Fungos endofíticos constituem uma fonte promissora e ainda pouco explorada de novas substâncias potencialmente bioativas, que podem ter aplicações na medicina, agricultura e biologia química. Neste trabalho foram isolados cinco fungos endofíticos das folhas de Tithonia diversifolia, os quais foram cultivados em pequena escala e avaliados em diversos bioensaios. O fungo endofítico Phoma sorghina foi cultivado em escala ampliada, produzindo nove substâncias, sendo três derivados antraquinônicos inéditos na literatura. Três fungos endofíticos associados à Viguiera robusta foram estudados. De Colletotrichum gloeosporioides foram isoladas oito substâncias, sendo um derivado dicetopiperazínico e um derivado aminoaçúcar inéditos na literatura. Diaporthe phaesolorum produziu três derivados dicetopiperazinicos, um inédito na literatura. Chaetomium globosum produziu treze substâncias, sendo oito derivados azaphilônicos inéditos. Algumas linhagens endofíticas foram avaliadas em experimentos de biotransformação de três naftoquinonas e da 1-tetralona, catalisando reações de oxidação e redução. O fungo Diaphorte phaseolorum catalisou uma reação de metilação inédita na literatura de biotransformação. / Endophytic fungi are a promising and untapped source of potential biologically active compounds that might be useful as therapeutic and agrochemical agents, or chemical biology tools. In this thesis five endophytic fungi were isolated from the leaves Tithonia diversifolia. All the strains have been cultivated in small scale and the extracts submitted to bioassays. The culture of the endophyte Phoma sorghina was scaled up, affording six known compounds and three novel anthraquinone derivatives. Three endophytes from Viguiera robusta have also been studied as sources of natural products. Colletotrichum gloeosporioides produced six known compounds, one novel aminosugar and one new diketopiperazine derivative. Diaporthe phaesolorum biosynthesized three diketopiperazine derivatives, one novel in the literature. Five known compounds and eight novel azaphilone derivatives were isolated from Chaetomium globosum. Some endophytic strains have been evaluated in biotransformation experiments of three naphthoquinones and 1-tetralone, catalyzing oxidation and reduction reactions. The endophyte Diaphorte phaseolorum catalyzed a novel methylation reaction in the biotransformation literature.

Este trabalho teve como objetivo estudar a permeabilização celular de Candida guilliermondii FTI 20037 empregando processos químicos (agentes tensoativos) e físicos (congelamento-descongelamento) e verificar o potencial uso das células permeabilizadas na redução de xilose em xilitol. Os ensaios de permeabilização empregaram suspensão celular de 2 g/L, temperatura de 30ºC e pH 7. Para os processos químicos foram avaliados CTAB (Brometo de cetiltrimetilamônio) e Triton X-100 e os ensaios foram realizados empregando metodologia do planejamento experimental. O monitoramento da permeabilidade celular foi realizado através da dosagem in situ e no sobrenadante da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), selecionada como marcador do tratamento. As enzimas xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XD) também foram dosadas. A permeabilização de C. guilliermondii com CTAB permitiu a dosagem in situ de G6PD e XD, mas não de XR. As três enzimas avaliadas não foram detectadas no sobrenadante. As condições que promoveram máxima permeabilidade celular (0,41 mM de CTAB, 200 rpm de agitação e 50 min de tempo de contato) resultaram em níveis in situ de G6PD de 283,4 ± 60,7 U/L e 122,4 ± 15,7 U/gcélulas. Nestas condições de tratamento, o CTAB influenciou negativamente a atividade catalítica de G6PD, XR e XD presentes no homogenato das células rompidas (não tratadas). O estudo de permeabilização celular com Triton X-100 mostrou que o tensoativo foi pouco efetivo, permitindo a dosagem in situ apenas da G6PD. As condições que promoveram máxima permeabilidade celular, ou seja, 2,78 mM de Triton X-100, 200 rpm de agitação e 50 min de tempo de contato, resultaram em níveis in situ de G6PD de 44,7 ± 0,0 U/L e 16,9 ± 0,0 U/gcélulas. Nestas condições, Triton X-100 não afetou a atividade catalítica de G6PD, XR e XD presentes no homogenato das células rompidas (não tratadas). O processo físico de permeabilização consistiu no congelamento da suspensão celular (-18ºC) por período de 48h, seguido do descongelamento em banho-maria (30ºC). Este tratamento permitiu a dosagem in situ das enzimas G6PD (108,7 ± 3,8 U/L e 54,3 ± 1,9 U/ gcélulas) e XR (26,4 ± 0,1U/L e 13,2 ± 0,1 U/gcélulas), mas não da XD. O tratamento não foi suficiente para liberar G6PD, no entanto, cerca de 60% da atividade total de XR foi detectada no sobrenadante (47,1 ± 0,4 U/L e 23,6 ± 0,2 U/gcélulas). Os ensaios de biotransformação mostraram que, nas condições avaliadas, a conversão de xilose em xilitol foi dependente do tipo de tratamento de permeabilização do biocatalisador. Os ensaios de cultivo mostraram que o tratamento das células com Triton X-100 não foi suficiente para causar perda de viabilidade e atividade metabólica de C. guilliermondii, enquanto o congelamento-descongelamento promoveu perda parcial da viabilidade celular. O tratamento das células com CTAB foi mais agressivo, causando a perda total de viabilidade celular. Foi também verificado que resting cells (células em estado de repouso) de C. guilliermondii sem tratamento e permeabilizadas com Triton X-100 foram capazes de converter xilose em xilitol com rendimento de ~60%, após 10 h de reação. Com o presente trabalho pode se concluir que os métodos estudados podem ser especialmente úteis para a determinação in situ de G6PD. Além disto, a utilização de células permeabilizadas pode ajudar a superar os problemas/custos associados com a extração e purificação das enzimas e conseqüentemente contribuírem para o desenvolvimento de uma tecnologia de baixo custo para a produção de xilitol. / This work describes the effect of the surfactants (CTAB and Triton X-100) and freezing-thawing treatment on the permeabilization of C. guilliermondii cells. The potential use of these cells (unpermeabilized and permeabilized by CTAB, Triton X-100 and freezing-thawing treatment) was also evaluated. Response surface methodology was used to investigate the effect of different parameters (detergent concentration, agitation and treatment time) on the permeabilization of C. guilliermondii cells. The experimentation was aimed to find the values of process variables to achieve maximal glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) activity in situ. The intracellular G6PD of the C. guilliermondii could not be detected in intact (unpermeabilized) whole cells. However, on treatment of C.guilliermondii with detergents (CTAB and Triton X-100) and freeze-thawing, the G6PD activity could be measured.The effectiveness of detergent permeabilization of C.guilliermondii cells was dependent on its concentration and exposure time. Maximum permeabilization, measured in terms of assayable G6PD activity in situ, was obtained when the cells were treated with CTAB. Triton X-100 and freeze-thawing were also found to permeabilize the cells, but to a lesser degree than CTAB. The optimum operating conditions for permeabilization process were 0.41 mM (CTAB) or 2.78 mM (Triton X-100) under agitation of 200 rpm at 30ºC temperature and process duration of 50 min and pH 7. At these conditions of process variables, the maximum value of enzyme activity was found to be 283.4 ± 60.7 U/L (122.4 ± 15.7 U/gcells) and 44.7 ± 0.0 U/L (16.9 ± 0.0 U/gcells) for permeabilized cells with CTAB and Triton X-100, respectively. The Triton X-100 was not enough to cause loss of viability and metabolic activity of C. guilliermondii. Freezing-thawing treatment promoted partial loss of cell viability. On the other hand the cells treated with CTAB were totally affected. The biotransformation of xylose to xylitol was studied by employing C. gulliermondii FTI 20037 in two different forms namely unpermeabilized cells and permeabilized cells. The maximum xylitol yield of about 60% was observed with unpermeabilized yeast cells and Triton X-100 permeabilized cells after 10 h of reaction time. In conclusion, surfactants and freezing-thawing treatment provides a simple and mild procedure for C.guilliermondii permeabilization. The method may be especially useful for the in situ determination of G6PD. Response surface methodology was found effective in optimizing and determining the interactions among process variables for the permeabilization process. The use of permeabilized cells can help to overcome the problems/costs associated with enzyme extraction and purification from yeast cells and in the development of a low-cost technology for xylitol production.

Enantiômeros podem interagir de maneira diferenciada no organismo, ocasionando efeitos farmacológicos variados. Dessa forma, metodologias para a obtenção de fármacos enantiomericamente puros são importantes para a indústria farmacêutica. Modelos sintéticos empregando reagentes quirais, como complexos de salen e modelos biológicos utilizando fungos estão sendo muito estudados neste contexto. O uso de fungos apresenta como principais vantagens o crescimento rápido, baixo custo e fácil operação, além da produção de metabólitos em grande quantidade. Complexos de salen são eficientes e estáveis, possuindo ampla aplicabilidade e possibilidade de produzir reações enantiosseletivas. O objetivo deste trabalho foi avaliar fungos e complexo de salen como alternativas na produção enantiosseletiva de terbutalina, o metabólito quiral e ativo de seu pró-fármaco, o bmbuterol. A separação enantiosseletiva dos analitos foi realizada empregando a cromatografia líquida de alta eficiência com detector UV-Vis (LC/UV). A validação da metodologia analítica e os estudos de biotransformação foram executados por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). A resolução do bambuterol e da terbutalina por LC/UV foi realizada utilizando como fase estacionária a coluna Chirobiotic T e como fase móvel acetonitrila:metanol (80:20, v/v) + 0,3% de ácido fórmico e 0,1% de trietilamina, numa vazão de 1,5 mL min-1 e por LC-MS utilizando a mesma fase estacionária e a fase móvel composta por 96% de metanol em água + 0,2% de ácido acético e 0,1% de acetato de amônio na vazão de 1 mL min-1. A extração dos analitos em meio de cultura líquido (Czapek, 2 mL) foi feita empregando a microextração liquido-liquido dispersiva (DLLME), nas condições: solvente dispersor,isopropanol (600 µL); solvente extrator, diclorometano (50 µL); reagente par iônico, di(2-etil-hexil)fosfato (100µL); e solução tampão fosfato de sódio (2 mL, pH 7,6). A recuperação do bambuterol foi de 92% e a da terbutalina foi estimada em 55%. O método foi validado para a análise do bambuterol no meio de cultura e se mostrou linear na faixa de concentração 500 17500 ng mL-1 para cada enantiômero (r > 0.998).O limite de quantificação foi igual a 500 ng mL-1. Dentre os fungos avaliados neste trabalho, nenhum foi capaz de realizar a biotransformação do bambuterol em terbutalina nas condições empregadas. Nos estudos feitos utilizando catálise assimétrica também não foi possível observar esse metabólito. Dada a complexidade do metabolismo do bambuterol (reações de hidrólise e/ou oxidação) e da formação de vários intermediários anterior a etapa de formação da terbutalina, as condições avaliadas nesse estudo não foi capaz de produzir o metabólito ativo do bambuterol, terbutalina. / Enantiomers may interact differently in the organism causing pharmacological sundry effects. For these reason, enantiomeric pure drugs are very important for the pharmaceutical industries. Synthetic models employing chiral reagents, like salen complexes, and biological models using fungi are been very studied in this context. Fungi present as main advantage the fast growing up, low costs and easily application, moreover, their metabolites are produced in huge quantities. Salen complexes are efficient and stable. They have a wide application and the possibility of production of high enantiomeric excess. The aim of this work was to evaluate fungi and salen complex as alternatives to the enantioselective production of terbutaline, the chiral and active metabolite of your prodrug, bambuterol. The analytes enantioselective separation was done employing high performance liquid chromatography with UV-Vis detector (LC/UV). The method validation and the studies of biotransformation were done using high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS). The resolution of bambuterol and terbutaline by LC/UV was accomplished using the Chirobiotic T column and acetonitrile: methanol (80:20, v/v) + 0.3% formic acid and 0.1% triethylamine as mobile phase at a flow rate of 1.5 mL min-1 and by LC-MS employing the same column and the mobile phase was composed by 96% of methanol in water + 0,2% acetic acid and 0,1% ammonium acetate at a flow rate of 0.1 mL min-1. The analytes extraction of the culture medium (Czapek, 2 mL) was done using the dispersive liquid liquid microextraction (DLLME), in the following conditions: dispersive solvent, isopropanol (600 µL); extractor solvent, dichloromethane (50 µL); ionic-pair reagent; di(2-ethylhexyl)phosphate (100 µL); and sodium phosphate buffer (2 mL, pH 7.6). The recoveries were 92% for the bambuterol and estimated in 55% for terbutaline. The method was validated for the analysis of bambuterol in the culture medium and was linear over the concentration range of 500 17500 ng mL-1 for each enantiomer (r > 0.998). The quantification limit was 500 ng mL-1. Among the evaluated fungi, none was able to do the biotransformation process of bambuterol at terbutaline in the employed conditions and so do the studies employing asymmetric catalyses. Because the complexity of bambuterols metabolism for producing terbutaline (hydrolysis and/or oxidation reactions) and the formation of several intermediates before the terbulalines formation step, the evaluated conditions in this study were not able to produce the chiral active metabolite, terbutaline.

A fexofenadina (FEX) tem sido o fármaco de primeira escolha no tratamento sintomático de manifestações alérgicas, por ser um anti-histamínico dos receptores H1 de 2ª geração não sedativo. É o metabólito ativo e quiral da terfenadina (TERF), medicamento cuja produção e comercialização foram suspensas em função dos eventos adversos apresentados. Fungos têm se apresentado como uma alternativa promissora na produção de compostos com atividade biológica. Dessa forma, o objetivo desse projeto foi avaliar a capacidade de fungos em biotransformar enantiosseletivamente a terfenadina em seu metabólito ativo, a fexofenadina empregando fungos como agentes catalisadores. Para a análise enantiosseletiva da fexofenadina foi desenvolvido um método de separação cromatográfica empregando a coluna quiral Lux® cellulose-1, fase móvel constituída de água: metanol (35:65, v/v) + 0,3% trietilamina + 0,4% ácido acético, vazão de 0,5 mL min-1, com detecção em 220nm. Duas microtécnicas de preparação de amostras foram avaliadas na extração dos analitos do meio de cultura: a microextração liquido-liquido dispersiva (DLLME) e a microextração em fase liquida empregando membranas cilíndricas ocas (HF-LPME). Entre essas, a DLLME foi a microtécnica de escolha, pois forneceu melhores resultados tais como, maior valor de recuperação, cromatogramas sem picos de possíveis interferentes, maior rapidez e facilidade de preparação das amostras. As condições otimizadas da DLLME foram: clorofórmio (300 ?L) como solvente extrator, isopropanol (300 ?L) como solvente dispersor. Após a formação do ponto nuvem, as amostras foram submetidas à agitação por vórtex durante 15 segundos e centrifugação durante 10 minutos a 3000 rpm. As recuperações foram de 43% para ambos enantiômeros. O método se mostrou linear na faixa de concentração 2.0 - 15.0 ?g mL-1 para cada enantiômero da FEX (r > 0,990). O limite de quantificação foi de 2 ?g mL-1 para os enantiômeros da FEX. Dentre os sete fungos estudados (Papulaspora immersa Hotson SS13, Penicillium crustosum VR4, Mucor rouxii, Nigrospora sphaerica SS67, Fusarium oxysporum SS50, Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A e Cunninghamella elegans NRRL 1393 ATCC 10028B) somente o fungo Fusarium oxysporum SS50 e Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A apresentaram potencial para biotransformação da terfenadina em fexofenadina nas condições de incubação empregadas nesse trabalho. / Fexofenadine (FEX) has been the drug of choice for the symptomatic treatment of allergic manifestations, being an antihistamine H1 receptor 2nd generation non-sedating. It is the active and chiral metabolite of terfenadine (TERF), a drug whose production and marketing was suspended as a result of adverse events. Fungi have been presented as a promising alternative for the production of compounds with biological activity. Thus, the goal of this project was to evaluate the ability of fungi to biotransform asymmetric terfenadine to its active metabolite, fexofenadine using fungi as agents catalysts. For enantioselective analysis of fexofenadine a method for chromatographic separation was developed employing a chiral column Lux® cellulose -1, mobile phase water : methanol (35:65,v/v) + 0.3% triethylamine + 0.4% acetic acid, flow rate of 0.5 mL min-1, with detection at 220nm. Two sample preparation microtechnology were evaluated in the extraction of analytes from the culture medium: the dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) and hollow fiber liquid phase microextraction (HF- LPME). Between the two, the DLLME was the microtechnic chosen because it provided better results such as higher recovery values, chromatograms with no possible interfering peaks, greater speed and ease of sample preparation. The optimized conditions of DLLME were: chloroform (300 ?L) as extractor solvent, isopropanol (300 ?L) as disperser solvent. After the formation of the cloud point, the samples were subjected to agitation by vortexing for 15 seconds and centrifuging for 10 minutes at 3000 rpm. The recoveries were 43 % for both enantiomers. The method was linear in the concentration range from 2.0 -15.0 ?g mL-1 for each enantiomer of FEX (r > 0.990). The limit of quantification was 2 ?g mL-1 for the enantiomers of FEX. Among the seven fungi studied (Papulaspora immersa Hotson SS13, Penicillium crustosum VR4, Mucor rouxii, Nigrospora sphaerica SS67, Fusarium oxysporum SS50, Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A e Cunninghamella elegans NRRL 1393 ATCC 10028B), only the fungi Fusarium oxysporum SS50 e Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A showed potential for biotransformation of terfenadine in fexofenadine in the incubation conditions employed in this work.

Neste trabalho foi estudado o comportamento de hidróxi-calcogenetos (Se e Te) frente a biotransformações, empregando enzimas isoladas em meio orgânico ou aquoso e empregando microorganismos (fungos). Estudos comparativos sobre a influência de diversas variáveis, como solvente, temperatura, imobilização enzimática e estrutura do hidróxi-calcogeneto, foram realizados. Inicialmente os compostos foram sintetizados utilizando métodos descritos na literatura, em seguida foi estudada a resolução de hidróxiselenetos em meio orgânico empregando lipases isoladas (Esquema 1), (ver arquivo), incluindo um estudo de imobilização da PSL em diversos suportes, além do estudo da influência da variação do solvente, da temperatura, da lipase, etc. Na resolução em meio aquoso empregando enzimas isoladas, primeiramente os hidróxi-selenetos foram acetilados quimicamente e depois realizado uma triagem (com dez enzimas de diferentes fontes) empregando indicador de pH colori métrico. Posteriormente os acetatos dos hidróxi-selenetos (Esquema 2) (ver arquivo) foram submetidos à resolução enzimática em meio aquoso empregando as enzimas que foram selecionadas na triagem enzimática. As biotransformações utilizando fungos foram realizadas empregando células inteiras de algumas linhagens de Aspergillus terreus. Na seqüência foi realizada a resolução de hidróxi-teluretos em meio orgânico utilizando lipases isoladas (Esquema 3)(ver arquivo). Nessas resoluções também foi estudada a influência da variação do solvente, da lipase, do tempo, etc. De forma a demonstrar a importância dos compostos resolvidos, um hidróxi-seleneto quiral e dois hidróxi-teluretos quirais foram usados para preparar compostos pertencentes a classes de unidades estruturais de vasta ocorrência em produtos naturais: um álcool alílico e duas lactonas (Esquema 4)(ver arquivo). / In this work, the behavior of hydroxy chalcogenides (Se and Te) towards the biotransformations using isolated enzymes in organic media or aqueous media and using microorganisms (fungi) was studied. A comparative study of the effect of temperature, solvent, enzyme immobilization and structure of the substrates on the resolution was performed. Initially, the compounds had been synthesized using described methods in the literature, after, the resolution of hydroxy selenides in organic media using isolated lipases was carried out (Scheme 1)(see PDF), including a study on the immobilization of PPL on some supports, as well studies on the influence of the variation of the solvent, the temperature, lipase, etc. In the resolution in aqueous media using isolated lipases, initially the hydroxy selenides were transformed into their acetates by convertional chemical methods, and then, a screening with ten enzymes from different sources was carried out using pH indicator. In the following, the enzymatic resolution of the selanyl acetates in aqueous media using the enzymes selected in the screening step was performed (Scheme 2)(see file). The biotransformations by fungi were performed using whole cells of some Aspergillus terreus strains. In the sequence, the resolution of hydroxy tellurides in organic media using isolated lipases was carried out (Scheme 3) (see file). In these resolutions, the influence of the variation of the solvent, lipase and the reaction time was also studied. In order to demonstrate the potencial of the resolved compounds, one chiral hydroxy selenide and one chiral hydroxy telluride were used to prepare compounds belonging to classes of building blocks of wide occurrence in natural products: an allylic alcohol and a lactone (Scheme 4)(see file).

Neste trabalho foi desenvolvida uma metodologia sintética verde para as reações de condensação de Knoevenagel entre aldeídos aromáticos e o cianoacetato de metila 2\'. As reações foram assistidas pelo método de aquecimento via irradiação micro-ondas, realizadas em 30 minutos, em uma temperatura de 65-85 ºC e 55 W de potência. Foram realizadas as sínteses de doze compostos 2a-l utilizando água ou etanol como solvente e forneceram bons rendimentos na faixa de 70-90%. A metodologia desenvolvida para a síntese destes compostos envolveu uma simples estratégia de purificação, a qual utilizou-se de lavagens com hexano a quente para obter os produtos isolados. Todos os compostos foram caracterizados via RMN (1H e 13C), IV e CG-EM. Sequencialmente, com intuito de dar aplicabilidade aos adutos de Knoevenagel previamente sintetizados, foi realizada uma série sintética de 4H-cromenos, uma classe estrutural de moléculas que possuem um potencial bioativo. A metodologia utilizada foi adaptada da utilizada na síntese dos adutos de Knoevenagel 2a-l e uma série sintética foi realizada via reações one-pot tricomponente, resultando na síntese de dez 4H-cromenos 3a-j, dos quais 5 foram inéditos na literatura. As reações foram realizadas em 90 minutos, a 85 ºC, 55 W de potência, utilizando água como solvente e forneceram rendimentos na faixa de 40-60%. Todos os 4H-cromenos foram isolados por cromatografia em coluna e caracterizados via RMN (1H e 13C), IV e EM. Também foram realizadas neste estudo reações de condensação de Knoevenagel utilizando cetonas aromáticas e a malononitrila 5\'. Duas metodologias foram empregadas, sendo que a primeira utilizou uma base forte (NaOH) por meio de uma reação em cascata e a segunda metodologia utilizou uma base de força moderada (trietilamina) por meio de uma reação one-pot. A metodologia que utilizou NaOH teve como objetivo obter o ânion da malononitrila 5\' de uma maneira efetiva previamente a adição da cetona no frasco reacional com intuito de favorecer o progresso da reação. Foram sintetizados sete adutos de Knoevenagel 5a-c e 5e-i, em 24 h de reação, a 50 ºC em chapa de aquecimento e agitação convencional e utilizando tetraidrofurano como solvente. Foram obtidos valores de conversão (CG-EM) na faixa de 0-38%, com exceção do aduto 5e (c = 90%). Já a metodologia que utilizou trietilamina foi realizada via reação one-pot, ou seja, todos os reagentes foram adicionados ao frasco reacional simultaneamente. Foi verificado que as reações se comportaram mais efetivamente na ausência de solventes e assim, foram sintetizados 6 adutos de Knoevenagel 5 a-b, 5d-f e 5i em 1 h de reação, a 85 ºC, 10 W de potência. As reações forneceram valores de conversão na faixa de 42-58%, porém, foram encontradas dificuldades nos processos de purificação destes compostos e apenas os adutos 5b, 5f e 5i foram isolados com respectivamente 3%, 5% e 6% de rendimento. Todos os adutos 5a-i foram caracterizados via CG-EM e os isolados, 5b, 5f e 5i, foram caracterizados também via RMN (1H e 13C) e IV. Por fim, foram selecionados quatro adutos de Knoevenagel, 2d, 2g, 2j e 2k, sintetizados entre aldeídos e o cianoacetato de metila 2\' para realizar reações de biotransformação com o fungo de ambiente marinho Penicillium citrinum CBMAI 1186. Inicialmente o objetivo destas reações era reduzir a ligação dupla carbono-carbono dos adutos, o que resultaria em um centro estereogênico. Foram realizadas reações em 1, 2, 3 e 5 dias e não foram observadas reações de bio-hidrogenação, mas sim, reações de biotransformação, pois foram observados os produtos oxidados (como ácidos carboxílicos) e reduzidos (como álcoois) dos respectivos aldeídos formadores dos adutos de Knoevenagel entre outros compostos. A partir deste estudo, foi possível concluir que o fungo Penicillium citrinum CBMAI 1186 teve maior capacidade em biotransformar os adutos de Knoevenagel do que reduzir estereosseletivamente a ligação dupla carbono-carbono. Em suma, a partir de metodologias ambientalmente sustentáveis, foram obtidos 31 compostos, sendo 5 inéditos na literatura. e a grande maioria dos restantes foram sintetizados pela primeira vez sob efeito da irradiação micro-ondas. / In this work a synthetic green methodology was developed for Knoevenagel condensation reactions between aromatic aldehydes and methyl cyanoacetate 2\'. The reactions were under microwave irradiation method, carried out in 30 minutes at a temperature of 65-85 ºC and 55 W of power. Twelve compounds 2a-1 were synthesized using water or ethanol as the solvent and provided good yields in the 70-90% range. The methodology developed for the synthesis of these compounds involved a simple purification strategy, which was used of hot hexane washes to obtain the isolated products. All compounds were characterized by NMR (1H and 13C), IR and GC-MS. Sequentially, in order to give applicability to previously synthesized Knoevenagel adducts, a synthetic series of 4H-chromenes was performed, a structural class of molecules that have a bioactive potential. The methodology used was adapted from that used in the synthesis of the Knoevenagel 2a-1 adducts and a synthetic series was performed, resulting in the synthesis of ten 4H-chromenes 3a-j, of which 5 compounds were unpublished in the literature. The reactions were carried out in 90 minutes at 85 ºC, 55 W, using water as solvent and provided yields in the range of 40-60%. All 4H-chromenes were isolated by column chromatography and characterized by NMR (1H and 13C), IR and MS. Also carried out in this study are Knoevenagel condensation reactions using aromatic ketones and malononitrile 5\'. Two methodologies were employed, the first using a strong base (NaOH) by means of a cascade reaction and the second methodology using a moderate force base (triethylamine) by means of a one-pot reaction. The methodology that used NaOH had as objective to obtain the anion of malononitrile 5\' in an effective way before the addition of the ketone in the reaction vial in order to favor the progress of the reaction. Seven Knoevenagel 5a-c and 5e-1 adducts were synthesized within 24 h of reaction at 50 ° C in conventional stirring and heating plate and using tetrahydrofuran as solvent. Conversion values (CG-MS) were obtained in the 0-38% range, with the exception of the adduct 5e (c = 90%). The methodology using triethylamine was carried out via a one-pot reaction, that is, all the reagents were added to the reaction flask simultaneously. It was verified that the reactions behaved more effectively in the absence of solvents and thus, 6 adducts of Knoevenagel 5a-b, 5d-f and 5i were synthesized in 1 h of reaction at 85 ºC, 10 W of potency. The reactions provided conversion values in the range of 42-58%, however, difficulties were found in the purification processes of these compounds and only adducts 5b, 5f and 5i were isolated with respectively 3%, 5% and 6% yield. All adducts 5a-i were characterized via GC-MS and the isolates, 5b, 5f and 5i, were also characterized by NMR (1H and 13C) and IV. Finally, four adducts of Knoevenagel, 2d, 2g, 2j and 2k, synthesized between aldehydes and the methyl cyanoacetate 2\' were selected to perform biotransformation reactions with the marine environment fungus Penicillium citrinum CBMAI 1186. Initially the purpose of these reactions was reduce the carbon-carbon double bond of the adducts, which would result in a stereogenic center. Reactions were carried out at 1, 2, 3 and 5 days and no biohydrogenation reactions were observed, but biotransformation reactions were observed, since the oxidized products (as carboxylic acids) and reduced (like alcohols) of the respective aldehydes forming the Knoevenagel adducts among others. From this study, it was possible to conclude that the fungus P. citrinum CBMAI 1186 had a greater ability to biotransform the Knoevenagel adducts than to stereoselectively reduce the carbon-carbon double bond. In short, from the environmentally sustainable methodologies, 31 compounds were obtained, of which 5 were unpublished in the literature. and the vast majority of the rest were synthesized for the first time under the effect of microwave irradiation.

A oxibutinina é um fármaco quiral empregado na forma de racemato que, após administração por via oral, sofre biotranformação hepática pronunciada levando à formação de N-desetiloxibutinina. Este metabólito apresenta atividade anticolinérgica semelhante a da oxibutinina, contribuindo com o efeito farmacológico e, também, com os efeitos adversos. Em relação às propriedades farmacocinéticas, alguns estudos prévios indicam que a biotransformação é estereosseletiva. Assim, propôs-se o desenvolvimento e validação de um método para análise dos enantiômeros do fármaco e seu metabólito em fração microssomal de fígado de ratos. O método foi desenvolvido empregando a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção em 262 nm; a separação dos enantiômeros do fármaco e metabólito foi efetuada em uma coluna Chiralpak AD, empregando hexano: isopropanol: etanol (95:4:1, v/v/v) com 0,3% de dietilamina como fase móvel, na vazão de 0,9 mL min-1. A microextração em fase líquida (LPME) foi empregada como técnica de preparação das amostras e o método foi otimizado empregando planejamento fatorial. A seguinte condição final de extração foi selecionada: tempo de extração de 45 min, nenhuma adição de metanol ou NaCl, agitação da amostra a 4500 rpm, membrana de 6 cm de comprimento, fase doadora em pH 8,0 e ácido trifluoracético 0,1 mol L-1 como fase aceptora. O método mostrou ser linear na faixa de concentração de 312 - 5000 ng mL-1 para os enantiômeros da oxibutinina e 250 - 5000 ng mL-1 para os enantiômeros do metabólito. As recuperações foram de 61 e 55% para a (R)-oxibutinina e (S)-oxibutinina, respectivamente e de 70 e 72% para a (R)-N-desetiloxibutinina e (S)-N-desetiloxibutinina, respectivamente Obteve-se precisão com coeficientes de variação inferiores a 15% e exatidão com erros relativos menores que 15%. O método foi aplicado em um estudo de biotransformação in vitro empregando a fração microssomal de fígado de ratos. As constantes cinéticas foram determinadas e verificou-se uma pequena diferença de afinidade da enzima pelos enantiômeros da oxibutinina (Km= 9,3 nmol L-1 e 7,9 nmol L-1 para a (R)-oxibuinina e a (S)-oxibutinina, respectivamente), com maior afinidade à (S)-oxibutinina em função do menor valor de Km. / Oxybutynin is a chiral drug used as a racemate which, after oral administration, suffers pronounced liver biotransformation leading to the formation of N-desethyloxybutynin. This metabolite shows anticholinergic activity similar to the oxybutynin, contributing to the pharmacological effect and also with the adverse effects. Regarding the pharmacokinetic properties, some studies indicate the stereoselective biotransformation. Thus, it was proposed the development and validation of an enantioselective method for analysis of oxybutynin and its metabolite in rat liver microsomal fraction. The method was developed using high-performance liquid chromatography with detection at 262 nm; the separation of drug and metabolite enantiomers was performed on a Chiralpak AD column employing hexane: isopropanol: ethanol (95:4:1, v/v/v) plus 0.3 % diethylamine as the mobile phase, at a flow rate 0.9 mL min-1. Liquid phase microextraction was used for preparation of the samples and the method was optimized using factorial design; the following condition was established: extraction time of 45 min, no methanol and NaCl in donor phase, agitation of the sample at 4500 rpm, membrane of 6 cm in length, donor phase pH 8.0 and trifluoracetic acid 0.1 mol L-1 as aceptor phase. The method was linear over the range of 312 - 5000 ng mL-1 for oxybutynin enantiomers and over the range of 250 - 5000 ng mL-1 for the metabolite enantiomers. The recoveries were 61 and 55% for (R)-oxybutynin and (S)-oxybutynin, respectively and, for (R)-N-desethyloxybutynin and (S)- N-desethyloxybutynin 70 and 72%, respectively. Within-day and between-day assay precision and accuracy were lower than 15%. The method was applied to an in vitro biotransformation study using rat liver microsomal fraction. The kinetic constants were determined and there was a small difference in affinity of the enzyme for oxybutynin enantiomers (Km=9.3 nmol L-1 and 7.9 nmol L-1 for (R)-oxybutynin and (S)-oxybutynin, respectively), with higher affinity to the (S)-oxybutynin according to the lower value of Km

O estudo foi dividido em capítulos que incluíram diversos aspectos da ecologia química de insetos e espécies de Piperaceae como se seguem: O Capítulo 1 descreve as informações taxonômicas, a história natural dos insetos, as observações de campo e a organização das espécies hospedeiras de Piperaceae segundo as preferências alimentares dos insetos. Observou-se forte especificidade química de espécies de Coleoptera (Naupactus bipes) e Homoptera (Membracis foliata, Callocanophora sp., e Aethalium reticulatum) por Piper aduncum, P. gaudichaudianum, P. arboreum e P. hispidum que possuem ácidos benzóicos prenilados como produtos predominantes. As Lepidoptera (Quadrus u-lucida, Heraclydes brasiliensis e H. helicorides) constituíram-se num segundo grupo de insetos para o qual constatou-se forte especificidade. Nesse caso as espécies de Piperaceae, P. regnellii e P. solmsianum, são nitidamente acumuladores de neolignanas e/ou lignanas. Os Capítulos 2 e 3 (coleópteros - besouros e lepidópteros - borboletas, respectivamente) descrevem os resultados relacionados aos estudos das reações que ocorreram durante o processo de digestão de folhas de espécies de Piper, seqüestros de metabólitos secundários pelos insetos. O estudo de possíveis fatores atrativos presentes em óleos essenciais foram investigados mediante o uso de ensaios eletrofisiológicos. Foram observadas reações de desmetilações em lignanas tetraidrofurânicas, esterificação de ácidos benzóicos, hidrólise de amidas, reação do tipo ozonólise de lignanas, neolignanas e fenilpropanóides durante o processo digestivo das borboletas (larvas) e dos besouros adultos. Foram observados seqüestros de neolignanas das folhas e raízes de P. regnellii pelas larvas da borboleta Heraclides hectorides e ácidos benzóicos prenilados das raízes de P. gaudichaudianum pelas larvas do besouro Naupactus bipes. Os experimentos de EAG com antenas do besouro N. bipes indicou que os óleos de P. gaudichaudianum, P. regnellii e P. hispidum foram ativos, e tal comportamento foi confirmado por observações em campo, sendo que as respostas mais intensas foram observadas para as fêmeas em relação às respostas para os machos. A análise de GC/EM-EAD permitiu a determinação dos compostos bioativos como os monoterpenos α- pineno, ß-pineno e ß-mirceno. O Capítulo 4 descreve as espécies de homópteros que têm especificidade por P. gaudichaudianum, P. arboreum e P. aduncum que são acumuladoras de ácidos benzóicos 7 prenilados. Outros possíveis fatores determinantes para tal especificidade foram atribuídos ao baixo teor de metabólitos secundários nas seivas, alto teor de micronutrientes, baixo teor de macronutrientes, ausência de lignanas ou neolignanas nas seivas, lignificação com predominância de resíduo siringila (S). O Capítulo 5 descreve a determinação e caracterização estrutural dos 49 metabólitos secundários envolvidos neste estudo. O Capítulo 6 descreve o estudo da estabilidade de lignanas tetraidrofurânicas realizado em função da rara ocorrência na natureza de isômeros com a configuração toda cis. O estudo da estabilidade para os dez possíveis estereoisômeros para a lignana tetraidrofurânica através do cálculo do funcional de densidade, B3LYP, com a base 6- 316(dp) mostrou que a configuração toda cis é de fato menos estável do que a toda trans. / The study was presented in six chapters that included several aspects of chemical ecology of insects and Piperaceae species as following: The Chapter 1 describes taxonomical aspects, natural history of the insects and field observation and the organization of hosts Piperaceae according to the observed feeding preferences of the associated insects. It was observed strong chemical specificity of Coleoptera and Homoptera species by Piper aduncum, P. gaudichaudianum, P. arboreum and P. hispidum which contain prenylated benzoic acids. The Lepidoptera showed preference for species containing neolignanas and/or lignanas such P. regnellii and P. solmsianum. The Chapters 2 and 3 (coleopterous - beetles and lepdopterous-butterflies, respectively), were addressed for the studies of biotransformation reactions, sequestration and attractive assays. The study of possible factors present attractions in essential oils was investigated by the use of electrophysiological essays. It were observed several reactions as esterification, hydrolyses and ozonolyse-type for lignans, neolignans, phenylpropanoids and amides occurring in from species of Piperaceae during the digestive process of the butterflies and of beetles. It was observed sequestration of neolignans of P. regnellii by larvae of Heraclides hectorides and prenylated of benzoic acids from roots of P. gaudichaudianum by the larva of the beetle Naupactus bipes. The experiments of EAG using antennas of the beetle N. bipes showed that the oils of P. gaudichaudianum, P. regnellii and P. hispidum were active and such results were in agreement with field observations and the most intense response was observed for the females in relation to the response for the males. The analyses of GC/EM-EAD allowed the determination of the bio-actives compounds as the monoterpenes α-pinene, β-pinene and β-mircene. The Chapter 4 describes the homopteros species that have specificity for the P. gaudichaudianum, P. arboreum and P. aduncum accumulative of prenylated benzoic acids. Further determinant factors for specificity included: low percentage of secondary metabolites in saps, high percentage of micro-nutrients and low percentage of macro-nutrients, absence of lignans or neolignans in the saps, lignifications with predominance of siringyl residues (S) which confer a pattern related to Angiosperms. The Chapter 5 describes the determination and structural characterization of the 49 secondary metabólitos involved in this study. The Chapter 6 shows the study of stability versus natural occurrence of tetrahydrofuran lignans was carried out due to the rare occurrence of all-cis configuration. The study of the stability for the ten possible stereoisomers for the tetrahydrofuran lignans was through the calculation of the functional of density, B3LYP, with the base 6-316(dp), it showed that the all-cis configuration is less stable than the all-trans tetrahydrofuran lignans.

Os flavonoides são um grupo diversificado de compostos polifenólicos que podem ser encontrados na natureza e também sintetizados. A gama de atividades biológicas e o potencial para reduzir o risco de doenças crônicas tem motivado a comunidade científica a desenvolver métodos de síntese de compostos desta classe. Neste sentido, as reações de biotransformação são estratégias interessantes com grande potencial para modificar as estruturas de flavonoides naturais e sintéticos. Este estudo teve como objetivo a biotransformação de derivados de flavonoides por fungos de ambiente marinho. Assim, os derivados de flavonoides 2\'-hidroxichalconas (1a-h), 2\'-hidroxi-diidrochalcona (2a), flavanona (3a) e flavan-4-ol (4a) foram usados como substratos em reações biocatalisadas por células totais de fungos de ambiente marinho. As condições reacionais foram otimizadas variando-se o pH e a composição nutricional do meio reacional. Dessa forma, foi realizada uma triagem com oito fungos derivados de ambiente marinho (Penicillium raistrickii CBMAI 931, Cladosporium sp. CBMAI 1237, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Penicillium oxalicum CBMAI 1996, Penicillium citrinum CBMAI 1186, Mucor racemosus CBMAI 847, Westerdykella sp. CBMAI 1679 e Aspergillus sclerotiorum CBMAI 849) utilizando a 2\'-hidroxichalcona 1a como substrato. A partir da triagem foram selecionados os fungos P. raistrickii CBMAI 931 e A. sydowii CBMAI 935 para serem aplicados com outros derivados de flavonoides. As reações empregando o fungo P. raistrickii CBMAI 931 resultou preferencialmente na hidrogenação da ligação Cα=Cβ das 2\'-hidroxichalconas substituídas (1a-h) com a formação das 2\'-hidroxi-diidrochalconas (2a-h) com conversões que variaram de 25 a 83% em 14 dias de reação. Também foi realizada uma triagem com dez fungos derivados de ambiente marinho (Fusarium sp. CBMAI 1830, Acremonium sp. CBMAI 1676, Aspergillus sp. CBMAI 1829, A. sydowii CBMAI 935, P.oxalicum CBMAI 1996, P. citrinum CBMAI 1186, P. raistrickii CBMAI 931, Cladosporium sp. CBMAI 1237, M. racemosus CBMAI 847 e Westerdykella sp. CBMAI 1679) para a biotransformação da flavanona 3a. A biotransformação da flavanona 3a resultou na formação de produtos de biorredução, hidroxilação e clivagem de anel. As reações empregando os fungos Cladosporium sp. CBMAI 1237, Westerdykella sp. CBMAI 1679 e Acremonium sp. CBMAI 1676 levou preferencialmente a biorredução do grupo cetônico da flavanona 3a para formação do flavan-4-ol 4a correspondente. Os fungos Acremonium sp. CBMAI 1676 e Cladosporium sp. CBMAI 1237 foram então utilizados para reduzir uma série de flavanonas 3b-g meta e para substituídas, onde os flavan-4-ois foram isolados com bons rendimentos (67-87%), porém com baixa seletividade. O fungo P. raistrickii CBMAI 931 também apresentou potencial para obtenção de diidrochalconas a partir de flavanonas, assim como os fungos A. sydowii CBMAI 935 e Fusarium sp. CBMAI que além de produzirem diidrochalconas ainda promoveram a hidroxilação da mesma. Assim, os fungos de ambiente marinho P. raistrickii CBMAI 931 e A. sydowii CBMAI 935 foram eficientes na biotransformação de derivados de flavonoides com controle quimio- e regiosseletivo. Os fungos de ambiente marinhoutilizados mostraram-se como uma fonte de enzimas ene redutases, álcool desidrogenases e monoxigenases ao mediar eficientemente a biotransformação de derivados de flavanoides. / Flavonoids are a diverse group of polyphenolic compounds that can be found in nature and synthesized. The range of biological activities and the potential to reduce the risk of chronic diseases has motivated the scientific community to develop methods of synthesis of compounds of this class. In this sense, biotransformation reactions are interesting strategies with great potential to modify the structures of natural and synthetic flavonoids. This study aimed at the biotransformation of flavonoid derivatives by marine environment fungi. Thus, the flavonoid derivatives 2\'-hydroxychalconas (1a-h), 2\'-hydroxy dihydrochalcone (2a), flavanone (3a) and flavan-4-ol (4a) were used as substrates in biocatalysed reactions by total cells of fungi of marine environment. The reaction conditions were optimized by varying the pH and nutritional composition of the reaction medium. In this way, eight marine-derived fungi (Penicillium raistrickii CBMAI 931, Cladosporium sp. CBMAI 1237, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Penicillium oxalicum CBMAI 1996, Penicillium citrinum CBMAI 1186, Mucor racemosus CBMAI 847, Westerdykella sp. 1679 and Aspergillus sclerotiorum CBMAI 849) were screened to perform the biotransformation of 2\'-hydroxychalcone 1a. From the screening, the fungi P. raistrickii CBMAI 931 and A. sydowii CBMAI 935 were selected for applied with other flavonoid derivatives. The reactions using the fungus P. raistrickii CBMAI 931 resulted preferentially in the hydrogenation of the Cα-Cβ double bond of the substituted 2\'-hydroxychalconas (1a-h) to led formation of 2\'-hydroxy-dihydrochalcones (2a-h) with good conversions (25 to 83%) in 14 days of reaction. It was also carried out a screening with ten fungi derived from marine environment (Fusarium sp. CBMAI 1830, Acremonium sp. CBMAI 1676, Aspergillus sp. CBMAI 1829, A. sydowii CBMAI 935, P. oxalicum CBMAI 1996, P. citrinum CBMAI 1186, P. raistrickii CBMAI 931, Cladosporium sp, CBMAI 1237, M. racemosus CBMAI 847 and Westerdykella sp, CBMAI 1679) for the biotransformation of flavanone 3a. The biotransformation reaction resulted in the biorreduction of flavanona 3a, hydroxylation and ring cleavage of the products. Reactions by Cladosporium sp. CBMAI 1237, Westerdykella sp. CBMAI 1679 and Acremonium sp. CBMAI 1676 preferably led to the reduction of the pro-chiral ketone of flavanone to form the corresponding flavan-4-ol. The fungi Acremonium sp. CBMAI 1676 and Cladosporium sp. CBMAI 1237 were used to reduce a series of substituted flavanones, where flavan-4-ols were isolated in good yields (67-87%), but with low selectivity. The fungus P. raistrickii CBMAI 931 presented potential for produce dihydrochalcones from flavanones, as well as the fungi A. sydowii CBMAI 935 and Fusarium sp. CBMAI that in addition to producing dihydrochalcones still promoted the hydroxylation thereof. Thus, the marine environment fungi P. raistrickii CBMAI 931 and A. sydowii CBMAI 935 were efficient in biotransformation of flavonoid derivatives with chemo- and regioselective control. Marine-derived fungi have been shown to be a source of ene reductase enzymes, alcohol dehydrogenases and monoxigenases by efficiently mediating the biotransformation of flavonoid derivatives.

O trabalho abrange o estudo de biorreduções de cetonas por espécies vegetais, empregando-se homogenatos de células de tecidos de plantas já desenvolvidas (folhas) ou culturas de células de Rauwolfia sellowii e Cereus peruvianus em suspensão. Dentre os objetivos principais do trabalho estão: reduzir cetonas-modelo por culturas de células vegetais, avaliando a eficiência e estereosseletividade do processo. Desenvolver um procedimento de triagem por enzimas vegetais solúveis entre diversas espécies obtidas no campus \"Armando Salles de Oliveira\", através da manipulação de variáveis que sabidamente alteram a atividade enzimática. Este tipo de preparação enzimática é utilizado no estudo de rotas biossintéticas, mas o emprego de homogenatos de células vegetais na triagem por novos biocatalisadores é inovador, tendo sido demonstrado seu potencial como ferramenta na seleção de enzimas vegetais para a biotransformação de xenobióticos. A metodologia é simples e confiável, possibilitando o estudo de biotransformações por enzimas diferentes daquelas expressas em culturas de células e oferecendo maior garantia de que a atividade enzimática observada é originária da espécie vegetal em estudo, e não de microorganismos endofíticos, que podem atuar nas biotransformações em que se utilizam partes de plantas desenvolvidas como biocatalisador / The work focuses on the study of the bioreduction of ketones by plant species, using homogenates of already developed plant tissues cells (leaves) or of Rauwolfia sellowii and Cereus peruvianus cell cultures suspensions. Among the main objectives of the study are the evaluation of the efficiency and stereoselectivity of the ketone-reduction process in plant cell cultures. It was employed a screening procedure for soluble enzymes from different plant species found on campus \"Armando Salles de Oliveira\", through the manipulation of variables known to be related to the enzyme activity. This type of enzyme preparation has been already reported in studies of biosynthetic routes, but the use of homogenates of plant cells to the screening for new biocatalysts is innovative. In this work we could demonstrate the potential of this approach as a tool in the selection of plant enzymes for the biotransformation of xenobiotics. The methodology is simple and reliable, allows the study of biotransformations by enzymes different from those expressed in cultured cells, and provides greater assurance that the enzymatic activity observed originated in plant species under study, rather than in endophytic microorganisms, which can act in biotransformations that employ parts of developed plants as biocatalyst.