Os carrapatos estão distribuídos por todo mundo e impactam tanto a saúde animal quanto humana. A espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal parasita que afeta a bovinocultura nas regiões tropicais e subtropicais do globo, causando grandes prejuísos econômicos. Os métodos de controle estão baseados no uso de acaricidas químicos, o que resulta na seleção de populações resistentes e no risco de poluição do meio ambiente e dos alimentos. As vacinas têm-se mostrado um método de controle factível, e representam uma alternativa ao uso de acaricidas químicos. No entanto, dez anos após a disponibilização da primeira vacina comercial contra carrapatos, ainda não foi encontrada uma formulação capaz de alcançar a proteção necessária para dispensar o uso de agentes químicos. Sendo assim, estudar a biologia do parasita e conhecer mecanismos de importância fisiológica pode ser uma boa estratégia para encontrar moléculas alvo que possam ser usadas como antígenos no desenvovimento de uma vacina eficaz. Com este objetivo, nesta tese foi estudada a reprodução em carrapatos e avaliada a eficácia de uma enzima evolvida neste processo como antígeno vacinal. Foram abordados os processos de vitelogênese e de embriogênese. Em uma primeira etapa, usando carrapatos da espécie Amblyomma hebraeum como modelo, foi investigada a atuação do hormônio 20- hidroxiecdisona (20E) e de fatores adicionais, presentes na hemolinfa, na captação de vitelogenina (Vg) pelos oócitos. Neste trabalho, verificamos que existem diferentes estratégias de controle da captação de Vg pelo ovário nos carrapatos Ixodide, e que para que ocorra capatação de Vg pelos oócitos de A. hebraeum é necessaário um fator adicional presente na hemolinfa das fêmeas. Uma vez que o desenvolvimento do embrião depende da disponibilidade do material do vitelo estocado nos oócitos, a segunda parte da tese explorou uma cisteíno endopeptidase envolvida na degradação de vitelina (Vt) em ovos do carrapato R. microplus denominada Vitellin Degrading Cysteine endopeptidase (VTDCE). As enzimas da classe das cisteíno endopeptidases estão amplamente distribuidas nas fêmeas deste carrapato. Os estudos com VTDCE mostraram que esta é uma enzima de origem materna, com provável síntese extraovariana e transporte pela hemolinfa, até ser internalizada pelos oócitos. A VTDCE está presente durante todo o desenvolvimento embrionário, assim como em larvas. Interessantemente, esta cisteíno endopeptidase apresenta a propriedade de se associar a Vt por um outro sítio, além do sítio ativo. A VTDCE é a enzima mais eficiente na degradação de vitelina (Vt) em ovos de R. microplus, e devido a sua importância fisiológica, a VTDCE foi testada como antígeno em experimento de vacinação de bovinos e desafio com larvas de R. microplus. Os parâmetros mais afetados nos carrapatos alimentados em bovinos vacinados, com relação aos controles, foram o peso das fêmeas ingurgitadas (19,3 %) e a fertilidade dos ovos (17,6 %). Relacionado os parâmetros análisados, vimos que este antígeno confere uma proteção de 21% aos animais imunizados quando infestados por R. microplus. A proteção parcial alcançada pela VTDCE pode ser complementar a de outros antígenos no desenvolvimento de um coquetel antigênico contra carrapatos, uma vez que nenhum antígeno encontrado até o momento foi capaz de oferecer a proteção necessária para ser empregado individualmente na composição de uma vacina. Estudos como os realizados nesta tese contribuem para o melhor entendimento da biologia dos carrapatos, assim como para o desenvolvimento de novos e melhores métodos de controle desses parasitas. / Ticks are distributed worldwide impacting human and animal health. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main parasite that affects livestock in tropical and subtropical regions of world, causing large economical losses. Tick control methods are based on the application of chemical acaricides, which has resulted in selection of resistant ticks and a potential risk of environmental pollution and food contamination. Vaccines have been shown to be a feasible tick control method that offers a cost-effective, environmentally friendly alternative to chemical control. However, ten years after the commercialization of the first vaccine against ticks, to identify tickprotective antigens remains a limiting step in the development of an efficient formulation that would avoid the use of chemical acaricides. In face of this situation, to study the parasite biology and understanding physiological important mechanisms could be a good strategy to find new targets to be used in an efficient vaccine. In order that, this thesis subject was to investigate the reproduction process in ticks and to evaluate the efficiency of an enzyme involved in this process as vaccinal antigen. The process of vitellogenesis and embryogenesis were studied. In the first part, using Amblyomma hebraeum ticks as model, the role of 20- hydroxiecdisone and additional hemolymph borne factors in vitellogenin (Vg) uptake by oocytes were investigated. Our findings showed that there are different strategies to control Vg uptake by ovary in Ixodide ticks. Additionally, for Vg uptake in A. hebraeum ovaries, a vitellogenin uptake factor (VUF) present in female hemolymph is required. As embryo development depends on the availability of yolk material stored into the oocytes, in the second part we studied a cysteine endopeptidase involved in Vt digestion in R. microplus eggs, named vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE). Cysteine endopeptidase enzymes are widely distributed in these tick females. Studies with VTDCE demonstrate that it is a maternal derived endopeptidase involved in a route including extraovarian synthesis, transport, and ovary uptake, before internalization by oocytes. VTDCE is present during all tick development, as well as in larva. Interestingly, this cysteine endopeptidase is able to associate with Vt in another site than the active site. VTDCE showed to be the most efficient Vt hydrolytic enzyme in R. microplus eggs. So, supported by its physiological role, VTDCE was used as antigen in bovine vaccination and R. microplus challenge experiment. The most affected biological parameters in ticks fed on vaccinated animals were weight of engorged ticks (19.3 %), and egg fertility (17.6 %). Relating the biological parameters analyzed, bovine vaccination with VTDCE as antigen resulted in an overall protection of 21%. Therefore, this partial protection could be complementary in the formulation of an antigenic cocktail against tick, once there is not one single protein that achieves the protection level necessary for an efficient and practical vaccine development. Studies like that contribute to the better understanding of tick biology, as well as to the development of new and more efficient methods of control.

GVB é um patógeno agrícola composto por RNA de fita simples de senso positivo, com extremidades 3’ poliadeniladas e tem seu diagnóstico feito por testes biológicos, imunológicos e moleculares. Juntamente com outros vírus, causa a síndrome do “complexo rugoso”, que impede a pega da enxertia, destruindo o floema e matando a planta precocemente. A produção de anticorpos contra uma proteína do capsídeo e o desenvolvimento de teste imunológico são os objetivos deste trabalho. A clonagem da região codificante da proteína do capsídeo do Grapevine Virus B foi obtida por PCR, utilizando primers específicos para região codificante e com sítios de restrição para endonucleases BamHI e NdeI, obtendo-se um amplicon de 594 pb. Este fragmento foi clonado no vetor de expressão pET19b e transformado em Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). Para a expressão da proteína rGVB1a (24 kDa com cauda de histidina), estabeleceu-se uma indução de 1 mM de IPTG (isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside), mantida sob agitação a 250C por 18 horas. A expressão foi analisada por SDS-PAGE 13% e a presença da rGVB1a foi confirmada por Western blot, usando anticorpo monoclonal anti-histidina. A rGVB1a expressada foi purificada por cromatografia de afinidade a cauda de histidina em resina sepharose-Ni2+. A proteína purificada foi utilizada para imunizar um coelho e sete lotes de três camundongos para obtenção de soro policlonal e monoclonal contra a proteína recombinante. A fusão de células de linfócitos B com mielomas SP2/0 foi realizada, obtendo-se um hibridoma produtor de anticorpo IgG2a que em testes de ELISA e Western blot reconhecem a proteína recombinante. Adicionalmente, testes de Western blot utilizando extrato total de plantas sintomáticas e assintomáticas foram realizados para verificar se estes soros reconheciam a proteína nativa. / GVB is an agricultural pathogen composed by a single-stranded positive sense RNA with poliadenilated 3’ end and its diagnosis is based on biological, immunological and molecular tests. Together with another virus, it causes the rugose wood complex disease which prevents grafting, destroying the phloem and killing the plant early. The objectives of this work are the production of antibodies against the coat protein and the development of an immunological test. Cloning of a coat protein coding gene from Grapevine Virus B was performed by PCR, using specific primers for the coding region with restriction sites for BamHl and Ndel endonucleases, obtaining an amplicon of 594 bp. This fragment was cloned into the pET19b expression vector and transformed with Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). For expression of rGVB1a protein (24 kDa with histidine tail) a protocol with 1 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside), and shaking for 18 hours at 25ºC was established. The expression was analyzed by SDS-PAGE 13% and the presence of rGVB1a was confirmed by Western-blot, using an anti-histidine monoclonal antibody.rGVB1a expressed was purified by histidine tail Ni2+ Sepharose affinity chromatography. Purified protein was used to immunize a rabbit and seven lots of mice to obtain policlonal serum and monoclonal antibody against the recombinant protein. Cell fusions of lymphocyte B and SP2/0 were performed and a hybridoma producer of IgG2a antibody was obtained. This hybridoma recognized the recombinant protein in ELISA and Western blot tests. Additionally, Western blot using the extract of symptomatic and assymptomatic plants were developed to investigate if these serum recognize the native protein.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas constantemente pelo metabolismo aeróbico. Em situações de estresse biótico ou abiótico, a produção é aumentada e a toxicidade das ERO pode conduzir a diversos danos celulares. As ERO atuam também como moléculas sinalizadoras regulando a expressão de genes de defesa a estresses, senescência, morte programada da célula, crescimento e desenvolvimento da planta, entre outros processos metabólicos. Uma vez que as ERO são tóxicas e também participam de eventos de sinalização, as células vegetais requerem mecanismos que regulem finamente a concentração intracelular destas moléculas. A ascorbato peroxidase (APx) é uma enzima fundamental do metabolismo antioxidante, catalisando a decomposição do H2O2. Em arroz, a APx é codificada por oito genes, cujas isoformas são caracterizadas por sua localização subcelular: citosólica, peroxissomal, mitocondrial ou cloroplástica. O objetivo deste trabalho foi caracterizar funcionalmente as APx citosólicas (OsAPx1 e OsAPx2) e peroxissomais (OsAPx3 e OsAPx4). A estratégia utilizada foi o silenciamento pós-transcricional por RNA de interferência (RNAi) dos genes individualmente e de ambos os genes codificantes de isoformas do mesmo compartimento subcelular. A redução da expressão de cada gene, assim como de ambos os genes de um compartimento, resultou na produção de diferentes sinais. As plantas RNAi mostraram diferentes fenótipos e padrões de expressão transcricional dos genes da família OsAPx. Analisando as plantas silenciadas para os genes OsAPx1 e OsAPx2 sob estresse com radiação UV e altas doses de alumínio, foi observada compensação por outras enzimas antioxidantes e aclimatação, possivelmente sinalizados pelos níveis mais elevados de H2O2. Estes resultados indicam que cada isoforma de OsAPx pode apresentar funções específicas na célula. / Reactive Oxygen Species (ROS) are continually produced by aerobic metabolism. Under biotic and abiotic stresses, the production is enhanced and the ROS toxicity can lead to cell damage. ROS act also as signalling molecules and are able to regulate the expression of resistance genes, senescence, programmed cell death, plant growth and development, among other metabolic processes. By the fact that ROS are cytotoxic and make part of signalling events, plant cells need mechanisms to tightly regulate the intracellular concentration of these molecules. Ascorbate peroxidase (APx) is a fundamental enzyme of the antioxidant metabolism, it catalyses the H2O2 decomposition. In rice, APx are encoded by a small multigene family, and the different isoforms are classified according to their subcellular localization: cytosolic, peroxisomal, mithocondrial or chloroplastic. The present work aimed to characterize the function of cytosolic (OsAPx1 and OsAPx2) and peroxisomal (OsAPx3 and OsAPx4) APx isoforms. The strategy was the post-transcription silencing by interference RNA (RNAi) of single genes and both genes of the same subcellular localization. The reduced expression of each gene or both genes from the same compartment resulted in the development of different signals. RNAi plants showed changes in the phenotype and in the transcriptional expression of the OsAPx gene family. The analyses of OsAPx1 and OsAPx2 silenced plants under stresses with UV radiation and aluminum revealed that the lack of APx was compensated by other antioxidant enzymes and the acclimation could be signaled by the increased level of H2O2. These results indicate that each isoform of APx should have specific functions in the cell.

Infecções por Chlamydia trachomatis estão entre as mais freqüentes doenças sexualmente transmissíveis (DST) em todo o mundo, apresentando grande importância epidemiológica. A identificação deste patógeno pode ser difícil e um método de detecção baseado na amplificação de ácidos nucleicos é altamente desejável, por sua acurácia e rapidez. O presente estudo avaliou a acurácia, sensibilidade e especificidade de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) in “house” em amostras de urina de homens com e sem sintomas de DST comparados a um teste comercial, o COBAS Amplicor CT/NG (Roche, Suiça). Foram utilizados primers específicos para amplificar um segmento do plasmídio críptico de C. trachomatis gerando um fragmento de 201 pb, cuja seqüência foi confirmada por clivagem enzimática e seqüenciamento automático. A especificidade analítica dos primers foi confirmada frente ao DNA de diferentes microrganismos patogênicos e não patogênicos da microbiota urogenital masculina. A detecção limite do DNA clamidial pela PCR in house após hibridização (Southern blot), foi de 1 pg. O COBAS Amplicor CT/NG foi considerado o teste de referência por ser automatizado e conter um programa de controle interno da reação para identificar inibição da DNA polimerase. Entre as 37 amostras testadas positivas para C. trachomatis pelo COBAS Amplicor, 33 foram confirmadas positivas pela PCR in house. Foram detectados inibidores da reação nas 4 amostras que apresentaram resultados falso-negativos, utilizando-se a técnica de contaminação da reação com o DNA clamidial (spiked) e um controle interno da reação com primers que amplificam a β-globina do DNA humano. Após congelamento e descongelamento para eliminar prováveis substâncias inibidoras lábeis, as 4 amostras foram re-testadas, resultando na positividade de mais 2 amostras, completando 35 amostras positivas pela PCR in house. Entre as 74 amostras testadas negativas para C. trachomatis pelo COBAS Amplicor, 72 foram confirmadas negativas pela PCR in house. Das 2 amostras prováveis falso-positivas, apenas 1 permaneceu positiva, após re-teste. Dos 111 pacientes analisados, 108 apresentaram resultados idênticos nos dois testes, o equivalente a uma acurácia = 97,3%, sensibilidade = 94,6% e especificidade = 98,6%. A alta sensibilidade e especificidade apresentada pela PCR in house, demonstra a possibilidade de triar e diagnosticar C. trachomatis em urina de homens, importante reservatório da infecção clamidial para as mulheres. / Chlamydia trachomatis infections are among the most commum sexually transmitted diseases and of great epidemiological importance world-wide. Identification of this pathogen can be difficult, and it is highly desirable to have a rapid and accurate nucleic acid amplification based detection method. The present study was designe to evaluate the accuracy, sensitivity and specificity of a in house plasmid-based polymerase chain reaction (PCR) and hybridization on first void urine specimens from symptomatic and asymptomatic men, compared with a commercial test the PCR COBAS Amplicor CT/NG (Roche, Switzerland), for detection of C. trachomatis (CT). Specific primers for the cryptic plasmid of C. trachomatis were designed to amplify a 201 bp fragment confirmed by enzymatic cleavage and automatic sequencing. The analytic specificity was determined by submitting to the intended protocol, the DNA of normal and pathogenic urogenital microbiota, the specific primers anneling was confirmed. The detection limit of the PCR and the Southern blot hibridization, was mesured in 1 pg of chlamydial DNA. The COBAS Amplicor CT/NG was considered the reference test, it contains a internal control (IC) programme to identify DNA polymerase inhibition. Among 37 positive specimens tested by COBAS Amplicor, 33 were confirmed positive by in house PCR and inhibitors of PCR were demonstrated in the 4 possibly false-negative samples performing DNA chlamydial spiking experiments and using a positive internal control of human β-globin DNA. The specimens were freezedthowed and re-tested to remove labile inhibitors, but 2 samples remained negative. Among 74 negative specimens by COBAS Amplicor, 72 were confirmed negative by in house PCR. The 2 problaby false-positive samples were re-tested and just one remained positive. The final results of the two tests were identical for 108 of the 111 pacients, accuracy = 97,3% ; sensitivity = 94,6% and specificity = 98,6%. This study shows that the in house plasmid-based PCR is fasible for detection of Chlamydia trachomatis in male urine specimens. This test presented high accuracy, sensitivity and specificity, offering great potencial for the screening of men, an important reservoir of infection chlamydial for women.

As plantas superiores sintetizam uma ampla variedade de compostos, denominados classicamente metabólitos secundários, que as ajudam a se adaptar ao seu ambiente. Um subconjunto de metabólitos secundários são os alcalóides. Essas substâncias nitrogenadas de baixo peso molecular desempenham funções variadas nas plantas, podendo apresentar propriedades antibióticas, repelentes de herbívoros ou alelopáticas. O alcalóide monoterpeno indólico braquicerina, de estrutura inédita, foi extraído da planta arbustiva Psychotria brachyceras (Rubiaceae). Esse composto revelou ação específica como antiinflamatório em testes de quimiotaxia, possuindo, portanto, potencial valor farmacológico. Trabalhos anteriores revelaram que a molécula possui significativas propriedades antioxidantes e antimutagênicas, e que a concentração foliar desse alcalóide é induzida por dano mecânico e radiação ultravioleta (UV). Neste trabalho, demonstramos os resultados de uma série de experimentos desenvolvidos com o objetivo de entender o papel de braquicerina em P. brachyceras frente a esses estresses. Uma parte dos experimentos foi desenvolvida paralelamente com amostras de Psychotria carthagenensis da mesma região, que não acumula alcalóides e é mais sensível a UV do que P. brachyceras, além de ser alvo significativo de herbívoros em seu ambiente natural. O comportamento de algumas classes de metabólitos secundários reconhecidas como importantes na resposta a ferimento e radiação UV é descrito em amostras de P. brachyceras submetidas a esses tratamentos. A aplicação de dano mecânico e de radiação ultravioleta não alterou os níveis de compostos fenólicos e flavonóides totais, respectivamente. A única classe de metabólitos que sofreu regulação nessas condições foram antocianinas, que tiveram sua concentração induzida em experimentos de exposição à UV; porém, os teores induzidos em P. brachyceras foram muito menores do que àqueles basais em P. carthagenensis. Os dados sugerem um papel predominante do alcalóide frente a esses estresses. O potencial tóxico/repelente da braquicerina foi testado em bioensaios que utilizaram herbívoros generalistas. O alcalóide isolado não foi capaz de inibir o consumo das amostras pelos animais, o mesmo ocorrendo com extratos de P. brachyceras. Porém, extratos de P. carthagenensis inibiram a alimentação do molusco Helix aspersa, provavelmente pela presença de taninos. A atividade protetora do alcalóide foi testada em discos foliares de P. carthagenensis expostos à UV. A aplicação de braquicerina diminuiu a degradação de clorofilas causada pela radiação. Ensaios de atividade antioxidante in vitro e in vivo demostraram que o alcalóide é ativo em relação ao ânion superóxido e ao peróxido de hidrogênio, espécies ativas de oxigênio importantes no estresse por ultravioleta e dano mecânico, respectivamente. Além disso, foi verificado que epidermes foliares acumulam braquicerina. Os dados sugerem uma atividade predominantemente antioxidante ou moduladora de estresse oxidativo para o alcalóide. Essa atividade de detoxificação pode fazer parte de uma estratégia de tolerância da planta tanto em relação ao ultravioleta quanto ao ferimento/herbivoria e pode ser importante em outras condições adversas. / Higher plants synthesize a wide range of compounds, classically known as secondary metabolites, which help plants adapt to their environment. A class of secondary metabolites are the alkaloids. These nitrogen-containing low molecular weight substances play several roles in plants as antimicrobial, herbivore deterrents or allelopathic agents. The monoterpene indole alkaloid brachycerine, which has a unique structure, was extracted from the shrub Psychotria brachyceras (Rubiaceae). This compound showed antinflamatory activity in chemotaxis assays, indicative of pharmacological potential. Previous work described antioxidant and antimutagenic effects for brachycerine, and the regulation of its leaf tissue concentration upon ultraviolet (UV) radiation exposure and mechanical damage stress. In this thesis, we report the data from a series of experiments in an attempt to understand the roles of brachycerine in P. brachyceras with regard to wounding and UV stresses. Some experiments were carried on using samples from Psychotria carthagenensis shrubs of the same region, a plant devoid of detectable alkaloids. P. carthagenensis leaves are UV-sensitive if compared to P. brachyceras and are often found damaged by herbivores in field-grown plants. The contents of secondary metabolites with known functions in wounding and UV responses are described from experiments in which P. brachyceras samples were submitted to these treatments. The only group of secondary metabolites regulated by these stresses was that of anthocyanins in UV treated samples; however, induced content of these metabolites were always much lower than the basal ones in P. carthagenensis. The data indicated a major role for brachycerine in UV and wound responses. Toxic/deterrent properties of brachycerine were tested in bioassays with generalist herbivores. The alkaloid failed to deter herbivore feeding, however, samples treated with P. carthagenensis extracts were less consumed by the snail Helix aspersa, and this may be due to the presence of tannins. UV-protecting activity was tested in brachycerine-treated P. carthagenensis leaf disks exposed to UV radiation. Brachycerine treatment protected disk samples from UV-driven chlorophyll loss. In vitro and in vivo assays detected antioxidant activity of brachycerine towards superoxide anion and hydrogen peroxide, reactive oxygen species related to UV and wounding stress, respectively. In addition, it was shown that leaf epidermal layers accumulate brachycerin. The results suggest an antioxidant or oxidative stress modulator role for brachycerine in P. brachyceras. This detoxifying activity may be part of a tolerance strategy in relation to UV and wounding stresses, and perhaps to other environmental pressures.

Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-06T12:35:58Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO EVARISTO FINAL (1).pdf: 3619384 bytes, checksum: ce2f500cb5c5efadf38bd2d0f730d863 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-29T14:36:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO EVARISTO FINAL (1).pdf: 3619384 bytes, checksum: ce2f500cb5c5efadf38bd2d0f730d863 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T14:36:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO EVARISTO FINAL (1).pdf: 3619384 bytes, checksum: ce2f500cb5c5efadf38bd2d0f730d863 (MD5) / CNPq / A leishmaniose é uma doença de grande relevância à saúde pública em que a Leishmania braziliensis é um dos agentes etiológicos. Seu tratamento é realizado através da administração de medicamentos considerados tóxicos às células humanas, caros e ineficientes às diversas espécies de Leishmania, podendo resultar em cepas resistentes e por essas razões, estudos que abordem novas terapias com vista a reduzir os efeitos indesejados são de suma importância. A terapia fotodinâmica (TFD), é uma das técnicas ditas como sendo promissoras no tratamento de inúmeras doenças parasitárias. Portanto, foi proposto este trabalho com o objectivo de avaliar os efeitos da TFD na L. braziliensis, bem como a interação deste parasito com macrófagos J774, utilizando como fotossensibilizador, o azul de metileno na concentração de 12,5 µg/mL associado ao LASER vermelho de baixa potência com λ = 660 nm; 40 mW; 8,4J /cm2. Os testes foram realizados em triplicata, e as amostras foram distribuídas em quatro grupos: Grupo Controle, Grupo Fotossensibilizador, Grupo LASER, Grupo TFD. Como métodos avaliativos da morfologia e ultraestrura das promastigotas face aos efeitos da TFD sobre a Leishmania, foram utilizadas as microscopias eletrônicas de varredura e de transmissão. Para a avaliação da interação, foi utilizada a microscopia ótica. Nela, foram realizadas contagens de macrófagos infetados e não infetados. Como resultado, foi observado que a TFD foi capaz de criar deformações morfológicas e estruturais compatíveis com alterações promovidas por ‘stress’ oxidativo. Após a analise dos ensaios de interação foi observado que a infecção de macrófagos no grupo TFD apresentou taxa de infecção menor que no controle com uma significância de p=0.0339 e p=0.0181 nos períodos respetivos de 24 e 48 horas. Aavaliação estatística foi realizada através do teste ANOVA com pós-teste de Tukey, p <0,05. Assim, conclui-se que a TFD além de ser eficaz em causar danos potencialmente letais à promastigotas de Leishmania braziliensis ela também, é capaz de estimular a resposta do sistema imune, desempenhando um papel sinergístico. / Leishmaniasis is a disease of great importance to public health in what Leishmania braziliensis is one of the etiological agents. The treatment is performed by administering drugs considered toxic to human cells, expensive and inefficient to several species of Leishmania and can result in resistant strains and for these reasons, studies that address new therapies to reduce the unwanted effects are of paramount importance. Photodynamic therapy (PDT) is a technique said to be promising in the treatment of many parasitic diseases. Therefore, we proposed this work aimed to evaluate the effects of PDT in L. braziliensis and the interaction of this parasite with J774 macrophages, using as a photosensitizer, methylene blue at a concentration of 12.5 µg/mL associated with red Low power LASER with λ = 660 nm; 40 mW; 8,4 J/cm2. The tests were performed in triplicate, and the samples were divided into four groups: control Group, photosensitizer Group, LASER Group and TFD Group. As evaluative methods of morphology and structure, promastigotes against the effects of PDT on Leishmania, electronic microscopy scanning and transmission were used. For the evaluation of the interaction, the optical microscope was used. Here, infected macrophage counts were performed and uninfected. As a result, it was found that PDT was able to create morphological and structural deformation compatible with alterations resulting Oxidative stress. After the analysis of the interaction tests was observed that infection of macrophages in the PDT group showed lower infection rate than the control with a significance of p = 0.0339 and p = 0.0181 in the respective periods of 24 and 48 hours. Statistical analysis was performed using ANOVA with Tukey's post-test, p <0.05. Thus, the conclution is that PDT is effective in causing potentially lethal damage to Leishmania braziliensis promastigotes it is able to stimulate the immune system response and plays a synergistic role.

Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-04T13:02:41Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final-Adriana E F Morato.pdf: 2704014 bytes, checksum: 20efa22afe3e61e735f04f4257d1f05a (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-06T12:45:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final-Adriana E F Morato.pdf: 2704014 bytes, checksum: 20efa22afe3e61e735f04f4257d1f05a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-06T12:45:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Final-Adriana E F Morato.pdf: 2704014 bytes, checksum: 20efa22afe3e61e735f04f4257d1f05a (MD5) / CNPq / Atualmente, a produção de enzimas recombinantes é um dos mercados mais promissores para a biotecnologia. Processos catalisados por enzima são aplicados em diversos processos industriais por apresentarem alta eficiência catalítica, especificidade e seletividade, além do baixo consumo de energia, o que contribui positivamente com o Meio ambiente. A maioria dos biocatalisadores aplicados em processos industriais consiste em enzimas imobilizadas em resinas insolúveis. A imobilização aumenta a atividade catalítica, a estabilidade e também torna possível a aplicação da enzima em meio reacional contínuo assim como, sua reutilização no meio de reação. O interesse em torno do aprimoramento da técnica de imobilização e produção de biocatalisadores enzimáticos tem aumentado nos últimos anos, o que permite indicar o processo de purificação enzimática como o passo mais dispendioso na produção de enzimas. Este trabalho teve como objetivo desenvolver um processo adequado de purificação e imobilização de enzimas recombinantes em passo único, baseados na interação do his-tag com resinas específicas, que permita a produção de catalisadores enzimáticos aplicáveis à produção industrial com baixo custo. Para tanto, foram utilizadas três tipos de resinas da série Amberlite, as quais foram avaliadas quanto à sua interação com os íons Ni2+ ou Co2+, com proteínas inespecíficas e com a enzima lipase B de Pseudosyma antarctica transformada com cauda de hexahistidina. Paralelamente, análises da eficiência catalítica da lipase foram realizadas através da mensuração da atividade hidrolítica por meio de testes de degradação do pNPP e concentração da proteína pelo método colorimétrico de Bradford. No presente estudo, foi realizada uma prospecção tecnológica com o intuito de avaliar o desenvolvimento da tecnologia no mundo. Esse estudo indicou a necessidade de pesquisas no Brasil. Entre os suportes testados, a resina Amberlite IRN77 carregada com íons Ni2+ e pré-tratada com tampão Tris-HCl (pH 7.0) apresentou dados favoráveis quanto a ligação de íons metálicos e proteína inespecífica, sendo utilizada nas etapas de purificação e imobilização enzimática. A lipase PALB purificada na coluna apresentou uma boa atividade catalítica (522U/g) em meio aquoso, mesmo na presença de compostos desnaturantes. Com isso, um suporte de baixo custo foi empregado para o processo de purificação e imobilização enzimática. Este trabalho é um novo passo para o esclarecimento dos processos envolvidos na técnica de purificação e imobilização de enzimas em passo único, além de contribuir para a pesquisa no país por meio de uma patente que está sendo desenvolvida. / Currently, the production of recombinant enzymes is one of the most promising markets for biotechnology. Catalyzed processes by enzymes are applied in many industrial processes because they have high catalytic efficiency, specificity and selectivity, in addition to low power consumption, which contributes positively to the environment. Most of biocatalysts in industrial processes are applied in immobilized enzyme insoluble resins. The immobilization enhances the catalytic activity, stability and also makes possible the use of continuous enzyme reaction medium as well as reuse in the reaction medium. The interest around the improvement of production technique and immobilization of enzyme biocatalysts has increased in recent years, allowing indicate enzymatic purification process as the most expensive step in the production of enzymes. This study aimed to develop an appropriate process of purification and immobilization of recombinant enzymes in one step, based on the interaction of his-tag with specific resins, allowing the production of enzymatic catalysts applicable to industrial production at low cost. For this purpose, three types of resins Amberlite series, which were evaluated for their interaction with Ni2+ ions, were used or Co2+, with nonspecific proteins and their Pseudosyma antarctica lipase B transformed with hexahistidine tail. In parallel, analyses of the catalytic efficiency of lipase were performed by measuring the hydrolytic activity by testing the degradation of pNPP and protein concentration by the Bradford colorimetric method. In the present study, a technological exploration was performed in order to evaluate the development of technology in the world. This study indicated the need for research in Brazil. Among the tested media, the Amberlite IRN77 charged with Ni2+ ions and pre-treated with Tris-HCl buffer (pH 7.0) presented favorable data for binding of metal ions and nonspecific protein being used in purification and immobilization stage of enzyme. The purified lipase PALB column showed good catalytic activity (522U/g) in an aqueous medium, even in the presence of denaturing compounds. With this, a low-cost support was used for the process of purification and enzyme immobilization. This work is a further step towards the understanding of the processes involved in the art for purification and immobilization of enzymes in a one step, as well as contributing to research in the country through a patent that is being developed.

Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-04T12:20:08Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Fúlvia - pdf.pdf: 2635541 bytes, checksum: 2467e7499254166de412e643a75fac66 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-06T12:50:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Fúlvia - pdf.pdf: 2635541 bytes, checksum: 2467e7499254166de412e643a75fac66 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-06T12:50:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Fúlvia - pdf.pdf: 2635541 bytes, checksum: 2467e7499254166de412e643a75fac66 (MD5) / CAPES / O bioma restinga pode ser caracterizado por áreas arenosas, de alta salinidade e com uma vegetação típica, com plantas adaptadas e de ocorrência descontínua no litoral brasileiro, sendo inclusive a transição para a mata atlântica. A maçaranduba, Manilkara salzmannii, uma sapotácea muito comum em áreas de transição e em vários biomas, inclusive na floresta amazônica atingindo mais de 20 metros de altura e usada como madeira para reflorestamento e na fabricação de móveis, mas várias espécies de plantas do gênero Manilkara sp tem características herbáceas como na restinga, sendo retorcida e com folhas duras e alternadas, A ocorrência de plantas da família Sapotaceae na restinga, pode representar um modelo para estudos desde em eco-fisiologia até de biodiversidade. Os micro-organismos endofíticos vivem no interior das plantas e desempenham importantes papéis ecológicos, podendo ser benéficos às plantas, como produtores de fito-hormônios e agentes de controle biológico e até prejudiciais, como os fitopatógenos, Recentemente, tem-se estudado fungos endofíticos principalmente para fins de bioprospecção e neste trabalho foram isolados e caracterizados endofíticos de Manilkara salzmannii quanto á atividade antimicrobiana. Um isolado, MK001, apresentou atividade antimicrobiana, onde, diferentes frações do mesmo extrato, inibiram fungos (Candida albicans ATCC18804) e bactérias (Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Corynebacterium sp. VD57). Este isolado foi caracterizado como do gênero Lophiostoma sp., Ordem Pleosporales, e com características que podem indicar uma nova espécie. / The biome sandbank, can be characterized by sandy areas, high salinity and with a typical vegetation with plants adapted and with a discontinuous occurrence of the Brazilian coast, and even the transition to rainforest. The maçaranduba, Manilkara salzmannii, represents a sapotacea very common in transitions areas and can be found in various biomes, including the Amazon rainforest reaching over 20 feet tall and used as wood for reforestation and the manufacture of furniture, but several species of plants from this genus Manilkara sp has herbaceous characteristics, mainly in the sandbank, being twisted and stiff and alternate leaves, the occurrence of plants from the Sapotaceae family in sandbank, may represent as a model for studies on ecophysiology and biodiversity. Endophytic microorganisms living inside the plants and play important ecological roles, may be beneficial to plants as producers of phyto-hormones and biological control agents and even harmful, such as pathogens, has been recently studied, mainly endophytic fungi for bioprospecting purposes and in this work were isolated and characterized endophytic from Manilkara salzmannii with the goal to selected fungi with an antimicrobial activity. One isolate, MK001, shows antimicrobial activity, where different fractions from the same extract was able to inhibit the growth fungi Candida albicans and bacteria (Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Corynebacterium sp.). This isolate was characterized as genus Lophiostoma sp., Order Pleosporales, and can be a new species.

Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-04T13:16:42Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Final - LUISA CARVALHO ANDRADE.pdf: 1905703 bytes, checksum: d26c7953ce5663f0aca0a866c5701328 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-06T12:52:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Final - LUISA CARVALHO ANDRADE.pdf: 1905703 bytes, checksum: d26c7953ce5663f0aca0a866c5701328 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-06T12:52:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Final - LUISA CARVALHO ANDRADE.pdf: 1905703 bytes, checksum: d26c7953ce5663f0aca0a866c5701328 (MD5) / FAPESB / A Baía de Todos os Santos (BTS), segunda maior baía do Brasil, abriga grande diversidade de ambiente, flora e fauna, porém pouco se sabe sobre sua diversidade microbiológica e seu potencial de bioprospecção. Este trabalho teve por objetivo a busca de novas substâncias antimicrobianas, capazes de inibir o crescimento de bactérias patogênicashumanas e de animais marinhos, isolados do solo de cinco praias da BTS. No total foram isoladas 107 bactérias das quais dez apresentaram produção de substâncias antimicrobianas. Após o sequenciamento verificou-se que dos dez isolados, somente oito foram de fato identificadas molecularmente, sendo sete destes membros da família Bacillaceae, grupo ao qual pertencem diversas produtoras de substâncias antimicrobianas. Entre os isolado que apresentaram produção de substâncias inibidoras do crescimento constatou-se que os isolados 21, 50 e 54 tinham maior poder de inibição. O extrato destes três isolados foi confeccionado através da acidificação do sobrenadante livre de células, isolado após o período de incubação. Os extratos do isolado 21 e do isolado 50 foram capazes de inibir a bactéria Klebsiella rizophyla, e o extrato 21 conseguiu ainda inibir a Vibrio vulnificus. Após verificação molecular através de primers específicos de sete substâncias antimicrobianas produzidas por Bacillus, constatou-se que os isolados 21 e 50 são produtores da substância ericina. / The All Saints´s Bay (BTS), the second largest bay in Brazil, where can be founded great diversity of flora and fauna including diversity of landscapes, but unknown about their microbial diversity and potential to bioprospecting. This study aimed to search for new antimicrobial substances that can be able to inhibit the growth of human pathogenic bacterias and marine animals, isolated from sediment from five BTS beaches. Was isolated a total of 107 bacterias where 10 showed antimicrobial substances production. After 16S sequencing, was found that from the ten isolates, only eight were identified by amplification PCR and seuqencing, seven members of the Bacillaceae family, where antimicrobial substances belonging this group are known. It was found that the isolates numbers 21, 50 and 54 had a greater power of inhibition. The extract of these three strains was made by acidification of the cell-free supernatant, isolated after the incubation period. The extracts of the isolate 21 and 50 were able to inhibit the bacteria Kocuria rhizophyla , and the same extract could also inhibit Vibrio vulnificus. In advance, was realized a molecular bioprospecting using specific molecular primers from conserved regions belongs to seven antimicrobial substances produced by Bacillus. It was found that the isolates 21 and 50 are Erycina producing.

Submitted by Renorbio (renorbioba@ufba.br) on 2017-08-15T14:32:14Z No. of bitstreams: 1 Tese_ Zulane Lima Sousa_ Atividades biológicas de extratos e frações das folhas de Persea americana e Syzygium malaccense_ 2016.pdf: 3239265 bytes, checksum: 5c62167b6ccb9fb8640e54efc7cd1af4 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-08-28T13:56:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_ Zulane Lima Sousa_ Atividades biológicas de extratos e frações das folhas de Persea americana e Syzygium malaccense_ 2016.pdf: 3239265 bytes, checksum: 5c62167b6ccb9fb8640e54efc7cd1af4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-28T13:56:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ Zulane Lima Sousa_ Atividades biológicas de extratos e frações das folhas de Persea americana e Syzygium malaccense_ 2016.pdf: 3239265 bytes, checksum: 5c62167b6ccb9fb8640e54efc7cd1af4 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia – FAPESB / Os produtos naturais são fonte de substâncias biologicamente ativas, especialmente as plantas, as quais passaram por anos de processos adaptativos contra fatores abióticos, como temperaturas extremas, falta de água, luz e nutrientes, assim como fatores bióticos, como insetos e micro-organismos. Esse processo adaptativo permitiu o desenvolvimento de metabólitos secundários que hoje são alvo para o estudo de compostos bioativos. Na área médica, a necessidade de novas drogas antimicrobianas ocorre devido ao crescente número de casos de micro-organismos resistentes às drogas de uso atual, além do que no caso dos antifúngicos, muitos são tóxicos, devido à similaridade de células eucariotas humanas e fúngicas. Na área agronômica, o problema de perda de produção pela ação de fitopatógenos é preocupante, principalmente para aquelas culturas que ainda não têm um método de controle eficaz e humanamente e ambientalmente seguros, como é o caso do cacaueiro (Theobroma cacao Linn.) infectado por Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime and Phillips-Mora, que causa a vassoura de bruxa. Com base nisto, este trabalho foi realizado com o objetivo de buscar substâncias bioativas em extratos das folhas de Persea americana Miller e Syzygium malaccense (L.) Merr. & Perry, plantas já utilizadas na medicina tradicional contra doenças infecciosas. A fração diclorometanólica de P. americana (PAD) apresentou atividade contra M. perniciosa com concentração de 500 µg/mL, apresentando 0,3% de sobrevivência quando comparado ao controle sem tratamento (p<0,05). Através dos estudos realizados, essa ação provavelmente é devida à presença de flavonoides nessa fração, os quais possivelmente agem sobre a membrana plasmática do fungo, levando-o à morte. Já o extrato bruto metanólico de S. malaccense (SMM) apresentou atividade contra Enterococcus faecalis resistente à vancomicina (ATCC 51299) e Staphylococcus aureus multirresistente (ATCC 43300), com concentração inibitória mínima (CIM) de 100 μg/mL. A fração aquosa de S. malaccense (SMA) mostrou atividade contra Candida albicans (CIM = 50 μg/mL) e Candida krusei (CIM = 6,25 μg/mL). A fração etanólica (SME) apresentou atividade contra Candida parapsilosis e C. albicans (CIMs = 100 μg/mL). Dessa maneira, tanto a fração PAD pode ser utilizada como uma alternativa para o controle da vassoura de bruxa, como as frações SMM, SMA e SME podem ser utilizadas para a elaboração de formulações farmacêuticas para o uso terapêutico. / Natural products are sources of biologically active substances, especially plants, which have gone through years of adaptive processes against abiotic factors such as extreme temperatures, and water, light and nutrients lack, as well as biotic factors such as insects and micro-organisms attacks. This adaptive process allowed the development of secondary metabolites that are now targeted for the study of bioactive compounds. In the medical field, the need for new antimicrobial drugs is due to the increasing number of cases of microorganisms resistant to currently useed drugs and in the case of antifungals many are toxic due to the similarity of human and fungal eukaryotic cells. In agronomy, the problem of lost production by plant pathogens action is worrying, especially for those crops that do not yet have an effective control method humanly and environmentally safe, as is the case of the cacao tree (Theobroma cacao Linn.) infected with Moniliophthora pernicious (Stahel) Aime and Phillips-Mora, which causes witches' broom. Based on this, this study was conducted with the objective of seeking bioactive compounds in extracts of Persea americana Miller and Syzygium malaccense (L.) Merr. & Perry leaves, plants already used in traditional medicine against infectious diseases. P. americana dichloromethane fraction (PAD) showed activity against M. perniciosa at concentration of 500 µg/mL, with 0.3% survival when compared to the untreated control (p <0.05). Through studies carried out, this action is probably due to the presence of flavonoids in this fraction, which possibly acts on the plasma membrane of the fungus, leading to death. S. malaccense crude methanol extract (SMM) showed activity against vancomycin-resistant Enterococcus faecalis (ATCC 51299) and multidrug-resistant Staphylococcus aureus (ATCC 43300) with minimum inhibitory concentration (MIC) of 100 µg/mL. The S. malaccense aqueous fraction (SMA) showed activity against Candida albicans (MIC = 50 µg/mL) and Candida krusei (MIC = 6.25 µg/mL). The S. malaccense ethanol fraction (SME) showed activity against Candida parapsilosis and C. albicans (MIC = 100 µg/mL). Thus, the PAD fraction may be used as an alternative for the control of witch's broom, as well as the SMM, SMA and SME fractions can be used for the preparation of pharmaceutical formulations for therapeutic use.