But : La perte de l’intégrité de la barrière hémo-encéphalique (BHE) est l’une des caractéristiques principales de la sclérose en plaques. Cette augmentation de la perméabilité est associée à une désorganisation des molécules de jonction serrée et à une augmentation de l’expression de molécules d’adhérence essentielles à l’extravasation des cellules immunitaires. Identifier de nouvelles molécules impliquées dans ce processus est donc crucial pour le développement de nouvelles thérapies contre la sclérose en plaques visant à promouvoir l’intégrité de la BHE et à diminuer la migration des leucocytes dans le système nerveux central (SNC) au cours du processus neuro-inflammatoire. Dans cette étude, le rôle spécifique de la molécule d’adhérence ALCAM, qui est exprimé à la surface des cellules endothéliales de la BHE (CE-BHE) et de certains sous-types de leucocytes, a été évalué. Méthodologie : À l’aide d’une analyse protéomique exhaustive, notre laboratoire a identifié ALCAM comme étant une molécule d’adhérence surexprimée par les CE-BHE mises en culture dans un milieu pro-inflammatoire. Dans le but d’étudier le rôle spécifique d’ALCAM durant la diapédèse leucocytaire, nous avons induit chez des souris de type sauvages et des souris ALCAM déficientes l’encéphalite auto-immune expérimentale (EAE), le modèle animal de la sclérose en plaques. Le rôle d’ALCAM a aussi été étudié à l’aide d’un système d’adhérence sous flux laminaire. Cet appareil, qui imite un capillaire cérébral, permet de suivre en temps réel le mouvement des leucocytes, soumis à une pression physiologique, dans un tube couvert à sa base par des CE-BHE. Résultats : En utilisant ce système d’adhérence, j’ai pu démontrer que des anticorps dirigés contre ALCAM réduisent de façon significative le roulement et l’adhérence de monocytes CD14+ humains à la surface de CE-BHE. Par ailleurs, ces anticorps préviennent de façon marquée la diminution de la vitesse moyenne des cellules au cours de l’expérience. Par le fait même, j’ai aussi observé une réduction significative de l’extravasation des monocytes traités avec de l’anti-ALCAM au travers de CE-BHE dans un modèle statique de migration. Subséquemment, j’ai démontré que ces monocytes migrent plus rapidement et en plus grand nombre au travers d’une barrière constituée de cellules endothéliales méningées à comparer à des CE-BHE. Bien que des observations similaires ont été effectuées en utilisant des lymphocytes T CD4+ humains ex vivo, j’ai été incapable de reproduire ces résultats à l’aide de cellules Th1 et Th17 réactivées in vitro. Par opposition à nos données in vitro, j’ai découvert que les souris déficientes en ALCAM développent une EAE active plus sévère que celle observée chez des souris de type sauvages. Cette EAE est par ailleurs associée à une infiltration périvasculaire de lymphocytes T pro-inflammatoires et de monocytes/macrophages de type M1 plus marqué chez les souris ALCAM déficientes. L’induction d’une EAE par transfert adoptif, dans laquelle des cellules immunitaires de type sauvage réactivées par du MOG sont injectées à des souris déficientes en ALCAM, suggère que la pathophysiologie observée durant l’EAE active serait liée à l’absence d’ALCAM au niveau de la BHE. Une caractérisation de la barrière des souris ALCAM déficientes non immunisées a par la suite révélé une réduction de l’expression de certaines molécules de jonction serrée. Une analyse plus poussée a par ailleurs démontré qu’ALCAM est lié indirectement à des molécules de jonction serrée des CE-BHE, ce qui expliquerait l’augmentation de la perméabilité de celle-ci chez les souris déficientes en ALCAM. Une analyse de la perméabilité intercellulaire de la BHE effectuée in vitro a d’autre part corrélé ces résultats. Conclusion : Collectivement, nos données prouvent qu’ALCAM joue un rôle prépondérant dans la diapédèse des monocytes, mais pas des lymphocytes Th1 et Th17 au travers de la BHE. Par ailleurs, nos résultats suggèrent qu’ALCAM remplit une fonction biologique cruciale favorisant le maintien de l’intégrité de la BHE en agissant comme molécule adaptatrice intermédiaire entre les molécules de jonction serrées et le cytosquelette. De cette façon, l’absence d’ALCAM au niveau des CE-BHE promeut indirectement le recrutement de leucocytes pro-inflammatoires dans le SNC des souris atteintes de l’EAE en augmentant la perméabilité des vaisseaux sanguins de la BHE. / Aim: The loss of blood-brain barrier (BBB) integrity is a hallmark of multiple sclerosis. It is associated with a disorganization of junctional molecules and an upregulation of cell adhesion molecules essential for immune cell transmigration. Identifying novel key players involved in this process is thus crucial for the development of MS therapies aimed at promoting BBB integrity and decreasing leukocytes trafficking into the central nervous system (CNS) during neuroinflammation. In this study, the specific role of the adhesion molecule ALCAM, found on BBB endothelial cells (BBB-ECs) and subsets of leukocytes, was assessed. Methods: We first identified ALCAM as an important molecule upregulated during inflammation in a proteomic screen of in vitro cultured primary human BBB-ECs. In order to study the effects of ALCAM on leukocyte transmigration, both active and passive experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) was induced in ALCAM KO and WT animals. The specific role of ALCAM during leukocyte transmigration was also assessed using a modified adhesion assay under sheer-stress, in which leukocytes flow across a capillary-like channel lined with a monolayer of BBB-ECs under physiological pressure. Results: Using the modified adhesion assay, we demonstrated that anti-ALCAM blocking antibodies significantly reduce the rolling and the adhesion of human CD14+ monocytes interacting with primary human BBB-ECs, as well as prevent their overall decrease in velocity. Concurrently, we also observed a significant reduction in the migration of ex vivo CD14+ monocytes, across a monolayer of human BBB-ECs. These monocytes also migrated more rapidly and in higher number across meningeal endothelial cells, as compared to BBB-ECs. While similar observations were made using ex vivo CD4+ T lymphocytes, we failed to reproduce these results using in vitro activated Th1 and Th17 cells. In opposition to our in vitro data, ALCAM KO mice developed a more severe active EAE associated with a significant increase in perivascular infiltration of pro-inflammatory lymphocytes (Th1/Th17) and M1 monocytes/macrophages, as compared to WT controls. In addition, EAE transfer experiments, in which ALCAM KO mice received WT MOG-reactivated splenocytes, suggested that the pathophysiology observed in active EAE was linked to the absence of ALCAM on BBB-ECs. Phenotypic characterization of un-immunized ALCAM KO mice revealed a reduced expression of BBB junctional proteins. Further analysis showed that ALCAM is indirectly associated with tight junction molecules of the BBB-ECs, which explains the increased CNS parenchymal blood vessel in vivo permeability in ALCAM KO animals. Correlating with these data, primary culture of mouse brain BBB-ECs was shown to possess a lower TEER and an increased permeability coefficient. Conclusion: Collectively, our data provide evidence of the implication of ALCAM in monocyte transmigration, but not Th1 or Th17 lymphocyte diapedesis across CNS endothelium. Our results also point to a biologically crucial function of ALCAM in maintaining BBB integrity by acting as an adaptor molecule between tight junctions and the cytoskeleton. As such, the absence of ALCAM at the level of BBB-ECs indirectly promotes the recruitment of pro-inflammatory leukocytes in the CNS of EAE animals by increasing the BBB vessels permeability.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le système nerveux central (SNC) en contrôlant le passage des substances sanguines et des cellules immunitaires. La BHE est formée de cellules endothéliales liées ensemble par des jonctions serrées et ses fonctions sont maintenues par des astrocytes, celles ci sécrétant un nombre de facteurs essentiels. Une analyse protéomique de radeaux lipidiques de cellules endothéliales de la BHE humaine a identifié la présence de la voie de signalisation Hedgehog (Hh), une voie souvent liées à des processus de développement embryologique ainsi qu’au niveau des tissus adultes. Suite à nos expériences, j’ai déterminé que les astrocytes produisent et secrètent le ligand Sonic Hh (Shh) et que les cellules endothéliales humaines en cultures primaires expriment le récepteur Patched (Ptch)-1, le co-récepteur Smoothened (Smo) et le facteur de transcription Gli-1. De plus, l’activation de la voie Hh augmente l’étanchéité des cellules endothéliales de la BHE in vitro. Le blocage de l’activation de la voie Hh en utilisant l’antagoniste cyclopamine ainsi qu’en utilisant des souris Shh déficientes (-/-) diminue l’expression des protéines de jonctions serrées, claudin-5, occcludin, et ZO-1. La voie de signalisation s’est aussi montrée comme étant immunomodulatoire, puisque l’activation de la voie dans les cellules endothéliales de la BHE diminue l’expression de surface des molécules d’adhésion ICAM-1 et VCAM-1, ainsi que la sécrétion des chimiokines pro-inflammatoires IL-8/CXCL8 et MCP-1/CCL2, créant une diminution de la migration des lymphocytes CD4+ à travers une monocouche de cellules endothéliales de la BHE. Des traitements avec des cytokines pro-inflammatoires TNF-α and IFN-γ in vitro, augmente la production de Shh par les astrocytes ainsi que l’expression de surface de Ptch-1 et de Smo. Dans des lésions actives de la sclérose en plaques (SEP), où la BHE est plus perméable, les astrocytes hypertrophiques augmentent leur expression de Shh. Par contre, les cellules endothéliales de la BHE n’augmentent pas leur expression de Ptch-1 ou Smo, suggérant une dysfonction dans la voie de signalisation Hh. Ces résultats montrent que la voie de signalisation Hh promeut les propriétés de la BHE, et qu’un environnement d’inflammation pourrait potentiellement dérégler la BHE en affectant la voie de signalisation Hh des cellules endothéliales. / The blood-brain barrier (BBB), composed of tightly bound endothelial cells (ECs), regulates the entry of blood-borne molecules and immune cells into the CNS. Recent studies indicate that the Hedgehog (Hh) signaling pathway in adult tissues plays an important role in vascular proliferation, differentiation and tissue repair. Using a lipid membrane raft-based proteomic approach, I have identified the Hedgehog (Hh) pathway as a signaling cascade involved in preserving and upkeeping BBB functions. My study shows that human astrocytes express and secrete Sonic Hh (Shh) and conversely, that human BBB-ECs bear the Hh receptor Patched-1 (Ptch-1), the signal transducer Smoothened (Smo) as well as transcription factors of the Gli family. Furthermore, activation of the Hh pathway in BBB-ECs restricts the passage of soluble tracers in vitro. By blocking the Hh signaling in vitro and by using Shh knock-out (-/-) embryonic mice, I demonstrate a reduced expression of TJ molecules claudin-5, occludin and ZO-1. Hh activation also decreases the surface expression of cell adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1, and decreases BBB-ECs secretion of pro-inflammatory chemokines IL-8/CXCL8 and monocytes chemoattractant protein 1 MCP-1/CCL2, resulting in a reduction of migrating CD4+ lymphocytes across human BBB-EC monolayers. In vitro treatment with inflammatory cytokines TNF-α and IFN-γ, upregulates the production of astrocytic Shh and the BBB-EC surface expression of Ptch-1 and Smo. In active Multiple Sclerosis (MS) lesions, in which the BBB is disrupted, Shh expression is drastically upregulated in hypertrophic astrocytes, while Ptch-1 and Smo expression is down-regulated or left unchanged, suggesting that a deregulation in the Hh signaling pathway may prevent the barrier stabilizing properties of Hh. Our data demonstrate an anti-inflammatory and BBB-promoting effect of astrocyte-secreted Hh and suggest that a pro-inflammatory environment disrupt the BBB by impacting, at least in part, on Hh signaling in brain ECs.

La sclérose en plaques (SEP) est caractérisée par des infiltrations périvasculaires de cellules immunitaires et par de la démyélinisation au sein du système nerveux central (SNC). Ces deux paramètres de la maladie sont associés à la fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). En ce sens, le recrutement des cellules présentatrices d’antigène (CPA) myéloïdes, telles que les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques, dans le SNC à travers la BHE, est une étape cruciale dans l’initiation et la persistance de l’inflammation cérébrale. Nerve injury-induced protein (Ninjurin)-1 est une nouvelle molécule d’adhérence qui médie une interaction de type homophilique et dont l’expression sur l’endothélium vasculaire de la BHE humaine fut identifiée grâce à une analyse protéomique des protéines associées à la BHE. Les résultats présentés dans ce mémoire montrent que l’expression de Ninjurin-1 augmente dans un contexte inflammatoire dans les cultures primaires de cellules endothéliales de la BHE (CE-BHE) et sur les CPA myéloïdes humaines ex vivo et générées in vitro. De plus, les CPA infiltrantes retrouvées dans les lésions cérébrales de patients atteints de SEP et dans le SNC des souris atteintes d’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), le modèle murin de la SEP, expriment de hauts niveaux de Ninjurin-1. À l’aide du modèle in vitro de la BHE, la neutralisation de Ninjurin-1 restreint spécifiquement la migration des monocytes à travers les CE-BHE sans affecter le recrutement des lymphocytes, ni la perméabilité des CE-BHE. Enfin, les souris atteintes d’EAE et traitées avec un peptide bloquant dirigé contre Ninjurin-1 présentent une maladie moins sévère ainsi qu’une diminution des CPA infiltrant le SNC et ce comparé au groupe contrôle. Ces résultats suggèrent que Ninjurin-1 est une molécule d’adhérence de la BHE impliquée dans le recrutement de CPA myéloïdes au sein du SNC et qu’elle peut être considérée comme une cible thérapeutique potentielle en SEP. / Multiple Sclerosis (MS) is characterized by perivascular infiltrations of immune cells and by demyelination in the central nervous system (CNS). These two hallmarks of the disease are associated with the disruption of the blood-brain barrier (BBB). The recruitment of monocytes, macrophages and dendritic cells, the so-called myeloid antigen-presenting cells (APCs), in the CNS through the BBB is thought to play a crucial role in the initiation and the persistence of the disease. Therefore the identification of the molecular mechanisms involved in the migration of myeloid APCs into the CNS is considered a valid therapeutic option in MS. Nerve injury-induced protein (Ninjurin)-1, a novel adhesion molecule that mediates homophilic binding, was found to be expressed in the vascular endothelium of the BBB following a proteomic screen of human BBB-associated proteins. Ninjurin-1’s expression increases during an inflammatory context in primary cultures of endothelial cells of the BBB (BBB-ECs) and on ex vivo and in vitro generated myeloid APCs. In addition, infiltrating APCs in human MS lesions and in the CNS of the murine model of MS, the mice affected with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), express high levels of Ninjurin-1. Using an experimental model of the BBB, the neutralization of Ninjurin-1 specifically restricts the migration of monocytes across the BBB-ECs without affecting the recruitment of lymphocytes or the permeability of the BBB-ECs. Finally, EAE mice treated with a Ninjurin-1 blocking peptide have reduced disease severity and a reduced infiltration of myeloid APCs in the CNS, as compared to the control group. Our results show that Ninjurin-1 is an adhesion molecule of the BBB involved in the recruitment of myeloid APCs to the CNS and is also a potential therapeutic target to dampen CNS inflammatory processes, as occurs in MS.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration périvasculaire de cellules mononucléaires, telles que les lymphocytes T CD4+ et CD8+, les lymphocytes B ainsi que les cellules myéloïdes qui comprend les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs). Ce phénomène d’infiltration est dû à une fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’entrée des cellules immunitaires au SNC va mener à la destruction de la gaine de myéline et donc à l’apparition de plaques de démyélinisation. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que la migration des divers sous-types de cellules immunitaires du sang périphérique à travers la BHE est contrôlée par des mécanismes moléculaires distincts et spécifiques à chaque type cellulaire. Afin de répondre à cette hypothèse, quatre différentes études ont été mises sur pieds. En premier lieu, nous démontrons un effet bénéfique des statines sur la BHE en SEP, en diminuant la migration des lymphocytes T et des monocytes, et en diminuant la diffusion de marqueurs moléculaire soluble. Ce phénomène s’opère via la suppression du processus d’isoprenylation, et en empêchant probablement la contraction des cellules endothéliales de la BHE. De plus, nous démontrons que les monocytes qui migrent au SNC en condition inflammé sont en mesures de se différencier en DCs et d’induire une réponse inflammatoire de la part des lymphocytes T CD4+. La migration des monocytes à travers la BHE est contrôlée par une nouvelle molécule d’adhérence nommée Ninjurin-1. Le blocage de Ninjurin-1 conduit à une inhibition spécifique de la migration des monocytes in vitro, ainsi qu’à une amélioration des signes cliniques du modèle animal de la SEP, soit l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Finalement, nous démontrons que la migration des lymphocytes T CD8+ au SNC s’effectue via l’intégrine alpha-4. De plus, la majorité des lymphocytes T CD8+ que l’on retrouve dans le liquide céphalo-rachidien de patients SEP, dans le SNC de souris EAE ainsi que dans le SNC de souris infectée au virus de l’hépatite murine portent un phénotype effecteur mémoire. Ces données pourraient expliquer l’émergence de leucoencéphalopathie multifocale progressive observée chez certains patients SEP traités au natalizumab, un anticorps dirigé contre l’intégrine alpha-4. En conclusion, notre étude a permis de démontrer l’importance des monocytes provenant de la périphérie dans le processus inflammatoire prenant part au SNC en SEP. L’inhibition d’entrée de ces cellules pourrait s’avérer bénéfique en SEP tout en permettant l’immuno-surveillance du cerveau, ce que l’anti-alpha-4 intégrine ne permet pas. Les statines pourraient s’avérer une autre option intéressante puisqu’elles agissent sur les processus inflammatoires impliqués dans la SEP. / Multiple sclerosis (MS) is an immune-mediated disorder of the central nervous system (CNS) characterized by multifocal areas of leukocyte infiltration and demyelination associated with a breakdown of the blood-brain barrier (BBB). Typically, demyelination is centered around perivascular accumulation of CD4+ and CD8+ T lymphocytes, monocytes, macrophages and dendritic cells (DCs) that arise from migration of peripheral blood immune cells across the CNS microvascular endothelium. We have thus suggested that the migration across the BBB of immune cells subsets from the blood is controlled by molecular mechanism specific for each cell type. To answer this hypothesize, we have performed four different studies. We first show a beneficial effect of statins on the BBB, restricting the migration of lymphocytes and monocytes as well as the diffusion of soluble molecular tracers. This phenomenon is mediated through abrogation of isoprenylation processes that is probably inhibiting the ability of endothelial cells of the BBB to contract. We also show that CD14+ monocytes migrate across the inflamed human blood BBB and differentiate into DCs in response to BBB-secreted TGF-beta and GM-CSF. These DCs then promote the proliferation and expansion of inflammatory CD4+ T lymphocytes. We demonstrate that the migration of monocytes is controlled by a new adhesion molecule called Ninjurin-1. Ninjurin-1 neutralization specifically abrogated the adhesion and migration of human monocytes across endothelial cells of the BBB, without affecting lymphocyte recruitment. Moreover, Ninjurin-1 blockade reduced clinical disease activity and histopathological indices of experimental allergic encephalomyelitis (EAE). Finally we show that migration of CD8+ T lymphocytes across BBB is dependent on alpha-4 integrin. Also, the majority of CD8+ T lymphocytes found in the cerebrospinal fluid of MS patients, and in the CNS of EAE mice as well as the CNS of mouse infected with hepatitis virus are showing an effector memory phenotype. These data could explain the numerous cases of progressive multifocal leukoencephalopathy seen in natalizumab treated MS patients. In conclusion, our study unveils an important role of peripheral monocytes in MS. The inhibition of migration of these cells to the CNS could be a beneficial therapy since it would allow immune surveillance of the brain. The statins could also be a very interesting option since these molecules would reduce the inflammatory processes involved in MS.

L’insuffisance rénale chronique (IRC) affecte 13 % de la population américaine et son incidence ne cesse d’augmenter. Malgré un ajustement des doses de médicaments administrés en fonction du taux de filtration glomérulaire du patient urémique, près de 40 % des patients reçoivent une dose trop élevée en raison de modifications de l’élimination extrarénale des médicaments chez ces patients. Il est connu que l’IRC affecte l’élimination métabolique des médicaments par les cytochromes P450 et les enzymes de biotransformation de phase II. Nous avons aussi démontré, chez le rat, que l’IRC affecte l’expression et l’activité de transporteurs de médicaments intestinaux entraînant une augmentation de la biodisponibilité de certains médicaments. On retrouve des transporteurs de médicaments dans de nombreux organes comme le foie, les reins et la barrière hématoencéphalique (BHE) où ils jouent des rôles importants dans les éliminations biliaire et rénale et la pénétration des médicaments au cerveau. Le but de ce travail était de mesurer, chez des rats néphrectomisés, les impacts de l’IRC sur l’expression protéique et génique et l’activité des transporteurs de médicaments hépatiques, rénaux et cérébraux. Les transporteurs étudiés sont de la famille des transporteurs ABC (P-glycoprotéine, multidrug-resistance related protein, breast cancer resistance protein) ou des solute carriers (organic anion transporter, organic anion transporting protein). Aussi, une étude réalisée chez l’humain visait à évaluer la pharmacocinétique de deux médicaments : la fexofénadine, un médicament majoritairement transporté, et le midazolam, un substrat du cytochrome P450 3A4, chez des sujets dialysés. Nos résultats montrent que, chez le rat, l’IRC entraîne des modulations de l’expression des transporteurs d’influx et d’efflux hépatiques pouvant entraîner des diminutions du métabolisme hépatique et de l’excrétion biliaire des médicaments. Dans le rein, nous avons démontré des modulations de l’expression des transporteurs de médicaments. Nous avons aussi démontré que l’IRC diminue l’élimination urinaire de la rhodamine 123 et favorise l’accumulation intrarénale de médicaments transportés comme la benzylpénicilline et la digoxine. À la BHE, nous avons démontré des diminutions de l’expression des transporteurs de médicaments. Toutefois, nous n’avons pas observé d’accumulation intracérébrale de trois substrats utilisés (digoxine, doxorubicine et vérapamil) et même une diminution de l’accumulation intracérébrale de la benzylpénicilline. Il semble donc que, malgré les modulations de l’expression des différents transporteurs de médicaments, l’intégrité et la fonction de la BHE soient conservées en IRC. Chez l’humain, nous avons démontré une augmentation de la surface sous la courbe de la fexofénadine chez les sujets dialysés, comparativement aux témoins, suggérant une altération des mécanismes de transport des médicaments chez ces patients. Nous n’avons, toutefois, pas observé de modification de la pharmacocinétique du midazolam chez les patients dialysés, suggérant une activité métabolique normale chez ces patients. Un ou des facteurs s’accumulant dans le sérum des sujets urémiques semblent responsables des modulations de l’expression et de l’activité des transporteurs de médicaments observées chez le rat et l’humain. Ces travaux mettent en évidence une nouvelle problématique chez les sujets urémiques. Nous devons maintenant identifier les mécanismes impliqués afin d’éventuellement développer des stratégies pour prévenir la toxicité et la morbidité chez ces patients. / Chronic renal failure (CRF) affects 13% of the American population and its incidence is rising. Despite dose adjustment of drugs administered to CRF patients according to their glomerular filtration rate, nearly 40% of patients receive up to 6,45-times the recommended dose due to modifications in the extra-renal elimination of drugs. It is known that CRF affects the metabolic elimination of drugs via cytochrome P450s and Phase II biotransformation enzymes. Also, we showed modulations in the expression and activity of intestinal drug transporters in CRF rats that could lead to increases in the bioavailability of drugs. Drug transporters are expressed in various organs including the liver, the kidneys and the blood-brain barrier (BBB) where they play important roles in the biliary and renal elimination, and the brain penetration of drugs. The objective of this work was to measure, using a rat model of CRF, the impacts of CRF on the protein and mRNA expression and the activity of liver, kidney and brain drug transporters. We studied ABC transporters (P-glycoprotein, multidrug-resistance related protein, breast cancer resistance protein) and solute carriers (organic anion transporters, organic anion transporting proteins). Also, a study conducted in human aimed to evaluate the pharmacokinetics of two drugs: fexofenadine, a transported drug, and midazolam, a substrate of cytochrome P450 3A4, in dialyzed patients. In rats, our results show modulations in the expression and activity of hepatic influx and efflux drug transporters that could lead to decreases in the hepatic metabolism and biliary excretion of drugs. In the kidney, we demonstrated modulations in the expression of drug transporters in CRF rats. We also demonstrated that CRF causes a reduction of the urinary elimination of rhodamine 123, a P-glycoprotein substrate, and the intra-renal accumulation of at least two transported drugs: benzylpenicillin and digoxin. Finally, we demonstrated decreases in the expression of influx and efflux drug transporters at the BBB of CRF rats. However, these decreases did not correlate with in vivo changes since BBB permeability of benzylpenicillin was decreased in CRF rats while digoxin, doxorubicin and verapamil permeabilities were unchanged. It thus appears that, even with decreased drug transporters, BBB integrity and function is conserved in CRF. In human, we showed an increase in the area under the curve of fexofenadine in dialyzed subjects compared to healthy controls, suggesting alterations of drug transport mechanisms in these patients. However, we observed no modifications in the pharmacokinetics of midazolam in dialyzed patients, suggesting a normal metabolic activity in these patients. Results from in vitro studies suggest that one or many uremic factors accumulating in the serum of uremic rats and patients are responsible for the observed modulations in drug transporter expression and activity observed in rat and human. This work demonstrates the impacts of CRF on the expression and activity of drug transporters and how they could affect drug pharmacokinetics in patients. Now, the mechanisms leading to these modulations need to be identified in order to eventually develop strategies to prevent drug toxicity and morbidity in uremic patients.

La sclérose en plaques est une maladie neuroinflammatoire idiopathique caractérisée par la formation de lésions focales de démyélinisation, qui apparaissent suite à l’infiltration périvasculaire de cellules immunitaires et à l’augmentation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal de cette maladie. Cependant, ce modèle présente des différences importantes avec la sclérose en plaques. L’objectif de ce projet de maîtrise était d’approfondir la caractérisation d’un nouveau modèle transgénique d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale spontanée, le modèle TCR1640, afin de valider celui-ci pour l’étude des phénomènes physiopathologiques qui surviennent à différents stades de la sclérose en plaques, ainsi que pour le développement de nouveaux traitements de la maladie. La souris TCR1640 porte un récepteur des cellules T (TCR) transgénique autoréactif, qui reconnaît un peptide de la myéline et déclenche une réaction auto-immune contre la myéline endogène au sein du système nerveux central (SNC). Des observations faites in situ et in vitro ont permis d’identifier des changements qui surviennent de façon très précoce dans l’unité neurovasculaire chez les animaux TCR1640 présymptomatiques, et qui sont liés à la présence d’un profil immunitaire périphérique proinflammatoire. Lors des phases actives de l’EAE spontanée, les animaux TCR1640 au stade chronique présentent une inflammation accrue du système nerveux central associée à une infiltration leucocytaire massive, par rapport aux animaux au stade aigu de la maladie. Une étude in vivo a également permis de moduler la maladie développée par des animaux ayant subi une immunisation passive avec des cellules T auxiliaires en provenance de souris TCR1640. Enfin, l’implication de nouvelles molécules d’adhésion cellulaire dans le développement et le maintien de l’EAE spontanée a été suggérée par des observations in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que le modèle TCR1640 présente plusieurs avantages pour l’étude de la physiopathologie de maladies neuroinflammatoires telles que la sclérose en plaques, et servira d’outil afin de valider de nouvelles stratégies thérapeutiques. / Multiple sclerosis is an idiopathic inflammatory disease of the central nervous system. It is characterized by the formation of focal perivascular lesions and demyelination of the surrounding area, which appear concomitantly to a massive immune cell infiltration and disruption of the blood brain barrier. Experimental autoimmune encephalomyelitis is the animal model most extensively used for the study of multiple sclerosis. Unfortunately, this model does not mimic many aspects of the human disease. The goal of this project is to further the characterization of a new transgenic model of spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis, the TCR1640 model, and to validate it as a relevant tool for the study of multiple sclerosis physiopathology and treatment. The TCR1640 mouse possesses a transgenic T cell receptor which recognizes a myelin peptide and triggers an autoimmune response against endogenous myelin in the central nervous system. In situ and in vitro observations have led to the identification of early changes which appear at the neurovascular unit in presymptomatic TCR1640 animals. This early disruption of blood brain barrier homeostasis is linked to the establishment of a proinflammatory immune profile in the periphery. Animals at the chronic stage show sustained inflammation of the central nervous system parenchyma and massive leukocyte infiltration, compared to animals in acute phase of disease. An in vivo experiment has allowed modulating the disease by treatment with a multiple sclerosis-approved therapy, in wild type mice which had received reactivated CD4+ T cells from TCR1640 animals. Finally, the implication of new cell adhesion molecules in the development and maintenance of spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis has been suggested by in vitro study of melanoma cell adhesion molecule (CD146) and activated leucocyte cell adhesion molecule (CD166). The results obtained in this study suggest that the TCR1640 model is a valuable asset in the study of neuroimmune diseases such as multiple sclerosis. It could also be used to validate new therapeutic strategies for the treatment of this disease.

Norrin is a secreted cystine-knot growth factor that plays critical roles in vascular development in the brain, retina, and cochlea, as well as the uterus. Although Norrin is unrelated to the lipid-modified morphogens Wnts, Norrin activates the canonical Wnt/β-catenin pathway by binding to receptor Frizzled4 cysteine-rich domain (Fz4-CRD) and co-receptors of low density lipoprotein receptor related protein 5/6 ectodomain (Lrp5/6-ECD) in conjunction with Tetraspanin-12 (Tspan-12). Like Wnts, Norrin has limited extracellular diffusion properties as a result of associating with heparan sulfate proteoglycans (HSPGs). Mutations lead to inherited disordered retinal vascularization diseases such as Norrie disease, familial exudative vitreoretinopathy and coats' disease. However, the molecular mechanism of how Norrin initiates signalling by engagement with Fz4, Lrp5/6, and HSPGs has remained unresolved. Here, novel strategies for protein production of recombinant human Norrin and Fz4-CRD as well as the complex are developed. The crystal structures of Norrin and its complex with Fz4-CRD, plus complex bound with the heparin mimic sucrose octasulphate, and unliganded structures of Fz4-CRD are presented. These structural data together with biophysical and cellular assays not only reveal the Fz4 and Lrp5/6 binding sites on distinct patches of the Norrin surface, but also indicate the HSPGs binding site on Norrin and Fz4-CRD as well as providing a framework to explain numerous disease-related mutations. Structural comparison with Xenopus Wnt8 in complex with mouse Fz8-CRD provides molecular insights for our understanding of ligand-receptor binding specificity and promiscuity, which has important implications for developing therapeutic strategies against Norrin dependent retinal disorders, and cancers caused by abnormal Wnt signaling.

Das posttraumatische Hirnödem trägt zur erhöhten Morbidität und Mortalität Schädel-Hirn-traumatisierter Patienten bei. Das vasodilatierende Bradykinin führt als ein Bestandteil des Kallikrein-Kinin-Systems über Bradykinin-2 (B2)-Rezeptoren zu einer Öffnung der Blut-Hirn-Schranke und trägt damit zur Entstehung und Aufrechterhaltung des vasogenen bzw. zytotoxischen Hirnödems bei. Eine selektive Hemmung der B2-Rezeptoren konnte bereits die Ausbreitung des posttraumatischen vasogenen Hirnödems erfolgreich vermindern. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Entwicklung des vasogenen Hirnödems, der hemisphäralen Schwellung und der Integrität der Blut-Hirn-Schranke im zeitlichen Verlauf bis 7 Tage nach Controlled Cortical Impact Injury (CCII) an Ratten anhand T2- und T1-gewichteter MRT-Bildgebung charakterisiert. Im zweiten Teil wurde eine mögliche therapeutische Wirkung des spezifischen B2-Antagonisten LF 16.0687 Ms auf das posttraumatische Ödem und der Blut-Hirn-Schrankenöffnung durch Anwendung von MRT- und gravimetrischer Methoden untersucht. In den T2-gewichteten Sequenzen kam es innerhalb von 90 Minuten nach CCII zum prozentual stärksten Anstieg der hemisphäralen Schwellung, ein Maximum lag zwischen 24 und 48 Stunden vor gefolgt von einer Abnahme bis 7 Tage danach. T1-gewichtete Aufnahmen zeigten ein durch die Extravasation von Gadolinium-DTPA erzeugtes Maximum der Kontrastverstärkung innerhalb des Läsionszentrums bereits 6 Stunden nach CCII, während die Kontrastverstärkung in der Ödemperipherie erst nach 48 Stunden Maximalwerte erreichte. Bei einer frühzeitigen Gabe des Kontrastmittels 90 Minuten nach CCII kam es im Verlauf zu einer signifikant höheren Kontrastverstärkung innerhalb der traumatisierten Hemisphäre, vermutlich durch eine Retention des extravasierten Kontrastmittels. Dies könnte für eine frühe Restitution der Blut-Hirn-Schranken Integrität innerhalb der Kontusion sprechen, während der Verschluß perikontusionell erst später erfolgt. LF 16.0687 Ms führte bei frühzeitiger Gabe nach CCII zu einer signifikanten Reduktion der gravimetrisch bestimmten posttraumatischen hemisphäralen Schwellung um 27%. Hierbei korrelierte die im MRT ermittelte hemisphärale Schwellung signifkant mit den gravimetrisch gemessenen Werten. / Posttraumatic brain edema contributes to a higher morbidity and mortality in severe head-injured patients. Vasodilatating bradykinin, part of the kallikrein-kinin-system, mediates over bradykinin 2 (B2) receptors an blood-brain-barrier (BBB) disfunction and causes the formation and maintenance of vasogenic and cytotoxic brain edema. A selective blocking of the B2 receptors has been shown to successfully reduce brain edema formation. One objective of this study was to analize the development of vasogenic brain edema, lesion-size, hemispheric swelling and BBB-integrity after controlled cortical impact injury (CCII) in rats over a period of 7 days using magnetic resonance imaging (MRI) techniques (T2- and T1-weighted MRI, Gadolinium-DTPA (Gd-DTPA)). The other purpose was to investigate the protective effect of the novel nonpeptide B2 receptor antagonist LF 16-0687 Ms on posttraumatic edema and BBB-opening using MRI- and gravimetric methods. T2-weighted imaging showed the highest percentual increase of hemispheric swelling during the first 90 minutes after CCII, a maximum between 24 and 48 hours after CCII and and a decrease after 7 days. T1-weighted imaging revealed a maximum of contrast enhancement caused by extravasation of Gd-DTPA in the lesion-center 6 hours after CCII, while contrast enhancement in the lesion periphery reached its maximum at 48 hours.After an early administration of Gd-DTPA (90 minutes after CCII) contrast enhancement in the traumatized hemisphere was significantly higher compared to the non-traumatized hemisphere. This could be explained by a retention of Gd-DTPA caused by an early closure of the BBB in the lesion-center, while BBB-integrity in the lesion-periphery re-establishes later. The novel nonpeptide B2 receptor antagonist LF 16-0687Ms significantly reduced brain swelling by 27% after single administration measured by gravimetric wet-dry-weighting. Gravimetric and T2-weighted MRI-measurements of hemispheric swelling correlated significantly.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.