Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências. / Made available in DSpace on 2012-10-26T12:25:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 303861.pdf: 2650431 bytes, checksum: a9f9899f0d32abf02474782e9c45e6e8 (MD5) / Este estudo teve por objetivo avaliar a atividade antiparasitária intracelular e a citotoxicidade de diaminas sintéticas em macrófagos murinos infectados com L. braziliensis, L. chagasi e T. cruzi. A perda do potencial de membrana mitocondrial (.m) de formas epimastigotas de T. cruzi, a indução de TNFa e óxido nítrico e a inibição da enzima tripanotiona redutase recombinante de L. braziliensis e T. cruzi foram utilizados para investigar possíveis mecanismos de ação dos compostos ativos. Dentre 17 diaminas estudadas, 13 inibiram a proliferação de formas promastigotas de L. braziliensis e 10 de epimastigotas de T. cruzi (CI50< 20µM). Destas, 12 foram ativas contra amastigotas intracelulares de L. braziliensis e L. chagasi (CI50 de 2,6 a 28,2 µM) e 6 foram ativas contra formas intracelulares de T. cruzi (CI50 de 1,6 a 23,6µM). A diamina DP23 foi a mais ativa contra L. braziliensis e L. chagasi (CI50 2,6 e 3,0 µM e IS de >100 e >115,4, respectivamente). A diamina DP24 foi a mais ativa contra T. cruzi (CI501,6 µM e IS>187,5). A CC50 para macrófagos variou de 149,5 a >300 µM. Diaminas cloridratadas foram mais citotóxicas que seus análogos não cloridratados. Quatro compostos (DP23Cl, DP25, RAG10 e RAG11) mostraram elevada citotoxicidade para macrófagos infectados em concentração >10 µM. A análise da estrutura e da lipofilicidade (logP) das diaminas mostrou que as estruturas com15 a 17 carbonos metilênicos foram mais ativas enquanto que, estruturas com mais de 19 carbonos não apresentaram nenhuma atividade antiparasitária. A melhor atividade leishmanicida foi observada para as diaminas com valor de logP = 5,36, sugerindo que a atividade não depende somente da distribuição de carbonos metilênicos na molécula mas também do logP ideal. Epimastigotas tratados com o composto DP24 na concentração de 6 e 12 µM mostraram despolarização da membrana mitocondrial e morte celular apartir de 6 horas de incubação de forma dose-dependente. O tratamento de células infectadas com os compostos ativos não induziu níveis significantes de produção de TNFa e NO. Com relação a inibição das enzimas tripanotiona redutase recombinante de L. braziliensis e T. cruzi, quatro compostos (DP23Cl, DP25, DP25Cl e RAG10) inibiram a atividade enzimática de LbTR entre 74,2 a 89,4% na concentração do 100 µM, enquanto que para a TcTR apenas o composto DP25Cl ocasionou inibição de 74,5% na concentração de 100 µM, sugerindo diferenças entre a tripanotiona destas duas espécies de tripanosomatídeos. As diaminas avaliadas no presente estudo apresentaram potente efeito in vitro contra formas intracelulares de Leishmania spp e T. cruzi e podem ser consideradas moléculas líder para o desenvolvimento de novos compostos contra Leishmania e T. cruzi. / This study aimed to evaluate the antiparasitic activity and cytotoxicity of synthetic diamines in murine macrophages infected with Leishmania braziliensis, L. chagasi and Trypanosoma cruzi. The loss of mitochondrial membrane potential (øm) of T. cruzi epimastigotes, the induction of TNFá nd nitric oxide and inhibition of the recombinant trypanothione reductase of L. braziliensis and T cruzi were used to investigate possible mechanisms of active compounds. Among 17 evaluated diamines, 13 inhibited the proliferation of L. braziliensis promastigotes and 10 inhibited T. cruzi epimastigotes (IC50<20 ìM). Of these, 12 were active against intracellular amastigotes of L. braziliensis and L. chagasi (IC50 of 2.6 to 28.2 ìM) and 6 were active against T. cruzi (IC50 = 1.6 to 23.6 ìM). The compound DP23 was the most active compound against both L. braziliensis and L. chagasi (IC50 = 2.6 and 3.0 ìM and SI>100 and >115.4) respectively. The compound DP24 was the most active against T. cruzi (IC50 = 1.6 ìM and SI > 187.5). The citotoxicity CC50 for macrophages ranged from 149.5 to > 300 ìM. Chlorinated diamines were more cytotoxic than their non-chlorinated analogs. Four compounds (DP23Cl, DP25, RAG10 and RAG11) showed high cytotoxicity for infected macrophages at a concentration > 10 ìM. The analysis of the structure and lipophilicity (logP) of the diamines showed that structures with 15 to 17 methylenic carbons were more active while structures with more than 19 carbons did not present any antiparasitic activity. The higher leishmanicidal activity was observed for the diamine DP23 with a value of logP = 5.36 and 13-NH-4 distribution of methylenic carbon suggesting that the activity does not depend solely on the distribution of methylenic carbon atoms in the molecule but also depends on ideal logP value. Epimastigotes treated with the compound DP24 at a concentration of 6 and 12 ìM demonstrated dose-dependent membrane depolarization and cell death starting at 6 hours of incubation. Treatment of cells infected with the active compounds did not induce significant levels of TNFá and NO production. Concerning the inhibition of the recombinant trypanothione reductase enzymes of L braziliensis and T. cruzi, four compounds (DP23Cl, DP25, DP25Cl and RAG10) inhibited the enzymatic activity of LbTR between 74.2 to 89.4% at a concentration of 100 ìM, whereas for TcTR, only the compound DP25Cl caused inhibition of 74.5% at the same concentration, suggesting differences between the trypanothione of these two species of trypanosomatids. The diamines evaluated in the study presented potent in vitro effect against intracellular forms of Leishmania spp and T. cruzi and therefore may be considered as leader molecules for developing new compounds against Leishmania and T. cruzi.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-03-04T20:33:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 313813.pdf: 1957580 bytes, checksum: c466ffed4187341cf53bf6eaeeb68449 (MD5) / Dentre os patógenos humanos de veiculação hídrica, destacam-se os vírus de transmissão fecal-oral, como é o caso dos adenovírus (HAdV), rotavírus-A (RVA), vírus da hepatite A (HAV) e urino-oral como o poliomavírus (JCPyV). Estes vírus estão envolvidos, principalmente em episódios de gastroenterites, podendo causar ainda infecções respiratórias, conjuntivites, meningite asséptica, encefalites e sérias complicações em pacientes imunocomprometidos, além do que, possuem a característica de serem estáveis e permanecerem longos períodos no ambiente e por isso são apontados como potenciais indicadores ambientais de contaminação por efluentes humanos. Nesse contexto, a hipótese desse estudo foi que os vírus de transmissão fecal e urinária são prevalentes nas águas de consumo humano, não possuem correlação com perfis físico-químicos e de nutrientes, além de possuírem potencial infeccioso. Assim os principais objetivos desse trabalho foram: 1) Estudar a incidência de HAdV, JCPyV, HAV e RVA em águas de mananciais superficiais utilizadas para consumo humano; 2) Analisar a correlação viral com parâmetros físico-químicos e de nutrientes da água; 3) Estudar a relação da sazonalidade com a presença de contaminação viral 4) Avaliar a integridade, infecciosidade e realizar estudos filogenéticos de HAdV nas matrizes aquáticas estudadas. Três sítios de coletas, na cidade de Florianópolis-SC, foram selecionados: Sítio 1) Lagoa do Peri (em quatro Micro-ambientes (MA): i) MA1 centro ii), MA2 local preservado, iii) MA3 local degradado e iv) MA4 local de coleta de água para consumo humano e atividades recreacionais); Sítio 2) Fonte/Nascente natural de água, utilizada para consumo humano sem tratamento prévio e Sítio 3) Solução Alternativa de Abastecimento Coletivo (SAC), água utilizada para abastecimento humano, previamente clorada. Para as análises virais, dois litros de água foram coletados mensalmente, durante um ano e processadas (método de adsorção-eluição e reconcentração em dispositivo Centriprep®). Posteriormente, o material genético foi extraído e a presença e quantificação viral determinada por qPCR. As análises físico-químicas e de nutrientes das águas contemplaram todos os Micro-ambientes da Lagoa do Peri (físico-químicas foram realizadas in situ, utilizando Sonda Multiparâmetros (YSI-85) e as de nutrientes determinadas em laboratório). Os HAdVs detectados nas amostras provenientes do Micro-ambiente 4 da Lagoa do Peri, Fonte/Nascente e da SAC foram avaliados quanto a sua integridade (por meio de tratamento com enzimático com DNAse), infecciosidade (por meio do ensaio de placa de lise (EPL) e por cultura celular integrada ao RT-qPCR (ICC-et-RT-qPCR), bem como submetidos a estudos filogenéticos. Das amostras analisadas 93% (67/72) foram positivas para HAdV, 45,8% (33/72) para RVA, 13,8% (10/72) para JCPyV e 12,5% (9/72) para HAV. A distribuição sazonal viral foi determinada e o HAdV mostrou-se o mais prevalente em todas as estações. Os estudos físico-químicos e de nutrientes nos MAs da Lagoa do Peri não apresentaram diferenças espaciais significativas, concluindo que a lagoa é homogênea em sua coluna d'água. Quanto a correlação viral com parâmetros físico-químicos e de nutrientes, apenas JCPyV e nitrito correlacionaram-se positivamente no MA4. A integridade e infecciosidade de HAdV foi determinada, sendo que nas amostras do MA4 da Lagoa do Peri 83% (10/12) continham partículas íntegras, 66% ( 8/12) infecciosas por EPL e 75% (9/12) infecciosas por ICC-et-RT-qPCR; Na Fonte/Nascente 66% (8/12) continham partículas íntegras, 33% (4/12) infecciosas por EPL e 58% (7/12) infecciosas por ICC-et-RT-qPCR; Na SAC 58% (7/12) continham partículas de HAdV íntegras, 8% (1/12) infecciosas por EPL e 25% (3/12) infecciosas por ICC-et-RT-qPCR. Os estudos filogenéticos de HAdV demonstraram que o sorotipo circulante prevalente foi o 2 (HAdV-2 respiratório). Em conclusão, estes resultados demonstraram a fragilidade do sistema de segurança sanitária, principalmente em águas de mananciais superficiais utilizadas para abastecimento e consumo da população. Frente a ampla distribuição e persistência dos vírus de veiculação hídrica, há necessidade de implementar o monitoramento e remoção viral no processo de potabilização da água, o que traria reflexos positivos na manutenção da saúde humana e ambiental

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-03-04T20:56:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2013-07-16T20:57:51Z : No. of bitstreams: 1 303859.pdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / A reutilização de águas residuárias geradas na suinocultura pode atender a várias finalidades merecendo destaque o reúso no próprio processo de produção animal ou em outras atividades agrícolas. Porém, para que se tenha segurança nesta prática, informações consistentes sobre a qualidade da água envolvendo aspectos físicos, químicos e microbiológicos precisam ser avaliadas. Atualmente, a inexistência de parâmetros para reúso de água na pecuária brasileira torna esta prática sem critérios para sua recomendação técnica. Diante disso, o presente estudo teve por objetivos padronizar e validar metodologias moleculares para o monitoramento de águas residuárias da suinocultura no que se refere à detecção viral; 2) Avaliar as águas residuárias da suinocultura por meio de estudo virológico de dois sistemas de tratamento de dejetos de suínos; 3) Estabelecer o perfil químico e microbiológico de ambos os sistemas de tratamento, apontando qual sistema é mais eficiente; 4) Apontar qual vírus seria o melhor candidato a marcador de contaminação ambiental por dejeto de suíno, tendo como base a incidência e persistência dos diferentes vírus nos sistemas de tratamento; 5) Apontar qual dos dois sistemas é mais eficiente na remoção dos compostos químicos e microbiológicos avaliados. Para isso, foram avaliados mensalmente (março de 2009 a dezembro de 2010), dois sistemas de tratamento de dejetos de suínos (sistema 1 e 2). Os resultados revelaram que o genoma de PAdV esteve presente em 66% das amostras coletadas o sistema 1 e em 78% das amostras do sistema 2. Já o PCV2 foi detectado em 96% das amostras coletadas no sistema 1 e em 86% das amostras do sistema 2. Partículas íntegras de PAdV e PCV2 estavam presentes em todos os pontos de amostragem, e partículas infecciosas de PCV2 (genótipos 2a e 2b) estavam presentes no efluente final. Foram detectados ainda PPV, TTSuV em ambos os sistemas . Dentre os vírus avaliados, recomenda-se o PAdV como marcador de contaminação ambiental por dejeto de suíno, por este ser um dos mais resistentes e frequentes. Em relação aos parâmetros químicos, a redução ao longo do sistema 1 atingiu níveis acima de 70% em todos os compostos e para o sistema 2, a redução atingiu níveis acima de 80% em todos os compostos avaliados. Para Salmonella sp., não houve redução no sistema 1, e a bactéria não foi detectada no efluente do sistema 2. Em resumo, o perfil químico e microbiológico do sistema 1 apresentou taxas de redução inferiores do que as encontradas no sistema 2, mostrando assim que o este último foi o mais indicado para o tratamento de dejetos de suíno visando o reúso de água. Porém, conclui-se que há a necessidade de se estudar um protocolo adicional de desinfecção do efluente final, visando a eliminação de micro-organismos patogênicos.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-06-25T18:52:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 311573.pdf: 7982077 bytes, checksum: 243e7ae4350af569490079c4e00e4810 (MD5) / Agaricus brasiliensis (syn A. subrufescens) é um fungo basidiomiceto nativo no Brasil, que apresenta paredes celulares ricas em polissacarídeos, tais como ?-(1?6)-(1?3)-glicanas nos corpos de frutificação e ?-(1?2)-glico-?-(1?3)-mananas no micélio. Neste trabalho, estes polissacarídeos foram isolados e modificados quimicamente gerando seus respectivos derivados sulfatados. Os polissacarídeos nativos (FR e MI) e sulfatados (FR-S e-MI-S) foram caracterizados quimicamente e avaliados quanto as suas atividades citotóxica e anti-herpética in vitro. Uma vez que FR-S e MI-S apresentaram uma promissora ação anti-HSV-1 (cepas KOS e 29-R) e anti-HSV-2 (cepa 333), seu mecanismo de ação foi determinado. A atividade anti-herpética in vivo do MI-S também foi testada utilizando-se modelos murinos de infecção ocular, cutânea e genital. FR-S e MI-S apresentaram duas novas bandas de absorção no espectro de infravermelho em 1253 e 810 cm-1, relacionados aos grupamentos C-S-O e S=O, respectivamente. A massa molecular do FR e MI foram estimados em 609 e 310 kDa, respectivamente. FR-S (127 kDa) e MI-S (86 kDa) apresentaram massas reduzidas provavelmente devido a hidrólise ocorrida durante a reação de sulfatação. FR-S e MI-S apresentaram ~14% de enxofre na análise elementar. Análise de RMN de 1H e 13C confirmaram as estruturas mencionadas anteriormente para FR e MI, sendo o FR-S totalmente sulfatado em C-4 e C-6, enquanto o MI-S parcialmente sulfatado em C-2, C-3, C-4 e C-6. Embora FR e MI não terem apresentado atividade, FR-S e MI-S exibiram promissora ação anti-HSV, com índices de seletividade (SI=CC50/EC50) superiores a 208. FR-S e MI-S não tiveram efeito virucida, mas significativamente inibiram a adsorção e penetração, provavelmente por interagir com glicoproteínas virais. Estudos de combinação revelaram que FR-S e MI-S atuam de forma sinérgica com o aciclovir. Além disso, MI-S inibiu a expressão das proteínas virais ICP27, UL42, gB e gD. Não foi observada toxicidade nos grupos de animais não infectados e tratados com MI-S. O tratamento tópico e oral com MI-S não foi efetivo na redução da doença ocular. A aplicação tópica de MI-S nas lesões cutâneas também não foi efetiva, mas os animais infectados cutaneamente e tratados oralmente com MI-S mostraram redução significativa dos escores da doença e cura acelerada das lesões pelo HSV-1 após o nono dia. A administração vaginal de MI-S (500 µg), 20 min antes do desafio viral, significantemente reduziu os escores da doença (dias 5 a 9), títulos virais (dias 1 e 3) e mortalidade em comparação aos grupos controles. A sulfatação aumentou em 5X o efeito citotóxico do FR contra células tumorais A549, enquanto foi essencial para a atividade do MI. A combinação de fatores como o alto grau de substituição e a massa molecular relativamente menor teve impacto positivo sobre a atividade citotóxica do FR-S e MI-S. Os resultados mostram que o MI-S tem potencial a ser utilizado na redução da severidade das lesões cutâneas pelo HSV-1 e principalmente como um microbicida evitando a transmissão sexual das infecções genitais pelo HSV-2. Ainda, os resultados promissores obtidos na triagem preliminar estimulam novos estudos para avaliação do mecanismo da atividade citotóxica do MI-S e FR-S.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-25T20:49:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 313176.pdf: 31537040 bytes, checksum: 2b55698432e1ff3ffc517949aac3d02b (MD5) / Dentre os vários fatores de crescimento que têm sido relatados na literatura para tratamento de defeitos ósseos, as proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs) têm atraído bastante interesse, em decorrência de sua capacidade osteoindutora. As células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) também vêm se destacando na regeneração tecidual e na modulação da resposta inflamatória pelo seu efeito parácrino. O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro e in vivo os efeitos da BMP-2 e de ASCs na osteogênese. Os experimentos se dividiram em 4 etapas, sendo: (1) avaliação do efeito da proteína óssea morfogenética recombinante humana do tipo 2 (rhBMP-2), da BMP-4 e da BMP-7 na diferenciação osteogênica de ASCs suplementadas com arcorbato e ?-glicerofosfato; (2) comparação do efeito do ácido retinóico (AR), da rhBMP-2 e da rhBMP-2+AR na diferenciação osteogênica de ASCs; (3) avaliação do efeito da implantação de ASCs incorporadas em arcabouços de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) na inflamação causada por rhBMP-2 no tecido muscular de cães; e (4) avaliação do efeito de ASCs incorporadas em arcabouços autógenos de plasma rico em plaquetas (PRP) na regeneração óssea na tíbia de cães. Os resultados confirmaram as caracterísitcas de células-tronco mesenquimais das ASCs, através da imunofenotipagem e da diferenciação adipogência e osteogênica. Em relação à etapa 1, as ASCs expressaram BMP-4 e BMP-7 endógenas, a suplementação do meio osteogênico com rhBMP-2 não aumentou a atividade de ALP, a expressão do mRNA da osteonectina e osteocalcina, e a deposição de cálcio. No que diz respeito à etapa 2, a rhBMP-2 promoveu maior expressão de Smad 1 e BMP-7 (dia 7), maior expressão relativa do mRNA do receptor de BMP do tipo II (BMPR-II) e do mRNA da osteocalcina (dia 21). Por sua vez, o AR exibiu as maiores atividades de ALP (dias 7, 14, 21 e 28), maior expressão relativa do mRNA do receptor de BMP do tipo II (RBMP-II) (dia 14), do mRNA da Smad 1 (dia 21) e do mRNA da osteonectina (dias 14, 21 e 28). A associação rhBMP-2+AR promoveu os maiores níveis de cálcio na matriz extra-celular (dias 12 e 32), a expressão da Smad 4 considerável (dias 21 e 28), expressão da Smad 1/ 5/ 8 fosforilada similar ao MC3T3-E1 (controle positivo) (dias 7, 14, 21 e 28), maior expressão relativa do mRNA da Smad 1, mRNA da osteocalcina e mRNA da osteonectina (dias 14, 7 e 7, respectivamente). Em relação à etapa 3, a agregação da rhBMP-2 aos arcabouços foi de aproximadamente 78, 74 e 61% para 1, 2,5 e 5 µg de rhBMP-2.mL-1, respectivamente. A liberação acumulada da rhBMP-2, em 21 dias, foi de aproximadamente 90, 64 e 64% para 1, 2,5 e 5 µg de rhBMP-2.mL-1, respectivamente. Os arcabouços de PLGA foram quase que totalmente degradados em 6 semanas de pós-operatório. As ASCs foram capazes de modular a resposta inflamatória causada por baixa dose de rhBMP-2 (2,5?g) no tecido muscular de cães, diminuindo o número de focos inflamatórios, células gigantes e aumentando a neovascularização. Os resultados da etapa 4 mostraram que PRP+ASCs apresentou menor quantidade de tecido de granulação e promoveu maior quantidade (osso primário e secundário) e maturação (osso secundário) de tecido ósseo neoformado nos defeitos ósseos, comparado com osso autógeno e PRP, isoladamente. Resumidamente, pode-se concluir que a suplementação da rhBMP-2 ao meio osteogênico não melhorou a osteogênese das ASCs; a associação de rhBMP-2+AR se mostrou mais eficiente na osteodiferenciação das ASCs, comparado com rhBMP-2 ou AR isoladamente; as ASCs reduziram o processo inflamatório e aumentaram a neovascularização nos sítios musculares que receberam baixa dose de rhBMP-2; e as ASCs associadas com PRP apresentaram menor quantidade de tecido de granulação e promoveram maior quantidade e maturação de tecido ósseo neoformado nos defeitos ósseos, comparado com osso autógeno e PRP.<br) / Abstract : Recombinant human bone morphogenetic protein type 2 (rhBMP-2) is a potent osteogenic growth factor, which has been used for treatment of bone defects in maxillofacial, oral, orthopedic, and spine surgeries. The adipose-derived stem cells (ASCs) have been draun attention in tissue regeneration and modulation of inflamatory disease because of their paracrine effect. This study evaluated the in vitro and in vivo effects of rhBMP-2 and ASCs in osteogenesis. The experiments were divided into 4 parts: (1) evaluated the effect of recombinant human bone morphogenetic protein type 2 (rhBMP-2), BMP-4, and BMP-7 in osteogenic differentiation of ASCs suplemented with arcorbate and â- glycerophosphate; (2) compared the effect of retinoic acid (RA), rhBMP-2, and rhBMP-2+AR in osteogenic differentiation of ASCs; (3) evaluated the effect of the implantation of ASCs incorporated into scaffolds of poly lactic-co-glycolic (PLGA) in canine muscular tissue; and (4) evaluated the effect of ASCs incorporated into scaffolds of platelet-rich plasm (PRP) in bone regeneration in canine tibia. The results confirmed the mesenchymal stem cells characteristics of ASCs. According to part 1, ASCs expressed endogenous BMP-4 and BMP-7. The supplementation of osteogenic medium with rhBMP-2 did not increase ALP activity, mRNA expression of osteonectin and osteocalcin, and the calcium deposition. According to the results of part 2, rhBMP-2 promoted the highest expression of Smad1 and BMP-7 (day 7), the highest relative expression of BMP receptor type II (BMPR-II) mRNA and osteocalcin mRNA (day 21). RA exhibited the highest phosphatase alkaline activity (ALP) (days 7, 14, 21 and 28), highest expression of BMPR-II mRNA (day 14), Smad 1 mRNA (day 21) and osteonectin mRNA (days 14, 21, and 28). The association rhBMP-2+RA promoted the highest levels of calcium in extracellular matrix (days 12 and 32), a considerable expression of Smad 4 (days 21 and 28), expression of phosphorylated Smad 1/ 5/ 8 similar to MC3T3-E1 (positive control) (days 7, 14, 21, and 28), the highest expression of Smad 1 mRNA, osteocalcin mRNA, and osteonectin mRNA (days 14, 7, and 7, respectivamente). According to part 3, the rhBMP-2 loading into the scaffolds was approximately 78, 74, and 61% for 1, 2.5, and 5 ìg of rhBMP-2.mL-1, respectively. Cumulative rhBMP-2 release was approximately 90, 64, and 64% for 1, 2.5, and 5 ìg of rhBMP-2.mL-1, respectively, at day 21. PLGA scaffolds were almost completely degradated at 6 weeks postoperative. ASCs modulated inflammatory response induced by low dose of rhBMP-2 (2.5ìg) in muscle sites, decreasing the number of inflammatory foci, giant cells, and neovascularization. The results of part 4 showed that PRP+ASCs promoted the fewest formation of granulation tissue, the highest amount of bone neoformation (primary and secondary bone), and the highest level of bone maturation in bone deffects, compared to autogenous bone and PRP, alone. In summary, supplementation of osteogenic medium with rhBMP-2 did not improve the osteogenic differentiation of ASCs; the assotiation rhBMP-2+RA was more efficient on osteodifferentiation process compared to rhBMP-2 or RA alone; ASCs modulated the inflammatory process and increased neovascularization in muscle sites with low dose of rhBMP-2; the assotiation ASCs+PRP promoted the lowest number of granulation tissue and increased the amount of bone neoformation (primary and secondary bone) and maturation in bone deffects, compared to autogenous bone and PRP, alone.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:08:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 223774.pdf: 1385999 bytes, checksum: 40e28c5a941c3142d2646b4d37cb75b6 (MD5) / A criptococose é uma infecção fúngica de distribuição mundial causada pela levedura encapsulada Cryptococcus neoformans. Esta doença é de grande importância em pacientes imunocomprometidos, podendo também acometer indivíduos imunocompetentes. A infecção pelo C. neoformans resulta da inalação basidiósporos, conídios ou blastoconídios pouco capsulados (4 a 5µm) presentes no ambiente, podendo inicialmente causar infecção sintomática ou assintomática na área subpleural dos pulmões, ser erradicada ou ainda permanecer dentro de um granuloma em estado latente. Este patógeno pode ser classificado em três variedades: C. neoformans var grubii (sorotipo A), com distribuição mundial, C. neoformans var neoformans (sorotipo D) freqüentemente encontrado na Europa e América do Sul e C. neoformans var gattii (sorotipos B e C) regiões tropicais e subtropicais e o híbrido sorotipo AD. No Brasil, as três variedades são os agentes etiológicos da criptococose em humanos. O objetivo deste estudo foi avaliar a variabilidade genética de amostras de C. neoformans isoladas de pacientes HIV positivos atendidos no Hospital Nereu Ramos de Florianópolis, Santa Catarina. Os 35 isolados clínicos analisados foram caracterizados como C. neoformans var grubii, sorotipo A, através da metodologia de PCR-RFLP do fragmento de 597 pb do gene CAP59. A PCR-fingerprinting com o iniciador M13 agrupou 34 isolados clínicos no padrão molecular VNI e uma amostra apresentou perfil distinto. A caracterização das 35 amostras através da técnica de RAPD utilizando 4 iniciadores aleatórios 3303, 3304, 3306 e 3307 mostrou baixa variabilidade genética das amostras. O sequenciamento do fragmento de 597 pb do gene CAP59 de duas amostras representativas juntamente com o padrão sorotipo A LMM794, mostrou uma homologia de 96% na seqüência nucleotídica e de aminoácidos predita com as seqüências de sorotipo A e AD depositadas no GenBank. Nossos resultados adicionam novas informações sobre a Biologia Molecular do C. neoformans no Estado de Santa Catarina. Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast-like fungus of worldwide distribution and the etiologic agent of cryptococcosis. This disease is a common opportunistic infection among patients with immunosupression and in apparently immunocompetent individuals. The infection is acquired by the inhalation of infectious propagules present in the environment. Therefore, the primary settlement of the pathogens is in the lungs, a site from which dissemination may occur. This fungus is classified in three varieties C. neoformans var. grubii (serotype A) of worldwide distribution, C. neoformans var. neoformans (serotype D) isolated rather frequently in Europe and South America, C. neoformans var. gattii (serotypes B and C) isolated in tropical and subtropical regions and a hybrid serotype AD. In Brazil, these three distinct neoformans varieties are the main casual agents of human cryptococcosis. The main goal of this dissertation is to study the genetic variability of C. neoformans samples isolated from patients attended at the Hospital Nereu Ramos Hospital, Florianópolis, Santa Catarina state, Brazil. Thirty-five clinical isolates were characterized, based on morphological and molecular data. All 35 clinical isolates were identified as C. neoformans var. grubii, representing serotype A, by PCR-RFLP analysis of CAP59 gene 597pb restriction fragment. A PCR-fingerprinting with the microsatellite-specific primer M13 grouped 34 isolates into the molecular type VNI and one showed distinct profile. The genetic variability among C. neoformans isolates were studied using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. The four arbitrary polymerase chain reaction primers used in this study detected low genetic variability among the samples. The CAP59 nucleotide and predicted amino acid sequences analysis of two representative samples and serotype pattern A LMM794 of C. neoformans showed more than 96% similarity among serotype A and AD deposited in GenBank database. Our results add considerable new information to the available data on molecular biology of C. neoformans in the Santa Catarina State, Brazil.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:25:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 224306.pdf: 1144206 bytes, checksum: 3851e6455c9e7fcbff5c43c79ee99f3c (MD5) / Compostos presentes em algas marinhas podem desempenhar importantes funções biológicas, entre elas: atividade antimicrobiana direta, influenciando as interações entre planta-patógeno ou ativando mecanismos de defesa das plantas tratadas. O polissacarídeo ulvana, os extratos solúvel e insolúvel em metanol, o extrato etanólico obtidos de Ulva fasciata e o polissacarídeo B obtido de Ulva sp. foram testados quanto a atividade antimicrobiana e o potencial desta macroalga marinha no controle da antracnose de feijoeiro comum, causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum. Para a obtenção da ulvana, algas frescas foram autoclavadas com água destilada; a solução resultante foi filtrada e precipitada com etanol. O polissacarídeo foi identificado por RNM-1H e RNM-13C e I.V. como unidades repetitivas de ácido ulvanobiurônico-3-sulfato. Para a obtenção dos extratos metanólicos e do extrato etanólico, algas secas e moídas foram extraídas com metanol em sistema de soxhlet ou com etanol, respectivamente. A atividade antimicrobiana da ulvana e dos extratos metanólicos foi determinada pelo método de difusão em ágar frente a bactérias potencialmente patogênicas ao homem: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Micrococcus luteus, a levedura Candida albicans e bactérias fitopatogênicas: Xanthomonas campestris e Erwinia carotovora. A concentração inibitória mínima, através do método de microdiluição em caldo, foi determinada contra os fungos: C. lindemuthianum (fitopatogênico), Trichophyton mentagrophytes e Microsporum canis (dermatófitos). Além disto, o efeito da ulvana e dos extratos metanólicos foi avaliado, in vitro, nos testes de inibição de crescimento miceliano e inibição da germinação de conídios de C. lindemuthianum. In vivo, foi avaliado o efeito do extrato etanólico, extratos metanólicos, ulvana e polissacarídeo B na proteção de plantas de feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) contra antracnose em casa-de-vegetação. Os resultados demonstraram que os extratos metanólicos inibiram o crescimento de bactérias Gram-negativas: P. aeruginosa, X. campestris e E. carotovora. Além disso, o extrato insolúvel (2 mg/ml) em metanol inibiu o crescimento de T. mentagrophytes e o extrato solúvel em metanol (1 e 2 mg/ml) inibiu significativamente (p<0,05) o crescimento miceliano de C. lindemuthianum. Por outro lado, nenhum dos extratos testados inibiu a germinação dos conídios deste fungo e a ulvana não apresentou nenhuma atividade in vitro contra os microrganismos testados. Nos experimentos in vivo, observou-se que o extrato etanólico (10 mg de alga seca/ml) e a ulvana (10 mg/ml) de U. fasciata apresentaram uma possível indução de resistência quando pulverizados três dias e quatro dias antes da inoculação do fungo, respectivamente.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioctecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A agricultura brasileira é altamente dependente de fertilizantes. Eles são utilizados em grande quantidade, sendo que a maior parte é importada e representa uma parcela significativa dos custos de produção. O uso de pó de rochas, contendo os nutrientes necessários às plantas, tem sido sugerido como uma alternativa aos fertilizantes solúveis. No entanto, a baixa disponibilidade dos nutrientes contidos em rochas tem limitado o seu uso. Vários microrganismos do solo apresentam a capacidade de disponibilizarem nutrientes e podem se constituir no mecanismo de solubilização dos nutrientes das rochas. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de selecionar rochas e microrganismos disponibilizadores de nutrientes para serem utilizados como inoculantes visando a substituição total ou parcial dos fertilizantes solúveis. Foram utilizadas dez amostras de rochas, sendo sete provenientes do Estado de Santa Catarina (flogopita olivina melilitito, granitos - SB1b, Sb, PC201A e PC201B, calcário Irati e fonolito) e três provenientes do Estado de Goiás (arenito, brecha alcalina e carbonatito). Determinou-se o número e obteve-se isolados de microrganismos solubilizadores de fosfatos presentes no pó das rochas. A capacidade e o potencial dos isolados em solubilizar fosfatos foram avaliados em meio de cultura GEL sólido, suplementado com CaHPO4. Esses isolados, juntamente com os da Coleção do Laboratório de Microbiologia do Solo da Universidade Federal de Santa Catarina, foram avaliados quanto ao seu potencial de solubilização em meio de cultura líquido, suplementado ou não com pó de rochas. As rochas e os isolados foram testados no cultivo de alface em casa de vegetação. A população de microrganismos solubilizadores variou entre 200 e 770 unidades formadoras de colônias por grama de pó de rocha. Os teores de P e K, solubilizados no meio de cultura GEL líquido suplementado com pó de rochas e inoculado com diferentes microrganismos, foram afetados pelo tipo de rocha, pelo isolado e pela interação rocha/microrganismo. As rochas diferiram quanto ao potencial de biodisponibilização. Carbonatito apresentou alto potencial para a biodisponibilização de P e K. Destacaram-se, ainda, a flogopita para a biodisponibilização de P e o granito da Saibrita na biodisponibilização de K. Os isolados MSF-344, MSF-352, e MSF-353 apresentaram um alto potencial de solubilização de P e K, destacando-se também os isolados MSF-305 e MSF-313 na solubilização de P e MSF-62, MSF-293, MFS-322, MFS-331 na de K. As rochas diferiram quanto ao potencial de suprimento de nutrientes para as plantas. A flogopita possui potencial para ser utilizada como fonte de P e K. Como fonte de K, pode ser utilizada também o carbonatito, a brecha alcalina, o fonolito, o arenito, o calcário Irati e o granito da Saibrita. Microrganismos e pó de rocha podem ser utilizados na substituição total ou parcial das adubações solúveis. Em relação ao P, os isolados MSF-305, MSF-313 e MSF-344. E, em relação ao K, os isolados MSF-322 e MFS-331. Sendo assim, estes isolados apresentaram potencial para serem utilizados em programas de inoculação controlada visando a biodisponibilização de nutrientes de rochas na substituição total ou parcial das adubações solúveis. Brazilian agriculture is highly dependent on fertilizers which are used in the country intensively. The majority of fertilizers are imported and represent a significant fraction of the production costs. The use of rock powder containing the nutrients required by the plants has been suggested as an alternative source to the soluble fertilizers. However, the small availability of nutrients included in these rocks has limited their use. Several microorganisms have the potential to improve availability of some of these nutrients and may be represent a mechanism for the use of these rock nutrients. The study was conducted with the purpose of selecting rocks and microorganisms to be used as inoculants aiming at the total or partial substitution of soluble nutrients. Ten rock samples were used, seven from the state of Santa Catarina (phlogopyte, granites - SB1b, Sb, PC201A and PC201B, calcareous rock Irati and phonolyte) and three from the state of Goiás (sand stone, alcaline breccia and carbonatite). Enumeration and pure culture establishment of phosphate availability microorganisms isolated from the rock powder was performed. The ability and the potential of the isolated samples of available phosphates were evaluated through a solid GEL culture supplemented with CaHPO4. The isolated samples, together with other isolates preserved in the Soil Microbiology Laboratory of Universidade Federal de Santa Catarina, were evaluated for their potential of phosphate utilization in liquid culture, supplemented or not with rock powder. The rocks and isolated samples were tested in a greenhouse and in the fertilization of lettuce plants. The population of microorganisms able to improve phosphate availability varied from 200 to 770 colony forming units per gram of rock powder. The contents of P and K, available in a GEL culture supplemented with rock powder and inoculated with different microorganisms resulted differently according to the type of rock, the microorganism involved and also the interaction rock/microrganism. The rocks differed in their potential of phosphate bioavailability. Carbonatite presented a higher potential for the P and K bioavailability. The phlogopyte improved the P bioavailability and the granite of Saibrita in the K bioavailability. The isolated samples coded MSF-344, MSF-352, and MSF-353 presented a higher potential of improving P and K availability, standing out also the isolated samples of MSF-305 and MSF-313 in relation to P and MSF-62, MSF-293, MFS-322, MFS-331 in relation to K. The rocks differed in their potential of supplying nutrients to the plants. phlogopyte showed a potential to be used as a source of P and K and as sources of K, it was identified the carbonatite, the alcaline breccia, phonolyte, sand stone, calcareous rock Irati and granite of Saibrita.. Microorganisms and rock powder may be used in the total or partial substitution of soluble fertilizers. In relation to P, the isolated samples MSF-305, MSF-313 and MSF-344, and in relation to K, MSF-322 and MFS-331. Therefore, these isolated showed a great potential to be used in programs of controlled inoculation, aiming at improving the bioavailability of rock nutrients in the place of fertilizers, either when used alone or as fertilizer supplements.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:45:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 237897.pdf: 458130 bytes, checksum: 060a4a0f2a67fee33822c23e381a7b72 (MD5)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-16T01:10:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 213152.pdf: 1497563 bytes, checksum: 7052e7edb69803e43a00d0418e6a68c8 (MD5) / A necessidade do desenvolvimento de fármacos com maior eficácia e menores efeitos adversos contra algumas patologias, tem estimulado a procura por novas moléculas protótipo. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antioxidante e antifúngica de análogos sintéticos da acetofenona e pró-oxidante e antitumoral de chalconas sintéticas, utilizando modelos in vitro e in vivo. A avaliação da atividade pró e antioxidante in vitro foram investigadas pelos métodos de captação do radical DPPH e pela medida de proteção da lipoperoxidação (TBARS). A atividade antifúngica dos análogos sintéticos da acetofenona foi avaliada pelo método de microdiluição através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM). Os estudos da atividade