Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-11-14T03:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348744.pdf: 2197516 bytes, checksum: 31e87183b524275798bb8e4777c7375c (MD5) Previous issue date: 2017 / Os ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (PUFA), especialmente os ácidos Eicosapentaenoico (EPA) e Docosahexaenoico (DHA) da família ?-3 são reconhecidos como nutracêuticos e desempenham papéis importantes na sanidade animal e humana. Entretanto, existe uma crescente preocupação tanto em relação à possível contaminação, quanto à sustentabilidade no fornecimento da matéria-prima fonte desses ácidos graxos. Nesse cenário, as microalgas (produtoras naturais de PUFA) podem se tornar uma fonte alternativa à produção de ácidos graxos poli-insaturados. Uma espécie, Phaeodactylum tricornutum, naturalmente acumula elevadas concentrações de EPA, o que faz dessa diatomácea uma espécie promissora como fonte de PUFA ?-3. Contudo, ainda não é bem compreendido qual é a possível interação ambiental na biossíntese de EPA em um nível molecular. Em um primeiro estudo, foi avaliada a possível modulação nos níveis de transcrição de seis genes envolvidos na biossíntese de EPA ? as desaturases PTD15, PTD6, PTD5 alfa e beta e as elongases ELO6 b1 e b2 ? em diferentes razões N/P (21/1, 14/1 e 7/1) e em diferentes fases de cultivo. Todos os níveis de transcrição foram dependentes da fase de cultivo, enquanto somente dois genes (PTD6 e PTD5 alfa) foram modulados por uma razão N/P. O perfil de expressão gênica (PTD5 alfa) pode estar associado aos níveis de EPA em pelo menos em uma razão N/P (21/1). Com os dados dos níveis de transcritos, concentrações de EPA e a falta de alguns intermediários da via poderiam indicar algum tipo de regulação entre a transcrição gênica e a biossíntese de EPA. Já em um segundo trabalho, foi verificada a influência de três diferentes fotoperíodos (24:0, 16:8 e 12:12) na transcrição dos mesmos seis genes da via de síntese de EPA. Os níveis de transcrição foram distintos entre os três regimes de iluminação empregados, com um padrão de sobre-expressão no fotoperíodo 12:12 em relação aos outros dois tratamentos. No fotoperíodo 16:8, os perfis dos transcritos atingiram um pico de expressão ao final do período escuro. Já as culturas iluminadas continuamente não apresentaram mudanças nos perfis de expressão relativa dos genes associados. Por último, os genes PTD5 alfa e PTD6 apresentaram um padrão de coexpressão em todos o tratamentos, possivelmente indicando a importância de ambos na biossíntese de EPA. / Abstract : The long chain polyunsaturated fatty acids (PUFA), notably the Eicosapentaenoic (EPA) and Docosahexaenoic (DHA) acids of the ?-3 family are acknowledged as nutraceuticals and play important roles in human and animal health. However, there is a crescent concern in a possible contamination, as well as the sustainability in the fatty acids natural sources supply. In this scenario, microalgae (natural PUFA producers) could become an alternative source at PUFA production and supply. One species, Phaeodactylum tricornutum, naturally accumulates high EPA contents, which makes this diatom a promising species as a ?-3 PUFA source. Nevertheless, it is still not well understood the possible environment interaction on EPA biosynthesis on a molecular level. In the first study, it was evaluated the possible modulation of six gene transcript levels involved in EPA biosynthesis ? desaturases PTD15, PTD6, PTD5 alfa, beta and elongases ELO6 b1, b2 ? in different N/P ratios (21/1, 14/1 and 7/1) and in different cultivation phases. All gene transcription levels were growth phase dependent, while only two genes (PTD6 and PTD5 alpha) were modulated by N/P ratios. At least in one N/P ratio (21/1), one gene expression profile (PTD5 alpha) might be associated with the EPA levels. Data from gene transcripts, EPA concentration, and the lack of some EPA intermediates might indicate some type of regulatory step between gene transcription and actual EPA biosynthesis. In the second work, it was verified the influence of three different photoperiods (24:0, 16:8 and 12:12) in the transcription levels of the same six genes involved in EPA biosynthesis. The transcription levels were distinct among the three illumination regimes employed, with a 12:12 photoperiod upregulation pattern in relation to the other two treatments. In the 16:8 photoperiod, the transcript profiles presented an upregulated expression peak at the end of the dark period. While the cultures with continuous illumination did not present changes at the relative associated gene expression levels. Lastly, the PTD5 alpha and PTD6 genes showed a co-expression pattern in all treatments, which possibly indicates the importance of both expression products in the EPA biosynthesis.

A ascorbato peroxidase (APX) é uma das principais enzimas do sistema de detoxificação de espécies reativas de oxigênio (ERO) em plantas, catalisando a conversão do peróxido de hidrogênio em água usando o ascorbato como doador de elétrons. No arroz, oito genes codificam APX. O presente estudo teve como objetivo avaliar o papel das enzimas de APXs em arroz, através da determinação das localizações subcelulares das diferentes isoformas, do estudo da expressão gênica e da caracterização detalhada do efeito do silenciamento das isoformas cloroplastídicas (chlAPXs) no metabolismo da planta, em condições normais e na resposta à estresses abióticos. A expressão diferencial das diferentes isoformas de APXs em condições de estresses abióticos varia entre as espécies e com a intensidade e duração do estresse. A localização subcelular de OsAPX1 e OsAPX2 no citosol, OsAPX3 e OsAPX4 nos peroxissomos, OsAPX5 no cloroplasto/mitocôndria, OsAPX6 na mitocôndria e OsAPX7 no cloroplasto foram confirmadas em protoplastos de arroz. Plantas duplamente silenciadas para os genes OsAPX7/OsAPX8 não apresentam alterações fenotípicas, no entanto possuem alterações no metabolismo antioxidante sob condições normais de crescimento. Análises proteômicas dessas plantas revelaram que várias rotas importantes foram afetadas, especialmente proteínas envolvidas com processos fotossintéticos. Plantas silenciadas submetidas a estresse de alta luz (HL) e metil viologênio (MV) mostraram que as chlAPXs são importantes na proteção antioxidante em arroz. Alterações como fotodanos, fotoinibição e bloqueio do transporte de elétrons foram observadas nas plantas silenciadas submetidas a estresses abióticos, gerando grandes distúrbios na atividade fotoquímica. No entanto, sob alta luz as chlAPXs parecem não serem essenciais para a proteção de fotodanos, fotoinibição e danos oxidativos dirigidos pela alta luz no fotossistema II. Plantas silenciadas e não-transformadas (NT) exibem diferenças na fotossíntese sob condições normais de crescimento, bem como quando submetidas a estresses abióticos. / Ascorbate peroxidase (APX) is a major enzyme of the Reactive Oxygen Species (ROS) detoxification system in plants, catalyzing the conversion of hydrogen peroxide into water using ascorbate as electron donor. In rice eight genes encode APX. This study aimed to evaluate the role of APX enzymes in rice, through subcellular localization of the different isoforms, the study of gene expression and detailed characterization of chloroplastic APXs (chlAPXs) silencing in plant metabolism under normal conditions and in response to abiotic stresses. The differential expression of the different isoforms of APXs under abiotic stress conditions varies among species, and depends on the intensity and duration of stress. The subcellular localization of OsAPX1 and OsAPX2 in cytosol, OsAPX3 and OsAPX4 in peroxisomes, OsAPX5 in cloroplast/mitochondria, OsAPX6 in mitochondria and OsAPX7 in chloroplast were confirmed in rice protoplasts. Double silenced plants in OsAPX7/OsAPX8 genes did not show phenotypic changes; however presented alterations in the antioxidant metabolism under normal growth conditions. Proteomic analysis revealed that in theses plants several important pathways were affected, especially proteins involved with photosynthetic process. Silenced plants subjected to high light (HL) and methyl viologen (MV) stresses show that the chlAPXs are important in the antioxidant protection in rice. Alterations such photodamage, photoinhibition and obstruction of the electron transport were observed in silenced plants subjected to abiotic stresses, generating great disturbances in photochemical activity. However, under high light the chlAPXs appear not be essential to the protection of photodamage, photoinhibition and oxidative damage triggered by HL in photosystem II (PSII). Silenced and non-transformed (NT) plants exhibit differences in photosynthesis under normal growth conditions, as well as, when subjected to abiotic stress.

Este trabalho analisa os requisitos para o estabelecimento de um Sistema de Inovação Orientado para a Sustentabilidade com base na inovação biotecnológica e avalia as condições para aplicá-la no estado brasileiro do Rio Grande do Sul. A biotecnologia tem o potencial de fornecer soluções sustentáveis para alguns dos maiores desafios que a humanidade enfrentará nas próximas décadas, tais como a escassez de alimentos, acesso à energia de fontes renováveis, degradação ambiental, a saúde de uma população cada vez mais numerosa e o agravamento das mudanças climáticas. Em âmbito nacional e estadual, este trabalho apresenta a estrutura para promoção da inovação biotecnológica, incluindo aspectos como o ambiente legal e regulatório, a formação de recursos humanos, desenvolvimento de ciência e tecnologia, bem como os cenários e oportunidades de financiamento. Ao fazê-lo, permite avaliar as condições existentes que podem estimular ou dificultar o estabelecimento de um Sistema de Inovação Orientado para a Sustentabilidade (SIOS) e aponta gargalos a serem resolvidos com vistas à implantação de um SIOS efetivamente operacional. / This assay analyzes the requirements for the establishment of a Sustainability-oriented Innovation System, based on biotechnological innovation and assesses the conditions for applying it in the Brazilian state of Rio Grande do Sul. Biotechnology has the potential to provide sustainable solutions to some of the greatest issues humanity will be facing in the coming decades, such as food shortages, environmental degradation, energy sources, population health, and climate-related changes. The assay presents the framework, at the level of country and state, to foster biotechnological innovation, such as legal and regulatory environment, training of human resources, science and technology scenarios, and funding opportunities. In doing so, this work evaluates the existing conditions that may stimulate or hinder the establishment of a Sustainability-oriented Innovation System (SoIS) and points to the bottlenecks which need to be addressed in order to establish an effective and operational SoIS.

Neste trabalho foram desenvolvidos, em escala laboratorial, processos para o aproveitamento do soro de queijo como meio de cultura para as leveduras Kluyveromyces marxianus CBS 712 e Kluyveromyces marxianus CBS 6556 , objetivando a produção de lactase. A primeira etapa dos experimentos foi realizada em incubadora rotatória para determinar-se as condições ideais de crescimento microbiano (pH, meio de cultura e temperatura). Os resultados desta etapa definem que o pH e a temperatura ideais de crescimento são 5,5 e 37oC, respectivamente. Quanto ao meio de cultura, definiu-se soro de queijo in natura (7% w/v) para a cepa CBS 6556 e soro suplementado com extrato de levedura (1% w/v) para a cepa CBS 712. A segunda etapa dos experimentos foi realizada em biorreator aerado, utilizando-se as condições de crescimento determinadas na etapa anterior, com o objetivo de determinar a melhor cepa produtora de lactase. Ambas linhagens produziram quantidades equivalentes da enzima, sendo então escolhida, para os testes posteriores de otimização do processo e caracterização enzimática parcial, a levedura Kluyveromyces marxianus CBS 6556, por utilizar um meio de cultura mais simples e barato. Testou-se, então, o crescimento em soro de queijo concentrado (21% w/v), que resultou em uma maior produtividade específica de lactase pela levedura, contudo apresentou, também, maior produção de etanol, tóxico à célula. A caracterização enzimática mostrou que a lactase produzida possui atividade enzimática máxima em torno de 37oC e que possui pouca estabilidade à temperatura ambiente (30oC) e ao armazenamento à 4oC. Durante o armazenamento nas temperaturas de -4oC e -18oC a enzima conservou sua estabilidade durante as nove semanas.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-19T18:21:29Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5916812 bytes, checksum: 639d6c03f1d6b4f272d2a161b0ecbfc4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T18:21:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5916812 bytes, checksum: 639d6c03f1d6b4f272d2a161b0ecbfc4 (MD5) Previous issue date: 2017-07-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A proteína LIMYB (L10-interacting MYB domain-containing protein) foi recentemente identificada como um componente downstrean da via de sinalização antiviral mediada pelo receptor NIK1 (Nuclear shuttle protein- interacring kinase 1). Diante da ativação de NIK1, LIMYB interage com RPL10 para reprimir a expressão de genes de proteínas ribossomais, levando a supressão global de tradução. Exceto pelos genes de proteínas ribossomais que são regulados por LIMYB, os demais alvos diretos de LIMYB em escala genômica não foram ainda determinados. Para determinar possíveis genes controlados por LIMYB e compreender sua função no desenvolvimento e nos processos coordenados pela regulação da tradução, foi avaliado o perfil transcricional de plantas overexpressando LIMYB, por RNA-seq e ChIP-seq. Nas análises por RNA-seq, foram identificados 2351 genes diferencialmente expressos, sendo que 1246 genes down regulados e 1105 genes up regulados, em plantas expressando ectopicamente LIMYB. Os estudos de ontologia gênica demonstraram que a categoria funcional mais enriquecida entre genes down regulados, de fato pertence aos constituintes ribossomais, enquanto que para genes up regulados foi notada uma categoria associada a resposta de níveis de nutrientes. Nas análises de ChIP-seq, o DNA associado à proteína foi fragmentado, imunoprecipitado e sequenciado, permitindo uma avaliação dos locais de ligação de LIMYB ao DNA nos respectivos genes sob controle da proteína. A análise integrativa de ChIP-seq e RNA-seq identificou 156 genes down regulados e destes, os constituintes ribossomais foram o grupo mais afetado, seguido por categorias relacionadas a metabolismo celular de aldeídos, fotossíntese e tradução. Nestas diversas categorias, foi possível identificar genes reprimidos por LIMYB e que também participam de processos de infecção viral, expandindo a atividade antiviral de LIMYB. Entre os genes reprimidos por LIMYB, foram identificados componentes chaves do aparato fotossintético sugerindo que LIMYB pode funcionar como um molecular link que sincroniza supressão de tradução e inibição de fotossíntese. Já no conjunto de genes up regulados, a categoria relacionada a transporte de ânions foi a mais enriquecida, seguida por categorias relacionadas a escassez de determinados compostos como fosfato e na resposta a estímulos internos e externos. A partir dos genes diferencialmente expressos para compreender sua função no desenvolvimento e nos processos coordenados a regulação da tradução na intercessão dos experimentos de ChIP-seq e RNA-seq, foram encontrados em maior significância 3 sequencias consensos, CAAAC, AAGAAA e ATATATA. A interação de LIMYB com promotores, reprimindo e ativando genes alvo, foi elucidada neste trabalho, através de análise de cobertura (co-localização RNA- seq/ChIP-seq), representando a proximidade dos picos com os respectivos genes, e pelo mapeamento das sequencias consensos nos promotores escolhidos. Estes resultados permitem uma melhor compreensão da função de LIMYB como um regulador capaz de gerenciar processos celulares em função da inibição da tradução global, durante o desenvolvimento e na defesa antiviral. / LIMYB (L10-interacting MYB domain-containing protein) was recently identified as a downstream component of the NIK1 (Nuclear shuttle protein-interacting kinase 1)-mediated antiviral signaling. Upon NIK1 activation, LIMYB interacts with RPL10 to repress the expression of ribosomal protein genes, leading to the global translation suppression. Apart from the LIMYB-mediated regulation of RP genes, the genome-wide direct target genes of LIMYB are unknown. To identify genes controlled by LIMYB towards understanding LIMYB function in development and in processes coordinated by translation regulation, we carried out a transcriptional profiling of LIMYB-overexpressing plants by RNA-seq and ChIP-seq. RNA-seq analyses revealed 1246 down-regulated genes and 1105 up- regulated genes in LIMYB-overexpressing plants. Gene enrichment analysis, based on gene ontology, demonstrated that the ribosomal constituent category was the most-enriched down-regulated functional term, whereas the most- enriched up-regulated term was associated with response to nutrient levels. For the chip-seq analysis, the DNA associated with the protein was fragmented, immunoprecipitated and sequencing, allowing the location of LYMIB association with DNA on the respective genes under control of LIMYB. The integrative analysis between ChIP-seq and RNA-seq identified 156 down-regulated genes, from which the ribosomal constituents were the group more affected, followed by categories related to aldehyde metabolism, photosynthesis and translation. Within these categories, we identified LIMYB-repressed genes unrelated to translation that also participate in viral infections, expanding the antiviral activity of LIMYB. Among the LIMYB-repressed genes, we also identified key components of the photosynthetic apparatus, suggesting that LIMYB may function as a molecular link, which synchronizes translation suppression and photosynthesis inhibition. Within the up-regulated genes, the anion transport term was the most enriched category, followed by phoshate deprivation-related category and response to internal and external stimuli. By analyzing the set of differentially expressed genes also found in ChIP-seq, the three consensus sequences CAAAC, AAGAAA and ATATATA were identified as the top-scoring motifs. The interaction of LIMYB with promoters, repressing and activating target genes, was elucidated by the coverage analysis (co-localization RNA-seq/ChIP- seq), mapping peaks from ChIP-seq and heats from RNA-seq within the gene locus. These results allowed a better understanding of the LIMYB function as a regulator of cell processes related to suppression of global translation, during development and antiviral defense.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2014-11-07T20:27:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22741 bytes, checksum: 6d485fa57a2ebb95a6dd0efb0da258db (MD5) DISSERTAÇÃO_EnvolvimentoÍonCálcio.pdf: 1506646 bytes, checksum: 7dde3667710312142c80b380bbd24455 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-11-10T16:31:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22741 bytes, checksum: 6d485fa57a2ebb95a6dd0efb0da258db (MD5) DISSERTAÇÃO_EnvolvimentoÍonCálcio.pdf: 1506646 bytes, checksum: 7dde3667710312142c80b380bbd24455 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-10T16:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22741 bytes, checksum: 6d485fa57a2ebb95a6dd0efb0da258db (MD5) DISSERTAÇÃO_EnvolvimentoÍonCálcio.pdf: 1506646 bytes, checksum: 7dde3667710312142c80b380bbd24455 (MD5) Previous issue date: 2014 / Para manter sua capacidade produtiva, as células de leveduras precisam adaptar-se às mudanças ambientais que ocorrem durante o processo produtivo. A resposta a baixo pH é de interesse, pois tal exposição ocorre sob condições industriais como no tratamento ácido para redução de contaminação bacteriana antes da reciclagem celular em processos fermentativos. Semelhante à resposta a ácidos orgânicos, a resistência a ácidos inorgânicos envolve mudanças da permeabilidade de membrana, extrusão ativa de H+ e modulação da expressão gênica. O presente trabalho estudou a participação do íon cálcio na resposta ao estresse ácido na levedura Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos mostram elevação transitória dos níveis citoplasmáticos de Ca2+ desencadeada por pulso ácido e que esta mudança decorre do influxo de cálcio extracelular e da mobilização vacuolar do íon. Testes de viabilidade celular sugerem que a tolerância da S. cerevisiae a estresse ácido envolve a ativação da via de sinalização da calcineurina dependente de Ca2+/calmodulina e consequente regulação da expressão de alguns genes mediada pelo fator de transcrição Crz1p/Tcn1p. A tolerância dos mutantes nulos da via de sinalização da quinase Snf1p, responsável pela utilização de fontes alternativas de carbono, foi menor em relação à cepa parental BY4741, sugerindo a participação desta via na resposta a baixo pH. Em conjunto, os resultados mostram a importância das vias de sinalização da fosfatase calcineurina e da quinase Snf1p para a resposta da S. cerevisiae a estresse ácido. _____________________________________________________________________ / ABSTRACT: To maintain their productive capacity, yeasts cells need to adapt to environmental changes that occur during production process. Acid stress response is of interest, because such exposure occurs under industrial conditions, such as the acidic treatment to reduce bacterial contamination before cell recycling in fermentation process. Resembling the response to organic acids, resistance to inorganic acids exposure involves changes in membrane permeability, active extrusion of H+ and gene expression modulation. The present work studied ion calcium involvement in acid stress response in Saccharomyces cerevisiae. Results show that there is transient elevation of cytoplasmic Ca2+ levels triggered by acid pulse and this happens through influx of extracellular calcium and vacuolar mobilization. Cell viability tests suggest that tolerance of S. cerevisiae to acid stress involves the Ca2+/calmodulin-dependent calcineurin pathway activation and subsequent gene expression regulation mediated by the transcription factor Crz1p/Tcn1p. The tolerance of null mutants of the kinase Snf1p signaling pathway, responsible for the use of alternative carbon sources, was lower compared to the parental strain BY4741, suggesting the involvement of this pathway in response to low pH. Together, the results show the importance of calcineurin and Snf1p signaling pathways to S. cerevisiae response to acid stress.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnologico / Made available in DSpace on 2016-01-08T20:49:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 105515.pdf: 11165147 bytes, checksum: 177e019ac8f049361b40c973a7ebdde0 (MD5) Previous issue date: 1996 / O objetivo deste trabalho foi a otimização de um meio de cultura para produção de Candida utilis IZ-1840, em cultivo descontínuo, contendo glicerol como principal fonte de carbono. A composição do meio de cultura base foi a seguinte: K2HPO4 0,49 g/L, KH2PO4 1,74 g/L, NH4Cl 4,00 g/L, ácido cítrico mono hidratado 0,21 g/L, MgCl2 . 6 H20 2,54 g/L, Na2SO4 1,63 g/L, ZnSO4. 7 H2O 7,00 mg/L, biotina 4,0 µg/L e glicerol 10,00 g/L. As condições experimentais, exceto a composição do meio de fermentação, foram as mesmas em todos os ensaios (pH (4,5), temperatura (30°C), agitação (300 rpm), aeração (3,0 L/min), volume de inóculo (0,4 L), volume de meio (3,6 L). Para a otimização do meio de cultura, visando a maximização da produtividade em células, foi utilizado um planejamento fatorial saturado e uma metodologia de planejamento seqüencial. Com seis variáveis e dois níveis, oito condições experimentais iniciais foram realizadas. Com o resultado deste conjunto inicial de dados, foram estimados os parâmetros de um modelo linear empírico, feita a validação do mesmo e feita a busca das concentrações de sais que maximizaram a produtividade em células. A produtividade em células do meio otimizado, cuja composição é: K2HPO4 0,49 g/L, KH2PO4 1,74 g/L, NH4Cl 3,20 g/L, ácido cítrico mono hidratado 0,17 g/L, MgCl2 . 6 H20 2,03 g/L, Na2SO4 1,63 g/L, ZnSO4. 7 H2O 7,00 mg/L, glicerol 10,00 g/L e biotina 4,00 µg/L, foi 0,87 g/L.h, o fator de conversão de substrato em células foi 0,88 g/g, o consumo específico de glicerol foi 1,12 g/g e a velocidade específica máxima de crescimento foi 0,34 h-1.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015 / Made available in DSpace on 2016-04-19T04:21:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015Bitstream added on 2016-05-24T17:28:17Z : No. of bitstreams: 1 337984.pdf: 3082430 bytes, checksum: f6fee464aa1fce0e699df5a94e815c5f (MD5) / As leishmanioses afetam cerca de 12 milhões de pessoas e constituem um problema de saúde mundial. Faz-se necessário o desenvolvimento de metodologias para o estudo de novas entidades químicas ativas contra a doença e que sejam menos laboriosas, mais rápidas, sensíveis e compatíveis com a automação. No presente trabalho, realizou-se a transfecção de forma integrativa do gene da ß-galactosidase em três espécies de Leishmania (L. (L.) infantum, L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis) com o objetivo de padronizar um ensaio colorimétrico rápido e sensível para triagem de compostos contra amastigotas intracelulares de L. (V.) braziliensis. A transfecção dos parasitos não alterou suas características biológicas avaliadas pelo crescimento de promastigotas em cultura, a infectividade para células THP-1 e para camundongos Balb/c em nenhuma das cepas transfectadas. A atividade da enzima medida através de ensaio colorimétrico mostrou correlação direta entre a leitura e o número de parasitos. A expressão da enzima foi estável nas linhagens selecionadas, mesmo na ausência da pressão do antibiótico de seleção, indicando a integração do gene que foi confirmado através de PCR. Ensaios de atividade enzimática utilizando promastigotas mostraram um limite inferior de detecção de 780 parasitos por cavidade, permitindo a determinação da atividade enzimática em amastigotas intracelulares. A transfecção em L. (V.) braziliensis não alterou a susceptibilidade aos fármacos leishmanicicas de uso clínico: anfotericina B e miltefosina. Contudo, o processo de transfecção provocou a resistência dos parasitos aos fármacos paromomicina e glucantime, 3 a 10 vezes acima da IC50 da cepa parental. Os resultados obtidos pela metodologia colorimétrica foram semelhantes aos obtidos pela metodologia clássica de contagem através de microscopia, pasronizando assim o ensaio.<br> / Abstract : Leishmaniasis affects about 12 million people worldwide and represents a global health problem. It is necessary the development of less laborious, faster and more sensitive and compatible with automation methods for the study of new active compounds against the disease. In this present study, we transfeceted in a integrative form the ß-galactosidase in three species of Leishmania (L. (L.) infantum, L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis) aiming the standardization of a reproducible, fast and sensitive colorimetric assay for screening of compounds active against intracellular amastigotes using the transfected strain of L. (V.) braziliensis. Transfection did not alter the parasite?s biological characteristics evaluated by promastigote growth in culture, infectivity on THP-1 cells and on Balb/c mice for any of the transfected strain. The enzymatic activity measured by colorimetric assay showed direct correlation between the reading and the number of parasites. Enzymatic expression was stable under the selected strains even in the absence of the selection antibiotic pressure, indicating the integration of the gene, which was confirmed by PCR. Enzymatic activity assay using promastigotes showed a lower limit of 780 parasites per well, allowing the determination of the enzymatic activity in intracelular amastigotes. Transfection in L. (V.) braziliensis did not alter the susceptibility to the drugs: amphotericin B and miltefosine. However the trasnfection process led to resistance to the drugs paromomycin and glucantime, 3 to 10 times higher from the IC50 of the wild type parasite. Results obteinedby the colorimetric assay were similar to the ones obteined by the classical methodology of microscopic counting, validating the assay.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015 / Made available in DSpace on 2016-04-19T04:22:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015Bitstream added on 2016-05-24T17:34:34Z : No. of bitstreams: 1 337986.pdf: 2799017 bytes, checksum: 4aeae083fbd264b859e7eeb1e831db5b (MD5) / O Trypanosoma cruzi e o Trypanosoma rangeli são duas espécies de protozoários de ocorrência simpátrica entre as Américas do Sul e Central e que compartilham os mesmos hospedeiros invertebrados, hospedeiros mamíferos silvestres e domésticos, incluindo seres humanos. Uma vez que infecções mistas T. rangeli/T. cruzi já foram relatadas para diversos hospedeiros, buscamos gerar ferramentas para analisar a dinâmica da co-infecção, tendo gerado cepas de ambas as espécies que expressassem marcadores fluorescentes diferentes. Após a obtenção das cepas transfectadas, as mesmas foram clonadas e ensaios de PFGE confirmaram a integração dos plasmídeos pTREXmRFP/pTREXnGFP-Neo, pTREXmRFP-Hygro e pROCKGFP-Neo no genoma dos parasitos. Com estas ferramentas foi possível realizar um estudo quantitativo da cinética da infecção mista e das variações populacionais dos parasitos em ambos os hospedeiros mamífero e invertebrado. A avaliação do crescimento em diferentes proporções das duas espécies em co-cultivo axênico em meio LIT não revelou diferenças significativas se comparado ao cultivo isolado de cada cepa. Infecções de células THP-1 com os parasitos transfectados revelou uma diferença significativa no que diz respeito às cepas selvagens e transfectadas de T. cruzi, sendo caracterizada por um número menor de formas amastigotas por célula infectada em relação à cepa parental nos tempos de 2, 4, 8 e 24 h de infecção, porém ao comparar as taxas e tempos de multiplicação de cada uma das cepas, as diferenças não foram significativas. Ensaios preliminares in vitro da interação de hemócitos extraídos de Rhodnius prolixus com uma cepa de T. rangeli transfectada com o plasmídeo pTREXnGFP-Neo permitiram evidenciar uma rápida interação do parasito com estes tipos celulares, sendo registrada a internalização em várias situações, não sendo evidenciados sinais de multiplicação do T. rangeli nestes tipos celulares. Foram também realizados ensaios preliminares in vivo de co-infecção de Rhodnius prolixus por T. cruzi e T. rangeli, revelando uma resposta diferencial frente à infecção exclusiva pelo T. cruzi e T. rangeli em relação à co- infecção neste vetor. Em camundongos Balb/C a infecção prévia pelo T. rangeli não foi capaz de gerar uma proteção significativa contra a infecção subsequente pelo T. cruzi, porém é capaz de gerar uma redução da parasitemia causada pelo T. cruzi além de aumentar a sobrevida dos animais infectados.<br. / Abstract : Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli are two species of sympatric occurrence of protozoa between South and Central America that share the same invertebrates hosts, wild and domestic mammalian hosts, including humans. Once mixed infections T. rangeli / T. cruzi have been reported for various hosts, we seek to generate tools for analyzing the dynamics of co-infection, having generated strains of both species that expressed different fluorescent markers. After obtaining the transfected strains, they were cloned and PFGE assays confirmed the integration of the plasmids pTREXmRFP / pTREXnGFP-Neo, and pROCKGFP pTREXmRFP-Hygro-Neo into the genome of parasites. With these tools it was possible to perform a quantitative kinetic study of mixed infection and population variations of the parasites in both mammal and invertebrate hosts. The evaluation of different growth ratios of the two species in axenic co-cultivation in LIT medium revealed no significant differences when compared to the isolated culture of each strain. THP-1 cells infections with transfected parasites revealed a significant difference in respect to the wild and transfected T. cruzi strains, characterized by a smaller number of amastigotes per infected cell In relation to parental strain on times 2, 4, 8 and 24 h of infection. However, when comparing propagation rates and times of each of the strains, the differences were not significant. Preliminary assays in vitro of the interaction of hemocytes extracted from Rhodnius prolixus with T. rangeli strain transfected with the pTREXnGFP-Neo plasmid showed a rapid interaction of the parasite with these cell types, internalization being recorded in various situations, not being evidenced signals of multiplication of T. rangeli in these cell types. It was also carried out preliminary tests in vivo of co-infection of Rhodnius prolixus by T. cruzi and T. rangeli, showing a differential response against exclusive infection by T. cruzi and T. rangeli regarding co-infection in this vector. In mice BALB / C, prior infection with T. rangeli was not able to generate a significant protection against subsequent infection by T. cruzi, but it is able to generate a reduction in parasitemia caused by T. cruzi, in addition to increasing the survival of infected animals.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:26:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338219.pdf: 1806932 bytes, checksum: cb4e68c860e46d1c5b4be98ef954ceed (MD5) Previous issue date: 2015 / Na levedura S. cerevisiae os carboidratos sacarose, maltose e maltotriose são fermentados por vias metabólicas diferentes: a sacarose é hidrolisada pela invertase extracelular (codificada pelos genes SUC), enquanto maltose e maltotriose são ativamente transportadas para dentro da célula e hidrolisadas pelas a-glicosidases presentes no citoplasma (ambas proteínas codificadas pelos genes MAL). Os genes SUC também permitem a síntese de uma forma intracelular da invertase, uma enzima com nenhuma função óbvia em leveduras. No entanto, a sacarose pode também ser metabolizada por células de levedura através dos transportadores e a-glicosidases codificados pelos genes MAL. Nossos resultados mostram que a maltotriose pode ser também eficientemente fermentada pelas células de S. cerevisiae através de seu transporte ativo mediado pela permease AGT1, um transportador MAL necessário para utilização de maltotriose, e sua hidrólise intracelular mediada pela invertase intracelular. A cepa brasileira industrial utilizada na produção de etanol combustível CAT-1 não pode fermentar maltotriose eficientemente devido ao promotor do AGT1 ser defeituoso. Para aumentar a fermentação de maltotriose por esta levedura, colocamos um promotor constitutivo (PGPD) à frente do gene AGT1 presente na cepa CAT-1, gerando a linhagem GMY05. No entanto, esta linhagem não foi capaz de fermentar eficientemente a maltotriose. Por outro lado, quando esta linhagem foi modificada para sobre-expressar a forma intracelular da invertase, por substituição da sequência sinal do gene SUC2 com o promotor constitutivo PADH1, a cepa iSUC2 obtida (GMY08) fermentou maltotriose eficientemente. Utilizando condições em que os genes MAL não são expressos, foi possível mostrar que a forma intracelular da invertase é capaz de hidrolisar a maltotriose (mas não maltose ou p-nitrofenil-a-glicosídico). Assim, os nossos resultados indicam uma sobreposição inesperada no metabolismo de sacarose e maltotriose por células de levedura, indicando que a invertase intracelular pode hidrolisar da maltotriose, e oferece novas abordagens a ser aplicadas para otimizar várias fermentações industriais que utilizam hidrolisados de amido, incluindo a panificação, produção de bebidas destiladas e cerveja, ou inclusive bioetanol.<br> / Abstract : It is well known that in the yeast S. cerevisiae the sugars sucrose, maltose and maltotriose are metabolized by different pathways: sucrose is hydrolyzed by the extracellular invertase (encoded by SUC genes), while maltose and maltotriose are actively transported into the cell and hydrolyzed by intracellular a-glucosidases (both proteins encoded by MAL genes). Furthermore, the SUC genes also allow the synthesis of an intracellular form of invertase, an enzyme with no obvious function in yeasts. We have already shown that sucrose can be metabolized by yeast cells through MAL-encoded transporters and a glucosidases. Now, our results will show that maltotriose can be efficiently fermented by S. cerevisiae cells through its active transport mediated by the AGT1 permease, a MAL transporter required for maltotriose utilization, and its intracellular hydrolysis mediated by the cytoplasmic invertase. The Brazilian industrial fuel-ethanol strain CAT-1 cannot ferment maltotriose efficiently due to a defective promoter of the AGT1 gene. To increase maltotriose fermentation by this strain, we placed a strong promoter (PGPD) in the AGT1 gene of strain CAT-1, generating strain GMY05. While the AGT1 gene was indeed over-expressed in this strain (measured by real-time PCR), maltotriose was still not fermented efficiently. However, when we over-expressed the intracellular form of invertase, by replacing the signal sequence of the SUC2 gene with the strong PPGK promoter, the resulting iSUC2 strain GMY08 fermented maltotriose efficiently. Using conditions were the MAL-encoded a glucosidases could not be expressed, we showed that the intracellular form of invertase could hydrolyze maltotriose (but not maltose or p-nitrophenyl-a-glucoside). Thus, our results indicate an unexpected overlap in sucrose-maltotriose metabolism by yeast cells, showing that the intracellular invertase allows efficient maltotriose hydrolysis, and offers new approaches that can be applied to optimize several industrial fermentation processes that use starch hydrolysates, including production of bread, distilled beverages and beer, or even bioethanol.