Orientador: Gláucia Maria Pastore / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-26T00:10:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paulino_BrunoNicolau_M.pdf: 3431534 bytes, checksum: 95854820504f050fe2c1dd2bb892df9f (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A crescente demanda por processos que tenham impacto ambiental reduzido, rendimentos consideráveis e ainda custos minimizados recorrem à biotecnologia como uma ciência que pode tornar essa necessidade uma realidade. Processos biotecnológicos para a produção de compostos de interesse industrial como biocorantes, açúcares funcionais, biosurfactantes e biodiesel são uma tendência no meio científico e ganham destaque pela inovação, resultados e aplicações obtidos. O apelo comercial dos produtos biotecnológicos é outro fator que influencia as pesquisas haja vista que esses produtos são considerados naturais e tem-se comprovado que muitos deles apresentam atividades biológicas relevantes. O aroma é um importante atributo dos alimentos e pode ser produzido via biotecnológica a partir de substratos de baixo custo. A utilização de resíduos agro-industriais com alto teor nesses substratos, como por exemplo, resíduos ricos em monoterpenos são de grande interesse na biotecnologia de produção de aromas. Além disso, a utilização de micro-organismos isolados de diferentes fontes como biocatalisadores na produção desses compostos é outra perspectiva, muito explorada e ainda desafiadora. A biotransformação de monoterpenos para a produção de compostos de aroma é vantajosa quando comparada com a síntese química clássica. Contudo, alguns problemas ainda devem ser minimizados, como sensibilidade dos biocatalisadores à toxicidade dos substratos ou condições operacionais e baixos rendimentos. Assim, a seleção de novos biocatalisadores, como micro-organismos endofíticos, o uso de ferramentas de engenharia genética e a utilização de métodos estatísticos de otimização de processos são promissores e caracterizam-se como a nova vertente na área de bioaromas, contornando as desvantagens até então limitantes dos processos de biotransformação. Eles permitem em alguns casos, o aumento de escala e dessa forma a real aplicação da bioconversão microbiana na indústria. Assim, trabalhos que visem selecionar novos biocatalisadores é ainda uma necessidade e quando aliados a otimização de processos podem fornecer caminhos para que os rendimentos da bioconversão de monoterpenos sejam aumentados. Nesse contexto, o presente trabalho visou selecionar micro-organismos com potencial para a bioconversão de monoterpenos de baixo custo e presentes em grandes quantidades em resíduos agro-industriais, como 'alfa'-pineno e R-(+)-limoneno, para a produção de compostos de aroma valorizados comercialmente, S-(-)-verbenona e 'alfa'-terpineol. O capítulo 1 traz uma revisão sobre os compostos monoterpênicos, abordando suas características químico-estruturais, biossíntese e recentes aplicações terapêuticas, além do seu uso como substratos na biotecnologia de produção de compostos de aroma. O capítulo 2 é dividido em duas partes: a parte I mostra os resultados de um screening realizado com 81 linhagens de fungos isolados de diferentes fontes, entre eles, fungos endofíticos, utilizados no estudo do potencial de biotransformação de R-(+)-limoneno e 'alfa'-pineno. A parte II descreve a otimização do processo de produção de S-(-)-verbenona biotecnológica a partir de ?-pineno por uma linhagem de fungo endofítico, ainda não identificado, isolado da romã (Punica granatum). O uso de um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) de 4 variáveis proporcionou o estabelecimento de condições mais favoráveis ao processo, elevando a concentração de verbenona que era de 66 mg.L-1 para aproximadamente 108 mg.L-1 em um dos ensaios do DCCR e em torno de 98 mg.L-1 no ensaio de validação. O capítulo 3 aborda a otimização do processo biotecnológico de produção de ?-terpineol a partir de R-(+)-limoneno pela linhagem Bacillus tequilensis isolada de resíduos de processamento de frutas cítricas. Após a otimização e validação do processo nas condições consideradas ótimas através da análise de superfícies de resposta, a concentração de ?-terpineol passou de 25 mg.L-1 para 85 mg.L-1. Portanto, os resultados obtidos no trabalho mostraram um ganho de rendimento nos processos de bioconversão de substratos monoterpênicos e que a otimização de processos é uma importante ferramenta para a melhoria das condições experimentais possibilitando trabalhos futuros que envolvam aumento de escala / Abstract: The growing demand for processes that reduce environmental impacts, have high yields and costs minimized uses biotechnology as a science that can make this need into a reality. Biotechnological processes for the production of industrial interesting compounds, such as biocolorant, functional sugars, biosurfactants and biodiesel, are a trend in the scientific field and are highlighted by innovation, application and results obtained. The commercial appeal of biotechnological products is another factor that stimulates researches since these products are considered natural and has been proven that many of them presents significant biological activities. The flavor is an important attribute of food and can be produced through biotechnological processes from low-cost-substrates. The use of agro-industrial wastes with high content of these substrates, such as residues rich in monoterpenes, is of great interest in biotechnology. Furthermore, the use of micro-organisms isolated from several sources as biocatalysts in the production of flavor compounds is another well-explored and challenging perspective. The biotransformation of terpenes for aroma compounds production is advantageous when compared with chemical synthesis. However, there are still some problems that must be minimized like biocatalysts sensitivity, toxicity of substrates and low yields. Thus, the selection of new biocatalysts, such as endophytic micro-organisms, use of genetic engineering and statistical methods for optimization of processes are promising and characterize a new perspective in bioaromas field. Thereby, works that search for new biocatalysts are necessary and associated with optimization processes can improve the monoterpenes bioconvertion. In this context, the objective of this work was the screening and selection of micro-organisms that are able to realize the biotransformation of low cost monoterpenes, 'alfa'-pinene and limonene, into high-value aroma compounds, such as verbenone and 'alfa-terpineol. The chapter 1 presents a current review on monoterpenes, showing their chemical characteristics, biosynthesis and recent therapeutic applications, besides their potential use as substrates for bioflavor production. The chapter 2 is divides in two parts: the first one shows the results of the screening of 81 strains of fungi isolated from several sources, including endophytic strains, for biotransformation of limonene and ?-pinene. The second part describes the optimization process for biotechnological verbenone production from "alfa'-pinene by a non-indentified fungal strain, isolated from pomegranate (Punica granatum). The use of a central composite rotatable design (CCRD) of 4 variables provided the optimal conditions for this process, increasing the verbenone concentration from 66 mg.L-1 to 108 mg.L-1 in one of the CCRD assays and 98 mg.L-1 after validation. The chapter 3 also shows an optimization study, in this case using limonene as substrate and the product obtained was ?-terpineol. The biocatalyst used was a bacterial strain, identified as Bacillus tequilensis, isolated from citrus fruit processing waste. After the optimization and validation in the best conditions obtained through the surface response analysis, the concentration of ?-terpineol reached was 85 mg.L-1. Therefore, the results obtained in this work show an improve of the yields in the biotransformation of both monoterpenic substrates and that optimization of processes is an important tool for the progress of future works involving scale-up studies / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-20T21:21:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_LiviaRosas_M.pdf: 6389418 bytes, checksum: 474ea71f0f4b85a4fb59fa346c31f972 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A tanino acil hidrolase (EC 3.1.1.20), conhecida como tanase, é uma enzima com habilidade de atuar em ligações éster e depsídicas de taninos hidrolisáveis e também foi descrita como capaz de hidrolisar polifenóis como ácido clorogênico, epicatequina galato e epigalocatequina galato. Os polifenóis, ou compostos fenólicos, estão distribuídos em uma ampla variedade de fontes vegetais e estão relacionados à prevenção de câncer e doenças cardiovasculares. No entanto, os polifenóis ocorrem frequentemente como glicosídeos ou outros conjugados, o que pode comprometer a biodisponibilidade e os efeitos benéficos destes compostos à saúde, sendo necessária a biotransformação destes conjugados no trato gastrointestinal. Como alternativa tecnológica, a biotransformação enzimática dos polifenóis ou de suas fontes vegetais também pode liberar estes compostos de seus conjugados e consequentemente, melhorar a atividade funcional de tais antioxidantes. O objetivo do presente trabalho foi estudar a especificidade do extrato semipurificado de tanase de Paecilomyces variotii frente a diferentes padrões comerciais de polifenóis e avaliar sua atuação na matriz alimentar suco de laranja quanto a modificações em características físico-químicas, perfil fenólico e atividade antioxidante. O estudo da especificidade do extrato semipurificado de tanase foi realizado por CLAE-DAD e ESI-MS e o suco de laranja foi avaliado quanto aos parâmetros acidez total titulável, sólidos totais, pH, teor de vitamina C e fenólicos totais. As alterações no perfil fenólico do suco de laranja foram avaliadas por CLAE-DAD e a atividade antioxidante pelos métodos in vitro ORAC e de sequestro de radicais DPPH. Os resultados obtidos por CLAE-DAD e ESI-MS mostraram que não houve hidrólise dos padrões ácido clorogênico, ácido ferúlico, ácido elágico, resveratrol, quercetina e hesperetina pelo extrato semipurificado de tanase nas condições empregadas para o teste. No entanto, foi observado a hidrólise da ligação entre a aglicona e o dissacarídeo dos flavonoides rutina, naringina e hesperidina, gerando respectivamente os produtos quercetina, naringenina e hesperetina, e indicando uma atividade diglicosídica do extrato semipurificado de tanase. Para o suco de laranja, os resultados de acidez titulável, pH, sólidos solúveis e vitamina C não apresentaram diferença significativa após o tratamento enzimático do suco com extrato semipurificado de tanase, no entanto, houve um aumento de 16,8% no teor de fenólicos totais. Além disso, foi verificada uma modificação no perfil polifenólico do suco de laranja obtido por CLAE-DAD, resultando em um aumento na atividade antioxidante do suco biotransformado em aproximadamente 50% pelo método ORAC e 70% pelo método DPPH. Os padrões comerciais hesperidina e naringina biotransformados pelo extrato semipurificado de tanase também apresentaram maior atividade antioxidante do que o controle sem reação. Pelo que se tem conhecimento, a hidrólise de flavonoides glicosilados por tanase é um relato inédito na literatura e, portanto este trabalho fornece novos substratos para o extrato semipurificado de tanase de P. variotii e confirma que a biotransformação é uma boa estratégia para melhorar a atividade antioxidante in vitro de polifenóis e de suco de laranja / Abstract: Tannin acyl hydrolases (EC 3.1.1.20), commonly named as tannases, are enzymes able to act on ester and depside bonds of hydrolysable tannins and have also been described to hydrolyse polyphenols such as chlorogenic acid, epicatechin gallate and epigallocatechin gallate. Polyphenols, or phenolic compounds, are widely distributed in the plant kingdom and are related to the prevention of cancer and cardiovascular diseases. However, polyphenols are often found as glycosides or other conjugates, which may affect their bioavailability and health benefits, being necessary the biotransformation of these compounds in the gastrointestinal tract. As a technological alternative, the enzymatic biotransformation of the polyphenols or their plant sources can also release these compounds from their conjugates and therefore improve the functional activity of these antioxidants. The objectives of the present study were to investigate the specificity of the crude extract of tannase from Paecilomyces variotii in reaction with differents comercial standards of phenolic compounds and to evaluate the effects on the physico-chemical properties, phenolic profile and antioxidant activity of the orange juice reacted with the crude extract of tannase. The specificity study of the crude extract of tannase was performed by HPLC-DAD and ESI-MS. The orange juice was subject to analysis of titratable acidity, pH, and total solids, vitamin C and total phenolics contents. Furthermore, changes in the phenolic profile of orange juice were analyzed by HPLC-DAD and the antioxidant capacity of the samples was tested by in vitro DPPH and ORAC assays. The results obtained by HPLC-DAD and ESI-MS did not show hydrolysis of the standards chlorogenic acid, ferulic acid, ellagic acid, resveratrol, quercetin and hesperetin at test conditions. However, the crude extract of tannase was able to hydrolyse the glucosidic bond between disaccharide and aglycone of the flavonoids rutin, hesperidin and naringin, yielding as products quercetin, hesperetin and naringenin, respectively, and indicating a diglycosidase activity of the crude extract of tannase. For orange juice, the results of acidity, pH, soluble solids and vitamin C showed no significant difference after enzymatic treatment with the crude extract of tannase, but there was an increase of 16.8% in total phenolic content. In addition, there was an extensive modification in the polyphenolic profile from the biotransformed orange juice obtained by HPLC-DAD, which resulted about 50% and 70% increase in orange juice antioxidant activity by ORAC and DPPH methods, respectively. The standards hesperidin and naringin biotransformed by crude extract of tannase also showed higher antioxidant activities than the control. To the best of our known, this is the first report about tannase which could hydrolyze flavonoid glycosides and, therefore this work provides new substrates for crude extract of tannase from P. variotii and confirms that biotransformation is a good strategy to improve in vitro antioxidant activity of polyphenols and orange juice / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2017-04-19T16:57:00Z No. of bitstreams: 1 Pontes, Simone Gomes [Dissertação, 2012].pdf: 1302242 bytes, checksum: 7aab3cecd1b771d41f103c491d846579 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-19T16:57:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pontes, Simone Gomes [Dissertação, 2012].pdf: 1302242 bytes, checksum: 7aab3cecd1b771d41f103c491d846579 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A dihidroxiacetona (DHA) é uma molécula constituída por três carbonos e não tóxica, utilizada como insumo para as indústrias de cosméticos, fármacos e química fina. É produzida industrialmente por fermentação, utilizando a bactéria Gluconobacter oxydans. Esse processo tem como principal limitação a inibição do crescimento tanto pelo substrato – glicerol – quanto pelo produto – DHA e, por tal, estudos recentes descrevem propostas para melhoria do processo. Sendo a conversão de glicerol a DHA realizada por uma única enzima em uma etapa, o presente trabalho considera que tal processo se enquadra nas definições de uma biotransformação, ou seja, a utilização de um catalisador biológico com o propósito de converter um substrato a um produto estruturalmente similar, através de modificações específicas e utilizando um número limitado de etapas enzimáticas. Dessa forma, neste estudo foram avaliados comparativamente a secagem de células em acetona e, em um segundo momento, a utilização de células de Gluconobacter oxydans previamente crescidas, para a produção de DHA a partir de glicerol. Objetivando contornar o principal problema do processo, que é a inibição do crescimento microbiano pelo substrato e pelo produto, foram testadas duas linhagens. A utilização de células secas em acetona se mostrou possível, porém os resultados não foram reprodutíveis e células previamente crescidas por 24 horas passaram a ser usadas nos experimentos de biotransformação. O pH e a temperatura de reação foram selecionados a partir de um planejamento delineamento composto central rotacional como sendo de 34ºC e pH de 4,5, para G. oxydans CCT 0552 e de 26ºC e pH de 4,5 para G. oxydans CCT 0174. A linhagem G. oxydans CCT 0552 se mostrou mais adequada à oxidação de glicerol à DHA, com aumento do acúmulo de DHA no meio reacional com o tempo (2,1 g/g biomassa) e com a produtividade constante (0,45 g/g biomassa). Foi constatada perda de atividade nas células estocadas por congelamento, o que leva à necessidade de selecionar um melhor método de conservação das células para a utilização na produção / The dihydroxyacetone (DHA) is a non-toxic molecule consisting of three carbons, used in the cosmetics, pharmaceuticals and fine chemicals industry. The DHA is industrially produced by fermentation, using the bacteria Gluconobacter oxydans. The main bottleneck of this process is the growth inhibition by the substrate – glycerol – and the product – DHA. This problem leads recent studies to describe proposals for improving the process. As the conversion of glycerol to DHA is performed by a single enzyme in one step, this study considers that this process fits in the definitions of biotransformation, in other words, the use of a biological catalyst in order to convert a substrate for a structurally similar products, by speficic modifications, and using a limited number of enzymatic steps. Thus, this study were assessed by comparison with drying of cells in acetone and in second stage, the use of previously grown cells of Gluconobacter oxydans for the production of DHA from glycerol. The use of dried cells proved to be possible, but the results were not reproducible and the biotransformation experiments were done with previously grown cells of 24 hours age. . The best pH and temperature for the reaction were selected from a central composite design as being 34o C and pH 4.5 for G. oxydans CCT 0552 and 26o C and pH 4.5 for G. oxydans CCT 0174. The strain G. oxydans CCT 0552 was more suitable for the oxidation of glycerol to DHA, with increased accumulation of DHA in the reaction media (2,1 g/g biomass) and constant productivity (0,45 g/g biomass). Loss of activity was observed in cells stored by freezing, which leads to the need to select a best method of preserving cells for the production

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andre Luis Willerding.pdf: 1072090 bytes, checksum: 40252d9eb53ef8726b984868bb04a34a (MD5) Previous issue date: 2007-09-28 / The biotechnology industries look for new products or in the improvement of the already existent processes with the use of the genetic available resources. The recent advancements in areas as metabolic roads and directed evolution of the protein, they indicate an exchange of the paradigm of the traditional biology to biotechnology. This work presents a selection of bacteria producer of lipase, with the objective to apply the enzyme in the Buriti oil hydrolysis. Of 440 activated bacteria, 181 isolated ones were effectively tested in medium inductors. Of this total, 75 isolated ones (41 %) showed lipase production. The enzymatic activity were tested in different temperatures (30º, 35º, 40º, 45ºC), with the enzymatic activity lessening with the increase of the temperature. To 30ºC had to peak of enzymatic activity. After 72 hours of cultivation in Petri dishes containing olive oil as substrate, the enzymatic index was valued through the relation beTween the diameter of the halo around the colony and the diameter of the colony. The isolated they were classified in different categories according to the enzymatic activity. Of isolated tested, twenty four were selected for the quantitative lipase tests and also for the affinity tests to Buriti oil in Petri dishes. After, it was possible to select six streams (INPA P-106; INPA P-108; INPA P-124; INPA P-798; INPA P-803 and INPA P-799). There were no significant differences beTween the six bacterias and they all were selected for the tests of enzymatic hydrolysis of the Buriti oil. The enzymatic hydrolysis was analysed by Response Surface Methodology. The selected bacterium (INPA P-798) presented the biggest affinity regarding the Buriti oil when were compared with others five bacterias. The profit of the hydrolysis with the precipitate enzyme (33,84 % fat acid free ) was superior to that of the purified lipase and crude extract results. The optimal activity were beTween 6,0 and 8,5 pH values above 3 hours. The extracellular lipase was purified by Sephadex G-25 gel and his kinetic analysis it presented the best activity 55ºC and pH 8,5. The lipolytic enzyme was promoted by CaCl2 and ZnSO4 that increase of the activity in 22 % and 18 %, respectively. The activity was inhibited by MgSO4 in 13%. The specific activity of the lipase purified was Vmax = 12500 μM p-NP.mL-1 e Km = 1,125 μM p-NP.min-1. The selected bacteria is a Burkholderia cepacia, a classic producer of lipase. / As indústrias biotecnológicas vêm buscando novos produtos ou realizando mehorias dos processos já existentes a partir dos recursos genéticos disponíveis. Os avanços recentes em áreas como biossíntese, rotas metabólicas e evolução dirigida de proteínas, indicam uma troca de paradigma da biologia tradicional para a biotecnológica. Esse trabalho apresenta uma seleção de bactérias produtoras de lipase visando a aplicação na hidrólise de óleo de buriti. De 440 isolados bacterianos testados, 181 foram selecionados para os testes qualitativos em placas de Petri. Desses, 75 isolados (41%) foram lipase positivos. A atividade enzimática foi analisada em diferentes temperaturas (30o, 35o, 40o e 45oC). Após 72 horas de cultivo em meio de cultura indutor contendo óleo de oliva como substrato, os índices enzimáticos foram avaliados através da relação entre o diâmetro do halo ao redor da colônia e o diâmetro da colônia. Aos 30oC houve a maior atividade enzimática, servindo assim como temperatura chave para a seleção. Os isolados foram classificados em diferentes categorias conforme a atividade enzimática e comparados com uma estirpe padrão. Assim, vinte e quatro foram selecionados para os testes quantitativos. Desses, foi possível selecionar seis isolados bacterianos (INPA P-106; INPA P-108; INPA P-124; INPA P-798; INPA P-803 e INPA P-799). Não houve diferenças significativas entre esses seis e todos foram selecionados para os testes de hidrólise enzimática do óleo de buriti. A bactéria selecionada (INPA P-798) apresentou a melhor afinidade ao óleo de buriti e o seu rendimento com a enzima precipitada (em % de ácidos graxos liberados) foi superior ao da sua lipase purificada e do seu extrato bruto. A enzima purificada apresentou atividade ótima a 55ºC e em pH 8,5. O CaCl2 e ZnSO4 promoveram o aumento da atividade em 22% e 18%, respectivamente, e o MgSO4 reduziu a atividade em 13%. Nos ensaios com diferentes concentrações de substrato, a enzima obteve um valor de Vmax = 12500 μM p-NP.mL-1 e Km = 1,125 μM p- NP.min-1. Das seis bactérias selecionadas, quatro pertecem ao gênero Burkholderia, uma ao gênero Klebsiella e uma não foi identificada ao nível de espécie. A bactéria selecionada (INPA P-798) pertence à espécie Burkholderia cepacia , uma clássica produtora de lipase.

O presente estudo teve como objetivo avaliar a produção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz empregando células de Candida guilliermondii permeabilizadas com Triton X-100. Para a obtenção do hidrolisado hemicelulósico foram realizadas etapas de pré-tratamento da palha de arroz sob condições previamente otimizadas pelo grupo de pesquisa, incluindo um tratamento alcalino seguido de tratamento com ácido diluído. Inicialmente, foi avaliado o efeito do meio de permeabilização celular (meio semi-definido ou hidrolisado hemicelulósico) sobre a biotransformação de xilose em xilitol empregando hidrolisado hemicelulósico. Numa segunda etapa, foi avaliado o efeito de tampão fosfato de potássio e MgCl2.6H2O sobre o processo de biotransformação empregando hidrolisado não detoxificado e detoxificado com carvão ativado através de um planejamento experimental 22. As condições de biotransformação foram mantidas a 35 °C, pH 6,8, com uma suspensão celular de 10-12 g/L. Neste estudo ficou demonstrado que a biotransformação do hidrolisado empregando células permeabilizadas em meio semi-definido, mostrou uma produtividade volumétrica em xilitol (QP = 1,86 g/L.h) de 34,8 % superior à obtida com células permeabilizadas no próprio hidrolisado (QP = 1,38 g/L.h), enquanto os fatores de conversão de xilose em xilitol foram semelhantes (~0,57 g/g) independente do meio de permeabilização. Foi observado que a adição de tampão fosfato de potássio e/ou MgCl2.6H2O ao hidrolisado hemicelulósico (não detoxificado e detoxificado) não promoveu qualquer efeito sobre a biotransformação de xilose em xilitol, obtendo-se em média uma produtividade volumétrica de 2,0 g/L.h e um fator de conversão de 0,57 g/g. O impacto da permeabilização celular com Triton X-100 sobre a biotransformação de xilose em xilitol empregando hidrolisado hemicelulósico não detoxificado e sem qualquer adição de sais foi de um aumento de 40 % na produtividade volumétrica e de 32 % no fator de conversão de xilose em xilitol. As células permeabilizadas com Triton X-100 também mostraram elevada estabilidade. Os valores de produtividade volumétrica e fator de conversão de xilose em xilitol foram mantidos em 4 ciclos de 15 horas cada em bateladas repetidas, os quais apresentaram em média 1,93 g/L.h e 0,59 g/g, respectivamente. Estes resultados mostram que a permeabilização celular é uma potencial estratégia para a biotransformação de xilose em xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz, pois além de aumentar os parâmetros da biotransformação, não promoveu queda da viabilidade celular e permitiu o reuso das células. / The present study aimed to evaluate the production of xylitol from hemicellulosic rice straw hydrolyzate using Candida guilliermondii cells permeabilized with Triton X-100. To obtain the hemicellulosic hydrolyzate, pre-treatment steps were performed on rice straw under conditions previously optimized by the research group, including an alkaline treatment followed by diluted acid treatment. Initially, the effect of the cellular permeabilization medium (semi-defined medium or hemicellulosic hydrolyzate) on the biotransformation of xylose in xylitol using a hemicellulosic hydrolyzate was evaluated. In a second step, the effect of potassium phosphate buffer and MgCl2.6H2O on the biotransformation process was evaluated using non-detoxified hydrolyzate and detoxified with activated charcoal through an experimental design 22. The biotransformation conditions were maintained at 35 °C, pH 6,8, with a cell suspension of 10-12 g/L. In this study, it was demonstrated that in the biotransformation of xylitol in xylitol by cells permeabilized in semi-defined medium using hemicellulosic hydrolyzate, the volumetric productivity in xylitol (QP = 1,86 g/L.h) was 34,8% higher than that obtained with cells permeabilized in hydroxylate (QP = 1,38 g/L.h), while xylose conversion factors in xylitol were similar (~ 0,57 g/g) independent of the permeabilization medium. It was observed that the addition of potassium phosphate buffer and / or MgCl2.6H2O to the hemicellulosic (non-detoxified and detoxified) hydrolyzate did not have any effect on the biotransformation of xylitol into xylitol, obtaining, on average, a volumetric productivity of 2,0 g/L.h and a conversion factor of 0,57 g/g. The impact of cell permeabilization with Triton X-100 on xylose biotransformation in xylitol using non-detoxified hemicellulosic hydrolyzate and without any addition of salts was a 40% increase in volumetric productivity and 32% in xylose conversion factor in xylitol. Cells permeabilized with Triton X-100 also showed high stability. The values of volumetric productivity and conversion factor of xylose in xylitol were maintained in 4 cycles of 15 hours each in repeated batch, which presented, on average, 1,93 g/L.h and 0,59 g/g, respectively. These results show that cellular permeabilization is a potential strategy for the biotransformation of xylitol in xylitol from hemicellulosic rice straw hydrolyzate, since in addition to increasing the parameters of biotransformation, it did not promote a decrease in cell viability and allowed reuse of the cells.

O uso de fungos na biotransformação estereosseletiva de fármacos pode constituirse em uma excelente alternativa à síntese assimétrica para obtenção de metabólitos, bem como aos estudos de biotransformação in vivo e in vitro convencionais. Neste trabalho foram empregados fungos isolados de órgãos internos de plantas, classificados como endofíticos, fungos fitopatógenos, bem como, fungos adquiridos de coleções de micro-organismos. Esses fungos foram empregados no estudo da biotransformação estereosseletiva dos fármacos midodrina, bufuralol e donepezila. Estes fármacos foram selecionados por produzirem metabólitos ativos nos processos de biotransformação em humanos. Para o monitoramento da formação dos metabólitos dos fármacos foi necessário desenvolver e validar métodos analíticos com características adequadas para essa aplicação. Para determinação enantiosseletiva da midodrina e seu metabólito empregou-se a eletroforese capilar, enquanto que para a determinação aquiral empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência. Para avaliar a biotransformação estereosseletiva do bufuralol e donepezila foram desenvolvidos métodos empregando a cromatografia líquida de alta eficiência. Os dados referentes ao estudo de cada fármaco são apresentados em quatro capítulos. O primeiro capítulo apresenta os resultados obtidos no desenvolvimento de um método empregando a eletroforese capilar para a determinação enantiosseletiva de midodrina e seu metabólito desglimidodrina (DMAE) em meio de cultura Czapek. As análises foram realizadas em capilar de sílica de 50 ?m de diâmetro interno e com comprimento efetivo de 40 cm, utilizando 30 mmol L-1 de trimetil- -ciclodextrina dissolvida em solução de acetato de sódio 70 mmol L-1, pH 5, como tampão de análise. A técnica de preparação das amostras empregada foi a extração líquidolíquido. O método foi validado, mostrando linearidade na faixa de concentração de 100 - 12000 ng mL-1, com coeficientes de correlação linear 0.9975. Os resultados de precisão e exatidão foram inferiores a 15% e a robustez do método foi avaliada através de um planejamento fatorial fracionário. O método foi aplicado em um estudo de biotransformação usando fungos endofíticos. Foram avaliados oito fungos com destaque para o fungo Papulaspora immersa Hotson (SS13) que biotransformou 21,3% da (+)-midodrina em (+)-DMAE e 2,4% da (-)-midodrina em (-)-DMAE, em 72 h de biotransformação, apresentando um excesso enantiomérico de 79,7%. O segundo capítulo apresenta os resultados obtidos no desenvolvimento de um método cromatográfico para a determinação de midodrina e DMAE em meio de cultura Czapek-Dox. As análises foram realizadas no modo reverso de eluição empregando uma coluna Lichrospher 100 RP 18 e fase móvel composta por acetonitrila:ácido fórmico 40 mmol L-1 (60:40, v/v), vazão de 1,4 mL min-1 e detecção em 290 nm. O preparo de amostras empregado foi a extração líquido-líquido, usando acetato de etila como solvente extrator. O método foi validado na faixa de concentração de 0,4 a 40 ?g mL-1, com coeficientes de correlação linear superiores ii a 0,9997. Este método foi aplicado em um estudo de biotransformação da midodrina empregando o fungo endofítico Papulaspora immersa e duas linhagens do fitopatógeno Botrytis cinerea (UCA 992 e 2100). Entre os fungos estudados, o Botrytis cinerea 2100, em condição de agitação, apresentou o maior percentual de biotransformação da midodrina em DMAE (42,2% em 48 h). Além disso, nos cromatogramas referentes a biotransformação em condição estática, pelos fungos Papulaspora immersa e Botrytis cinerea 2100, foi observada a presença de picos adicionais não observados nos controles realizados. Estes fungos foram submetidos à biotransformação em escala ampliada, em condição estática, a partir das quais foram isolados DMAE de ambos os fungos e um derivado desaminado da midodrina (Botrytis cinerea 2100). No terceiro capítulo são apresentados os resultados obtidos com o desenvolvimento de um método para a determinação estereosseletiva do bufuralol e seus metabólitos 1'-oxobufuralol e 1'-hidroxibufuralol em meio Czapek, usando a coluna Chiralcel OD-H no modo normal de eluição. As demais condições cromatográficas empregadas foram: fase móvel constituída por hexano:isopropanol:metanol (97,5:2,0:0,5; v/v/v) acrescidos de 0,5% de dietilamina, vazão 1,5 mL min-1 e detecção no UV em 248 e 273 nm. A microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca em três fases foi usada como procedimento de preparação das amostras. As condições empregadas na extração foram: fase doadora em pH 13 ajustado com NaOH 2 mol L-1, n-octanol como solvente orgânico, fase aceptora constituída por ácido acético 0,2 mol L-1, tempo de extração de 30 min e velocidade de agitação de 1750 rpm. Os valores de recuperação do método ficaram na faixa de 50 - 69%. O método foi aplicado em um estudo piloto de biotransformação com cinco espécies de fungos endofíticos. Nenhum dos fungos estudados biotransformou o bufuralol em 1'-oxobufuralol e/ou 1'-hidroxibufuralol e, devido a isso, o método desenvolvido não foi validado. O quarto capítulo mostra os resultados obtidos com o desenvolvimento de um método empregando a cromatografia líquida de alta eficiência na determinação enantiosseletiva da donepezila, 5-O-desmetil donepezila e 6-O-desmetil donepezila em meio de cultura Czapek. As análises foram realizadas na coluna Chiralpak AD-H no modo normal de eluição. As demais condições cromatográficas empregadas foram: fase móvel constituída por hexano:etanol:metanol (75:20:5, v/v/v) acrescido de 0,3% de trietilamina, vazão 1,5 mL min-1 e detecção no UV em 270 nm. A técnica de preparação das amostras foi a extração líquido-líquido e o solvente extrator foi o acetato de etila. O método descrito foi validado, mostrando linearidade na faixa de concentração de 100 - 10000 ng mL-1 para os enantiômeros da donepezila (r 0,9985) e 100 - 5000 ng mL-1 para os enantiômeros da 5-O-desmetil donepezila e 6- O-desmetil donepezila (r 0,9951). Os valores de recuperação foram superiores a 90% para todos os analitos. O método foi aplicado em um estudo de biotransformação usando fungos. Foram avaliados cinco fungos endofíticos e os fungos Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Beauveria bassiana ATCC 7159. Os fungos endofíticos não desmetilaram a donepezila nas condições estudadas, entretanto, esta reação foi catalisada pelo fungo B. bassiana que biotransformou predominantemente 8,3% da donepezila em (-)-(R)-5-O-desmetil donepezila (ee, 60,6%), enquanto que o fungo C. elegans apresentou biotransformação enantiosseletiva da donepezila em (-)-(R)-6-O-desmetil donepezila (ee, 100%) com um rendimento de 15,1%. Os dados aqui apresentados demonstram que biotransformações com fungos são uma importante alternativa para mimetizar a biotransformação em mamíferos e para a obtenção de metabólitos de fármacos, especialmente na forma de enantiômeros puros. / Drug biotransformations using fungi are considered an alternative approach to the asymmetric synthesis and conventional in vivo and in vitro metabolism studies. In this work, endophytic fungi isolated from health internal plant organs, phythophatogenic fungi and fungi purchased from ATCC were used to study the stereoselective biotransformation of midodrine, bufuralol and donepezil drugs. These drugs were selected because the biotrasformation process in humans results in active metabolites. To evaluate the metabolite formation during the biotransformation study, suitable analytical methods were required. The midodrine biotransformation was evaluated under chiral and achiral conditions. For the enantiosselective determination of midodrine, a capillary electrophoresis method was used, whereas the achiral determination of this drug and its metabolite was carried out by liquid chromatography. The determination of the other drugs was performed by chiral liquid chromatography.The results of each studied drug are presented in four chapters. In the first chapter, a capillary electrophoresis method was described for the stereoselective determination of midodrine and desglymidodrine (DMAE) in Czapek culture medium to be applied to a stereoselective biotransformation study employing endophytic fungi. The electrophoretic analyses were performed using an uncoated fused-silica capillary and 70 mmol L-1 sodium acetate buffer solution (pH 5.0) containing 30 mmol L-1 heptakis (2, 3, 6-tri-O-methyl)--CD as running electrolyte. The applied voltage and temperature used were 15 kV and 15°C, respectively. The UV detector was set at 200 nm. The sample preparation was carried out by liquid- liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 100 -12000 ng mL-1 for each enantiomer of midodrine and DMAE (r 0.9975). Within-day and between-day precision and accuracy evaluated by RSDs and relative errors, respectively, were lower than 15% for all analytes. The method proved to be robust by a fractional factorial design evaluation. The validated method was used to assess the midodrine biotransformation to DMAE by eight endophytic fungi. The fungus Papulaspora immersa (SS13) showed the best biotransformation results. It biotransformed 21.3% of (+)-midodrine to (+)-DMAE and 2.4% of (-)-midodrine to (-)-DMAE, after 72 hours. The observed enantiomeric excess was 79.7%. The second chapter describes the optimization and validation of a method for the determination of midodrine and DMAE in Czapek-Dox culture medium. The analyses were carried out under reverse elution mode using a Lichrospher 100 RP 18 column and acetonitrile: formic acid solution 40 mmol L-1 (60:40, v/v), as mobile phase, at a flow rate of 1.4 mL min-1 and UV detection at 290 nm. The sample preparation was carried out by liquid-liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 0.4 - 40 ?g mL-1 for each analyte (r 0.9997). This method was applied to evaluate the biotransformation of midodrine by the endophyte Papulaspora immersa and two Botrytis cinerea strains (UCA 992 and 2100). Among the studied fungi, Botrytis v cinerea 2100, at shaken condition, showed the higher percentual of DMAE formation (42.2%, at 48 hours). Moreover, the chromatograms obtained for the biotransformation under static condition, showed additional peaks not detected at performed controls, for both Papulaspora immersa and Botrytis cinerea 2100. Further biotransformation experiments were carried out at large scale on static condition. In addition to DMAE, a deaminated midodrine derivative was isolated from Botrytis cinerea 2100. In the third chapter, a three-phase hollow-fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME) method was used for the sample preparation of bufuralol and its metabolites 1'-oxobufuralol and 1'- hydroxybufuralol in Czapek culture medium. The analysis was carried out by chiral liquid chromatography using a Chiralcel OD-H column with hexane: isopropanol:methanol (97.5:2.0:0.5, v/v/v) plus 0.5% diethylamine as the mobile phase, and UV detection at 248 and 273 nm. The HF-LPME optimized conditions involved the use of n-octanol as the organic solvent, 0.2 mol L-1 acetic acid as the acceptor phase, donor phase pH adjusted to 13, sample agitation at 1750 rpm and extraction for 30 min. By using this extraction procedure, the recovery rates were in the range of 50-69%. The method was used to assess the biotransformation of bufuralol using five endophytic fungi strains. None of the studied fungi biotransformed bufuralol to 1'-oxobufuralol and / or 1'- hidroxybufuralol and because of this, the method developed was not validated. In the fourth chapter a chiral liquid chromatography method was described for the stereoselective determination of donepezil, 5-O-desmethyl donepezil, and 6-Odesmethyl donepezil in Czapek culture medium to be applied to a stereoselective biotransformation study employing fungi. The analysis was carried out using a Chiralpak AD-H column with hexane:ethanol:methanol (75:20:5, v/v/v) plus 0.3% triethylamine as the mobile phase at a flow rate of 1.5 mL min-1 and UV detection at 270 nm. The sample preparation was carried out by liquid-liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 100 -10000 ng mL-1 for each enantiomer of donepezil (r 0.9985) and of 100 - 5000 ng mL-1 for each enantiomer of 5-O-desmethyl donepezil and 6-Odesmethyl donepezil (r 0.9951). Within-day and between-day precision and accuracy evaluated by RSDs and relative errors, respectively, were lower than 15% for all analytes. The recoveries were higher that 90% for all analytes. The validated method was used to assess the donepezil biotransformation by five endophytes and by Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Beauveria bassiana ATCC 7159 fungi. The endophytic fungi do not demethylate donepezil at the studied conditions. On the other hand, Beauveria bassiana ATCC 7159 biotransformed 8.3% of donepezil to (-)- (R)-5-O-desmethyl donepezil (ee, 60.6%), while Cunninghamella elegans ATCC 10028B biotransformed 15.1% of donepezil to (-)-(R)-6-O-desmethyl donepezil (ee, 100%). The data presented here show that the biotransformations with fungi are an important alternative to mimetize biotransformations in mammals and to obtain drug metabolites, especially as pure enantiomers.

As aflatoxinas são compostos carcinogênicos produzidos por fungos do gênero Aspergillus, que contaminam alimentos antes e após o processamento, causando riscos à saúde humana e perdas econômicas na produção animal. A exposição à aflatoxina B1 (AFB1), principal metabólito com maior toxicidade produzido pelo fungo, ocorre predominantemente através da ingestão de alimentos contaminados, sobretudo milho, amendoim e derivados. Após absorção e biotransformação da AFB1 por enzimas hepáticas microssomais, a toxina biotransformada liga-se com macromoléculas originando adutos tais como AFB1-lisina. A AFB1-lisina indica a dose interna de AFB1 que foi efetivamente absorvida através de alimentos contaminados. Os objetivos deste estudo foram determinar a concentração dos níveis séricos de AFB1-lisina em frangos de corte e suínos, e verificar a correlação entre os parâmetros bioquímicos séricos (aspartato aminotransferase [AST] e gama glutamiltransferase [GGT], proteína total [PT], albumina [Alb] e globulina [Glob]) e a concentração de AFB1-lisina em soro dos referidos animais. Para isto, foram realizados dois experimentos independentes, sendo um com frangos de corte (N = 40) subdivididos em dois grupos iguais (ração controle e ração contendo 222,17 µg/kg AFB1) alimentados com as dietas experimentais durante 14 dias, e outro com suínos (N = 20) alimentados com ração normal utilizada rotineiramente em um Campus universitário, sem qualquer intervenção. As rações foram analisadas quanto à presença de aflatoxinas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), enquanto que a AFB1-lisina no soro foi determinada através de CLAE acoplada a espectrômetro de massas (EM/EM). A AFB1 no nível testado não causou sinais visíveis de intoxicação. Os níveis das enzimas séricas (AST e GGT), PT e Glob não apresentaram diferenças (p>0,05) entre os tratamentos, nem entre os dias, exceto no 42º dia, quando GGT foi menor (p<0,05) que nos dias 28 e 35. Os valores de Alb foram menores (p<0,05) no tratamento com AFB1 aos 42 dias. A AFB1-lisina foi detectada no soro de todos os frangos do tratamento com AFB1, em níveis de 56.52 a 77.83 ng/mg Alb nos dias 35 e 42 de idade, respectivamente. Esses valores indicam a dose interna de AFB1 nas aves, a qual se correlacionou negativamente (p<0,05) com os níveis de PT, Alb e Glob. No experimento com suínos, a dieta apresentou níveis não detectáveis ou muito baixos de AFB1; portanto, a AFB1-lisina não foi detectada nas amostras de soro dos suínos. Os dados indicam que a AFB1-lisina apresenta potencial como biomarcador específico e sensível para a avaliação da exposição de aflatoxinas na dieta, bem como para fins de diagnósticos. / Aflatoxins are carcinogenic compounds produced by fungi of the genus Aspergillus that contaminate food before and after processing, resulting in risks to human health and economic losses in animal production. Exposure to aflatoxin B1 (AFB1), the main metabolite with greater toxicity produced by the fungus, occurs predominantly through ingestion of contaminated food, especially mayze, groundnuts and derivatives. After absorption and biotransformation of AFB1 by hepatic microsomal enzymes, the biotransformed toxin binds to macromolecules thus originating adducts such as AFB1-lysine. The AFB1-lysine adduct indicates the internal AFB1 dose that was actually absorbed through contaminated food. The objectives of this study were to determine the serum AFB1-lysine levels in broiler chicks and pigs, and check the correlation between the serum biochemistry parameters (aspartate aminotransferase [AST] e gamma-glutamyl transferase [GGT], total proteína [TP], albumin [Alb] and globulin [Glob]) and the concentration of AFB1-lysine in the serum of those animals. To this end, two independent experiments were conducted, one with broiler chicks (N = 40) subdivided into two equal groups (control feed, and feed containing 222,17 µg/kg AFB1) fed the experimental diets during 14 days, and the other with pigs (N = 20) fed normal diets routinely prepared in an University Campus, without any intervention. Feeds were analyzed for afltaoxins by high performance liquid chromatography (HPLC), while serum AFB1-lysin was determined by HPLC coupled to mass spectrometry (MS/MS). AFB1 at the level tested did not cause any sign of intoxication. The levels of serum enzymes (AST and GGT), TP and Glob did not show any difference (p>0.05) between treatments, or at different days, except for GGT on the 42nd day, which as lower (p<0.05) than concentrations on days 28 and 35. AFB1-lysine levels were detected in serum of all broilers fed the AFB1-contaminated diet, at mean levels of 56.52 to 77.83 ng/mg Alb on days 35 and 42 of age, respectively. These values indicated the internal dose of AFB1 in the birds, which negatively correlated (p<0.05) with the TP, Alb and Glob levels. In the experiment with pigs, non detectable or very low levels of AFB1 were found in the diets; therefore no AFB1-lysin was detected in the pig serum samples. Data indicated that AFB1-lysine shows the potential to be a sensitive and specific biomarker for the evaluation of broiler exposure to dietary aflatoxin, as well as for use in diagnostic purposes.

A zopiclona (ZO) é um fármaco quiral extensivamente metabolizado em N-desmetilzopiclona (N-Des) e zopiclona-N-óxido (N-Ox). A (S)-N-Des apresenta atividade ansiolítica, o que indica que este metabólito possui potencial para ser empregado no tratamento da ansiedade. Uma alternativa para obtenção deste metabólito pode ser a biotransformação empregando fungos como agentes catalisadores. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial de fungos em realizar o metabolismo da ZO em seu metabólito N-Des assim como verificar a enantiosseletividade desse processo. A análise da ZO e seus metabólitos em meio de cultura líquido proveniente do estudo de biotransformação foi realizada por eletroforese capilar (CE) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) foi empregada como técnica de preparo de amostras. As análises por CE foram realizadas empregando uma solução tampão fosfato de sódio 50 mmol L-1 pH 2,5 acrescido de 0,5% (m/v) de carboximetil--cilcodextrina com tensão constante de +25 kV e temperatura do capilar de 20ºC. A condição estabelecida para extração por DLLME foi: 2 mL de meio de cultura líquido Czapek, 2 mL de solução tampão tris-HCl 0,1 mol L-1 pH 9,5, clorofórmio (100 µL) e metanol (300 µL) como solventes extrator e dispersor, respectivamente. Anterior aos estudos de biotransformação, o método foi validado seguindo as exigências do EMA e ANVISA para análise de fármacos em matrizes biológicas. O método foi linear no intervalo de concentração de 90-6000 ng mL-1 para cada enantiômero da ZO (r > 0,999) e 50-1000 ng mL-1 para cada enantiômero da N-Des (r > 0,998); a recuperação absoluta média foi de 52% para N-Des e 83% para ZO. Os demais parâmetros, como precisão, exatidão, seletividade e estabilidade apresentaram-se dentro das normas exigidas. O estudo de biotransformação foi realizado com os fungos Penicillium crustosum, Aspergillus fumigatus, Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason, Fusarium oxysporum, Mucor rouxii, Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Cunninghamella echinulata var elegans ATCC 8688A. Entre esses fungos avaliados, os fungos Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Cunninghamella echinulata var elegans ATCC 8688A foram capazes de biotransformar a ZO para seu metabólito ativo N-Des. Utilizando o fungo Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A, após 360 horas de incubação foi obtida uma concentração máxima de (-)-(R)-N-Des e (+)-(S)-N-Des de 508 ng mL-1 e 221 ng mL-1, respectivamente com excesso enantiomérico de 39%. O fungo Cunninghamella elegans ATCC 10028B formou preferencialmente o metabolito (+)-(S)-N-Des. Após 240 horas de incubação, a concentração dos metabólitos (-)-(R)-N-Des e (+)-(S)-N-Des foi 120 ng mL-1 e 228 ng mL-1, respectivamente com excesso enantiomérico de 35%. / Zopiclone (ZO) is a chiral drug extensively metabolized into N-desmethylzopiclone (N-Des) and zopiclone-N-oxide (N-Ox). Pharmacological studies showed that the metabolite (S)-N-Des presents anxiolytic activity, which indicates that this metabolite has a potential to be used in the treatment of anxiety. An alternative way for obtaining this metabolite may be the biotransformation employing fungi as catalytic agent. Therefore, the aim of this study was to evaluate if fungi are able to biotransform ZO into its active metabolite N-Des and to verify if this process is enantioselective. To perform ZO and its metabolites analysis from liquid culture medium, an enantioselective method by capillary electrophoresis (CE) and dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) was developed. The CE analyses were carried out in 50 mmol L-1 sodium phosphate buffer pH 2.5 containing 0.5% (w/v) carboxymethyl--CD with a constant voltage of +25 kV and capillary temperature of 20ºC. The extraction conditions established for DLLME were: 2 mL of sample (pH adjusted using 2 mL of 0.1 mol L-1 tris-HCl buffer pH 9.5), chloroform (100 µL) and methanol (300 µL) as extraction and disperser solvent, respectively. Before the biotransformation study, the method was validated according to EMA and ANVISA guidelines for analysis of drug and metabolites in biological matrices. The method was linear over a concentration range of 90-6000 ng mL-1 for each ZO enantiomer (r > 0.999) and 50-1000 ng mL-1 for each N-Des enantiomer (r > 0.998); the absolute recovery was 52% for N-Des and 83% for ZO. Other parameters, such as: accuracy, precision, selectivity and stability were all in agreement with guideline. The developed method was employed in biotransformation studies using the following fungi: Penicillium crustosum, Aspergillus fumigatus, Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason, Fusarium oxysporum, Mucor rouxii, Cunninghamella elegans ATCC 10028B and Cunninghamella echinulata var elegans ATCC 8688A. Among all evaluated fungi, Cunninghamella elegans ATCC 10028B and Cunninghamella echinulata var elegans ATCC 8688A were able to biotransform the ZO to its active metabolite N-Des. Using the fungus Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A, after 360 hours of incubation it was obtained a maximum concentration of (-)-(R)-N-Des and (+)-(S)-N-Des of 508 ng mL-1 and 221 ng mL-1, respectively with an enantiomeric excess of 39%. The fungus Cunninghamella elegans ATCC 10028B formed preferentially the metabolite (+)-(S)-N-Des. After 240 hours of incubation, the concentration of metabolites (-)-(R)-N-Des and (+)-(S)-N-Des was 120 ng mL-1 and 228 ng mL-1, respectively with enantiomeric excess of 35%.

Copaifera langsdorffii Desf. é conhecida popularmente como \"copaíba\", sendo encontrada nas regiões norte e nordeste do Brasil. Nesta tese reportam-se o estudo fitoquímico das folhas de C. langsdorffii, por meio do fracionamento de seu extrato hidroalcoólico, o isolamento e a purificação de seus metabólitos secundários majoritários, a biotransformação do epóxido do ácido caurenóico, bem como a avaliação das atividades analgésica e anti-inflamatória do extrato e compostos isolados. Para avaliação do perfil cromatográfico, o extrato hidroalcoólico das folhas (Cop) foi particionado em hexano, diclorometano, acetato de etila, n-butanol e água. Com o uso de filtração em gel, Cromatografia Contra Corrente e CLAE preparativa foram isolados os compostos quercetina-3-O-?-L-ramnopiranosídeo (quercitrina), canferol-3-O-?-L-ramnopiranosídeo (afzelina), bem como os ácidos 4\',4\'\'-dimetóxi-4,5-di-O-galoilquínico e 4-(4\'\'-metóxi galoil)-3,5-di-O-galoilquínico. O ácido caurenóico e o caurenol foram isolados em coluna de gel de sílica a partir da fração em acetato de etila. O ácido caurenóico foi submetido a epoxidação com ácido 3-cloroperbenzóico e foi submetido à biotransformação pelo fungo Beauveria sulfurenscens em meio sintético. A biotransformação do epóxido do ácido caurenóico forneceu o ácido 7?,17-diidroxi-ent-caur-15-en-19-oico, até então desconhecido, bem como o ácido 7?,17-diidroxi-16?-ent-cauran-19-oico, o ácido 7?,17-diidroxi-16?-ent-cauran-19-oico, o ácido 9?,16?,17-triidroxi-ent-cauran-19-oico e o ácido 16?,17-diidroxi-ent-cauran-19-óico. Cop e caurenol reduziram a inflamação induzida por ácido acético com máxima inibição de 40,3 e 53,6%, respectivamente. Na segunda fase do ensaio de formalina foi observada redução de 54,5 e 64,6%, respectivamente. A resposta inflamatória observada por carragenina e dextrana mostrou máxima redução de 52,3 e 43,6% para Cop e de 64,3 e 80% para caurenol, respectivamente. Cop e caurenol reduziram a produção de NO estimulada por LPS e aumentaram a liberação de TNF-?, mas não modularam a expressão de IL-6 e IL-10. Portanto, caurenol está envolvido na atividade antiedematogênica do extrato. Já a quercitrina e a afzelina não foram ativas nos protocolos utilizados. Cop e caurenol não alteraram a primeira fase do ensaio de formalina, a latência em placa quente, o desempenho motor dos animais e a migração celular. Concluiu-se que Cop e caurenol possuem atividade antiedematogênica atuando em sítios periféricos, contudo essa propriedade não está associada com a regulação da migração celular, TNF-?, IL-6 e IL-10. / Copaifera langsdorffii Desf., known as \"copaiba\", is found in the northern and northeastern of Brazil. This thesis reports the phytochemical study of C. langsdorffii leaves, through its hydroalcoholic extract (Cop) fractionation, isolation and purification of its major secondary metabolites, the biotransformation of kaurenoic acid epoxide, as well the evaluation of the analgesic and anti-inflammatory activities of the extract and isolated compounds. For the evaluation of the chromatographic profile, the extract was partitioned into hexane, dichloromethane, ethyl acetate, n-butanol and water fractions. With the use of gel filtration chromatography, counter current chromatography and preparative HPLC, quercetin-3-O-?-L-rhamnopyranoside (quercitrin), kaempferol-3-O-?-L-rhamnopyranoside (afzelin), 4\'- 4\'\'-dimethoxy-4 ,5-di-O-galloylquinic acid and 4-(4-methoxy galloyl\'\')-3,5-di-O-galloylquinic were isolated. The epoxidation of kaurenoic acid was performed with 3-chloroperbenzoic acid and it was submitted to biotransformation by the fungus Beauveria sulfurenscens in synthetic medium. Biotransformation of kaurenoic acid epoxide furnished the unknown compound 7?,17-dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid and the compounds 7?,17-dihydroxy-16?-ent-kauran-19-oic acid, 7?,17-dihydroxy-16?-ent-kauran-19-oic acid, 9?, 16?,17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid and 16?,17-dihydroxy-19-ent-kauran-oic acid. Cop and kaurenol reduced the inflammation induced by acetic acid in mice with a maximal inhibition of 40.3 and 53.6%, respectively. The second phase in the formalin test in mice showed maximal reduction of 54.5 and 64.6%, respectively. The inflammatory responses induced by both carrageenan and dextran in rats showed maximal reduction of 52.3 and 43.6 % for Cop, as well as 64.3% and 80.0% for kaurenol, respectively. Cop and kaurenol reduced the NO production stimulated by LPS in a dose-dependent manner, and increased the release of TNF-?, but did not regulate IL-6 and IL-10. Therefore, kaurenol is involved in the extract antiedematogenic activity of the extract, whereas quercitrin and afzelin were not active in the used protocols. Cop and kaurenol did not alter the formalin first phase, hot-plate latency, motor performance or cell migration. The obtained results show that C. langsdorffi extract and kaurenol possess antiedematogenic properties acting on peripheral sites, but these properties are not associated with cell migration, TNF-?, IL-6 or IL-10 regulation.

A risperidona (RISP) é um fármaco neuroléptico que após sua administração oral é metabolizado resultando em dois metabólitos quirais, a 7-hidroxirisperidona (7- RispOH) e a 9-hidroxirisperidona (9-RispOH). A 9-RispOH é o metabólito majoritário da risperidona a qual é comercializada na forma de racemato com o nome de paliperidona. Esse projeto teve como finalidade avaliar a capacidade dos fungos endofíticos Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globusum (VR10), Aspergillus fumigatus (VR12), Papulaspora immersa Hotson (SS13), Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason (SS67) e Glomerella cingulata (VA1) e do fungo de solo Mucor rouxii em biotransformar a risperidona em seu metabólito ativo 9-RispOH enantiosseletivamente. Foi objeto de estudo também a otimização do processo de biotransformação através do emprego de diferentes meios de cultura (Czapek, Czapek Dox e Koch`s K1) para o cultivo dos fungos utilizados no estudo. O método escolhido para a separação da risperidona e seus metabólitos quirais foi a eletroforese capilar (CE). As separações eletroforéticas dos analitos foram realizadas empregando um capilar de sílica fundida de 40 cm de comprimento e 75 ?m de diâmetro interno, uma solução tampão fosfato de sódio 100 mmol L-1 pH 3,0 contendo CD-?-sulfatada 2,0% (p/v) e carboximetil-?-CD 0,5% (p/v) como seletores quirais. Todos os experimentos no CE foram realizados no modo reverso aplicando uma tensão de -10kV. As amostras foram injetadas aplicando uma pressão 0,5 psi por 8 s. O capilar e as amostras permaneceram na temperatura de 20oC. Para a extração dos analitos do meio de cultura foi utilizado a microextração em fase líquida empregando membranas cilíndricas ocas (HF-LPME). A técnica de preparação de amostra foi realizada no modo de três fases utilizando uma fibra de polipropileno impregnada com n-octanol e preenchida com uma solução de ácido clorídrico 100 mmol L-1 pH 3,0. A fibra foi mergulhada na amostra tamponada com uma solução de fosfato de potássio dibásico 500 mmol L-1 pH 12,0. O método foi validado de acordo com os parâmetros estabelecidos pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) para análise de fármacos em material biológico avaliando os seguintes parâmetros: seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de quantificação e estabilidade. Todos os parâmetros avaliados ficaram dentro dos limites estabelecidos pela ANVISA. Entre os fungos avaliados, apenas o Mucor rouxii foi capaz de biotransformar a risperidona em seu metabólito ativo e quiral 9-RispOH. Nas condições empregadas a razão enantiomérica foi de 79,6%. / Risperidone (RISP) is a neuroleptic drug which after oral administration is metabolized into two chiral metabolites, 7-hydroxyrisperidone (7-RispOH) and 9- hydroxyrisperidone (9-RispOH). 9-RispOH is the major metabolite and it is commercialized under the generic name paliperidone. The objective of this project was to evaluate the capability of the endophytic fungi Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globusum (VR10), Aspergillus fumigatus (VR12), Papulaspora immersa Hotson (SS13), Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason (SS67) and Glomerella cingulata (VA1) and the soil fungus Mucor rouxii to biotransform risperidone into its chiral and active metabolite 9-RispOH, enantioselectively. In addition, it was also optimized the biotransformation process through the use of different culture medium (Czapek, Czapek Dox and Koch`s K1). The chiral analysis was performed by capillary electrophoresis (CE). The electrophoretic separation of the analytes was accomplished in a silica capillary with 40 cm of length and 75 ?m of internal diameter. The background electrolyte was a sodium phosphate 100 mmol L-1 pH 3.0 plus 2.0% (w/v) sulfated-?-CD and 0.5% (w/v) carboxymethyl-?-CD. All experiment on CE was performed in reverse mode by applying a voltage of -10 KV. The samples were injected hydrodynamically by applying a pressure of 0.5 psi for 8 s. The temperature of analysis was 20oC. For the extraction of the analytes from the culture medium it was employed the hollow fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME). The extraction conditions were: n-octanol as organic solvent and a hydrochloridric acid solution of 100 mm L-1 pH 3.0. The pH of the sample was controlled by the addition of potassium phosphate buffer 500 mmol L-1 pH 12.0. The method was validated according to ANVISA guidelines (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) for the analysis of drugs in biological fluids. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, precision, accuracy, limit of quantification and stability. All parameters were in agreement with the established limits by ANVISA. From all the evaluate fungi only Mucor rouxii was able to biotransform risperidone into its chiral and active metabolite 9-RispOH. In the conditions used in these project the enantiomeric ratio was 79.6%.