 30ºC sob diferentes concentrações de íons ferrosos (100, 200 e 300 mmol L-1) em meio T&K. Aos sistemas foram adicionados 2,5% (m/v) de calcopirita e 5% (v/v) do inóculo fresco de A. ferrooxidans. Nas condições abióticas, em todas as concentrações de Fe2+, o potencial redox atingiu, em média, 420 mV (Ag|AgCl|KCl(sat)), e foram os sistemas que apresentaram as maiores porcentagens de recuperação de cobre, sendo elas 73%, 90% e 78%, respectivamente, após 100 dias de ensaio. Contudo, os sistemas que continham bactéria apresentaram uma recuperação ínfima de cobre, chegando a apenas 17%, em um potencial médio... / Natural sources of sulfide ores come depleting rapidly due to the demand for metal goods industries in production and consumption. Copper is a metal of greater economic interest. About 70% of this metal is found in nature in the form of chalcopyrite (CuFeS2), however it is the mineral that present a major limitations in its extraction. One of the extraction processes is bioleaching, which uses microorganisms capable of promoting the solubilization of metals by metal sulfides oxidation and presents advantages over the common techniques used, mainly for economic and environmental nature. In this context, the present work was carrying out to evaluate the influence of the redox potential in the solubilization of copper from chalcopyrite. For this, ferrous ions oxidation tests were conducted in the presence and absence of the mineral. The bacterium used in the tests was Acidithiobacillus ferrooxidans - LR, the acidophilic species most studied and most commonly found in mine environments. A sample of chalcopyrite from La Chorrera, Colombia, was analyzed by X-ray diffraction (XRD) and showed the dominant presence of chalcopyrite. Ferrous ions oxidation tests were carried out in shaken flasks at 150 rpm, at 30 ºC using different concentrations of ferrous ions (100, 200, and 300 mmol L-1) in T&K medium. The systems were supplied with 2,5% (w/v) of chalcopyrite and 5% (v/v) of A. ferrooxidans fresh inoculum. At the abiotic conditions, the redox potential achieved 420 mV (Ag|AgCl|KCl(sat)) in all ferrous ions concentrations. Besides, these systems showed the highest copper recovery concentrations, such 73%, 90% and 78%, respectively, after 100 days of testing. However, the bacterial systems showed a low copper recovery, about 17% in a redox potential of 610 mV (Ag|AgCl|KCl(sat)). The solid residues were evaluated by XRD and showed, at abiotic conditions the formation of elemental sulfur, jarositas and a significant decrease in chalcopyrite’s...

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-07Bitstream added on 2014-11-10T11:58:48Z : No. of bitstreams: 1 000773794_20141201.pdf: 425804 bytes, checksum: a8f372a3e17a3a50333488864eec465f (MD5) Bitstreams deleted on 2014-12-02T13:27:28Z: 000773794_20141201.pdf,Bitstream added on 2014-12-02T13:28:01Z : No. of bitstreams: 1 000773794.pdf: 1429037 bytes, checksum: edb45f4f58822411314ab7f965ab2f0d (MD5) / A grande dependência de fontes fósseis de energia altamente poluentes, como o petróleo e seus derivados, tem levado a sociedade a buscar alternativas renováveis para a utilização de combustíveis. As pesquisas atuais sinalizam como tecnologia emergente a produção de etanol combustível a partir de biomassas residuais de composição lignocelulósica. Com o desenvolvimento e o estabelecimento de novas tecnologias para a obtenção de etanol de segunda geração, as celulases podem tornar-se a primeira classe de enzimas comercializadas e industrialmente utilizadas no mundo todo. Mesmo sendo produzidas por uma gama de micro-organismos, ainda há restrições que dificultam o processo de obtenção destas enzimas. Para superar algumas destas dificuldades, a Biologia Molecular surge como uma ferramenta favorável na produção enzimática, pois a clonagem e expressão de genes de celulases em leveduras representa uma estratégia interessante para a utilização das mesmas em processos de sacarificação e fermentação simultâneos (SFS). Dentro deste contexto, o presente estudo teve como objetivo a construção de uma linhagem de levedura capaz de expressar uma celulase bacteriana para testes futuros de SFS. Para tal, foi isolado o gene engXCA de Xanthomonas campestris pv. campestres (Xcc) e um fragmento do gene codificando para o peptídeo sinal do fator alpha de Saccharomyces cerevisiae (Sc) (MFalpha). Este foi ligado upstream ao gene engXCA, resultando na fusão MFalpha-engXCA. Tal quimera foi ligada ao vetor de expressão pYES2 de Sc e a endoglucanase recombinante foi secretada para o meio de cultivo. A linhagem que apresentou melhor produção da enzima recombinante foi Sc BJ3501 quando cultivada por 36h a 30°C, em meio rico YPGal+CMC (carboximetilcelulose) 1,0%. As condições reacionais foram avaliadas tanto para a endoglucanase recombinante quanto para a selvagem de Xcc e, as melhores condições para as atividades enzimáticas foram... / The dependence on highly polluting fossil sources of energy, such as oil and oil products, has led the society to look for alternatives for renewable fuel use. Current researches indicate as emerging technology the production of fuel ethanol from lignocellulosic biomass waste. With the development and the establishment of new technologies for obtaining second-generation ethanol, cellulases may become the first class of enzymes marketed and industrially used worldwide. Despite being produced by a range of microorganisms, there are still limitations that hinder the process to obtain these enzymes. In order to overcome some of these difficulties, molecular biology appears as a favorable enzyme production tool. Since cloning and expression of cellulase genes in yeasts represents a interesting strategy for using these enzymes in simultaneous saccharification and fermentation (SSF) process. Within this context, this study aimed the construction of a yeast strain capable of expressing a bacterial cellulase for future testing of SFS. To this end, engXCA gene was isolated from Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), and a gene fragment coding for the signal peptide of the alpha factor Sc (MFalpha). The latter was connected upstream to engXCA gene, resulting in MFalpha-engXCA merger. This chimera was linked to vector pYES2 Saccharomyces cerevisiae (Sc) and the recombinant expression endoglucanase was secreted into the culture medium. The strain that showed the best production of the recombinant enzyme was Sc BJ3501. When growing for 36 h at 30°C, in rich medium YPGal + CMC (carboxymethyl cellulose) 1.0%. The reaction conditions were evaluated for both native and Xcc recombinant endoglucanases and the best conditions for enzymatic activities were pH 5.5 and 65°C. Regarding stability, recombinant and native endoglucanases were more stable at pH 5.0 and maintained a high thermostability up to 55 °C when incubated for 1 hour.

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-18Bitstream added on 2014-12-02T11:21:06Z : No. of bitstreams: 1 000773336_20190218.pdf: 311514 bytes, checksum: 3013fb73613f9ad6df44d3e85824afe7 (MD5) / O fungo filamentoso Neurospora crassa é um organismo modelo amplamente utilizado para estudos de diversos aspectos da biologia dos eucariotos. Nosso laboratório tem utilizado este fungo para estudar os mecanismos moleculares e bioquímicos envolvidos na regulação do metabolismo de glicogênio. A avaliação de uma coleção de linhagens mutantes individualmente nocauteadas em genes que codificam fatores de transcrição permitiu identificar várias proteínas potencialmente envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio do fungo N. crassa. Dentre as proteínas, o fator de transcrição FLBC foi identificado como uma possível proteína regulatória do metabolismo de glicogênio. A linhagem mutante apresentou alterações no perfil de acúmulo de glicogênio e na expressão do gene gsn em relação à linhagem selvagem, quando submetidas a estresse térmico. Estudos preliminares realizados anteriormente em nosso laboratório mostraram severas alterações morfológicas na linhagem flbCKO, como reduzida capacidade de conidiação, com a presença de poucos microconídios, formação de hifas aéreas reduzidas, morfologia das extremidades das hifas alterada, aspecto e morfologia alterados das colônias e produção acentuada do pigmento melanina, indicando que a proteína FLBC desempenha importante papel no desenvolvimento do fungo. O fator de transcrição FLBC, objeto de estudo deste trabalho, é uma proteína homóloga às proteínas FlbC e FLE1 dos fungos Aspergillus nidulans e Podospora anserina, respectivamente, ambas envolvidas nos processos de conidiação e desenvolvimento dos fungos. O objetivo deste trabalho foi realizar uma caracterização funcional detalhada deste fator de transcrição em N. crassa. Análises de expressão gênica mostraram níveis elevados do transcrito flbC durante o crescimento vegetativo do fungo e após a indução do desenvolvimento assexual. A linhagem nocaute mostrou uma desregulação... / The filamentous fungus Neurospora crassa is a model organism widely used for studies of several aspects of the biology in eukaryotes. We have been studying the molecular and biochemical mechanisms involved in glycogen metabolism regulation in this fungus. The screening of a knocked-out strains set in genes encoding transcription factors has identified many proteins likely involved in the regulation of glycogen metabolism in the fungus N. crassa. Among the proteins, the transcription factor FLBC was identified as a regulatory protein of the glycogen metabolism. The mutant strain showed changes in the glycogen accumulated and in the gsn gene expression when compared to the wild-type strain under heat stress. Preliminary studies carried out in our laboratory showed severe morphological changes in the strain flbCKO, such as reduced ability to conidiate, presence of a few microconidia, reduced production of aerial hyphae, altered morphology of hyphae tips, changes in the colonies morphology and high production of the pigment melanin, suggesting that FLBC plays an important role in the fungus development. The transcription factor FLBC, object of study in this work, is the Aspergillus nidulans and Podospora anserina FlbC/FLE1 homologous protein, respectively, both involved in conidiation and fungal growth. The purpose of this study was to perform functional characterization of this transcription factor in N. crassa. Analysis of gene expression showed high levels of the transcript flbC during vegetative growth and after induction of asexual development. The knockout strain presented a misregulation in the accumulation of reserve carbohydrate (glycogen and trehalose) during vegetative growth accumulating higher levels of both carbohydrates as compared to the wildtype strain. Analysis of gene expression in the strains wild-type and flbCKO showed that gdn (encoding for debranching enzyme) and gpn (encoding glycogen phosphorylase) genes are...

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-09-05Bitstream added on 2014-12-02T11:21:05Z : No. of bitstreams: 1 000777406_20141231.pdf: 641973 bytes, checksum: 588137dce1974a2914edd3aadb3736f1 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-01-05T11:00:55Z: 000777406_20141231.pdf,Bitstream added on 2015-01-05T11:01:50Z : No. of bitstreams: 1 000777406.pdf: 2095617 bytes, checksum: c1c25558e3e61efd44b8465985d10f95 (MD5) / A proteína MxA humana é membro da superfamília de GTPases dinaminas. De maneira geral, as chamadas proteínas Mx estão presentes na grande maioria dos organismos vertebrados, estudados até o momento, e possuem dois domínios estruturais, chamados GTPase e CID-GED (stalk), além da capacidade de homooligomerização e associação com membranas intracelulares. Além disso, as proteínas Mx são produzidas unicamente após a sensibilização celular por interferons do tipo I e III. Entre as propriedades funcionais de MxA, destaca-se a sua vasta atividade contra diferentes vírus de RNA e DNA, incluindo o vírus influenza e membros da família dos buniavírus. Além disso, o silenciamento gênico de MxA está associado ao fenótipo de imortalização celular em uma série de neoplasias. Assim, MxA desperta o interesse por ser uma das proteínas chave nas respostas mediadas por interferons e por estar envolvida no controle da proliferação celular. Recentemente, por meio de rastreamento de duplo-híbrido, utilizando uma biblioteca de cDNA preparada a partir de cérebro fetal humano, foi possível mostrar que MxA interage com fatores envolvidos no processo de SUMOilação de proteínas e na formação de corpúsculos nucleares denominados PMLNB e com uma série de proteínas relacionadas com o controle da transcrição e apoptose. Neste estudo, foi investigada a interação entre MxA e as proteínas envolvidas nos processo de SUMOilação. Assim, foi possível confirmar a interação física entre a proteína MxA e os ligantes Ubc9 e SUMO1, por ensaios de coimunoprecipitação. A seguir, através de ensaios de duplo-híbrido, foi possível determinar que a região EIL (E67-interacting Loop) de SUMO1 e o domínio CID-GED de MxA estão envolvidos na interação entre essas proteínas e que esta interação independe de sequências SIM (SUMO-interacting motif) presentes em MxA. Ainda, foi possível determinar que Ubc9 interage diretamente com ... / The human MxA protein is a member of the superfamily of GTPases dynamins. The so called Mx proteins are present in the majority of the vertebrate organisms investigated so far and contain two structural domains, named GTPase and CID-GED (stalk), besides the capabilities of homo-oligomerization and association with intracellular membranes. Moreover, the Mx proteins are strictly produced upon cell sensibilization with type I and III interferons. The vast antiviral activity against RNA and DNA viruses, including the Influenza virus and members of the bunyaviridae family, is among the functional properties of MxA. Moreover, MX1 epigenetic silencing is associated with cellular immortalization in neoplasias. Therefore, the study of MxA is of great interest as it is a key component of the Interferon-mediated pathways and cell proliferation control. Recentely, in a two-hybrid screen using a fetal brain cDNA library, it was possible to reveal that MxA interacts with proteins related to the post-translational modification process named SUMOylation and to the assemble of the nuclear bodies named PML-NBs and with proteins implicated in the control of transcription and apoptose. In this study, it was investigated the interaction between MxA and the components of the protein SUMOylation pathway. It was possible to confirm the physical interaction between MxA and Ubc9 and SUMO1, using co-immunopreciptation assay. Then, using the yeast two-hybrid system, it was possible to determine that the EIL (E67-interacting loop) region on SUMO1 interacts with the CID-GED domain of MxA without the requirement of the SIM sequences (SUMO-interacting motif) present in MxA. Moreover, it was determined that Ubc9 interacts with the GTPase domain of MxA and that MxA homo-oligomerization is important for its interaction with SUMO1 and Ubc9. Also, we were able to demonstrate for the first time that the protein MxA undergoes SUMOylation by SUMO1, SUMO2 and SUMO3. Finally, it ...

En Chile, Eucalyptus globulus es una de las especies forestales de mayor importancia, debido a su rápido crecimiento y a la calidad de su madera. Estas características hacen que sea una especie de alto rendimiento y de principal interés para la industria de la celulosa. Sin embargo, la especie resulta extremadamente sensible a las bajas temperaturas, por lo que ocurren grandes pérdidas en plantaciones jóvenes de Eucalyptus globulus. En este contexto, la biotecnología forestal se perfila como una herramienta eficaz para comprender y proponer soluciones a éste y a otros problemas. En el plano de la investigación científica, se han realizado importantes avances en la determinación de los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta a estrés por frío en Eucalyptus globulus. Entre ellos, el aislamiento y secuenciación de una serie de genes involucrados en este proceso, como el gen EgCBF-1. Este gen codifica para un factor de transcripción que es activado por frío y que es capaz de activar numerosos genes de respuesta a estrés abiótico. En esta tesis se realizó un análisis estratégico que incluyó un recuento del panorama actual de la industria forestal chilena y los principales avances biotecnológicos atingentes. A través del análisis de la cadena de valor, se propuso un plan de negocios para la introducción de una variedad de Eucalyptus globulus tolerante a las bajas temperaturas en la industria forestal chilena. Se determinó que las principales ventajas para el desarrollo de este proyecto son las políticas gubernamentales favorables que incentivan el desarrollo biotecnológico del sector forestal y la consistencia de la industria forestal chilena. Se determinó que las principales desventajas son la carencia de una metodología para la transformación de especies de eucaliptos y la escasez de información a nivel social y legislación relativa al uso de organismos genéticamente modificados. La parte experimental de este trabajo de tesis se orientó al análisis funcional y estructural del promotor del gen EgCBF-1 en respuesta al estrés por frío. Se aisló y secuenció el promotor EgCBF-1 y se desarrollaron construcciones para estudios de funcionalidad. Se obtuvo una secuencia de 776 pares de bases río arriba del sitio de inicio de la transcripción del gen CBF-1 de Eucalyptus globulus, correspondiente a un segmento del promotor de dicho gen. En cuanto al análisis estructural, se confirmó la presencia de una serie de elementos de respuesta a estrés, entre ellos, cinco sitios de unión para el factor de transcripción EgICE-1, cuyo rol es clave en la respuesta al estrés provocado por las bajas temperaturas. Se determinó además, que éste y otros elementos de respuesta, están también presentes en promotores de genes ortólogos al promotor EgCBF-1. Se utilizaron dos estrategias para evaluar la funcionalidad del promotor: ensayos de funcionalidad mediante transformación transitoria en Nicotiana benthamiana y ensayos en plantas trnasgénicas de Arabidopsis thaliana. En ambos casos se utilizó el gen reportero GUS bajo el control del promotor en estudio.