Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais. / Made available in DSpace on 2012-10-18T03:35:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 188418.pdf: 379221 bytes, checksum: d605d37ab3da0f6d746da502781349e1 (MD5) / Na área agrícola, a engenharia genética se destaca por oferecer a possibilidade de se alterar características de cultivares já conhecidas através da introdução de um ou vários genes naturais ou sintetizados artificialmente. A fruticultura Brasileira experimentou considerável crescimento no decorrer das últimas três décadas, sendo que a crescente demanda por quantidade e qualidade nos mercados interno e externo tem forçado este ramo da agroindústria nacional a adotar cada vez mais tecnologias que permitam suprir esta demanda. O cultivo de fruteiras tem severas limitações decorrentes das condições climáticas nas regiões produtoras, o que resulta na ocorrência de doenças fúngicas responsáveis por perdas substanciais em pomares e em pós-colheita. Existem patógenos de fruteiras para os quais o controle químico é feito a um custo que muitas vezes chega a comprometer a economicidade do cultivo, além de apresentar um nível de controle nem sempre satisfatório. Há, portanto, a necessidade de se melhorar geneticamente o material usado para a produção de frutas no Brasil, sob pena de se perder a competitividade ao longo do tempo. Nesse sentido, avanços na área da engenharia genética têm proporcionado novas oportunidades de obtenção de cultivares resistentes, sendo que uma série de limitações biológicas podem ser vencidas pelos melhoristas.

Orientador: Lara Durães Sette / Banca: Maria Aparecida Marin Morales / Banca: Carlos Renato Corso / Banca: Valeria Maia de Oliveira / Banca: Vera Maria Valle Vitali / Resumo: Considerando a importância dos processos de biorremediação, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o potencial de consórcios microbianos, constituídos por quatro fungos filamentosos isolados de invertebrados marinhos e duas bactérias recuperadas de reservatório de petróleo, na destoxificação de poluentes ambientais, por meio da sobrevivência do microcrustáceo Artemia sp. e da luminescência da bactéria Vibrio fischeri. Após estudos de antagonismo entre os micro-organismos, foram estruturados oito consórcios microbianos, em diferentes combinações. Os consórcios foram usados, isoladamente, para avaliar a toxicidade dos poluentes ambientais corante têxtil RBBR (Remazol Brilliant Blue R), óleo diesel e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Dentre os consórcios estudados, o consórcio 3, composto por dois fungos filamentosos e pelas duas bactérias, apresentou melhores resultados de destoxificação do corante RBBR e óleo diesel, após sete dias de cultivo a 28 oC e 140 rpm. As enzimas ligninolíticas apresentaram atividade baixa ou ausente no teste feito com o corante e com o óleo diesel. Para o benzo[a]pireno (BaP), apesar de ter havido uma produção mais expressiva de enzimas ligninolíticas, os resultados de destoxificação foram incoerentes, por não apresentar toxicidade mesmo em elevadas concentrações. Sendo assim, no presente estudo o consórcio 3 foi empregado na otimização da destoxificação e descoloração do corante RBBR. Os resultados de dois planejamentos do tipo Plackett-Burman (PB1 e PB2) e um DCCR (Delineamento Composto Central Rotacional) revelaram que as melhores condições de destoxificação/descoloração foram obtidas no ensaio 11 do PB1 e no ensaio 2 do PB2. As condições de cultivo desses dois ensaios foram submetidas a experimentos de validação, porém ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico) / Abstract: Taking into account the relevance of bioremediation processes, the present work aimed to evaluate the potential of microbial consortia composed by four filamentous fungi isolated from marine invertebrates and two bacteria recovered from oil reservoirs in the detoxification of environmental pollutants, through the survival of the microcrustacean Artemia sp. and the luminescence of the bacterium Vibrio fischeri. After studies of antagonism between the microorganisms, eight microbial consortia were structured in different combinations. The consortia were tested separately against the environmental pollutants RBBR (Remazol Brilliant Blue R) textile dye, diesel oil, and polycyclic aromatic hydrocarbons. Among the consortia studied, the consortium 3, composed of two filamentous fungi and two bacteria presented better results of RBBR dye and diesel detoxification after seven days at 28 oC and 140 rpm. Ligninolytic enzymes showed low or absent activity in the experiments containing RBBR and diesel. For benzo[a]pyrene (BaP), although there was a more expressive production of ligninolytic enzymes, the results of detoxification were incoherent, since no toxicity was showed even at high concentrations. Therefore, in the present study the consortium 3 was used to optimize detoxification and discoloration of RBBR dye. Results from two Plackett-Burman designs (PB1 and PB2) and one CCD (Central Composite Design) revealed that the best conditions for detoxification/ discoloration were obtained in the assay 11 from PB1 and assay 2 from PB2. The culture conditions of this two assays were submitted to validation experiments, however only assay 2 from PB2 (4 cylinders (0.5 cm) of each fungus, and 4 mL of each bacteria (OD 0.4), 1 g/50 mL wheat bran, 100 % artificial sea water, pH 8, and 500 ppm RBBR) presented ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T16:33:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 273860.pdf: 2877096 bytes, checksum: 3f6283aa90114783b89e2a4000ab45e8 (MD5) / O vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV) é uma doença que afeta várias espécies de crustáceos, causando grandes mortalidades e perdas econômicas em regiões produtoras de camarão. Este trabalho teve como objetivo padronizar a metodologia de PCR em Tempo Real para a detecção do WSSV, genotipar isolados geográficos do vírus e isolar genes diferencialmente expressos em camarões de cultivo infectados com WSSV. Amostras positivas e negativas por PCR nested foram analisadas através de PCR em Tempo Real. A carga viral das amostras foi determinada e algumas amostras negativas por PCR nested foram positivas por PCR em Tempo Real, com baixa carga viral. Vírus isolados de camarões coletados em Santa Catarina e na Bahia foram comparados quanto ao padrão de três minissatélites, à presença de uma grande deleção e uma transposase. Todas as amostras de Santa Catarina tiveram o mesmo padrão para os minissatélites analisados.As amostras da Bahia apresentaram um padrão diferente para os loci analisados, indicando que existem dois genótipos de WSSV diferentes no Brasil. Os isolados brasileiros tem uma deleção de 10,780 bp na ORF 23/24 e não possuem a seqüência da transposase. O padrão de repetições para os três minissatélites analisados foi diferente entre os isolados brasileiros e de outros países da América. Entretanto, ao analisar apenas a ORF 94, Santa Catarina, México, Nicarágua, Honduras e Panamá têm mais de nove repetições, enquanto a Bahia e os EUA têm menos de nove repetições. Esta similaridade pode estar relacionada a uma similaridade em virulência. Aparentemente, os WSSVs encontrados na Bahia e em Santa Catarina originaram-se de diferentes fontes de contaminação ou o vírus sofreu mutações ao longo do tempo. mRNA foi extraído das brânquias de camarões infectados e não-infectados com o WSSV, reversamente transcrito e uma hibridização subtrativa (SSH) foi realizada. A Biblioteca 1 (genes induzidos) tem 300 clones dos quais foram formados 36 contigs e 36 singlets. Destas seqüências, 69 (88,4%) são similares a seqüências no GeneBank. Na Biblioteca 2 (genes reprimidos), de 403 clones, foram formados 23 contigs e 36 singlets e 40 (75,5%) são similares a seqüências conhecidas. Estes genes foram organizados em grupos, de acordo com a sua função. Dentre os genes induzidos há genes envolvidos na síntese de ATP, citoesqueleto, adesão celular, metabolismo e transporte de moléculas. Dentre os genes reprimidos, há genes envolvidos na defesa contra bactérias, transdução de sinal e biossíntese de ácidos nucléicos. A infecção pelo WSSV parece alterar várias rotas metabólicas diferentes. / White Spot Syndrome Virus (WSSV) is a disease that affects several species of crustaceans, causing high mortality rates, which has been causing great economical losses in shrimp farming regions. The aims of this study were to standardize the Real Time PCR methodology for WSSV detection, to genotype geographical isolates of the virus and to isolate differentially expressed genes in farmed shrimps infected with WSSV. Samples positives and negatives by nested PCR were analyzed by Real Time PCR. The viral load of the samples was determined and some samples negative by nested PCR were positive by Real Time PCR, with low viral load. The pattern of three minisatellite regions, the presence of a deletion and a transposase were compared in virus isolated from shrimp collected in Santa Catarina and Bahia. All Santa Catarina samples had the same pattern for the minisatellites analyzed. Bahia samples showed a different pattern for the loci, indicating that there are two different ORF 23/24 and do not have a transposase sequence. The repeat number pattern for the three minisatellite analyzed was different between the Brazilian isolates and isolates from America#s countries. However, when analyzing only ORF 94, South Brazil, Mexico, Nicaragua, Honduras and Panama have all more than nine repeats, while Northeast Brazil and USA samples have less than nine repeats. This similarity of repeats could be related to a similarity in virulence. Our results show that WSSV found in Bahia and Santa Catarina States have originated from different sources of contamination or the virus have undergone mutations during time. mRNA was extracted from gills of shrimps infected and non-infected with WSSV, reverse transcribed and a suppression subtractive hybridization (SSH) was performed. Library 1 (induced genes) has 300 clones, which formed 36 contigs and 36 singlets. Of these sequences, 69 (88,4%) are similar to sequences in GeneBank. Library 2 (repressed genes), has 403 clones, which formed 23 contigs and 36 singlets, and 40 sequences (75,5%) are similar to known sequences. These genes were organized in groups, according to their functions. Among the induced genes there are genes involved in ATP synthesis, cytoskeleton, cell adhesion, metabolism and molecule transport. Among the repressed genes, there are genes involved in antibacterial defence, signal transduction and nucleic acids biosynthesis. WSSV infection seems to alter several metabolic routes.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009 / Made available in DSpace on 2012-10-24T20:11:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 270312.pdf: 1276526 bytes, checksum: df4944e102b03f66313ae4454f115adf (MD5) / Embora adenovírus (Ad) humano do sorotipo 5 tenha sido utilizado como vetor vacinal contra inúmeras doenças infecciosas, a população humana apresenta imunidade pré-existente contra estes vírus. Para transpor este problema, Ad de outras espécies animais, tal como o Ad isolado de chimpanzés do sorotipo 6, denominado AdC6, tem sido utilizado. No entanto, existem poucos estudos sobre a resposta imune induzida por AdC6 em tecidos de mucosas. Este estudo avaliou células T ?/d e células NK das mucosas do trato genital de camundongos BALB/c após imunização intravaginal com o vetor AdC6 expressando a proteína Gag do HIV-1 (AdC6gag37). Análises de citometria de fluxo demonstraram que imunização com 1010 partículas virais de AdC6gag37 aumentou a frequência e o número de células T ?/d nas mucosas do trato genital. O número de células T ?/d atingiu seu pico três dias após a imunização, uma resposta que decresceu no sétimo dia. Além disso, detectou-se aumento relevante da expressão do marcador de ativação CD69 em células T ?/d do trato genital. Entretanto, não houve alteração na expressão da molécula CD25. Adicionalmente, para investigar o perfil de expressão gênica após exposição ao vetor adenoviral, células T ?/d do trato genital de camundongos imunizados foram isoladas magneticamente e avaliadas através de PCR em tempo real. Observou-se que AdC6gag37 foi capaz de aumentar a expressão de genes (1) relacionados com mecanismos de citotoxicidade mediado por células, tais como perforina e granzima B, (2) citocinas pró-inflamatórias, IL-6 e IL-12 e (3) quimiocinas CXCL-10, CCL5, CCL3 e CCL4. Demonstrou-se também que imunização com AdC6gag37 (105 e 107 partículas virais) foi capaz de induzir aumento expressivo na freqüência e no número de células NK do trato genital. Estes resultados indicam que AdC6gag37 modula a freqüência e o número de células T ?/d e células NK nas mucosas do trato genital e sugerem que estas células podem influenciar a resposta imune durante a imunização.

Dissertação (mestrado) - Univesidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009 / Made available in DSpace on 2012-10-24T20:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 270064.pdf: 1678063 bytes, checksum: de89498cbd9fdaf3dc0f4c547d9752f1 (MD5) / Nas últimas décadas, a contaminação dos ecossistemas marinhos tem aumentado como consequência da atividade humana, expondo os organismos a uma variedade de contaminantes oriundos da atividade industrial, agricultura e efluentes urbanos. O despejo de esgoto doméstico é a principal fonte de contaminação em ambientes costeiros e é considerado como uma das principais causas da diminuição da qualidade destes ecossistemas. Estudos que vêm sendo desenvolvidos no Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática e Imunoquímica visam a identificação e validação de novos biomarcadores de exposição ao esgoto doméstico em ostras para que possam ser futuramente utilizadas em programas de avaliação e biomonitoramento dos efeitos tóxicos causados por estes contaminantes. Este trabalho está dividido em dois capítulos. No primeiro capítulo são apresentados os resultados de experimentos realizados com ostras Crassostrea gigas expostas em um ambiente contaminado por esgoto doméstico. Foram analisadas a expressão de alguns genes previamente identificados em uma biblioteca subtrativa supressiva de cDNA em brânquias de C. gigas expostas a esgoto doméstico em condições de laboratório. A expressão do gene FABP apresentou uma indução significativa (28x) após 24 h de exposição, enquanto o gene GSTO obteve um aumento significativo na expressão após 1, 2 e 7 dias de exposição (8, 3.5 e 3.3x respectivamente). No segundo capítulo estão apresentados os resultados e uma discussão sobre os genes ativados e identificados em uma biblioteca subtrativa supressiva de cDNA em glândula digestiva de ostras C. gigas expostas por 24h no ambiente, sob condições de exposição real ao esgoto doméstico não tratado. Genes de diferentes categorias de função biológica foram encontrados após buscas no GenBank, incluindo alguns relacionados a resposta ao estresse, classe tipicamente utilizada em programas de biomonitoramento como biomarcadores moleculares de exposição. Também foram identificados genes relacionados com a o citoesqueleto, cadeia respiratória, desenvolvimento e diferenciação, divisão celular, metabolismo básico, maquinaria transcricional e traducional, transporte e armazenamento. Ambos trabalhos complementam os estudos em andamento no laboratório, ajudando na viabilização de metodologias práticas para o monitoramento de recursos marinhos utilizando organismos sentinela.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009 / Made available in DSpace on 2012-10-24T21:54:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 270587.pdf: 3722917 bytes, checksum: 5fca0f886701d91246cca285d114360f (MD5) / O recente avanço da biologia molecular tem ampliado o conhecimento relacionado a invertebrados marinhos e peixes, gerando inúmeras possibilidades de novas aplicações biotecnológicas. No presente estudo foram identificados e caracterizados novos genes em organismos modelo para estudos ecotóxicológicos. No capítulo I, foram estudados aspectos moleculares, bioquímicos e químicos, da ostra-do-mangue Crassostrea rhizophorae, uma espécie de importância econômica, ecológica e social que ocorre amplamente em estuários e manguezais na costa brasileira, áreas de risco constante de contaminação. Ostras expostas a efluentes contendo esgoto doméstico na Baía Norte da Grande Florianópolis mostraram aumento na atividade da enzima catalase, um biomarcador clássico de contaminação aquática. Bibliotecas subtrativas em ostra, comparando local contaminado e referência, possibilitaram a identificação de 36 novos genes de interesse para estudos ecotoxicológicos em C. rhizophorae, alguns deles codificam proteínas possívelmente envolvidas em biotransformação de xenobiótico, metabolismo de lipídeo, defesa imune, estresse oxidativo e ligante de metais. No capítulo II, bibliotecas públicas de sequências nucleotídicas expressas (ESTs) foram pesquisadas a fim de identificar novos genes de citocromo P450 (CYP) em moluscos bivalves dos gêneros Mytilus (mexilhões) e Crassostrea (ostras). Um total de 113 sequências CYP foram encontradas, a maioria em M. californianus (58). A caracterização preliminar do sistema complemento CYP em M. californianus, mostra que assim como é observado em deuterostômios, há uma expansão do Clan 2 neste organismo. Sequências similares as famílias CYP1, CYP3 e CYP26 de vertebrados foram clonadas em M. edulis, e a expressão órgão-específica e indução por contaminantes para estes genes foram avaliadas. Os genes CYP1-like, similares a CYP1A, que é proposto há décadas como biomarcador para agonistas do receptor AHR em vertebrados, não foi induzida por estas substâncias em M. edulis. Interessantemente, genes CYP3-like e CYP26-like foram induzidos por beta-naftoflavona, o que indica que diferentes mecanismos de ativação gênica, e provavelmente de biotransformação, ocorra nos CYPs em moluscos, quando comparados às famílias CYP similares de vertebrados. Este é o primeiro estudo a mostrar a diversidade do sistema complemento CYP (mesmo que de forma preliminar); clonar genes CYP1-like, CYP3-like e CYP26-like; e caracterizar a expressão destes genes em um molusco bivalve. No capitulo III foram identificados três novos genes CYP1 no peixe-modelo ambiental Fundulus heteroclitus. O set completo de genes CYP1 de peixe (CYP1A, CYP1B1, CYP1C1, CYP1C2 e CYP1D1), mostraram diferentes padrões de distribuição órgão-específica e indução por PCB 126, o que permitiu a escolha das combinações órgão/CYP1 mais apropriadas para detecção de contaminantes agonistas do receptor AHR. Estudos em uma população de F. heteroclitus proveniente de um local historicamente contaminado por PCB mostrou diferenças na expressão de alguns desses novos genes que podem estar relacionadas à adaptação para viver nestes locais. Os genes mais apropriados para detecção de contaminantes agonistas do AHR (CYP1A, CYP1B1 e CYP1C1) também foram clonados no peixe Poecilia vivipara, e poderão servir como biomarcadores de contaminação aquática nesta espécie amplamente distribuída em ambientes contaminados da costa Brasileira. Este trabalho apresenta um estudo sobre a aplicabilidade da técnica óptica shearografia para caracterizar a localização e profundidade de defeitos em materiais compósitos. Foi desenvolvido através de experimentos controlados tendo como base conjuntos de corpos de prova contendo falhas artificiais quadradas, propositalmente introduzidas entre as lâminas de um material compósito fabricado com resina epóxi e fibras de vidro unidirecionais e cruzadas. Defeitos de diferentes tamanhos foram dispostos em diferentes profundidades ao longo da espessura do material. O principal tipo de carregamento utilizado foi do tipo vibracional associado às técnicas de Média-Temporal, com iluminação contínua do laser para se obter a resposta da amplitude de modulação através de franjas de interferência e à técnica com iluminação Estroboscópica de forma a conseguir mapas das diferenças de fases referentes à superfície analisada. Foram produzidos conjuntos de corpos de prova com e sem falha de adesão artificialmente provocada. As respostas em freqüência foram relacionadas às profundidades das diferentes falhas. As relações freqüência x profundidade apresentaram bom comportamento, conforme descrevem as bibliografias consultadas. Também foram comparados os resultados obtidos através do modelamento matemático com os obtidos experimentalmente. Os resultados alcançados neste trabalho são encorajadores e abrem as portas para novos estudos com outros tipos de falhas e materiais compósitos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-24T22:34:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 287236.pdf: 1097040 bytes, checksum: d0907009139c43ab77550c139616bdc8 (MD5) / Perdas substanciais de producao sao registradas em pos-colheita de macieira causadas principalmente pelos fungos Penicillium expansum e Botrytis cinerea. Os metodos usuais de controle envolvem a imersao de frutos em solucoes fungicidas e o uso da frigorificacao. Na busca por metodos alternativos, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da quitosana e do vapor de acidos de cadeia curta, in vivo e in vitro, sobre os fungos P. expansum e B. cinerea. Nos ensaios in vivo, os frutos de macieira foram inoculados com uma suspensao de esporos de P. expansum ou B. cinerea antes (efeito curativo) ou apos (efeito preventivo) a imersao em suspensao de quitosana ou nas suas formulacoes. Os frutos tratados foram armazenados, no escuro, a 25+1C, sob alta umidade relativa, e avaliados periodicamente quanto a incidencia e a severidade das podridoes. Nos ensaios in vitro, avaliou-se o efeito de quitosana sobre a formacao de colonias de P. expansum, o crescimento micelial e a esporulacao de B. cinerea, bem como a germinacao de esporos e o comprimento do tubo germinativo de ambos. Os resultados indicaram que a imersao dos frutos de macieira em suspensoes de quitosana a 0,25 e 0,5% reduziu a severidade da podridao de Penicillium em ate 54 e 74% em tratamentos preventivos, respectivamente. Nos tratamentos curativos, adjuvantes foram necessarios para se obter bons niveis de reducao da severidade das podridoes: a adicao de glicerol a 3,0% na suspensao de quitosana a 0,5% reduziu em 47,6% a severidade da podridao de Penicillium; a formulacao contendo quitosana a 0,25%, glicerol a 0,75%, estearato de magnesio a 0,1% e Tween 80 a 0,1% foi eficiente em reduzir as podridoes de P. expansum e B. cinerea em 26,5 e 44,6%, respectivamente. Por outro lado, a adicao de cloreto de calcio ou carbonato de potassio as suspensoes de quitosana nao aumentou a eficiencia de controle das suspensoes contra as podridoes. In vitro, a quitosana a 50 e 100 Êg.mL-1 inibiu significativamente a germinacao de esporos e a elongacao do tubo germinativo de P. expansum e B. cinerea, respectivamente. Comparando-se diferentes quitosanas, a de baixo peso molecular (Qbpm) e a comercial (Qcom) reduziram o crescimento micelial e estimularam a esporulacao de B. cinerea em meio BDA. A atividade de peroxidases em tecidos de maca inoculados com P. expansum foi maior do que nos tecidos nao inoculados. No entanto, nao houve efeito da quitosana sobre a atividade das enzimas peroxidases e polifenoloxidases em frutos tratados. Na segunda etapa do trabalho, testou-se a fumigacao dos frutos de macieira cv. Fuji com os acidos formico, acetico e propanoico, bem como etanol e hexanal. Para tanto, depositou-se uma suspensao de esporos de P. expansum na epiderme intacta dos frutos. Apos a secagem, os frutos foram fumigados por 30 min e, posteriormente, feridos no local da deposicao dos esporos. Avaliou-se a severidade e a incidencia da podridao. A fumigacao dos frutos de macieira cv. Fuji, contendo esporos de P. expansum em sua epiderme, com os acidos formico, acetico e propanoico foi eficiente em reduzir a severidade e a incidencia da podridao de Penicillium. Os acidos ainda inibiram totalmente a germinacao do fungo em laminas escavadas, quando utilizados a 12 ÊL.L-1 de ar, mostrando potencial para reduzir a concentracao inicial de inoculo que se encontra tanto na epiderme dos frutos como nas embalagens de acondicionamento. Dessa forma, os resultados do trabalho indicaram que as reducoes na severidade das podridoes pela imersao dos frutos de macieira em quitosana e suas formulacoes devem-se principalmente a atividade antibiotica da quitosana. O uso da fumigacao de frutos com compostos volateis que apresentam elevada atividade antimicrobiana pode ser uma tecnica complementar empregada em pos-colheita, visando reduzir as elevadas concentracoes superficiais de inoculo.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T03:38:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 276304.pdf: 711610 bytes, checksum: 7a5fb5196f444c3817919ddce886b8e6 (MD5) / O polissacarídeo quitosana tem demonstrado potencial para o controle de doenças em plantas, e a babosa apresenta em sua composição substâncias que exibem propriedades antimicrobianas e podem atuar como eliciadores na indução de mecanismos de defesa das plantas. O presente trabalho foi conduzido com o intuito de verificar o efeito da quitosana no controle de duas importantes manchas foliares do tomateiro: mancha bacteriana e pinta preta. Adicionalmente, observou-se a atividade de uma fração polissacarídica da babosa (FPA) sobre Xanthomonas gardneri e no controle da doença. Utilizou-se uma quitosana comercial (Qcom), uma de baixo (Qbpm) e outra de médio peso molecular (Qmpm) e evidenciou-se um efeito antimicrobiano desses polissacarídeos sobre X. gardneri e Alternaria solani. Houve uma proteção média das plantas contra a mancha bacteriana de 67 %, conferida pelas quitosanas, com os melhores resultados obtidos com a Qbpm a 3 mg/mL, aplicada aos 3 dias antes da inoculação com a bactéria. O perfil espectrofotométrico de plantas tratadas com Qbpm mostrou um aumento da absorbância entre os comprimentos de onda de 280-300 nm, indicando que a quitosana pode ter induzido as plantas a sintetizarem diferentes classes de compostos em resposta à fitobactéria. A análise de compostos fenólicos totais e flavonóides corroboram os resultados obtidos na varredura espectrofotométrica, mostrando aumento significativo desses metabólitos aos 3 dias após a inoculação. Análises enzimáticas mostraram aumento na atividade de peroxidases e fenilalanina amônia-liase em plantas tratadas com a Qbpm. Não foi observado controle da pinta preta pelas quitosanas. Quanto à atividade da FPA, não houve um efeito antimicrobiano sobre X. gardneri, em contrapartida, o perfil espectrofotométrico de plantas tratadas com a FPA mostrou um aumento da absorbância entre os comprimentos de onda de 420-455 nm, o que pode ter implicado num aumento da biossíntese de compostos como os carotenóides. Os resultados do presente trabalho indicam a capacidade da quitosana de atuar diretamente sobre os patógenos bacteriano e fúngico estudados e que o controle da mancha bacteriana em plantas de tomate pode ter ocorrido tanto por essa atividade antimicrobiana da quitosana sobre a bactéria como pela indução de mecanismos de defesa na planta. / The polysaccharide chitosan has demonstrated potential to control diseases in plants, and the aloe presents substances with antimicrobial properties which can act as elicitors in the induction of defense mechanisms of the plants. The objective of this study was to verify the effect of chitosan in the control of two important diseases of tomato: bacterial spot and early blight. Additionally, the activity of a polysaccharidic fraction from aloe (FPA) was observed on Xanthomonas gardneri and in the control of disease. A commercial chitosan (Qcom), and anothers of low (Qbpm) and medium (Qmpm) molecular weight were evaluated on X. gardneri and A. solani and on the diseases caused by these plant pathogens. The avarage protection of the plants against the bacterial spot was 67%, checked by the chitosans, with the best results obtained with Qbpm to 3 mg/ml, applied 3 days before the inoculation with the bacteria. The spectrofotometric profile of plants sprayed with Qbpm showed an increase of the absorbance among the wavelengths of 280-300 nm, indicating that the chitosan can have conditioned the plants to synthesize different classes of compounds in response to the bacteria. The analysis of total phenolic compounds and flavonoids corroborate the results obtained in the spectrofotometric wavelength scan, showing significant increase of those metabolites 3 days after the inoculation. Enzymatic analyses showed increase of peroxidase and phenylalanine ammonia-lyase activities in plants sprayed with Qbpm. Control of early blight was not observed with the chitosans. There was not an effect antimicrobial of FPA on X. gardneri, by the other hand, the spectrofotometric profile of plants sprayed with FPA showed an increase of the absorbance among the wavelengths of 420-455 nm, which may have implied an increase in the biosynthesis of compounds such as the carotenoids. The results of the present study indicate the capacity of chitosan to act directly on the bacterial and fungic pathogens. Also, the control of the bacterial spot in tomato plants may have occurred due to the antimicrobial activity of chitosan on the bacteria as well as to the induction of defense mechanisms in the plants.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T04:30:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 282466.pdf: 9853650 bytes, checksum: bbea26b8767078edc352a095e4d16200 (MD5) / Crustinas são peptídeos antimicrobianos que integram o sistema imune inato dos crustáceos e atuam na defesa destes animais contra infecções, juntamente com outras moléculas imunoefetoras presentes na hemolinfa. O objetivo do presente trabalho foi clonar e expressar, em sistema heterólogo, uma crustina do camarão nativo Farfantepenaeus paulensis para avaliar sua atividade antimicrobiana e produzir anticorpos policlonais para imunolocalizar este peptídeo nas diferentes populações de hemócitos deste peneídeo, assim como em diferentes grupos de crustáceos. Por abordagem molecular, foi possível clonar uma sequência gênica correspondente a uma crustina, com características do subgrupo da crustina I, que denominamos de crusFpau2. A crusFpau2 apresentou 94% de homologia com a única isoforma já descrita em F. paulensis (crusFpau). Esta nova isoforma caracteriza-se por apresentar uma região N-terminal rica em resíduos de glicina, além da região C-terminal com doze resíduos conservados de cisteína, onde se encontra um domínio WAP (whey acidic protein). A crusFpau2 foi expressa em E. coli BL21(DE3)pLysS com peso molecular de 17,3 kDa e foi utilizada para avaliar sua atividade antimicrobiana e produzir anticorpos policlonais em camundongo. A crustina recombinante mostrou-se ativa contra a bactéria Micrococcus luteus. Através de imunomarcação foi possível determinar que as crustinas são produzidas de forma constitutiva apenas nos hemócitos granulares (HGs) de F. paulensis, sendo armazenadas em seus grânulos. Aparentemente, estas proteínas não são processadas no interior dos grânulos e não são secretadas para a hemolinfa. Os anticorpos produzidos contra a crusFpau2 recombinante foram ainda capazes de reconhecer especificamente crustinas nos hemócitos granulares de outros grupos de crustáceos (Litopenaeus vannamei, Macrobrachium potiuna e Callinectes sapidus), mas não no mexilhão marinho Perna perna. Estes resultados sugerem que as crustinas são peptídeos de ocorrência geral em crustáceos. Este é o primeiro trabalho que produziu um peptídeo antimicrobiano a partir de uma espécie nativa brasileira de crustáceos marinhos, além de produzir os primeiros anticorpos contra crustinas até o momento. Estes anticorpos constituem uma ferramenta importante para imunomarcar especificamente populações de hemócitos granulares de crustáceos, além de auxiliar a uma melhor compreensão do sistema imune deste grupo zoológico, que inclui muitas espécies de interesse econômico. Por fim, uma avaliação futura mais detalhada do seu real espectro antimicrobiano poderá revelar o seu potencial promissor como agente terapêutico para aquicultura e saúde humana.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T04:45:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 293478.pdf: 4302778 bytes, checksum: 611d76a72761188aacb1fd93c9c65820 (MD5) / A ecotoxicologia é um dos ramos da ciência que cada vez mais ganha relevância internacional por ter como objeto de estudo intoxicação ambiental em todas as suas nuances e consequências. A utilização de biomarcadores moleculares se destaca como uma das principais ferramentas ecotoxicológicas, por serem extremamente sensíveis e anteciparem efeitos gerados pela poluição. A ostra do Pacífico, Crassostrea gigas, é um invertebrado marinho que habita os ecossistemas costeiros (estuários), onde se encontra alta densidade demográfica e alta contaminação por efluentes domésticos. Esse bivalve representa um bioindicador de poluição ao responder à presença de xenobióticos pela variação de diversos biomarcadores. Um destes parâmetros são as enzimas citocromo P450 (P450), as quais podem participar tanto da via de biotransformação quanto na desregulação endócrina. Recentemente, foi identificada em C. gigas uma isoforma de P450, CYP356A1, grandemente induzida por esgoto doméstico não tratado. A sequência codificante para este gene foi determinada e clonada, e neste trabalho, utilizada para realização de expressão heteróloga, visando a produção de anticorpos policlonais. Estes seriam importantes no desenvolvimento de uma nova estratégia de avaliação de contaminação ambiental e contribuiriam para investigação da provável função biológica de CgCYP356A1, através de detecção imumológica. Imunodetecção é proposta como alternativa para estudos de proteínas com função desconhecida. Ensaios imunoquímicos com anticorpo anti- CgCYP356A1 mostraram um padrão com banda única, sem ocorrência de reações inespecíficas, corroborando a idéia de que esta metodologia poderá permitir avanços em estudos ecotoxicológicos com C. gigas e na caracterização bioquímica de CgCYP356A1. Nas análises de contaminação ambiental por imunodetecção, glândula digestiva teve uma quantidade de proteína significativamente maior depois de prolongada exposição in situ de C. gigas ao esgoto. O RNAm de CYP356A1 também foi avaliado, visando remontar o que poderia estar ocorrendo na célula, no que diz respeito a expressão desse gene, em resposta a xenobióticos, mas os resultados não foram muito conclusivos. Contudo, o método de análise aqui apresentado ampliam as perspectivas de estudo referentes a novos genes P450 identificados, especialmente CgCYP356A1, bem como o estabelecimento de novos biomarcadores.