Polymere Nanopartikel sind ein vielversprechender Ansatz für die Diagnose und Therapie von Krankheiten. Sie ermöglichen den Einsatz von schwerlöslichen oder instabilen Wirkstoffen. Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit das Targetings, durch gezielte Modifikationen des Nanopartikels wird der Wirkstoff zum Zielort transportiert und kann dort in der gewünschten Form freigesetzt werden; dadurch könnten bei erhöhter Wirksamkeit die Nebenwirkungen von Medikamenten reduziert werden. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von physikalischen und biochemischen Eigenschaften von Nanopartikeln bestehend aus einem abbaustabilen Polystyren- Kern und einer biologisch abbaubaren Schale aus Polybutylcyanoacrylat. Es werden Methoden beschrieben, um die Größe, Struktur und den Abbau dieser Wirkstoffträger zu untersuchen. Die untersuchten Nanopartikel zeigen RAYLEIGH-Streuung, sowohl Größe als auch Abbau können durch Messung des Absorptionsspektrums bestimmt werden. Weiterhin konnten diese Eigenschaften mit Hilfe von dynamischer und statischer Lichtstreuung sowie Neutronenkleinwinkelstreuung untersucht werden. Bei letzterer Methode konnte gezeigt werden, dass die Schale größtenteils abgebaut werden kann, während der Kern intakt bleibt. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke durch polymere Nanopartikel untersucht. Dabei wurde der fluoreszierende Thioflavine als Modellwirkstoffe eingesetzt. Das Durchdringen der Blut-Hirn-Schranke konnte nur mit Nanopartikeln erreicht werden, an deren Oberfläche ein Apolipoprotein E-Peptid gekoppelt war. Es konnte gezeigt werden, das die Nanopartikelschale im Gehirn abgebaut wird, der Wirkstoff freigesetzt wird und an Amyloid β, einem Marker der Alzheimer-Krankheit, bindet.

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A serious opioid crisis is affecting public health and economics, eroding people’s quality of life. 80% of patients who receive opioids suffer from adverse effects such as Opioid-induced constipation (OIC). However, there is no efficient medicine for these adverse effects. Notably, mainstream theory supports that analgesia effects are mainly controlled by CNS while OIC is predominately controlled by peripheral. In addition, the sites of action of opioid was based on the assumption that mu-opioid receptor antagonists (PAMORAs), did not cross the blood-brain barrier (BBB). Unfortunately, the BBB crossing of PAMORAs mislead the understanding of the role of the central nervous system (CNS) and gastrointestinal tract playing in the adverse effects such as opioid-induced constipation (OIC). Here, we developed a novel technology platform to prevent drugs from crossing the BBB. By applying this technology, naloxone- and oxycodone conjugates demonstrated superior potency, peripheral selectivity, pharmacokinetics, and effectiveness in rats compared to currently clinically used PAMORAs. By the help of these probes, it is revealed for the first time to that the mu-opioid receptors in the CNS played more important role in OIC than the peripheral receptors, which overturned the old theory. And the new theory points the way to better future PAMORAs drug design.

Contexte et objectifs : L'encéphalopathie hépatique (EH) est un trouble neuropsychiatrique, une complication majeure de la maladie hépatique chronique (MHC). L'EH se manifeste par un large éventail de symptômes, allant d'un léger manque d'attention et de troubles de la mémoire à une léthargie sévère et un coma. L'hyperammoniémie est centrale dans la pathogenèse de l'EH puisque l'ammoniac est neurotoxique et que l'ammoniac dérivé du sang traverse facilement la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cependant, d'autres facteurs pathogènes sont également impliqués dans l'EH, notamment le stress oxydatif. Au cours de la MHC, le muscle joue un rôle compensatoire essentiel dans l'élimination de l'ammoniac par l'action de l'enzyme glutamine synthétase (GS), qui transforme le glutamate en glutamine. Étant donné que les cellules endothéliales de la BHE sont l'interface entre le sang et le cerveau, il est plausible qu'elles métabolisent l'ammoniac pour protéger le cerveau de la neurotoxicité induite par l'ammoniac. Cependant, cela n'a jamais fait l'objet d'études. Les thérapies de réduction de l'ammoniac sont les traitements courants de l'EH. Cependant, les réponses des patients aux traitements sont hétérogènes, et les différences de sexe pourraient en être la cause. Par conséquent, nos objectifs étaient 1) d'explorer le métabolisme de l'ammoniac dans les cellules endothéliales de la BHE par la présence de GS et 2) d'évaluer l'impact du sexe sur la MHC et ses complications, y compris la sarcopénie et l'EH. Méthodes : Pour le premier objectif, nous avons évalué l'expression et l'activité de la protéine GS in vitro et ex vivo chez des rats naïfs. Nous avons également évalué l'impact de l'ornithine, du glutamate et du α-kétoglutarate sur l'activité de la GS dans les cellules endothéliales de la BHE via la génération de glutamine 5-13C marquée. Pour le deuxième objectif, nous avons évalué l'impact du sexe sur le neurophénotype (anxiété, mémoire, coordination motrice et activité) chez des rats ligaturés des voies biliaires (BDL) (et contrôles respectifs) ainsi que sur le développement d'une EH sévère (léthargie/perte du réflexe de redressement). Nous avons également évalué les marqueurs des lésions hépatiques, l'hyperammoniémie, le stress oxydatif systémique, la masse et la fonction musculaire et la clairance de l'ammoniac musculaire. Résultats : Nous avons trouvé l'activité et l'expression de la GS in vivo et ex vivo dans les cellules endothéliales de la BHE. L'analyse au microscope confocal a montré que la GS dans les cellules endothéliales est moins abondante que dans les astrocytes. L'exposition de cellules endothéliales cultivées à des substrats marqués a révélé que l'ornithine est la plus efficace pour générer de la glutamine. Chez les femmes, la chirurgie BDL a provoqué une MHC (augmentation des enzymes hépatiques circulantes et de la bilirubine) et de l'EH (altération de la coordination motrice et de l'activité nocturne) par rapport aux rats contrôles respectifs. De plus, le degré d'hyperammoniémie et la clairance musculaire de l'ammoniac étaient similaires entre les sexes. Contrairement aux mâles, les rats femelles n'ont pas développé de perte musculaire, d'œdème cérébral et de perte de mémoire à court terme. De plus, les femelles présentaient un stress oxydatif plus faible et étaient complètement protégées contre les EH sévères précipitées par l'ammoniac par rapport aux mâles BDL. Conclusions : Nous concluons que la GS est exprimée dans les cellules endothéliales de la BHE, jouant peut-être un rôle dans l'atténuation ou le retard de l'entrée de l'ammoniac dans le cerveau et que la supplémentation en ornithine améliore l'activité de la GS en fournissant du glutamate pour la détoxification de l'ammoniac. De plus, nous concluons que le sexe a un impact sur les complications des maladies du foie, y compris la sarcopénie et l'EH, le stress oxydatif systémique jouant un rôle vital dans la susceptibilité à l'EH sévère induite par l'ammoniac. / Background and aims: Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychiatric disorder and a major complication of chronic liver disease (CLD). HE manifests with a wide range of symptoms, from mild lack of attention and memory impairments to severe lethargy and coma. Hyperammonemia is central in the pathogenesis of HE since ammonia is neurotoxic, and blood-derived ammonia easily crosses the blood-brain barrier (BBB). However, other pathogenic factors are also implicated in HE, including oxidative stress. During CLD, muscle plays an essential compensatory role in removing ammonia by the action of the enzyme glutamine synthetase (GS), which amidates glutamate into glutamine. Since the endothelial cells of the BBB are the interface between the blood and the brain, it is plausible that they metabolize ammonia to protect the brain from ammonia-induced neurotoxicity. However, this has never been investigated. Ammonia lowering therapies are the mainstream treatments for HE. However, patients' response to treatments are heterogeneous, and sex differences might be the cause. Therefore, our aims were 1) To explore ammonia metabolism in BBB’s endothelial cells through the presence of GS and 2) to assess the impact of sex on CLD and its complications, including sarcopenia and HE. Methods: For the first aim, we assessed GS protein expression and activity in vitro and ex vivo in naïve rats. We also evaluated the impact of ornithine, glutamate, and α-ketoglutarate on GS activity in endothelial cells of the BBB via the generation of labeled 5-13C glutamine. For the second aim, we assessed the impact of sex on the neurophenotype (anxiety, memory, motor coordination, and activity) in bile-duct ligated (BDL) rats (and respective SHAMs) as well as on the development of an ammonia-precipitated severe HE (lethargy/loss of righting reflex). We also assessed liver injury markers, hyperammonemia, systemic oxidative stress, muscle mass and function, and muscle ammonia clearance. Results: We found GS activity and expression in vivo and ex vivo in endothelial BBB cells. The confocal microscope analysis showed that GS in endothelial cells is less abundant than astrocytes. Exposing cultured endothelial cells to labeled substrates revealed that ornithine is the most efficient in generating glutamine. In females, BDL surgery caused CLD (increased hepatic enzymes and bilirubin) and HE (impaired motor coordination and night activity) vs. respective SHAMs. Furthermore, the degree of hyperammonemia and muscle ammonia clearance was similar between sexes. Contrary to males, female rats did not develop muscle loss, brain edema, and short-term memory loss. In addition, females had lower oxidative stress and were completely protected against ammonia-precipitated severe HE compared to male BDLs. Conclusions: We conclude that GS is expressed in endothelial cells of the BBB, possibly playing a role in attenuating or delaying ammonia entry into the brain and, ornithine supplementation enhances GS activity by providing glutamate for ammonia detoxification. In addition, we conclude that sex impacts the complications of liver disease, including sarcopenia and HE, with systemic oxidative stress playing a vital role in the susceptibility to ammonia-induced overt HE.

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La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire et démyélinisante caractérisée par la formation de lésions multifocales à travers le système nerveux central. Les lymphocytes pro- inflammatoires CD4 Th1 et Th17 sont considérés pathogéniques en sclérose en plaques et dans son modèle animal, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale. L’obésité et la composition du microbiome intestinal sont associées à une exacerbation de l’inflammation et à la progression de la sclérose en plaques, faisant des approches thérapeutiques métaboliques une méthode de choix afin d’améliorer l’évolution de cette maladie. La méthionine est un acide aminé essentiel métabolisé en S-adénosylméthionine (SAM), considéré comme le donneur universel de groupements méthyl, influençant l’expression génique. La restriction en méthionine est quant à elle associée à une diminution de la prise de poids et de l’inflammation, et in vitro, permet de réduire l’expansion des cellules Th17. Notre hypothèse est donc que diminuer l’activité du cycle de la méthionine permettrait de limiter la progression de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale en modulant le métabolisme des cellules T, la barrière hémo-encéphalique et le microbiome intestinal. Pour ce faire, l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale est induite chez des souris mâles et femelles exposées à une diète réduite en méthionine ou contrôle afin d’effectuer une évaluation clinique quotidienne. Des expériences de cytométrie en flux, d’immunofluorescence et de séquençage d’ADN ribosomal 16S sont effectuées afin de déterminer l’activité des cellules immunitaires, la perméabilité de la barrière hémo-encéphalique et la composition du microbiome intestinal. Nos résultats montrent que la diète réduite en méthionine est associée à un délai significatif de l’apparition des symptômes neurologiques, avec une évolution clinique différente entre les mâles et les femelles. Ceci est associé à une diminution du nombre de cellules immunitaires infiltrant le système nerveux central, en plus d’influencer la composition du microbiome intestinal, suggérant des changements vers un profil plutôt anti-inflammatoire. La diète réduite en méthionine semble donc améliorer la progression de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale de manière différente selon les sexes et pourrait représenter une nouvelle voie thérapeutique contre la sclérose en plaques. / Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system with a sex bias towards women. Proinflammatory Th1 and Th17 cells are considered pathogenic in multiple sclerosis and its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis. Obesity, western diet and gut dysbiosis increase inflammation and influence the course of this disease. Contrarily, dietary methionine restriction is associated with lower weight gain and reduced inflammation. In vitro, T cells upregulate components of methionine metabolism, including S- adenosylmethionine, upon activation and proliferation, while methionine restriction in the milieu reduces the expansion of Th17 cells. Thus, we hypothesized that limiting the activity of the methionine cycle will improve experimental autoimmune encephalomyelitis course by modulating Th17 cells through sex-specific epigenetic mechanisms and modification of the gut microbiome. To test this hypothesis, active experimental autoimmune encephalomyelitis is induced in male and female mice exposed to a methionine restricted or control diet. Clinical scores, flow cytometry, immunofluorescence and 16S rRNA sequencing are used to characterize the properties of immune cells, the blood-brain barrier, and the gut microbiome. Our results show that dietary methionine restriction is associated with a significantly delayed onset of neurological symptoms, with clinical differences in disease evolution between males and females. This is associated with a reduced number of immune cells and pathogenic proinflammatory T cells in periphery, then in the central nervous system. Methionine restricted diet is moreover associated with modification of the gut microbiome, suggesting a shift towards an anti-inflammatory profile. Finally, methionine restriction also influences the expression of adherence molecules such as VCAM-1, present in the blood-brain barrier, suggesting a neuro-protective effect. Our data reveal that methionine restricted diet ameliorates the clinical course and neuroinflammatory processes in experimental autoimmune encephalomyelitis in a sex-dependent manner and could represent a new therapeutic avenue to improve multiple sclerosis course.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.

L’œdème cérébral est une complication associée à l’encéphalopathie hépatique (EH) lors d’une insuffisance hépatique chronique (cirrhose du foie). Présentement, l’origine de sa pathogenèse, vasogénique (rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE)) ou cytotoxique (prise anormale d’ions), n’a pas encore été déterminée. Il a été démontré que le co-transporteur Na-K-Cl (NKCC1) du côté luminal des microvaisseaux sanguins cérébraux (CMV) joue un rôle dans le développement de l’œdème cérébral dans des modèles d’ischémie où la bumetanide, un inhibiteur de NKCC, atténue l’œdème cérébral. Deux modèles d’EH ont été utilisés pour cette étude i) la ligature de la voie biliaire (BDL) qui présente l’hyperammoniémie chronique, l’œdème cérébral et le stress oxydatif systémique ; ii) l’anastomose portocave (PCA) qui présente de l’hyperammoniémie chronique seulement. Les buts du projet étaient de: i) définir l’origine du développement de l’œdème chez les rats BDL en étudiant l’extravasation de macromolécules, les jonctions serrées et l’activation des métalloprotéinases matricielles de la BHE; ii) observer les effets de l’hyperammoniémie chronique indépendamment sur la BHE chez les rats PCA; iii) évaluer le rôle de l’hyperammoniémie et du stress oxydatif et iv) étudier le rôle du NKCC1 dans les CMV dans la pathogenèse de l’œdème cérébral. Les résultats du projet démontrent que l’œdème est d’origine cytotoxique chez les rats BDL et que l’intégrité de la BHE est conservée chez les rats PCA malgré l’hyperammoniémie. L’expression génique du NKCC1 est associée à l’œdème mais pas son expression protéique et sa phosphorylation. Enfin, l’étude démontre que l’hyperammoniémie et le stress oxydatif indépendant ne jouent pas un rôle dans la pathogenèse de l’œdème mais suggère qu’ils y aient un effet synergique. / Brain edema is a complication associated with hepatic encephalopathy (HE) due to chronic liver failure (cirrhosis). It is unclear whether brain edema is of vasogenic (blood brain barrier (BBB) breakdown) or cytotoxic (abnormal cellular uptake of ions) origin. It has been demonstrated that the Na-K-Cl cotransporter (NKCC1) located on the luminal side of the cerebral microvessels (CMV) is implicated in the pathogenesis of brain edema in animal models of ischemia and that the administration of bumetanide, an inhibitor of NKCC, attenuates brain water increase. Two distinct animal models of chronic liver failure and HE are used in the present study; 1) bile duct ligation (BDL) where brain edema, chronic hyperammonemia and systemic oxidative stress are observed; 2) portacaval anastomosis (PCA) where only chronic hyperammonemia is observed. The aims of the study were to: i) determine the origin of brain edema in BDL rats measuring brain extravasation, tight junctions expression and matrix metalloproteinase activation; ii) observe the effects of chronic hyperammonemia on the BBB in PCA rats; iii) study the role of oxidative stress and hyperammonemia; iv) evaluate the role of NKCC in CMV in the pathogenesis of brain edema. The results of the study determined that brain edema in BDL rats is of cytotoxic origin and chronic hyperammonemia independently has no effect on the BBB. An increase of NKCC1 mRNA is associated with brain edema but protein expression and phosphorylation are not. Furthermore, hyperammonemia and oxidative stress independently are not implicated in the development of brain edema however a synergistic effect between the two pathogenic factors in BDL rats remains a possibility.

Le syndrome de Wernicke-Korsakoff (SWK) est un désordre neuropsychiatrique causé par la déficience en thiamine (DT). Dans la DT expérimentale comme dans le SWK, on observe une mort neuronale et des hémorragies dans certaines régions précises du diencéphale et du tronc cérébral. Les lésions diencéphaliques du SWK sont particulièrement sévères et entraînent souvent des séquelles amnésiques permanentes. Le lien entre la dysfonction métabolique induite par la DT et la mort neuronale n’est pas connu. Des rapports précédents ont démontré que la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) était altérée et ce, précédant l’apparition du dommage neuronal, suggérant un rôle critique de la dysfonction vasculaire. Les jonctions serrées (JS) interendothéliales, la base anatomique de la BHE, constituent un réseau moléculaire incluant l’occludin et les zonula occludens (ZOs). Cette thèse démontre une perte d’expression et une altération de la morphologie de ces protéines en relation avec la dysfonction de la BHE dans le thalamus de souris déficientes en thiamine, fournissant une explication pour la présence d’hémorragies. Le stress oxydatif peut entraîner des dommages directs aux protéines des JS et interférer avec leurs mécanismes de régulation. De plus, l’oxyde nitrique (NO) peut induire la métalloprotéinase matricielle-9 (MMP-9) impliquée dans la dégradation de ces protéines. L’endothélium vasculaire cérébral (EVC) semble être une source importante de NO dans la DT, l’expression de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) étant sélectivement induite dans les régions vulnérables. Le NO peut réagir avec les espèces réactives oxygénées et former du peroxynitrite, entraînant un stress oxydatif/nitrosatif endothélial. Les résultats présentés démontrent que la délétion du gène de eNOS prévient le stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, l’extravasation des immunoglobulins G (IgGs) et l’altération de l’occludin et des ZOs dans le thalamus de souris déficientes en thiamine. De plus, cette délétion prévient l’induction de l’expression de MMP-9 dans l’EVC. Des résultats similaires ont été obtenus avec l’antioxydant N-acétylcystéine (NAC). Les mécanismes précis par lesquels les espèces réactives altèrent les protéines des JS sont inconnus. Caveolin-1, une composante majeure du caveolæ de l’EVC, est impliquée dans la régulation de l’expression des protéines des JS, et celle-ci est modulée par le stress oxydatif/nitrosatif; l’altération de l’expression de caveolin-1 a été récemment associée à la rupture de la BHE. Les résultats présentés démontrent que l’expression de caveolin-1 est sélectivement altérée dans l’EVC du thalamus de souris déficientes en thiamine, coïcidant avec la rupture de la BHE, et démontrent que la normalisation de l’expression de caveolin-1 par le NAC est associée avec l’atténuation du dommage à la BHE. Pris ensemble, ces résultats démontrent un rôle central du stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, particulièrement celui provenant de eNOS, dans l’altération des JS de la BHE via des dommages directs et via l’induction de MMP-9 et de caveolin-1. Cette rupture de la BHE contribue par conséquent à la mort neuronale dans le thalamus, puisque la prévention des altérations cérébrovasculaires par la délétion du gène de eNOS et le NAC atténue significativement la mort neuronale. L’administration précoce d’antioxydants en combinaison avec la thiamine devrait donc être une considération importante pour le traitement du SWK. / Wernicke-Korsakoff syndrome (WKS) is a neuropsychiatric disorder caused by thiamine deficiency (TD). In experimental TD as in WKS, neuronal cell death and hemorrhages are observed in specific diencephalic and brainstem areas. Diencephalic lesions in WKS are especially severe and often lead to permanent amnesic symptoms. The link between TD-induced metabolic dysfunction and neuronal cell death is unknown. Previous reports have shown that blood-brain barrier (BBB) permeability was impaired and that this occurred prior to the onset of neuronal damage, suggesting a critical role for vascular dysfunction. Interendothelial tight junctions (TJs), the anatomical basis of the BBB, constitute a molecular network comprising occludin and zonula occludens (ZOs). This thesis shows a loss of expression and alterations in the morphology of these proteins in relation to BBB dysfunction in the thalamus of thiamine-deficient mice, providing an explanation for the presence of hemorrhages. Oxidative stress can lead to direct oxidative damage to TJ proteins and interfere with their regulation mechanisms. Also, nitric oxide (NO) can induce matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) involved in the degradation of these proteins. Cerebral vascular endothelium (CVE) seems to be an important source of NO in TD, since endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression is selectively induced in vulnerable areas. NO can react with reactive oxygen species and form peroxynitrite, leading to endothelial oxidative/nitrosative stress. Results have show that eNOS gene deletion prevents cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, immunoglobulins G (IgGs) extravasation and occludin and ZOs alterations in the thalamus of thiamine-deficient mice. Also, eNOS gene deletion prevents the induction of MMP-9 in CVE. Similar results have been obtained with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC). Precise mechanisms by which reactive species alter TJ proteins are unknown. Caveolin-1, a major component of CVE caveolæ, is involved in the regulation of TJ protein expression, and is modulated by oxidative/nitrosative stress; alteration in caveolin-1 expression has been recently associated with BBB breakdown. The present results show that caveolin-1 expression is selectively altered in CVE of the thalamus of thiamine-deficient mice, and show that normalization of caveolin-1 expression by NAC is associated with the attenuation of BBB damage. Taken together, these results demonstrate a central role for cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, especially coming from eNOS, in BBB TJ protein alterations via direct damage and via induction of MMP-9 and caveolin-1. As a result, BBB breakdown contributes to neuronal cell death in the thalamus, since prevention of cerebrovascular alterations by eNOS gene deletion and NAC significantly attenuates neuronal cell death. Early administration of antioxidants combined with thiamine should therefore be an important consideration for the treatment of WKS.

L’insuffisance hépatique aiguë (IHA) se caractérise par la perte soudaine de la fonction hépatique résultant de la nécrose massive des hépatocytes en l’absence de pathologie hépatique préexistante. L’IHA s’accompagne de perturbations métaboliques et immunologiques qui peuvent entraîner l’apparition de complications périphériques et cérébrales telles qu’un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS), une encéphalopathie hépatique (EH), un œdème cérébral, une augmentation de la pression intracrânienne, et la mort par herniation du tronc cérébral. Les infections sont une complication fréquente de l’IHA et elles sont associées à un risque accru de développer un SIRS et une aggravation subséquente de l’EH avec un taux de mortalité augmenté. L’ammoniaque joue un rôle majeur dans les mécanismes physiopathologiques qui mènent au développement de l’EH et de l’œdème cérébral, et des études récentes suggèrent que les cytokines pro-inflammatoires sont également impliquées. Le but de cette thèse est d’étudier le rôle des cytokines pro-inflammatoires circulantes et cérébrales dans le développement de l’EH et de l’œdème cérébral lors d’IHA. Dans l’article 1, nous démontrons que l’inhibition périphérique du facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) par l’etanercept retarde la progression de l’EH en diminuant le dommage hépatocellulaire, réduisant l’inflammation périphérique et centrale ainsi que le stress oxydatif/nitrosatif hépatique et cérébral associé chez la souris avec une IHA induite par l’azoxyméthane (AOM). Ces résultats démontrent un rôle important du TNF-α dans la physiopathologie de l’EH lors d’IHA d’origine toxique et suggèrent que l’etanercept pourrait constituer une approche thérapeutique dans la prise en charge des patients en attente de transplantation hépatique. Dans l’article 2, nous simulons la présence d’une infection chez la souris avec une IHA induite par l’AOM pour mettre en évidence une éventuelle augmentation de la réponse inflammatoire. Nous démontrons que l’endotoxémie induite par le lipopolysaccharide (LPS) précipite la survenue du coma et aggrave la pathologie hépatique. Les cytokines pro-inflammatoires systémiques et cérébrales sont augmentées de façon synergique par le LPS lors d’IHA et résultent en une activation accrue de la métalloprotéinase matricielle-9 cérébrale qui s’accompagne d’une extravasation d’immunoglobulines G (IgG) dans le parenchyme cérébral. Ces résultats démontrent une augmentation majeure de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui contribue à la pathogenèse de l’EH lors d’IHA en condition infectieuse. Les résultats de l’article 3 démontrent que l’augmentation de la perméabilité de la BHE lors d’IHA induite par l’AOM en condition non infectieuse ne résulte pas de l’altération de l’expression des protéines constitutives de la BHE. Dans l’article 4, nous démontrons que l’exposition d’astrocytes en culture à des concentrations physiopathologiques d’ammoniaque ou d’interleukine-1β résulte en l’altération de gènes astrocytaires impliqués dans la régulation du volume cellulaire et dans le stress oxydatif/nitrosatif. Un effet additif est observé dans le cas d’un traitement combiné au niveau des gènes astrocytaires impliqués dans le stress oxydatif/nitrosatif. L’ensemble des résultats de cette thèse démontre un rôle important de l’inflammation périphérique et cérébrale dans la survenue des complications neurologiques lors d’IHA et une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués pourrait contribuer à la mise en place de stratégies thérapeutiques chez les patients atteints d’IHA en attente de transplantation. / Acute liver failure (ALF) is the clinical manifestation of an abrupt loss of hepatic function resuting from a massive hepatocyte necrosis in a patient with no preexisting liver disease. ALF is associated with metabolic and immunological disturbances that may lead to peripheral and cerebral complications such as systemic inflammatory response syndrome (SIRS), hepatic encephalopathy (HE), brain edema, increased intracranial pressure (ICP) and ultimately death by cerebral herniation. ALF is frequently complicated by infections, which are known to increase the risk of developing a SIRS with a subsequent worsening of HE and higher mortality rates. Ammonia plays a pivotal role in the pathophysiological mechanisms leading to HE and brain edema, and recent studies suggest that pro-inflammatory cytokines may also be involved. The aim of this thesis is therefore to investigate the role of circulating and cerebral pro-inflammatory cytokines in the setting of HE and brain edema during ALF. In article No. 1, we demonstrated that peripheral inhibition of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) by etanercept delays the progression of HE by reducing hepatocellular damage, decreasing peripheral and cerebral inflammation as well as associated oxidative/nitrosatif stress in mice with ALF induced by azoxymethane (AOM). These findings demonstrate an important role of TNF-α in the pathophysiology of HE during toxic liver injury and suggest that etanercept may provide a therapeutic approach in the management of patient awaiting liver transplantation. In article No. 2, we mimicked infection in mice with AOM-induced ALF in order to better understand the effects of an increased inflammatory response. We demonstrated that endotoxemia induced by lipopolysaccharide (LPS) precipitates the onset of coma and worsens the liver pathology. Peripheral and brain pro-inflammatory cytokines are synergistically raised by LPS during ALF and result in a large increase in cerebral matrix metalloprotease-9 (MMP-9) activity that was associated with immunoglobulin G (IgG) extravasation in the brain parenchyma. These results demonstrate a major increase of blood-brain barrier (BBB) permeability that contributes to the pathogenesis of HE during ALF with superimposed infection. Results from article No. 3 demonstrate that increase of BBB permeability during AOM-induced ALF without superimposed infection is not due to alteration of BBB constitutive proteins. In article No. 4, we demonstrated that exposure of cultured astrocytes to pathophysiological concentrations of ammonia or interleukin-1β results in an alteration of the expression of astrocytic genes implicated in cell volume regulation and oxidative/nitrosative stress. An additive effect on astrocytic genes implicated in oxidative/nitrosative was made evident in case of co-treatment. Taken together, results of the present thesis demonstrate a major role of peripheral and cerebral inflammation in the onset of neurological complications during ALF and a better understanding of the pathophysiological mechanisms implicated may contribute to new therapeutic strategies for ALF patients awaiting transplantation.