Orientador: Carlos Alberto Hussni / Banca: Marcos Jun Watanabe / Banca: Cláudia Helena Pellizzon / Resumo: Foi realizada a avaliação morfológica e morfométrica da veia cefálica submetida à pinçamento de cinco equinos hígidos. Foram testadas as pinças hemostáticas: Diffenbach bulldog, De Bakey bulldog, Rochester reta e De Bakey com cremalheira. Após 15 minutos da aplicação das referidas pinças, foi realizada a flebectomia parcial e coletadas as amostras referentes a cada segmento do vaso pinçado e do segmento controle sem pinçamento. Das peças procedeu-se as preparações histológicas dos segmentos da veia nas colorações de Hematoxilina-Eosina e Tricrômio de Masson, os cortes histológicos foram avaliados por microscopia óptica. Foi realizada análise morfológica das veias, de forma qualitativa, utilizando para isto uma escala de avaliação de lesões vasculares após pinçamento; a avaliação morfométrica, quantificando em micrometros o achatamento produzido pelas pinças nas diferentes camadas vasculares. Em ambos os estudos, morfológico e morfométrico, as pinças com serrilhamento transversal e fechamento tipo cremalheira causaram as maiores alterações, observou se marcada vacuolização das células musculares e desarranjo na túnica media com perda marcada das células endoteliais da túnica intima do vaso estudado. / Abstract: Morphometric and morphologic evaluation of the cephalic vein of five healthy horses submitted to clamping was done. Hemostatic clamps tested were Dieffenbach bulldog, De Bakey bulldog, Rochester straight and De Bakey with ratchets. 15 minutes after mentioned clamps were applied partial phlebotomy was performed and histologic sections of the veins were prepared and stained with Hematoxylin-Eosin and Masson Trichrome, after the stained preparations were evaluated by light microscopy. A qualitative morphological analysis of the veins was performed using a rating scale of vascular lesions after clamping; the morphometric evaluation consisted in quantifying in micrometers the flattening produced by the hemostatic clamps in the different vascular beds. In both studies, morphologic and morphometric, hemostats with transverse serration and ratcheted mechanism caused major changes, pronounced vacuolization of the muscle cells, derangement of the medium tunic and marked loss of endothelial cells of the intima tunic was observed in the vessel studied. / Mestre

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Iran Malavazi / Resumo: O fungo Neurospora crassa é um organismo amplamente utilizado como organismo modelo na compreensão de aspectos fundamentais da biologia dos eucariotos. Nosso laboratório tem utilizado este fungo para estudar os mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos na regulação do metabolismo do glicogênio. A avaliação de uma coleção de linhagens mutantes individualmente nocauteadas em genes que codificam fatores de transcrição permitiu identificar várias proteínas potencialmente envolvidas na regulação do metabolismo do glicogênio neste organismo modelo. As linhagens mutantes selecionadas apresentaram alterações no perfil de acúmulo de glicogênio e expressão do gene que codifica a enzima glicogênio sintase (gsn) durante a situação de estresse térmico. Entre estas, as linhagens mutantes nas ORFS NCU03043, NCU01629 e NCU04731, anotadas como proteínas hipotéticas no banco de dados do genoma do fungo, foram selecionadas para o presente estudo. Através de análises de Blast, a proteína codificada pela ORF NCU04731 mostrou ser homóloga ao grupo de fator de transcrição SREBPs (Sterol Regulatory Element Binding Protein) de mamíferos, que atuam como principal regulador da síntese de colesterol. Estas proteínas possuem domínio transmembrana e são ativadas após clivagem. Uma proteína ortóloga a SREBP (Sre1) foi identificada em Schizosaccharomyces pombe, entretanto, enquanto a habilidade de resposta a esteróis é conservada, as SREBPs de fungo regulam genes envolvidos na resposta transcricional à hipóxia, sendo necessárias para o crescimento em baixas concentrações de oxigênio. A proteína codificada pela ORF NCU03043 mostrou homologia a proteínas FlbC e FLE1 de fungos, as quais estão envolvidas na conidiação e desenvolvimento asexual. A linhagem flbCKO de N. crassa apresentou defeitos na progressão... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The fungus Neurospora crassa has been widely used as a model organism for fundamental aspects of eukaryotic biology. We have been studying the biochemical and molecular mechanisms involved in glycogen metabolism regulation in this fungus. The screening of a set of knocked-out strains in genes encoding transcription factors was previously performed as an attempt to identify transcription factors regulating glycogen metabolism in N. crassa. Mutant strains presenting changes in glycogen accumulation and glycogen synthase gene (gsn) expression under normal growth temperature and under heat shock stress were selected. Among them, the mutant strains in the ORFs NCU03043, NCU01629 and NCU04731, annotated as hypothetical proteins in the fungus genome database were studied in the present work. By Blast analysis, the proteins NCU04731 showed homology to a group of mammalian transcription factors SREBPs (Sterol Regulatory Element Binding Protein), which act as regulators of cholesterol synthesis and requiring cleavage from the membrane for activation. A SREBP orthologue was identified in Schizosaccharomyces pombe (Sre1), however while the ability to respond to sterol is conserved, fungal SREBPs regulates genes involved in the transcriptional response to hypoxia and are required for growth under low-oxygen conditions. The proteins encoded by the ORF NCU03043 showed homology to the fungal proteins FlbC and FLE1 involved in conidiation and asexual development. The N. crassa flbCKO strain presented defects in cell cycle progression and morphology. FLBC protein is necessary for proper induction of conidiation and is important for growth and development in N. crassa. flbC gene expression was highly induced in the early times of conidia germination confirming the importance of this protein to the fungus... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Rogério Nogueira de Oliveira / Banca: Greiciane Gaburro Panetto / Resumo: Morte súbita cardíaca (MSC) é um dos maiores problemas de saúde pública no mundo, afetando cerca de 335 mil pessoas por ano nos EUA e aproximadamente 712 pessoas por dia no Brasil, predominantemente na faixa etária mais produtiva. Principalmente em jovens, as causas são desordens cardíacas com anormalidades estruturais e arritmogênicas de origens genéticas; além disso, alguns medicamentos podem influenciar na susceptibilidade a MSC ou a doenças cardiovasculares. Como a morte pode ocorrer num período máximo de uma hora após o início dos sintomas e não ser decorrente de trauma ou violência, o diagnóstico da causa de morte pode ser dificultado. A análise genética nestes casos é muito útil para ajudar a identificá-la e informar aos parentes próximos sobre um possível fator genético de risco pré-existente. Este trabalho propôs padronizar as reações de PCR e SNaPshot em multiplex para analisar 11 SNPs (single nucleotide polymorphisms) relacionados à MSC (NEWTON-CHEH et al. 2009) em grupos de familiares brasileiros com histórico de insuficiência cardíaca para uma futura utilização na Genética Forense e Médica, entretanto, o multiplex contendo 8 SNPs mostrou ser mais eficiente . Para tanto, amostras foram coletadas de indivíduos com histórico familiar de: coronariopatia, cardiomiopatia hipertrófica ou familiar próximo que sofreu ataque cardíaco e, indivíduos sem este histórico utilizados como controles. As análises não apresentaram diferenças significativas entre o grupo de indivíduos com histórico e controle, mas, os dados são compatíveis com as freqüências conhecidas dos SNPs. Também identificou-se um provável fator hereditário para o SNP rs4725982 em uma das famílias / Abstract: Sudden cardiac death (SCD) is a major public health problems worldwide, affeting about 335,000 people per year in the U.S. and approximately 712 people per day in Brazil, predominantly in the most productive age group. Especially in young people, the causes are structural abnormalities of cardiac disorders and genetic origins of arrhythmogenic, in addition, some medications may influence susceptibility to SCD or cardiovascular disease. As death can occur whitin a maximum of one hour after onset of symptoms and not be due to trauma or violence, the diagnosis of the cause of the death can be difficult. Genetic analysis in these cases is very useful to help identify them and inform close relatives about a possible genetic risk factor pre-existing. This work proposed to standardize the PCR and SNaPshot multiplex to analyze 11 SNPs (single nucleotide polymorphisms) related to the SCD (NEWTON-CHEH et al. 2009) in Brazilian familial groups with a history of heart failure for future use in Forensic Genetics and Medical. For this, samples were collected from individuals with a family history of heart disease, hypertrophic cardiomyophathy or close relative who suffered a heart attack, and individuals without this history used as controls. The analysis showed no siginificant differences between the group of the individuals with a history and control, but the data are compatible with the frequencies of known SNPs. It also identified a probable hereditary factor for the SNP rs4725982 in one of the studied families / Mestre

Orientador: Crispin Humberto Garcia-Cruz / Banca: Mauricio Boscolo / Banca: Edson José Fragiorge / Resumo: Os biocombustíveis têm despertado interesse crescente como alternativa para reduzir o impacto ambiental negativo do uso de combustíveis à base de petróleo, proporcionando ainda maior segurança energética entre os países. Em particular, o etanol celulósico produzido a partir de materiais renováveis lignocelulósicos, entre eles os resíduos agroindustriais, se apresenta como mais competitivo. Neste contexto, o presente trabalho abrange o potencial do uso de resíduos de mandioca (Manihot esculenta Crantz) obtidos durante o processamento de fécula como matéria-prima para a produção de bioetanol. Foram realizados experimentos de hidrólise nas concentrações de 0,5% até 5% de ácido sulfúrico (v/v). Os resultados demonstraram que H2SO4 a 2% durante 10 minutos de reação a 121ºC atingiram a maior liberação de açúcares redutores presentes no resíduo (134,84 g L-1 ). As condições ideais para a fermentação alcóolica utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae ATCC 26602 foram pH 6,5 e temperatura de 35ºC, frascos mantidos sem agitação e concentração de açúcar redutor inicial de 50g L-1, resultando em 21,23 g L-1 de etanol com uma produtividade de 1,86 g L h -1 e rendimento teórico de 96,5% após 10 horas de fermentação (0,49g/g açúcar fermentescível). Os resultados indicaram que resíduos de mandioca podem servir como um substrato potencial para a produção de etanol, visto que certos parâmetros fermentativos para a otimização do processo foram pesquisados. Assim, este estudo fornece dados práticos sobre as condições mais adequadas para o aproveitamento destes rejeitos industriais visando a geração de energia combustível "limpa", característica invejável e cada vez mais atrativa num mundo onde cresce a preocupação econômica e ambiental / Abstract: Biofuels has increased interest as alternative to reduce the negative environmental impact of petroleum-based fuels use, providing greater energy security among countries. In particular, cellulosic ethanol produced from renewable lignocellulosic materials including agroindustrial wastes presents as most competitive. In this context, this work has focused on the potential use of cassava waste (Manihot esculenta Crantz) obtained from starch processing as raw material for bioethanol production. Hydrolysis experiments were conducted in concentrations from 0.5% to 5% sulfuric acid (v/v). The results showed that 2% H2SO4 for 10 minutes at 121°C reaction reached the highest release of reducing sugars present in the residue (134.84 g L -1 ). The optimal conditions for the alcohol fermentation using Saccharomyces cerevisiae ATCC 26602 strain has pH 6.5, temperature of 35°C, flasks without stirring and initial reducing sugar concentration of 50g L-1, resulting in 21.23 g L-1 ethanol with a productivity of 1.86 g L h -1 and theoretical yield of 96.5% after 10 hours fermentation (0.49 g/g fermentable sugar). These results indicated that cassava residues may serve as potential substrate for ethanol production, since certain fermentation parameters for process optimization were investigated. This study provides practical information on the most suitable conditions for use of these industrial wastes aiming to generate "clean" energy, an enviable and increasingly attractive feature in a world where economic and environmental concerns are growing / Mestre

Orientador: Maria Inês de Moura Campos Pardini / Banca: Isabel Maria Vicente Guedes Carvalho-Mello / Banca: Domingos Alves Meira / Resumo: O HIV-1 é um retrovirus que possui grande variabilidade genética, principalmente no gene que codifica o envelope viral (env). A diversidade de seqüências encontrada na terceira alça variável (alça V3) da gp120 é relacionada a várias características biológicas virais, tais como: habilidade do vírus a induzir sincício, antigenicidade e tropismo viral. O arco da alça V3 é formado por uma seqüência de aminoácidos relativamente conservada (GPGR) nos vírus do subtipo B. No Brasil, encontramos a variante B’, que possui a seqüência GWGR formando a região do arco e tem sido associada a uma progressão mais lenta da infecção. O fenótipo viral Não Indutor de Sincício (NSI) predomina nas fases assintomáticas, enquanto que o fenótipo Indutor de Sincício (SI) emerge em indivíduos infectados precedendo um declínio acentuado de células T CD4, sendo associado à progressão para aids. A mudança do fenótipo NSI para SI é resultante da substituição de determinados aminoácidos na alça V3. Mutações que alterem a seqüência de aminoácidos da alça V3, incluindo a região do arco podem ser utilizadas como marcadores genéticos para inferir sobre a evolução da infecção. DNA viral foi isolado a partir de leucócitos e utilizado como fonte para amplificação por PCR e seqüenciamento automático da região da alça V3. Um script desenvolvido pelo setor de Bioinformática foi utilizado para identificar os fenótipos SI/NSI e a seqüência de aminoácidos do arco da alça V3 (GPGR/GWGR) em 1279 pacientes estudados no Estado de São Paulo como parte do projeto VGDN. Esse estudo mostrou que 34,8% dos pacientes possuíam os aminoácidos GPGR formando a região do arco enquanto que 22,8% possuíam GWGR. Além disso, análises estatísticas utilizando o Teste de Goodman apontaram uma prevalência significativa de GWGR em pacientes assintomáticos com fenótipo NSI... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Genomic diversity in HIV-1 is a well-characterized feature and although this heterogeneity is distributed throughout the genome, most of the polymorphisms are located in the envelope gene (env). Sequence variability at the env gene third variable region (V3 loop) of HIV-1 is highly correlated with several viral biological features, such as the ability to induce syncytia, antigenicity and viral tropism. The tip of V3 loop consists of a relative conserved amino acid sequence (GPGR) in subtype B and the presence of GWGR motif in this region has been found in Brazilian strains (B' variant). Non-syncytium-inducing (NSI) phenotype variants predominate in the asymptomatic phase and Sincytium-inducing (SI) phenotype variants emerge in infected patients preceding a CD4 cell decline and correlate with progression to clinical manifestations. The switch from an NSI to an SI phenotype was correlated with one or more basic amino acids substitutions in the V3 loop. Genetic mutations modifying the V3 sequence has been associated with alterations in cytopathic abilities and antigenicity. The patterns of the HIV-1 sequences variability can be used as genetic marker to infer about the infection evolution. Viral DNA isolated from leucocytes was used as a source for PCR amplification and automatic sequencing of the V3 loop gene. Home-made PERL scripts were used to identify NSI/SI phenotypes and GPGR/GWGR motif in 1279 patients studied in São Paulo State, Brazil, as part of VGDN Project (www.lemb.icb.usp.br). This study showed that 34.8% of the patients have had GPGR variants and 22.8% GWGR. In addiction, statistical analysis using Goodman's Test showed GWGR prevailed in asymptomatic patients with NSI strains... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: A metilação de ilhas CpG em regiões regulatórias de vários genes tem sido descrita como um processo importante no silenciamento de genes supressores de tumor e diretamente envolvida no processo de carcinogênese de uma série de tumores. O estudo desses genes afetados pela metilação em tumores visa identificar possíveis marcadores moleculares para o diagnóstico, prognóstico e tratamento de tumores, além de possibilitar a descoberta de fatores importantes no processo biológico do câncer. Neste sentido, ao estudar o perfil diferencial de metilação de genes em carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço, o gene MX1 foi identificado como diferencialmente expresso. Correlação também foi encontrada entre o silenciamento de ADAM23 e estágios tardios da progressão tumoral neste tipo de câncer. Dessa forma, o presente estudo envolveu a identificação de ligantes celulares das proteínas ADAM23 e MX1 por meio de rastreamentos de duplo- híbrido, usando bibliotecas de cDNA de cérebro fetal humano. Inicialmente, foi realizado rastreamento com os domínios desintegrina e rico em cisteína (DIS-ACR) de ADAM23, com um total de 5,1x105 transformantes obtidos, dos quais somente 1 foi confirmado pelo ensaio de "plasmid linkage". O candidato confirmado pelo "plasmid linkage", identificado como SPRY1, foi considerado como falso positivo por ser uma proteína estritamente citoplasmática, não podendo, portanto, interagir fisicamente com os domínios DIS-ACR de ADAM23, que são extracelulares. Ainda, foi realizado rastreamento com a proteína MX1, que resultou em aproximadamente 1,0x106 transformantes, dos quais 74 foram confirmados pelo ensaio de duplo- híbrido e codificam para 9 ligantes já conhecidos e 21 ligantes prováveis de MX1. Entre esses ligantes prováveis estão proteínas que já haviam sido descritas como ligantes de MX1, incluindo a própria proteína MX1, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The methylation of CpG islands at regulatory regions of various genes has been described as an important process for the silencing of tumor suppressor genes and is directly involved in the carcinogenesis of a series of tumors. The study of these methylation-affected genes in tumors aims at identifying possible molecular markers for diagnostic, prognostic and treatment of such tumors, besides making possible the discovery of factors important for cancer biology. On this purpose, the study of differential pattern of gene methylation in head and neck squamous cell carcinoma identified the gene MX1 as differentially methylated. Together with this result, it was found a correlation between ADAM23 silencing and late stages of tumor progression in this type of cancer. In order to identify cellular ligands of ADAM23 and MX1, we performed two-hybrid screenings using fetal brain cDNA libraries. Initially, a screening with the disintegrin and cystein rich (DIS-ACR) domains of ADAM23 was accomplished, with an amount of 5,1x105 transformants obtained, out of which just one was confirmed by plasmid linkage assay and identified as SPRY1. However, it was considered a false positive since this protein is restricted to the cytoplasmatic compartment and, therefore, it may not physically bind the DIS-ACR domains of ADAM23, known to be extracellular. Additionally, a screening with the MX1 protein was performed, resulting in approximately 1.0x106 transformants, out of which 74 were confirmed by two-hybrid assay and revealed 9 already known and 21 putative ligands of MX1. Among the putative ligands there are proteins previously described as MX1 ligands, including MX1 itself, corroborating the results obtained in our screening. Moreover, most of the identified ligands are factors involved in protein SUMOylation, PML-NB assembly and proteins that are related to transcriptional control and apoptosis. The results ... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Sandro Roberto Valentini / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Márcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Eloiza Helena Tajara da Silva / Mestre

Resumo: O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado de arqueas a mamíferos e é essencial para a viabilidade celular. Este fator tem sido associado com o início da tradução, proliferação celular, transporte nucleocitoplasmático e decaimento de mRNA. Estudos recentes associam eIF5A com a elongação, ao invés do inicio da tradução. eIF5A é a única proteína conhecida que contém o aminoácido essencial hipusina, gerado pelas enzimas desoxihipusina sintase e desoxihipusina hidroxilase. O objetivo deste estudo foi a caracterização estrutural e funcional de eIF5A de S. cerevisiae. Primeiramente, a estrutura terciária de eIF5A foi determinada por cristalografia e foi demonstrada a sua dimerização em solução, independentemente do resíduo hipusina. Foram obtidos e caracterizados 40 mutantes novos de eIF5A, dos quais 19 não complementaram o nocaute do gene selvagem, 13 apresentaram fenótipo de termossensibilidade e 8 não apresentaram nenhuma alteração nos fenótipos investigados. A maioria dos mutantes novos tem seus fenótipos resultantes da degradação da proteína eIF5A. Curiosamente, este é o primeiro estudo que sugere que a α-hélice presente no C-terminal de eIF5A é essencial para a manutenção da sua estrutura. Descrevemos também, que a extensão N-terminal de eIF5A, presente apenas em eucariotos, não é essencial para estrutura e função dessa proteína. Além disso, os mutantes contendo substituições na alça onde está localizado o aminoácido hipusina são inviáveis ou termossensíveis. Embora estes mutantes produzam eIF5A, inclusive na temperatura não permissiva, a proteína produzida não é hipusinada. Finalmente, dois mutantes termossensíveis (tif51AK56A e tif51AQ22H/L93F) produzem a proteína eIF5A estável na temperatura não permissiva, no entanto, apresentam... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved from archae to mammals and is essential for cell viability. This factor has been associated with translation initiation, cell proliferation, nucleocytoplasmatic transport and mRNA decay. Recent studies show eIF5A involved in elongation, rather than translation initiation. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid residue hypusine, generated by the enzymes deoxyhypusine synthase and deoxyhypusine hydroxylase. The main goal of this study was the structural and functional characterization of S. cerevisiae eIF5A. First of all, the tertiary structure of eIF5A was determined by crystallography and this protein was defined as a dimer in solution, independently of the hipusine residue. We obtained and characterized 40 new mutants, which 19 cannot complement tif51A knockout cells, 13 are temperature-sensitive and 8 show no detectable phenotype. The phenotypes of most mutantes are caused by protein folding defects. Interestingly, this is the first study suggesting that the C-terminal -helix present in yeast eIF5A may be an essential structural element. Moreover, we describe that the eIF5A N-terminal extension present only in eukaryotic homologues is not essential in yeast. Furthermore, the mutants containing substitutions surrounding the hypusine modification site showed unviable or temperature-sensitive phenotypes. Although these mutant proteins were stable, they were defective in hypusine modification. Finally, two of the temperature-sensitive mutant strains (tif51AK56A and tif51AQ22H/L93F) produced stable eIF5A protein but showed defects in growth and protein synthesis and these mutants revealed polysome profile defect similar to that described for mutations in factors involved in translation... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Sandro Roberto Valentini / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Paulo Sergio Rodrigues Coelho / Banca: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Banca: Beatriz Amaral de Castilho / Doutor

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Julio Cezar Franco de Oliveira / Resumo: Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) é uma bactéria Gram-negativa responsável pelo o cancro cítrico. A doença causada por este fitopatógeno constitui numa das mais graves doenças da citricultura brasileira, cujas medidas de controle capazes de eliminar completamente a doença são ineficientes até o momento. O sequenciamento e anotação do genoma de Xcc juntamente com estudos relacionados à genômica funcional nesta bactéria realizados em nosso laboratório mostraram a existência, na bactéria, de alguns genes (copA e copB) que codificam proteínas envolvidas com o mecanismo de resistência a cobre (CopA e CopB). Os genes que codificam ambas proteínas estão organizados em um operon, cuja transcrição é induzida por cobre e é específica ao metal. Componentes a base de cobre são comumente usados na agricultura como agentes microbicidas a fim de reduzir a severidade desta e também de outras doenças nas plantas. Contudo, a eficácia do cobre está sendo reduzida pelo aparecimento de linhagens de bactérias resistentes a este metal, portanto, estudos visando a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na resistência a cobre em Xcc são de grande importância. Uma pequena ORF (XAC3629) que codifica uma proteína hipotética de 152 aminoácidos e que se localiza upstream aos genes copAB foi identificada. Neste trabalho foi estudado o papel da ORF na regulação do operon copAB. Linhagens mutantes contendo a ORF XAC3629 interrompida por um transposon (XAC3629::Tn), previamente construídas no laboratório, foram avaliadas em relação ao crescimento em meio contendo diferentes concentrações de cobre. Estas linhagens mostraram perda da resistência quando o metal foi adicionado ao meio, mesmo em baixas concentrações (0,25 mM), sugerindo seu envolvimento na regulação do operon de resistência a cobre copAB. Células da linhagem selvagem ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) is a Gram-negative bacterium that causes citrus canker, one of the most serious diseases in Brazilian crops, and the ways to eliminate it are not efficient. After sequencing and annotation of the Xcc genome our laboratory started to perform functional genomic studies in Xcc. Previous studies identified two genes (copA and copB) that encode proteins involved in the copper resistance mechanism (CopA and CopB). The genes are organized in an operon whose transcription is induced and specific to copper. Copper compounds are commonly used in agriculture in order to control plant diseases, however the copper effectiveness is being reduced due to the emergence of copper resistant bacteria strains. Therefore, studies related to copper resistance mechanism in Xcc are very relevant. A short ORF (XAC3629) which encodes an 152 amino acids hypothetical protein was identified upstream the operon copAB. In this work the role of the ORF in the operon regulation was studied. Mutant strains containing the ORF XAC3629 interrupetd by a transposon (XAC3629::Tn) were previously constructed in our laboratory and in this work their growth were evaluated in a medium containing different copper concentration. The mutant strains were unable to grow when the metal was added to the medium, even at low concentration (0.25 mM) suggesting that the ORF XAC3629 may have a role in regulating the operon copAB. Wild type Xcc cells are able to grow up to 1 mM copper concentration. Attempts to construct an ORF XAC3629 knocked out strain were performed but this mutant strain was not obtained. Two XAC3629::Tn mutants strains were transformed with a plasmid construction containing the ORF XAC3629 entire sequence plus its flanking regions. The results did not show functional complementation (recovery of the copper resistance when cells were grown in medium containing ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador:Edwil Aparecida Gattás / Coorientador: . Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Jose Roberto Ernandes / Banca: Andre Ricardo Alcarde / Banca: Rosimeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Ana Marisa Fusco Almeida / Resumo: O processo de fermentação para produção de álcool combustível inclui a reutilização da biomassa de levedura, situação em que as células de levedura são expostas a condições de estresse, como temperaturas elevadas, aumento da concentração de etanol e baixos valores de pH. Este processo pode ocasionar uma redução da viabilidade celular, diminuindo de forma significativa o rendimento da fermentação. Algumas linhagens de Saccharomyces cerevisiae, no entanto, apresentam termotolerância ou resistência a maiores concentrações de etanol, sendo capazes de se adaptar ao meio em que estão. Neste trabalho, uma linhagem de levedura industrial foi isolada da dorna de fermentação ao final de safra por apresentar capacidade de permanência no processo fermentativo e ser boa fermentadora. Com o intuito de avaliar quais genes estão envolvidos com essas características, a levedura isolada foi esporulada e dissecada para geração de novos segregantes, que foram analisados e selecionados quanto a termo e álcool resistência e capacidade fermentativa. Os resultados mostraram que dois dos segregantes avaliados apresentaram-se promissores com relação a capacidade fermentativa e resistência a altas temperaturas e concentrações de etanol quando comparados às linhagens industriais PE-2, CAT-1 e SA-1, largamente utilizadas nas usinas produtoras de etanol. Em seguida, foi realizado o ensaio de PCR em Tempo Real, para avaliar a relação dos genes APJ1, FPS1, MKT1, SWS2 e HSP12 com a tolerância ao etanol. Além disso, foi avaliado também a possibilidade do gene HSP12 ser um marcador molecular de estresse nas leveduras de linhagens industriais. Para isso, foram utilizadas duas linhagens de levedura: uma resistente ao etanol (MA-12) e não resistente (MA-139), excluída no início dos experimentos. Todos os genes avaliadosapresentaram expressão significativa nas situações de estresse para a linhagem resistente MA-12, o que não aconteceu... / Abstract: Fuel-ethanol fermentation process includes a reutilization of the yeast biomass, in which yeast cells are exposed tostress conditions as high temperature, increasing alcohol concentration and low pH values. This enviroment may cause a significant delay in fermentation and drop in cell viability. Some Saccharomyces cerevisiaestrains, however, have thermotolerance or resistance to higher ethanol concentrations, while being able to adapt to the environment in which they are. In this work, the industrial resistant yeast strain was isolated from fermented sugar cane at the end of the harvest to be good leavening. Aiming to study genetic features associated with cell resistance to sustained stress in an industrial yeast strain, they wereinduced to sporulation and the ascospores were dissected in order to generate homozygous derivatives andwere ramdomly selected for further phenotype analysis. The results have shown that two of segregating presented to be promising with the fermentative capacity and resistance to high temperature and ethanol concentration as compared to industrial strains PE-2, CAT-1 and SA-1. Following that,the real time PCR assay was performed to assess the relationship of APJ1, FPS1, MKT1, SWS2 and HSP12 genes with ethanol tolerance. Furthermore, was also analyzed the differential expression of the HSP12 gene as a molecular marker for stress-resistance in industrial yeast.The PCR was performed with two yeast strains: a resistant yeast (MA-12) and non-resistant (MA-139, ruled in the early experiments) and shows wich all genes evaluated revealed a significant expression in stress situations for the resistantstrain MA-12, which did not happen in the sensitive yeast (except for APJ1 gene), which shows that the selected genes are directly related to stress resistance. The results also suggest that HSP12 gene can be used as a molecular marker of stress in industrial yeast strains, since they have shown significant expression in the ... / Doutor

Orientador: Denise Bevilaqua / Banca: Assis Vicente Benedetti / Banca: Paulo Teixeira Lacava / Resumo: As fontes naturais de minérios sulfetados vêm se esgotando rapidamente devido à demanda por metais nas indústrias de bens de produção e de consumo. O cobre é um dos metais de maior interesse econômico. Cerca de 70% deste metal é encontrado na natureza na forma de calcopirita (CuFeS2), contudo é o mineral que possui maiores limitações em sua extração. Dentre os processos de extração têm-se a biolixiviação, que utiliza micro-organismos capazes de promoverem a solubilização de metais pela oxidação de sulfetos metálicos, apresentando vantagens em relação às técnicas já utilizadas, principalmente de cunho econômico e ambiental. Neste contexto, o presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a influência do potencial de óxido-redução na solubilização de cobre a partir da calcopirita. Para isso, foram realizados ensaios de oxidação de íons ferrosos na presença e ausência do mineral. A bactéria utilizada nos ensaios foi a Acidithiobacillus ferrooxidans - LR, espécie acidófila mais estudada e mais encontrada em ambientes de mina. A amostra de calcopirita, proveniente da localidade de La Chorrera, na Colômbia, foi analisada por difração de raios-X (DRX) e evidenciou a presença dominante de calcopirita. Os ensaios de oxidação foram realizados em frascos, agitados a 150 rpm, a 30ºC sob diferentes concentrações de íons ferrosos (100, 200 e 300 mmol L-1) em meio T&K. Aos sistemas foram adicionados 2,5% (m/v) de calcopirita e 5% (v/v) do inóculo fresco de A. ferrooxidans. Nas condições abióticas, em todas as concentrações de Fe2+, o potencial redox atingiu, em média, 420 mV (Ag|AgCl|KCl(sat)), e foram os sistemas que apresentaram as maiores porcentagens de recuperação de cobre, sendo elas 73%, 90% e 78%, respectivamente, após 100 dias de ensaio. Contudo, os sistemas que continham bactéria apresentaram uma recuperação ínfima de cobre, chegando a apenas 17%, em um potencial médio... / Abstract: Natural sources of sulfide ores come depleting rapidly due to the demand for metal goods industries in production and consumption. Copper is a metal of greater economic interest. About 70% of this metal is found in nature in the form of chalcopyrite (CuFeS2), however it is the mineral that present a major limitations in its extraction. One of the extraction processes is bioleaching, which uses microorganisms capable of promoting the solubilization of metals by metal sulfides oxidation and presents advantages over the common techniques used, mainly for economic and environmental nature. In this context, the present work was carrying out to evaluate the influence of the redox potential in the solubilization of copper from chalcopyrite. For this, ferrous ions oxidation tests were conducted in the presence and absence of the mineral. The bacterium used in the tests was Acidithiobacillus ferrooxidans - LR, the acidophilic species most studied and most commonly found in mine environments. A sample of chalcopyrite from La Chorrera, Colombia, was analyzed by X-ray diffraction (XRD) and showed the dominant presence of chalcopyrite. Ferrous ions oxidation tests were carried out in shaken flasks at 150 rpm, at 30 ºC using different concentrations of ferrous ions (100, 200, and 300 mmol L-1) in T&K medium. The systems were supplied with 2,5% (w/v) of chalcopyrite and 5% (v/v) of A. ferrooxidans fresh inoculum. At the abiotic conditions, the redox potential achieved 420 mV (Ag|AgCl|KCl(sat)) in all ferrous ions concentrations. Besides, these systems showed the highest copper recovery concentrations, such 73%, 90% and 78%, respectively, after 100 days of testing. However, the bacterial systems showed a low copper recovery, about 17% in a redox potential of 610 mV (Ag|AgCl|KCl(sat)). The solid residues were evaluated by XRD and showed, at abiotic conditions the formation of elemental sulfur, jarositas and a significant decrease in chalcopyrite's... / Mestre