Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Centro de Desenvolvimento Sustentável, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-09-05T16:44:37Z No. of bitstreams: 1 2011_AlessandraBortoniNinis.pdf: 2465177 bytes, checksum: ca053ade1b8b8bdde3b003dfd788b882 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-10-14T12:32:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_AlessandraBortoniNinis.pdf: 2465177 bytes, checksum: ca053ade1b8b8bdde3b003dfd788b882 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-14T12:32:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_AlessandraBortoniNinis.pdf: 2465177 bytes, checksum: ca053ade1b8b8bdde3b003dfd788b882 (MD5) / O avanço científico e tecnológico dos últimos dois séculos fez aflorar na sociedadecontemporânea o interesse pelas consequências do progresso técnico para o futuro dahumanidade. Nas últimas décadas tem-se intensificado a discussão em relação aosavanços das tecnociências (biotecnologia, nanotecnologia, neurociência etc.), naconformação do homem e da sociedade do futuro. Por um lado, tais técnicas geram eprometem gerar ainda mais inovação no sistema agroalimentar, na medicina, no meioambiente e no próprio homem; por outro, não apresentam segurança sobre as suasimplicações em longo prazo, principalmente no que concerne aos seus efeitosintergeracionais e sobre a biodiversidade. Diante da complexidade do tema, o estudo sobreos efeitos da rápida evolução das tecnociências para a humanidade não comporta mais oolhar fragmentário do paradigma cartesiano. Nesta perspectiva, este trabalho propõe umaabordagem diferenciada sobre a temática da manipulação genética, baseada no paradigmada complexidade, de forma a compreender as interações sistêmicas entre diferentesdimensões de análise social, entre a representação social, a ideologia científica, asociedade de risco, o biocapitalismo e as dinâmicas políticas. O trabalho tem como objetivoanalisar as interações complexas entre essas dimensões, no intuito de demonstrar comoelas se relacionam entre si, conformando-se num sistema complexo. Buscou-se traçar umaanálise transversal entre estas dimensões a fim de obter uma visão sistêmica em torno dasdiferentes percepções e efeitos das técnicas de manipulação genética, desenvolvendo umpensamento capaz de enfrentar a complexidade da questão da biotecnologia na sociedadecontemporânea e sugerindo a constituição de uma nova etapa do desenvolvimentocapitalista, onde a vida transforma-se em mercadoria. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The scientific and technological advances of recent centuries has fostered interest incontemporary society about the consequences of technical progress for the future ofhumanity. In the last decades the debate regarding the advances of technoscience(biotechnology, nanotechnology, neuroscience etc.) in the conformation of man and societyof the future has been intensified. On the one hand, these techniques promise, among othersthings, generate huge innovation in agrofood system, in medicine, in the environment and inman himself, on the other hand, have no security on its long-term implications, especiallyregarding the effects of intergenerational use and the effects over biodiversity. Given thecomplexity of the subject, the study of the effects of technosciences for humanity does notsupport anymore the fragmented look of the Cartesian paradigm. Taking this perspective,this paper proposes a different approach on the issue of genetic manipulation, based on theparadigm of complexity in order to understand the systemic interactions between differentdimensions of social analysis: the social representation, the scientific ideology, the risksociety, the economic power and the political dynamics. The work aims to analyze thecomplex interactions between these dimensions in order to demonstrate how they relate toeach other, conforming to a complex system. We tried to draw a cross-sectional analysis ofthese dimensions in order to get a systemic view about the different perceptions and effectsof genetic manipulation techniques, developing an argument able to face the complexity ofthe issue of biotechnology in contemporary society.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-04-28T15:56:09Z No. of bitstreams: 1 2014_BrunaRayaneTeodoroJunqueira.pdf: 3067398 bytes, checksum: 8b5b8fc5895525f6b62933ad8fa85832 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-04-29T11:49:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_BrunaRayaneTeodoroJunqueira.pdf: 3067398 bytes, checksum: 8b5b8fc5895525f6b62933ad8fa85832 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-29T11:49:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_BrunaRayaneTeodoroJunqueira.pdf: 3067398 bytes, checksum: 8b5b8fc5895525f6b62933ad8fa85832 (MD5) / Pepper mild mottle virus (PMMoV) é um tobamovírus que possui genoma de RNA de fita simples com polaridade positiva. O vírion é composto pelo genoma envolvido por múltiplas cópias da proteína do capsídeo (CP). A fim de construir clones infectivos de PMMoV para desenvolver vetor de expressão de proteína heteróloga, duas estratégias simplificadas foram avaliadas, a primeira baseada na produção in vitro de transcritos infectivos e a segunda com o uso de vetor binário para agroinoculação. Primeiramente, o cDNA de PMMoV foi clonado no vetor pCR4-TOPO e, posteriormente, subclonado em pUC19, sob o comando do promotor T7 para a realização da transcrição in vitro. Os transcritos foram inoculados em folhas de Nicotiana benthamiana e após três semanas mostraram sintomas de mosaico e distorção foliar, indicações diretas da recuperação do vírus com este procedimento. A recuperação de vírus e infecção foi confirmada por DIBA usando anticorpo policlonal anti-PMMoV e microscopia eletrônica de transmissão. A segunda estratégia consistiu na clonagem do genoma no vetor binário derivado de pTRV2-MCS contendo o plasmídeo pCAMBIA 0390 modificado, pela técnica de overlap-extension PCR. A clonagem foi confirmada a partir da análise do padrão de digestão por enzima de restrição e sequenciamento. Agrobacterium tumefaciens foi transformada com a construção pCAMBIAPMMoV e folhas de N. benthamiana foram inoculadas para avaliar a recuperação do vírus. As plantas agroinoculadas apresentaram sintomas típicos de PMMoV em folhas inoculadas e folhas acima. A infecção foi confirmada por DIBA usando anticorpo policlonal anti-PMMoV. A possibilidade da adição de epítopos na capa proteica do vírus como ferramenta biotecnológica foi avaliada, inserindo genes de epítopo do vírus da dengue no clone agroinfectivo. Essa estratégia poderá fornecer uma ferramenta de apresentação de epítopos na superfície da CP em partículas montadas de PMMoV em grande escala. Um peptídeo de 24 aminoácidos contendo dois epítopos em tandem localizado nos domínios I/II da proteína E de DENV-1 foi inserido em duas posições distintas no gene cp: um entre os aminoácidos 59/60 e outro entre os aminoácidos 154/155. Após a inoculação, não apareceram sintomas de PMMoV e não foi possível detectar CP modificada em ambas as construções, apesar da confirmação dos clones por sequenciamento. Provavelmente a adição de 24 aminoácidos em cp interferiu no padrão de dobramento e na sua propriedade de automontagem. O tamanho do epítopo para display deverá ser avaliado no futuro. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pepper mild mottle virus (PMMoV) is a tobamovirus and consists of a monopartite single-stranded RNA genome in a positive polarity. The virion forms nucleoproteins in rodshaped rigid particles. Aiming to construct infectious PMMoV clones for expressing heterologous proteins, two distinct, strategies were attempted. The first strategy was based on in vitro infectious transcripts and the second on binary vector for agro-infiltration. The cDNA of PMMoV was cloned into pCR4-TOPO and subcloned into pUC19 under the T7 promoter for in vitro transcription. Transcripts were inoculated in Nicotiana benthamiana leaves. After three weeks plants showed typical PMMoV symptoms, such as mosaic and distortion. The virus recovery, hence infection, was confirmed by DIBA using polyclonal antibody raised against PMMoV and electron microscopy. The PMMoV complete genome and the binary plasmid, derived from pTRV2-MCS (modified pCAMBIA 0390) were fused by overlapextension PCR. Selected clones were confirmed by restriction digestion profile and DNA sequencing. N. benthamiana plants were agroinoculated with A. tumefaciens harvesting pCAMBIA-PMMoV clones. Plants showed symptoms similar to those from wild type virus both in inoculated and upper leaves. Infection was confirmed by DIBA. The use of coat protein as epitope display platform tool was evaluated by inserting an epitope from Dengue virus 1 in the agroinfectious clone pCAMBIA-PMMoV. This strategy can be applied for epitope display on the CP surface in PMMoV particles in large scale. A peptide of 25 amino acids containing two epitopes in tandem (domains I/II E protein from DENV-1) was inserted in two different positions in the cp gene; between amino acids 59/60 and 154/155. After agroinoculation it was not possible to detect CP carrying the epitope in both constructions, however DNA sequencing confirmed the epitope presence. Probably the 25-amino acid insertion in the cp gene led to incorrect CP folding and to unfavorable self-assembly. The epitope length will be evaluated for future display studies.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, saprophytic, non-pathogenic and free living bacterium. The complete sequencing of its genome has revealed many genes encoding products of biotechnological interest. Among these products are several chitinases. Chitinases, enzymes capable of degrading chitin, an insoluble polymer of β(1,4)-linked N-acetyl-β-D-glucosamine (GlcNAc), are of great biotechnological interest, because they can be used to convert chitin in useful derivatives as well as being exploited for the control of fungi and insects that cause damages in crops. This study aimed to carry out the biochemical, biological and structural characterization of a recombinant chitinase, belonging to family GH18, from C. violaceum ATCC 12472. The ORF CV2935 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vectors pET303/CT-His and pPICZαA, for expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. In both systems, the enzyme was secreted into the culture medium, in its soluble and functional form, and purified to homogeneity by affinity chromatography on a chitin matrix followed by size-exclusion chromatography on Superdex75 matrix. The yields of pure chitinase expressed in E. coli and P. pastoris were 2.6 and 44 mg per liter of culture, respectively. The recombinant chitinase produced in both microrganisms showed optimal activity at pH 3.0 and it was active after treated at temperatures up to 60 ÂC. The enzyme produced in P. pastoris (45 kDa) was N-glycosylated as revealed by Schiffʼs reagent and digestion with N-glycosidase F. Moreover, the glycosylated chitinase was found to be slightly more thermostable than the enzyme produced in E. coli (43 kDa). The rCV2935 showed hydrolytic activity against colloidal chitin, crab shell, and synthetic substrates containing p-nitrophenol. It was also able to hydrolyse glycol-chitin in SDS-PAGE and showed low chitosanase activity. The fluorescence spectra revealed that the proteins were produced in their folded conformation. The crystal structure of the recombinant chitinase produced in P. pastoris was determined by X-ray crystallography at a resolution of 2.1Ǻ. Its catalytic domain adopts an (β/α)8 triose-phosohate isomerase (TIM) barrel fold, and the residues essential for catalysis are conserved. The recombinant chitinase reduced the growth of the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani, and bioassays with cowpea weevil Callosobruchus maculatus showed that the rCV2935 possibly interfered with the insect feeding, which resulted in decreased weight of adults. The biochemical, biological and structural studies of rCV2935 may be useful for biotechnological application of this enzyme. / Chromobacterium violaceum à uma bactÃria Gram-negativa, saprÃfita, nÃo patogÃnica e de vida livre. O seqÃenciamento completo do genoma dessa espÃcie revelou muitos genes codificando produtos com potenciais aplicaÃÃes em diversas Ãreas. Dentre esses produtos, estÃo vÃrias quitinases. Quitinases, enzimas capazes de degradar a quitina, um biopolÃmero de N-acetil-β-D-glucosamina bastante insolÃvel, sÃo de grande interesse biotecnolÃgico, podendo ser utilizadas para converter quitina em derivados Ãteis, e tambÃm para o controle de fungos e insetos que causam danos em culturas agrÃcolas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar bioquÃmica, biolÃgica e estruturalmente uma quitinase recombinante (CV2935), da famÃlia 18 das glicosÃdeo hidrolases, de C. violaceum ATCC 12472. A ORF codificando a proteÃna CV2935 foi amplificada por reaÃÃo em cadeia da polimerase (PCR) e clonada nos vetores pET303/CT-His e pPICZαA, para expressÃo em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. Em ambos os sistemas, a enzima foi secretada para o meio de cultura, na sua forma solÃvel e funcional, sendo purificada a homogeneidade por cromatografia de afinidade em matriz de quitina, seguida de cromatografia de exclusÃo molecular em matriz de Superdex75. Os rendimentos da quitinase pura, expressa em E. coli e P. pastoris, foram 2,6 e 44 mg por litro de cultura, respectivamente. A quitinase produzida em ambos os microorganismos mostrou atividade Ãtima em pH 3,0 e foi ativa quando tratada a temperaturas de atà 60 ÂC. A enzima produzida em P. pastoris (45 kDa) foi N-glicosilada, como revelado por coramento com reagente de Schiff e digestÃo com N-glicosidase F, mostrando-se ligeiramente mais termoestÃvel do que a enzima nÃo glicosilada, produzida em E. coli (43 kDa). A rCV2935 apresentou atividade hidrolÃtica (endoquitinÃsica) frente a quitina coloidal, matriz de carapaÃa de caranguejo obtida comercialmente, glicol-quitina (em gel SDS-PAGE), substratos sintÃticos solÃveis contendo p-nitrofenol, alÃm de apresentar pequena atividade quitosanÃsica. Os espectros de fluorescÃncia revelaram que as proteÃnas foram produzidas na sua conformaÃÃo enovelada. A enzima teve sua estrutura cristalogrÃfica resolvida a uma resoluÃÃo de 2.1à e seu domÃnio catalÃtico apresentou um dobramento do tipo barril (β/α)8 (barril TIM) e resÃduos essenciais para catÃlise conservados, caracterÃsticas essas, comuns Ãs proteÃnas da mesma famÃlia. A quitinase recombinante retardou o crescimento do fungo fitopatogÃnico Rhizoctonia solani, e, em bioensaios com o caruncho Callosobruchus maculatus, a rCV2935 possivelmente interferiu com a alimentaÃÃo do inseto, o que acarretou na diminuiÃÃo do peso dos mesmos. Os estudos bioquÃmicos, biolÃgicos e estruturais da rCV2935 poderÃo ser Ãteis para aplicaÃÃo biotecnolÃgica dessa enzima.

A capacidade de degradação de compostos xenobióticos por organismos vivos, principalmente bactérias, tem sido objeto intenso de pesquisa, principalmente por aqueles microrganismos isolados do solo. Dessa forma, a busca por novos nichos que resultem no isolamento de microrganismos altamente eficientes se torna cada vez mais necessária. Assim, dada a diversidade de interações inseto - bactérias, este estudo buscou explorar insetos resistentes a inseticidas como nicho de bactérias com capacidade de degradação de pesticidas para o desenvolvimento de estudos voltados à i) utilização dessas bactérias na biorremediação e ii) determinação de sua contribuição na metabolização de inseticidas pelo hospedeiro. Assim, esse trabalho teve por objetivos i) isolar, identificar e caracterizar microrganismos associados ao trato digestivo de linhagens de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) resistentes a lambda-cyhalothrin e deltamethrin (piretróide), chlorpyrifos ethyl (organofosforado), spinosad (naturalyte) e lufenuron (inibidor de síntese de quitina), ii) verificar o seu potencial de biodegradação desses compostos, iii) estudar sua associação a populações naturais de S. frugiperda e iv) determinar seu papel na metabolização de xenobióticos. Bactérias com potencial de biodegradação foram selecionadas via cultivo seletivo da flora associada ao trato intestinal de lagartas de quinto ínstar de S. frugiperda em meio mínimo M9 acrescido de 10 ?g/mL de um dos inseticidas em estudo como única fonte de carbono. As bactérias isoladas foram sujeitas à análise de PCR-RFLP do gene do 16S rDNA, com três enzimas de restrição (EcoRI, Rsa, DdeI), resultando na identificação de 16 isolados. Após sequenciamento, dez filotipos foram identificados, distribuídos em Firmicutes (Enterococcaceae e Staphylococcaceae), ?-Proteobacteria (Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae), ?-Proteobacteria (Comamonadaceae) e Actinobacteria (Micrococcaceae e Microbacteriaceae). Enterococcus, Pseudomonas e Microbacterium foram os únicos representados por dois filotipos, sendo ainda encontrados um filotipo de Delftia, Leclercia, Staphylococcus e Arthrobacter. Enterococcus casseliflavus e Enterococcus mundtii foram isolados de praticamente todas as linhagens resistentes de S. frugiperda. Análises de antibiograma e do metabolismo de carboidratos indicaram a similaridade entre os clones de E. casseliflavus, enquanto que os clones de E. mundtii diferiram de maneira expressiva. Apesar disso, os alelos analisados para tipagem via multilocus não resultaram em diferenças. Análises de PCR-diagnóstico do intestino de lagartas de S. frugiperda de linhagem suscetível de laboratório resultaram na detecção de quatro dos dez filotipos isolados do intestino de linhagens resistentes de S. frugiperda. Já em populações naturais foram encontrados cinco dos dez filotipos. O isolado com maior capacidade de crescimento em cada inseticida foi selecionado e todos apresentaram resposta dependente da concentração dos inseticidas, sendo encontrado efeito antimicrobiano em alguns inseticidas. A análise de cromatografia acoplada a espectrometria de massas comprovou a degradação dos inseticidas utilizados pelos diferentes isolados. A colonização do trato digestivo de linhagem suscetível de S. frugiperda com um dos filotipos (Microbacterium arborescens) isolado de lagartas resistentes a lufenuron resultou em CL50 cerca de 10 vezes superior àquela da linhagem apossimbionte. Assim, linhagens resistentes de S. frugiperda se mostraram um excelente reservatório de bactérias com capacidade de degradação dos inseticidas testados e que podem auxiliar na metabolização desses produtos pelo hospedeiro, assim como ser exploradas na descontaminação de áreas que apresentam resíduos desses xenobióticos. / The capacity of living organisms to degrade xenobiotics has been intensively studied, mainly for soil-associated bacteria. Thus, there is a growing need to search for new niches to lead to the isolation of highly efficient microrganisms. As insect-bacteria interactions are very diverse, we focused on exploiting insecticide resistant insects as a niche of pesticidedegrading bacteria to develop studies devoted to a) bacterial utilization in bioremediation and ii) determination of bacterial contribution to insecticide metabolization by the host insect. Our main objetives were to i) isolate, identify and characterize the microrganisms associated to the gut of resistant strains of Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) capable to degrade lambda-cyhalothrin,deltamethrin (pyrethroids), chlorpyrifos ethyl (organophosphate), spinosad (naturalyte) and lufenuron (chitin synthesis inhibitor), ii) verify their potential to degrade these insecticides, iii) to verify their association to natural populations of S. frugiperda, and iv) to determine their role in the metabolization of xenobiotics in the host. Bacteria with biodegrading capacity were selected from the gut flora of fifth instars of S. frugiperda on selective media based on the minimum media M9 added of 10 ?g/mL of one of the insecticides selected as the sole carbon source. The isolated bacteria were subjected to RFLP-PCR analysis of the 16S rDNA gene using three restriction enzymes (EcoRI, Rsa, DdeI), which led to the identification of 16 isolates. These isolates were grouped in ten phylotypes after sequencing, representing Firmicutes (Enterococcaceae and Staphylococcaceae), ?-Proteobacteria (Enterobacteriaceae and Pseudomonadaceae), ?- Proteobacteria (Comamonadaceae) and Actinobacteria (Micrococcaceae e Microbacteriaceae). Enterococcus, Pseudomonas and Microbacterium were the only represented by more than two phylotypes. Delftia, Leclercia, Staphylococcus and Arthrobacter were also represented. Enterococcus casseliflavus and Enterococcus mundtii were isolated from almost all resistant lines of S. frugiperda. Antibiogram and carbohydrate metabolism assays indicated the similarity among the isolates of E. casseliflavus, while those of E. mundtii displayed some differences. However, no molecular differences were observed by comparing different alleles in multilocus sequence analysis. Diagnostic-PCR analysis of a susceptible, lab-strain of S. frugiperda allowed the identification of four out of the ten phylotypes isolated from resistant strains. But no bacteria from the susceptible strain could be cultivated in the selective media. In natural populations of S. frugiperda, five out of the ten isolates were detected. The most active isolate to degrade each pesticide was selected for further tests and all displayed a dose-dependent response to the insecticides. Analyses by gas or liquid chromatography-coupled mass spectrometry demonstrated the capacity of each isolate to degrade the insecticides tested. Gut colonization of larvae from the susceptible strain with Microbacterium arborescens isolated from resistant larvae increased the LC50 to lufenuron in 10 fold when compared to the aposymbiont strain. Thus, resistant strains of S. frugiperda are an excellent reservoir of bacteria capable of degrading the tested insecticides, and have a potential to be exploited for the bioremediation of xenobiotic contaminated areas. Moreover, these bacteria can auxiliate the host insect to metabolize insecticides and may play a role in insect response to insecticides.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As esponjas marinhas constituem uma rica reserva de substÃncias naturais, muitas delas de imenso interesse biotecnolÃgico. Elas compreendem um grupo promissor no fornecimento de compostos bioativos para a humanidade. Desta forma, pesquisas de novas drogas de fontes naturais sugerem que as esponjas marinhas possuem importantes compostos bioativos com ponteciais: farmacolÃgico, antimicrobiano; antitumoral; antiviral; antiinflamatÃrio; imunossupresor; cardiovascular; neurosupressor; relaxante muscular bem como biomarcador de poluiÃÃo. A anÃlise de proteÃnas expressas à uma abordagem importante para determinar a funÃÃo dessas molÃculas em um determinado organismo. Esse trabalho teve como objetivo bioprospectar proteÃnas expressas pela esponja marinha Aaptos sp. coletada no Icaraà de Amontada, CearÃ, que possam apresentar potencial biotecnolÃgico. Para a realizaÃÃo dessa abordagem, foram utilizadas como estratÃgias a eletroforese bidimensional (2-DE) e a bioinformÃtica. A 2-DE à uma ferramenta utilizada para separar proteÃnas de diversos organismos. Conhecendo-se as proteÃnas expressas na esponja estudada pode-se estabelecer padrÃes protÃicos caracterÃsticos da espÃcie em estudo. Com base no exposto, neste estudo foi utilizado 2DE para investigar as proteÃnas expressas de Aaptos sp. A fim de fazer a extraÃÃo de proteÃnas totais foi realizada a partir de 400 mg da esponja marinha Aaptos sp. Para anÃlise quantitativa e qualitativa das proteÃnas foi utilizado o mÃtodo de Bradford e SDS-PAGE, respectivamente. A partir das proteÃnas totais extraÃdas foi determinado o mapa bidimensional de referÃncia para a esponja marinha em estudo. O ajuste das imagens dos gÃis bidimensionais, a detecÃÃo de spots protÃicos e a avaliaÃÃo dos dados para determinaÃÃo massa molecular aparente (MM) e ponto isoelÃtrico (pI) dos spots foi feito pelo programa ImageMaster 7. ProteÃnas expressas foram identificadas utilizando os valores de pI e MM do spot contra um banco de dados de proteÃnas UniProt disponÃvel no servidor ExPASy. O nÃmero mÃdio de spots protÃicos das replicas dos gÃis 2DE foi de 124. A maior abundÃncia de proteÃnas foi observada nos gÃis 2DE na faixa de pH de 4 a 6,7 e com MM entre 13 a 119,67 quilodalton (kDa). A partir do gel 2DE de referencia foi identificado 122 proteÃnas das quais 61, 46 e 15 pertencem aos tÃxon cnidÃria, deuterostomia e porÃfera, respectivamente. As proteÃnas identificadas de porÃfera pertencem a categoria funcional: ligante de ATP, componente estrutural do ribossomo, atividade catalÃtica, ligante de GTP, ligante de Ãon de cÃlcio e atividade dissulfeto oxidoredutase. Sendo a categoria funcional ligante de ATP e de GTP com maior nÃmero de spots. Adicionadamente, houve proteÃnas expressas com importantes funÃÃes moleculares jà relada na literatura, porÃm nÃo em Aaptos sp., assim indicando a importÃncia destas esponjas marinhas como fonte de informaÃÃo proteica que poderÃo ser estudadas no futuro quanto ao seu potencial uso como ferramentas biotecnolÃgicas em diversas Ãreas, podendo ser empregadas em estudos que possam elucidar as vias metabÃlicas bem como o desenvolvimento de fÃrmacos contra possÃveis patologias. / Marine sponges are a rich reserve of natural substances, many of them of immense biotechnological interest. They comprise a promising group in providing bioactive compounds for humanity. Thus, research on new drugs from natural sources suggest that marine sponges have important bioactive compounds ponteciais: pharmacological, antimicrobial; antitumor; antiviral; anti-inflammatory; immunosuppressive; cardiovascular; neurosupressor; muscle relaxant and pollution biomarker. Analysis of expressed proteins is an important approach to determine the function of these molecules in a given organism. This study aimed to bioprospect proteins expressed by the marine sponge Aaptos sp. collected in Icarai de Amontada, CearÃ, who may have biotechnological potential. For the realization of this approach were used as strategies the two-dimensional electrophoresis (2-DE) and bioinformatics. The 2-DE is a tool used to separate proteins from different organisms. Knowing the proteins expressed in the study sponge can be established Protein patterns characteristic of the species under study. Based on the above, this study used 2DE to investigate the expressed protein Aaptos sp. In order to make the extraction of total proteins was performed using 400 mg of the marine sponge Aaptos sp. For qualitative and quantitative analysis of proteins was used the method of Bradford and SDS-PAGE, respectively. From the total protein extract was determined the two-dimensional reference map for marine sponge in the study. The adjustment of images of two-dimensional gels, the protein spot detection and evaluation of data to determine apparent molecular weight (MW) and isoelectric point (pI) of the spots was made by the ImageMaster software 7. Expressed proteins were identified using the values of pI and MM spot against a UniProt protein database available on the ExPASy server. The average number of protein spots of replicas of the gels 2DE was 124. The highest abundance proteins was observed in 2DE gels in the pH range of 4 to 6.7 and with MM between 13 to 119.67 kilodalton (kDa). From the 2DE reference gel was identified 122 proteins of which 61, 46 and 15 belong to the Cnidaria taxon deuterostomia and Porifera, respectively. The proteins identified Porifera belong to functional category: ATP binding, structural component of the ribosome, catalytic activity, GTP binding, calcium ion binding and disulfide oxidoreductase activity. The functional category binding of ATP and GTP with more spots. Adicionadamente, was expressed proteins with important molecular functions already hued in the literature but not in Aaptos sp., thus indicating the importance of these marine sponges as a source of protein information that may be studied in the future for their potential use as biotechnological tools in several areas and can be used in studies to elucidate the metabolic pathways and the development of drugs against possible pathologies.

Buscando compreender o processo de formação de grupos interdisciplinares, este trabalho estuda o caso de dois centros de pesquisa - o Centro de Biotecnologia e o Centro de Ecologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Partindo da evolução histórica da universidade, enquanto instituição de pesquisa, e das relações entre a pesquisa básica e a pesquisa aplicada, chega-se à discussão da pesquisa interdisciplinar e o seu desenvolvimento na UFRGS. São identificados e analisados os fatores que contribuíram para a formação e o desenvolvimento dos centros de pesquisa estudados enquanto grupos interdisciplinares. Estes fatores são classificados em: a) fatores ambientais - programas governamentais e estrutura organizacional; b) fatores administrativos - liderança e canais de comunicação e c) fatores comportamentais - relações interpessoais e interesses comuns. O estudo evidencia que os programas governamentais e a liderança foram os fatores preponderantes no processo de desenvolvimento dos grupos interdisciplinares, embora os demais tenham também contribuído com intensidades distintas. Constata-se também que a prática da pesquisa interdisciplinar está levando a uma mudança substancial no comportamento do pesquisador, ao requerer cooperação e humildade intelectual. Finalmente, considera-se que para assegurar o futuro da pesquisa interdisciplinar na UFRGS, é imperioso definir uma política institucional que legitime os centros de pesquisa. / In order to understand the process of development of interdisciplinary groups, this study considers the cases of two research centers - the Biotechnology Center and the Ecology Center of the Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS). The factors which contributed to the setting-up and development of the two research centers as interdisciplinary groups are identified and analised. The factors were classified as: a) environmental factors - governmental programms and organizational structure; b) administrative factors - leadership and channels of communication; and c) behavioral factors - personal relationships and common interests. The study shows that governmental programms and leadership were the most important factors in promoting interdisciplinary projects, although the other factors have also contributed to the process. The study also concludes that the interdisciplinary research is leading to substantial changes in the researcher behavior as it requires cooperation and intelectual humbleness. Finally it is noted that, in order to assure interdisciplinary research at UFRGS, it is necessary a definition of an institutional policy that will grant legitimacy to the research centers.

O ferro é elemento essencial para quase todos os organismos, participando de reações importantes no metabolismo das plantas, incluindo a fotossíntese. A homeostase desse metal não é completamente entendida em organismos vegetais, sendo que tanto o excesso quanto a deficiência são deletérios. O arroz (Oryza sativa L. ssp. indica) é normalmente cultivado em terrenos irrigados, o que pode levar ao excesso de ferro. Neste trabalho, nós utilizamos a técnica de Análise Diferencial de Representações (RDA) para isolar seqüências cuja expressão é aumentada ou diminuída pelo excesso de ferro. Foram isoladas 24 seqüências aumentadas e 15 inibidas. Onze seqüências tiveram seu padrão de expressão confirmado como sendo ativadas pelo excesso de ferro, de 14 testadas. Nenhuma seqüência teve seu padrão confirmado como sendo inibido pelo excesso de ferro. Dentre as seqüências confirmadas como diferencialmente expressas, foram encontrados genes relacionados à fotossíntese, resposta a estresse, degradação de proteínas, metabolismo de açúcares e aminoácidos e fatores de transcrição. Vários desses genes estão associados a senescência em outros trabalhos, indicando que a planta sob excesso de ferro pode estar entrando na rota que leva à senescência. Também foi encontrado um fator de transcrição da família WRKY cuja expressão é mais acentuada no 3º dia de tratamento, com diminuição gradual até o 9º dia. Esse dado pode indicar que essa proteína pode estar envolvida na resposta inicial ao estresse, sendo um candidato a regulador da resposta.

A eritropoietina (EPO) é um hormônio que pertence a um grupo de fatores de crescimento hematopoiético, controlando a proliferação e a diferenciação de células da medula óssea. Ela age induzindo a elevação da produção de células vermelhas, aumentando a quantidade de hemoglobina e o oxigênio circulante. Este hormônio é principalmente secretado pelo rim, e é amplamente usado na medicina no tratamento de anemias, desordens renais e cardíacas, tumores e diversas outras doenças. A EPO recombinante tem sido produzida em células de mamíferos (COS-1 e CHO) em culturas in vitro e tem sido expressa experimentalmente em células de insetos, leveduras e bactérias. Até o momento, há somente uma descrição da expressão transgênica desta proteína em plantas sem, no entanto, sucesso na regeneração de plantas saudáveis e férteis. No presente trabalho, plantas transgênicas de arroz (Oryza sativa) e tabaco (Nicotiana tabaccum) contendo o gene da EPO foram geradas, nas quais foi avaliada a expressão gênica e detectada a presença da proteína recombinante. O gene recombinante da EPO utilizado foi sintetizado baseado na técnica de “overlapping” de nucleotídeos. Um fragmento de 582 pb correspondente ao cDNA da EPO foi clonado e submetido a seqüenciamento automático. Uma mutação no nucleotídeo 252 (G A) foi identificada, o que não modificou o aminoácido codificado pelo códon, uma glicina. O fragmento foi transferido para o vetor de expressão pWUbi.tm1, o qual contém o promotor do gene da ubiquitina e o terminador tm1'. Este cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pWBVec4a, que foi transformado nas cepas AGL1 e LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Estas cepas foram utilizadas na transformação de arroz e de tabaco, respectivamente. A integração do transgene no genoma da planta foi comprovada por PCR. A expressão da EPO nas plantas de tabaco foi detectada por RT-PCR convencional e quantitiativa, e a presença da proteína foi avaliada por SDS-PAGE e Western blot, provando o sucesso da obtenção de plantas transgênicas de tabaco expressando EPO. Foi obtida por auto-fecundação a geração T1, a qual apresentou segregação mendeliana. Nenhuma das plantas avaliadas apresentou qualquer tipo de deformidade ou mal-formação. Não foi possível a obtenção de plantas de arroz transgênicas devido à deficiência das mesmas no processo de regeneração, possivelmente em conseqüência da super-expressão do transgene em função do promotor escolhido. / Erythropoietin (EPO) is a hormone that belongs to a group of growth hematopoeitic factors, which control the proliferation and differentiation of marrow bone´s cells. It acts inducing the production of blood red cells, increasing the amount of circulating hemoglobin and oxygen. This hormone, mostly secreted by kidneys, is widely used in medicine as a treatment for anaemia, kidney and heart disorders, tumors and numerous diseases. Recombinant EPO has been produced in mammalian cells (COS-1 and CHO) cultured in vitro and has been also experimentally inserted into insect, yeast and bacterial cells. Up to now, to the best of our knowledge, there is only one description of transgenic expression of this protein in plants but without success in the generation of healthy, fertile plants. In the present work we evaluated the expression of human EPO in plants such as rice (Oryza sativa) and tobacco (Nicotiana tabaccum). The recombinant EPO gene was synthesized based on the nucleotide “overlapping” technique. A fragment of 582 bp corresponding to the EPO cDNA was cloned and then submitted to automatic sequencing. At that time, a mutation on nucleotide 252 (G A) was identified. It did not modify the encoded amino acid of the codon, a glycine. This fragment was transferred to the expression vector pWUbi.tm1, armed with the promoter of the ubiquitin gene and the terminator tm1’. This expression cassette was transferred to the binary vector pWBVec4a, which was then transformed into strains ALG1 and LB4404 of Agrobacterium tumefaciens. These strains were employed in the transformation of rice and tobacco, respectively. Transgenic integration into plant genomes was evaluated by PCR. The expression of EPO in tobacco plants was detected by conventional and quantitative RTPCR and the presence of the protein was evaluated by SDS-PAGE and western blot, successfully proving the generation of transgenic tobacco plants expressing EPO. By selfcrossing it was obtained a collection of T1 plants, which presented mendelian segregation of the transgene, and none of the plants presented any kind of miss-formation or deformity. It was not possible to obtain rice transgenic plants due to their deficiency in the regeneration process, possibly due to the transgene over-expression driven by the ubiquitin promoter.

Os carrapatos estão distribuídos por todo mundo e impactam tanto a saúde animal quanto humana. A espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal parasita que afeta a bovinocultura nas regiões tropicais e subtropicais do globo, causando grandes prejuísos econômicos. Os métodos de controle estão baseados no uso de acaricidas químicos, o que resulta na seleção de populações resistentes e no risco de poluição do meio ambiente e dos alimentos. As vacinas têm-se mostrado um método de controle factível, e representam uma alternativa ao uso de acaricidas químicos. No entanto, dez anos após a disponibilização da primeira vacina comercial contra carrapatos, ainda não foi encontrada uma formulação capaz de alcançar a proteção necessária para dispensar o uso de agentes químicos. Sendo assim, estudar a biologia do parasita e conhecer mecanismos de importância fisiológica pode ser uma boa estratégia para encontrar moléculas alvo que possam ser usadas como antígenos no desenvovimento de uma vacina eficaz. Com este objetivo, nesta tese foi estudada a reprodução em carrapatos e avaliada a eficácia de uma enzima evolvida neste processo como antígeno vacinal. Foram abordados os processos de vitelogênese e de embriogênese. Em uma primeira etapa, usando carrapatos da espécie Amblyomma hebraeum como modelo, foi investigada a atuação do hormônio 20- hidroxiecdisona (20E) e de fatores adicionais, presentes na hemolinfa, na captação de vitelogenina (Vg) pelos oócitos. Neste trabalho, verificamos que existem diferentes estratégias de controle da captação de Vg pelo ovário nos carrapatos Ixodide, e que para que ocorra capatação de Vg pelos oócitos de A. hebraeum é necessaário um fator adicional presente na hemolinfa das fêmeas. Uma vez que o desenvolvimento do embrião depende da disponibilidade do material do vitelo estocado nos oócitos, a segunda parte da tese explorou uma cisteíno endopeptidase envolvida na degradação de vitelina (Vt) em ovos do carrapato R. microplus denominada Vitellin Degrading Cysteine endopeptidase (VTDCE). As enzimas da classe das cisteíno endopeptidases estão amplamente distribuidas nas fêmeas deste carrapato. Os estudos com VTDCE mostraram que esta é uma enzima de origem materna, com provável síntese extraovariana e transporte pela hemolinfa, até ser internalizada pelos oócitos. A VTDCE está presente durante todo o desenvolvimento embrionário, assim como em larvas. Interessantemente, esta cisteíno endopeptidase apresenta a propriedade de se associar a Vt por um outro sítio, além do sítio ativo. A VTDCE é a enzima mais eficiente na degradação de vitelina (Vt) em ovos de R. microplus, e devido a sua importância fisiológica, a VTDCE foi testada como antígeno em experimento de vacinação de bovinos e desafio com larvas de R. microplus. Os parâmetros mais afetados nos carrapatos alimentados em bovinos vacinados, com relação aos controles, foram o peso das fêmeas ingurgitadas (19,3 %) e a fertilidade dos ovos (17,6 %). Relacionado os parâmetros análisados, vimos que este antígeno confere uma proteção de 21% aos animais imunizados quando infestados por R. microplus. A proteção parcial alcançada pela VTDCE pode ser complementar a de outros antígenos no desenvolvimento de um coquetel antigênico contra carrapatos, uma vez que nenhum antígeno encontrado até o momento foi capaz de oferecer a proteção necessária para ser empregado individualmente na composição de uma vacina. Estudos como os realizados nesta tese contribuem para o melhor entendimento da biologia dos carrapatos, assim como para o desenvolvimento de novos e melhores métodos de controle desses parasitas. / Ticks are distributed worldwide impacting human and animal health. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main parasite that affects livestock in tropical and subtropical regions of world, causing large economical losses. Tick control methods are based on the application of chemical acaricides, which has resulted in selection of resistant ticks and a potential risk of environmental pollution and food contamination. Vaccines have been shown to be a feasible tick control method that offers a cost-effective, environmentally friendly alternative to chemical control. However, ten years after the commercialization of the first vaccine against ticks, to identify tickprotective antigens remains a limiting step in the development of an efficient formulation that would avoid the use of chemical acaricides. In face of this situation, to study the parasite biology and understanding physiological important mechanisms could be a good strategy to find new targets to be used in an efficient vaccine. In order that, this thesis subject was to investigate the reproduction process in ticks and to evaluate the efficiency of an enzyme involved in this process as vaccinal antigen. The process of vitellogenesis and embryogenesis were studied. In the first part, using Amblyomma hebraeum ticks as model, the role of 20- hydroxiecdisone and additional hemolymph borne factors in vitellogenin (Vg) uptake by oocytes were investigated. Our findings showed that there are different strategies to control Vg uptake by ovary in Ixodide ticks. Additionally, for Vg uptake in A. hebraeum ovaries, a vitellogenin uptake factor (VUF) present in female hemolymph is required. As embryo development depends on the availability of yolk material stored into the oocytes, in the second part we studied a cysteine endopeptidase involved in Vt digestion in R. microplus eggs, named vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE). Cysteine endopeptidase enzymes are widely distributed in these tick females. Studies with VTDCE demonstrate that it is a maternal derived endopeptidase involved in a route including extraovarian synthesis, transport, and ovary uptake, before internalization by oocytes. VTDCE is present during all tick development, as well as in larva. Interestingly, this cysteine endopeptidase is able to associate with Vt in another site than the active site. VTDCE showed to be the most efficient Vt hydrolytic enzyme in R. microplus eggs. So, supported by its physiological role, VTDCE was used as antigen in bovine vaccination and R. microplus challenge experiment. The most affected biological parameters in ticks fed on vaccinated animals were weight of engorged ticks (19.3 %), and egg fertility (17.6 %). Relating the biological parameters analyzed, bovine vaccination with VTDCE as antigen resulted in an overall protection of 21%. Therefore, this partial protection could be complementary in the formulation of an antigenic cocktail against tick, once there is not one single protein that achieves the protection level necessary for an efficient and practical vaccine development. Studies like that contribute to the better understanding of tick biology, as well as to the development of new and more efficient methods of control.

GVB é um patógeno agrícola composto por RNA de fita simples de senso positivo, com extremidades 3’ poliadeniladas e tem seu diagnóstico feito por testes biológicos, imunológicos e moleculares. Juntamente com outros vírus, causa a síndrome do “complexo rugoso”, que impede a pega da enxertia, destruindo o floema e matando a planta precocemente. A produção de anticorpos contra uma proteína do capsídeo e o desenvolvimento de teste imunológico são os objetivos deste trabalho. A clonagem da região codificante da proteína do capsídeo do Grapevine Virus B foi obtida por PCR, utilizando primers específicos para região codificante e com sítios de restrição para endonucleases BamHI e NdeI, obtendo-se um amplicon de 594 pb. Este fragmento foi clonado no vetor de expressão pET19b e transformado em Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). Para a expressão da proteína rGVB1a (24 kDa com cauda de histidina), estabeleceu-se uma indução de 1 mM de IPTG (isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside), mantida sob agitação a 250C por 18 horas. A expressão foi analisada por SDS-PAGE 13% e a presença da rGVB1a foi confirmada por Western blot, usando anticorpo monoclonal anti-histidina. A rGVB1a expressada foi purificada por cromatografia de afinidade a cauda de histidina em resina sepharose-Ni2+. A proteína purificada foi utilizada para imunizar um coelho e sete lotes de três camundongos para obtenção de soro policlonal e monoclonal contra a proteína recombinante. A fusão de células de linfócitos B com mielomas SP2/0 foi realizada, obtendo-se um hibridoma produtor de anticorpo IgG2a que em testes de ELISA e Western blot reconhecem a proteína recombinante. Adicionalmente, testes de Western blot utilizando extrato total de plantas sintomáticas e assintomáticas foram realizados para verificar se estes soros reconheciam a proteína nativa. / GVB is an agricultural pathogen composed by a single-stranded positive sense RNA with poliadenilated 3’ end and its diagnosis is based on biological, immunological and molecular tests. Together with another virus, it causes the rugose wood complex disease which prevents grafting, destroying the phloem and killing the plant early. The objectives of this work are the production of antibodies against the coat protein and the development of an immunological test. Cloning of a coat protein coding gene from Grapevine Virus B was performed by PCR, using specific primers for the coding region with restriction sites for BamHl and Ndel endonucleases, obtaining an amplicon of 594 bp. This fragment was cloned into the pET19b expression vector and transformed with Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). For expression of rGVB1a protein (24 kDa with histidine tail) a protocol with 1 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside), and shaking for 18 hours at 25ºC was established. The expression was analyzed by SDS-PAGE 13% and the presence of rGVB1a was confirmed by Western-blot, using an anti-histidine monoclonal antibody.rGVB1a expressed was purified by histidine tail Ni2+ Sepharose affinity chromatography. Purified protein was used to immunize a rabbit and seven lots of mice to obtain policlonal serum and monoclonal antibody against the recombinant protein. Cell fusions of lymphocyte B and SP2/0 were performed and a hybridoma producer of IgG2a antibody was obtained. This hybridoma recognized the recombinant protein in ELISA and Western blot tests. Additionally, Western blot using the extract of symptomatic and assymptomatic plants were developed to investigate if these serum recognize the native protein.