Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-06Bitstream added on 2014-06-13T19:35:10Z : No. of bitstreams: 1 felipe_lm_me_jabo.pdf: 356871 bytes, checksum: 16d6d5f606db8c2a71fd32fc4c6570dc (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A deterioração “blown pack” é caracterizada por abundante produção de gás, induzindo a completa distensão da embalagem durante o processo de estocagem sob refrigeração. Quando a embalagem é aberta, há um odor desagradável, levemente fecal. O gás presente na embalagem é composto por dióxido de carbono e hidrogênio e por vários tipos butíricos do metabolismo fermentativo. O objetivo deste experimento foi determinar possíveis causadores deste tipo de deterioração, quantificando as populações de bactérias da família Enterobacteriaceae, e caracterizando-as nos principais gêneros e espécies encontradas, o número de bactérias ácido-lácticas, a freqüência de Clostridium estertheticum e do Clostridium gasigenes, em carnes próprias para o consumo e em carnes que apresentaram a deterioração “blown pack”. Para contagem e identificação dos membros da família Enterobacteriaceae e contagem de bactérias ácido-lácticas utilizou-se de técnicas microbiológicas clássicas. Já para pesquisa do C. estertheticum e C. gasigenes fez-se uso de técnicas de biologia molecular. Os microrganismos da família Enterobacteriaceae e bactérias ácido-láticas estavam presentes em populações elevadas e em maior número nas carnes com deterioração “blown pack”. A espécie mais freqüentemente encontrada foi a Hafnia alvei. As amostras com deterioração “blown pack’ apresentaram maior positividade para o C. estertethicum que amostras não deterioradas. Não houve diferença estatística de positividade para a presença do C. gasigenes entre amostras com deterioração “blown pack” e carnes não deterioradas. A principal forma de controle desta deterioração é a prevenção da contaminação da carne por material fecal. / The blown pack spoilage is characterised by abundant gas production, leading to complete gross distention pack during refrigerated storage. When the packaging is opened, there is an unpleasant smell, lightly fecal. The gas present in the package is composed of carbon dioxide and hydrogen and also of several butyric types of metabolism fermentation. The purpose of this experiment was to determine possible causes of this spoilage type, quantifying the populations of bacteria of the family Enterobacteriaceae, and characterizing them in the major genera and species found, the number of lactic acid bacteria, the frequency of Clostridium estertheticum and Clostridium gasigenes in meat proper for consumption and meat which showed the blown pack spoilage. In order to enumerate and identify the members of the Enterobacteriaceae family, and to enumerate the lactic acid bacteria the procedure was classical microbiological techniques. However to search the C. estertheticum and C. gasigenes the procedure was molecular biology techniques. The microorganisms of the family Enterobacteriaceae and lactic acid bacteria were present in large populations and in greater numbers in meat with blown pack spoilage. The species which were found more often was the Hafnia alvei. Samples of blown pack“ spoilage had greater positive features for C. estertethicum than samples not damaged. There was no statistical difference of positive features for the presence of C. gasigenes between samples of blown pack spoilage and not damaged meat. The main way to control this spoilage is the prevention of contamination of meat by fecal material.

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The objectives of this study were to determine the microbial ecology of “blown-pack” fresh beef obtained from a federally inspected facility and to use biopreservation to prevent spoilage of vacuum packaged chilled beef. Organic acids and alcohols in the purge obtained from the “blown” beef packages were detected using HPLC. PCR analysis indicated that Clostridium spp. were present in the purge of the commercial sample. Biochemical tests, RFLP and 16S rDNA sequencing were used to identify organisms isolated from the meat. Out of 66 isolated strains, 26 isolates were strict anaerobes and RFLP indicated that all were clonal isolates. Based on sequence analysis, the isolate was identified as Clostridium putrefaciens. The isolate caused “blown-pack” spoilage and produced butyric and propionic acids when inoculated onto fresh meat and Carnobacterium maltaromaticum UAL307 prevented the production gas and obvious signs of spoilage. / Food Science and Technology

Orientador: Oswaldo Durival Rossi Junior / Banca: Luiz Augusto do Amaral / Banca: Ana Maria Centola Vidal Martins / Resumo: A deterioração "blown pack" é caracterizada por abundante produção de gás, induzindo a completa distensão da embalagem durante o processo de estocagem sob refrigeração. Quando a embalagem é aberta, há um odor desagradável, levemente fecal. O gás presente na embalagem é composto por dióxido de carbono e hidrogênio e por vários tipos butíricos do metabolismo fermentativo. O objetivo deste experimento foi determinar possíveis causadores deste tipo de deterioração, quantificando as populações de bactérias da família Enterobacteriaceae, e caracterizando-as nos principais gêneros e espécies encontradas, o número de bactérias ácido-lácticas, a freqüência de Clostridium estertheticum e do Clostridium gasigenes, em carnes próprias para o consumo e em carnes que apresentaram a deterioração "blown pack". Para contagem e identificação dos membros da família Enterobacteriaceae e contagem de bactérias ácido-lácticas utilizou-se de técnicas microbiológicas clássicas. Já para pesquisa do C. estertheticum e C. gasigenes fez-se uso de técnicas de biologia molecular. Os microrganismos da família Enterobacteriaceae e bactérias ácido-láticas estavam presentes em populações elevadas e em maior número nas carnes com deterioração "blown pack". A espécie mais freqüentemente encontrada foi a Hafnia alvei. As amostras com deterioração "blown pack' apresentaram maior positividade para o C. estertethicum que amostras não deterioradas. Não houve diferença estatística de positividade para a presença do C. gasigenes entre amostras com deterioração "blown pack" e carnes não deterioradas. A principal forma de controle desta deterioração é a prevenção da contaminação da carne por material fecal. / Abstract: The "blown pack" spoilage is characterised by abundant gas production, leading to complete gross distention pack during refrigerated storage. When the packaging is opened, there is an unpleasant smell, lightly fecal. The gas present in the package is composed of carbon dioxide and hydrogen and also of several butyric types of metabolism fermentation. The purpose of this experiment was to determine possible causes of this spoilage type, quantifying the populations of bacteria of the family Enterobacteriaceae, and characterizing them in the major genera and species found, the number of lactic acid bacteria, the frequency of Clostridium estertheticum and Clostridium gasigenes in meat proper for consumption and meat which showed the "blown pack" spoilage. In order to enumerate and identify the members of the Enterobacteriaceae family, and to enumerate the lactic acid bacteria the procedure was classical microbiological techniques. However to search the C. estertheticum and C. gasigenes the procedure was molecular biology techniques. The microorganisms of the family Enterobacteriaceae and lactic acid bacteria were present in large populations and in greater numbers in meat with "blown pack" spoilage. The species which were found more often was the Hafnia alvei. Samples of "blown pack" spoilage had greater positive features for C. estertethicum than samples not damaged. There was no statistical difference of positive features for the presence of C. gasigenes between samples of "blown pack" spoilage and not damaged meat. The main way to control this spoilage is the prevention of contamination of meat by fecal material. / Mestre

Orientador: Pilar Rodriguez de Massaguer / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T01:44:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_AlessandraReginadaSilva_D.pdf: 2932913 bytes, checksum: a22dc65d180eab3917e06501dc994ccc (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Esta pesquisa teve por objetivos: a. enumerar os Clostridium psicrotróficos na forma vegetativa e esporulada presentes em cortes bovinos embalados a vácuo e resfriados, deteriorados e não deteriorados; b. caracterizar e identificar estes isolados bioquímica e geneticamente, comparando a precisão entre as duas metodologias; c. monitorar as possíveis fontes de Clostridium psicrotróficos junto à linha de produção em frigorífico no interior do estado de São Paulo; d. testar a habilidade dos isolados, identificados como Clostridium psicrotróficos e recuperados tanto a partir dos cortes bovinos quanto a partir de diversas etapas ao longo da linha de produção do frigorífico, em reproduzir o defeito de estufamento quando inoculados em altas populações em cortes bovinos e acondicionados em embalagens a vácuo e termoencolhimento sob condições praticadas pela indústria (6mBar/83°C-3s) ; e. avaliar se diferentes níveis de vácuo e termoencolhimento teriam efeito sobre as características do estufamento dos isolados que melhor reproduziram o defeito; f. analisar as características físicas das embalagens primárias e secundárias bem como possíveis danos após simulação de transporte para distância de 500km que pudessem favorecer a incidência de Clostridium psicrotrófico ou outras espécies contaminantes. Para as enumerações foram utilizadas 8 amostras deterioradas (6 contra-filés, 1 cupim bovino e 1 picanha bovina) e 5 não deterioradas (contra-filé), sendo analisados: exsudato (1mL), superfície (100cm2) e interior do corte cárneo (25g). As subamostras foram submetidas à enumeração de anaeróbios psicrotróficos vegetativos (Reinforced Clostridial Médium - RCA, 5% de sangue de carneiro desfibrilado estéril, 5% de glicose e 1,5% de Agar, RCM modificado), anaeróbios esporulados ativados pelo calor e pelo álcool, em Perfringens Agar Base (PAB, Oxoid, com 5% de solução de gema de ovo estéril, 15000UI polimixina/500mL e 6mg Kanamicina/500mL, PKP; 200mg cicloserina/500mL (PC)). Os 17 isolados caracterizados preliminarmente como Clostridium foram submetidos ao teste de sensibilidade ao metronidazol. Aqueles com halos de inibição = 3,5mm tiveram seu perfil fenotípico analisado mediante kit API 20A (bioMeriéux) e seu perfil genético analisado (sequênciamento do gene 16S rRNA). O isolamento no ambiente do frigorífico foi realizado a partir das fezes, couro e amostras provenientes do corredor de atordoamento e sangria, sala de desossa, esteiras de corte e embalagem, através de coleta por swabs acondicionados em caldo PYGS em anaerobiose por 4 semanas a 4 e 15°C. Após, as amostras foram plaquea das em meio RCA e SFP (Shahidi Ferguson Perfringens) por 1 mês, caracterizadas e isoladas as colônias diferenciadas e ainda submetidas a confirmação, de gênero, para Clostridium. Os 2 isolados, provenientes de cultivo a 4°C confir mados como Clostridium, foram identificados utilizando mesma metodologia descrita anteriormente para isolados provenientes do corte cárneo. O teste de habilidade de reprodução do defeito de estufamento foi realizado com 12 linhagens, isoladas na primeira etapa da pesquisa, sendo 10 provenientes de cortes cárneos (8 identificados como C.gasigenes e 2 como C.algidicarnis) e 2 isoladas da linha de produção em frigorífico (C.gasigenes). Este teste foi realizado sob condições praticadas na indústria (6mBar com termoencolhimento 83°C/3s), inoculando-se nas superfícies dos bifes ( 10x5x2cm) de contra-filé, 1mL de suspensão padronizada em 108UFC/mL, obtendo-se 106UFC/50cm2. A incubação dos cortes bovinos inoculados juntamente, com 2 controles positivos (inoculados com C.estertheticum) e 2 controles negativos (sem inoculo) foi conduzida a 2° e 15°C por 8 semanas. Os 3 isolados (2 provenien tes dos cortes cárneos ¿ C.algidicarnis e C.gasigenes e 1 proveniente do frigorífico ¿ C.gasigenes) que melhor reproduziram as características do estufamento, seguiram para testes de influência de diferentes níveis de vácuo (6 e 9mBar) e temperaturas de termoencolhimento (83, 84 e 87°C) sob o tempo para aparecimento e intensidade do defeito. Também foram avaliados os sistemas de embalagem primário e secundário a fim de detectar falhas em ambos os sistemas que pudessem favorecer a incidência de espécies de Clostridium psicrotróficas. Mediante teste de simulação de transporte (norma ASMD4169-08, para caminhões) simulou-se o efeito de um percurso de 500km sobre as embalagens primárias e secundárias. Nas carnes deterioradas foi notado esverdeamento, aumento nos valores de pH e odores putrefativos e butíricos. As enumerações de psicrotróficos anaeróbios vegetativos, nas amostras deterioradas, atingiram níveis altíssimos (1014UFC/mL de exsudato). Quanto às formas esporuladas ocorreu predominância das ativadas pelo calor (105UFC/mL), sendo também recuperadas nas amostras não deterioradas. Bacillus facultativos psicrotróficos foram a flora dominante nas amostras deterioradas e não deterioradas com 50 e 70%, respectivamente. Das 17 linhagens, provenientes dos cortes cárneos, suspeitas de serem Clostridium apenas 10 foram confirmadas, destas, apenas 4 apresentaram perfis fenotípico e genético coincidentes (C1I13ESUPPKP; C2I2EXRCM; C4I8RCMEX; C2I5EXCHPC, sendo as 3 primeiras C.gasigenes e a última C.algidicarnis). Destes 10, 8 foram identificadas como C.gasigenes e 2 como C.algidicarnis. É importante enfatizar que em apenas 3 das 8 amostras de cortes cárneos deteriorados analisados (com estufamento), foram recuperados Clostridium psicrotrófico, ou seja, nas demais amostras onde estas espécies não foram recuperadas, a microflora causadora do estufamento pode ser um grupo heterogêneo composto por Bacillus psicrotróficos facultativos, que nesta pesquisa corresponderam a 50% da contaminação para as amostras deterioradas e, muito provavelmente, bactérias ácido lácticas e enterobactérias, conforme já detectado, em pesquisa paralela utilizando as mesmas amostras. Nos ambientes do frigorífico, temperaturas de 15°C fo ram medidas em locais que deveriam estar com temperaturas entre 0-6°C ou no máximo 7°C. A partir das superfícies de contato do frigorífico, fezes e chão, foram recuperados 38 isolados. Destes, apenas 2, 1 recuperado do couro e outro do corredor de abate/esteira de corte (mesmo isolado encontrado nos dois ambientes), foram identificados como Clostridium, os demais foram caracterizados como Bacillus facultativos psicrotróficos. Estes 2 foram identificados como C.gasigenes. A ocorrência destes isolados na forma viável junto à esteira de corte representa grande risco a carne pois uma vez arrastado ao produto final será um potencial causador do defeito de estufamento. Quanto aos ensaios de reprodução do defeito de estufamento, observou-se que a temperatura de 15°C acelerou a tempo para aparecimento dos primeiros sinais de estufamento, passando de 30 dias a 2°C pa ra 4 dias a 15°C e o isolado que melhor e mais rapidamente reproduziu as características do estufamento foi o C2I5EXCHPC (C.algidicarnis), com produção de gás, proteólise e alterações de pH (de 5.5 para 7.5) após 4 dias/15°C e 30 dias/2°C. Resultados similares foram obtidos para o controle positivo (C.estertheticum). Os outros 2 isolados que também reproduziram rápida e intensamente o estufamento foram C2I8EXCHPC e LMI13CA/EC ¿ isolado a partir do corredor de abate/esteira de corte junto ao frigorífico, ambos identificados como C.gasigenes, cabendo esclarecer que o defeito, para estes dois isolados, não foi tão intenso quanto para o C2I5EXCHPC. Todos os isolados foram capazes de reproduzir o defeito de estufamento ao final de 8 semanas de incubação a 15°C, enquanto que, a 2°C, somente 5 tiveram esta capacidade. Assim, temperaturas de abuso de refrigeração (15°C) aceleram o tempo para aparecimento dos primeiros sinais de estufamento por Clostridium e a temperatura de 2°C não é capaz de impedir a ocorrência deste defeito. Amostras inoculadas com C2I5EXCHPKP (C.algidicarnis) e submetidas a termoencolhimento a 83°C e 84°C/6mBar apresentaram períodos similares para aparecimento dos primeiros sinais de deterioração (~14 dias), entretanto, aplicando termoencolhimento a 87°C, foi observado um incremento neste tempo para 4 semanas. Assim sendo, considerando-se o nível de vácuo de 6mBar (aplicado pela indústria) a deterioração somente seria retardada, mas não deixaria de existir, aplicando-se um termoencolhimento a 87°C/3s, provav elmente porque nesta condição as células mais termosensíveis são inativadas. Por outro lado, as amostras tratadas com condições similares de termoencolhimento mas com nível de vácuo de 9mBar, apresentaram decréscimo no tempo de deterioração de 14 para 4 dias quando se aplicou 83 e 84°C/3s, d emonstrando que este vácuo maior estimula espécies de Clostridium. Entretanto, nas amostras tratadas com termoencolhimento a 87°C os primeiros sinais de deterioração somente foram observados após 7 semanas a 1°C. Assim, a condição de vácuo/termoencolhimento que mais prolongou a vida de prateleira da carne, quando inoculada, foi 87°C/9mBar, mas esta condição não impediu o desenvo lvimento do C.algidicarnis e o tempo de atraso do defeito de estufamento ainda foi inferior ao prazo de vida útil do produto. As embalagens primárias e secundárias analisadas estavam de acordo com as especificações do fabricante. Quanto à simulação de transporte, após o percurso de 500km apenas 1 embalagem primária demonstrou alterações que pudessem favorecer a atividade de anaeróbios facultativos. Por esta pesquisa, observou-se coincidência entre a flora encontrada nas superfícies do frigorífico e a flora recuperada a partir das amostras deterioradas. Além disso, a condição mais severa de termoencolhimento e vácuo aplicados (87°C/3s/9mBar), somente foi capaz de retardar o tempo para aparecimento do defeito de estufamento não o impedindo. Mesmo este tempo maior ainda foi inferior ao prazo de validade do produto. Sendo assim, pode-se inferir que a prevenção do defeito de estufamento não deve residir apenas na eliminação de células vegetativas de ambientes de planta mas também na eliminação de esporos que, uma vez arrastados para a embalagem, poderão germinar tornandose potenciais causadores do defeito de estufamento, além, é claro, da manutenção de ambientes de produção e estocagem em temperaturas inferiores a 2°C e higiene adequada durante a manipulação das carcaças e retirada do couro. Em adição, ficou comprovado que o abuso de temperatura de refrigeração acelera o estufamento de embalagens no caso de espécies de Clostridium psicrotróficos estarem presentes, principalmente C.algidicarnis, e que, as condições de vácuo/termoencolhimento aplicadas atualmente pela maioria das indústrias (83°C/3s/6mBar) não se apres entam como barreira eficiente à prevenção do defeito de estufamento na carne bovina embalada a vácuo / Abstract: This research aimed at: a. to enumerate psychrotrophic clostridia vegetative and spores from spoiled and unspoiled chilled vacuum packed red meat; b. to characterize and identify the isolates biochemical and genetically, comparing precision between then; c. to determine possible preslaughter and processing sources of psychrotrophic clostridia causing spoilage of vacuum packed red meats; d. assessment of blowing ability of Clostridium isolates at industrial conditions (6mBar/83°C-3s); e. to evaluate different vacuum and heat shrinking treatments on blown characteristics of the best representative isolates; f. to analyze physical characteristics of primary and secondary packs as well as possible damages after transport simulation (500km) that could lead to psychrotrophic Clostridium and other contaminant species incidence. For enumeration 8 spoiled samples (6 strip-loin, 1 hump beef and 1 rump cap beef) and 5 unspoiled (strip-loin): drip (1mL), surface (100cm2) and deep tissue (25g), were analyzed. Sub-samples were analyzed for vegetative psychrotrophic anaerobes (Reinforced Clostridial Medium - RCA, 5% of sterile defibrinated sheep blood, 5% of glucose and 1.5% of Agar, modified RCM); sporeforming anaerobes were counted by alcohol and heat treatment on Perfringens Agar Base (PAB, Oxoid, containing 5% sterile egg-yolk solution, 15000UI polymixin/500mL e 6mg kanamycin/500mL, PKP; 200mg cycloserin/500mL (PC)). For the 17 isolates characteried as clostridia, metronidazole test was applied for genera determination of Clostridium, isolates with inhibition zones = 3.5mm were phenotypical (by API 20A ¿ bioMeriéux) and genetically (16S rRNA sequence) identified. The slaughterhouse survey was conducted from feces, leather, stunning aisle, boning room, meat cutting conveyor belt and packing conveyor belt by sterile swabs inoculated in PYGS medium, incubated anaerobically at 4 and 15°C/4 weeks. Afte r incubation, loopfuls of the enrichments were directly streaked onto the surface of RCA and SFP (Shahidi Ferguson Perfringes), incubated for a month and then the different colonies were characterized and forwarded to genera confirmation. The confirmation of blowing ability was conducted with 12 strains, isolated from first stage of this research: 10 from red meats (8 identified as C.gasigenes and 2 as C.algidicarnis) and 2 from slaughterhouse (C.gasigenes). This test was conducted under industrial practices (6mBar, 83°C/3s), inocul ating sterile strip-loin beefs surfaces (10x5x2cm) with 1mL of vegetative cells suspension (108CFU/mL), obtained 106CFU/50cm2. Inoculated samples with 2 positive controls (inoculated with C.estertheticum) and 2 negative controls (uninoculeted samples) were performed at 2 and 15°C / 8 weeks. The three best representative isolates (2 from meat samples ¿ C.algidicarnis e C.gasigenes and 1 from slaughterhouse ¿ C.gasigenes) were tested for blown characteristics conducted at different vacuum (6 and 9mBar) and heat shrinking (83, 84 and 87°C) treatments to evaluate the time to first sign of blow pack and spoilage magnitude. The primary and secondary pack systems were evaluated for failures that support the psychrotrophic Clostridium incidence. Effects of a 500km route on primary and secondary packs were measured by transport simulation test (ASMD4169-08, for trucks). Spoiled samples showed green discoloration, increase of pH values and putrefactive and butyric odors. For these samples, the psychrotrophic vegetative anaerobic counts reached very high levels (1014CFU/mL of drip). Concerning sporeforming the heat activated ones were predominant (105CFU/mL) and also were recovered for unspoiled samples. Psychrotrophic facultative Bacillus was the dominant flora in analyzed samples (50% for spoiled and 70% for unspoiled). From 17 Clostridium suspect strains only 10 were confirmed and these 4 showed phenothypical and genetical coincident profiles (C1I13ESUPPKP, C2I2EXRCM and C4I8RCMEX ¿ C.gasigenes; C2I5EXCHPC ¿ C.algidicarnis). Concerning these 10 Clostridium isolates, 8 were identified as C.gasigenes and 2 as C.algidicarnis. It is important to emphasize that only 3 spoiled samples provided psychrotrophic Clostridium isolation, others spoiled samples flora were heterogeneous group, composed by facultative psychrotrophic Bacillus, that represented 50% of isolates from spoiled samples, and, probably, lactic acid bacteria and enterobacteria, according to Chaves (2010), in parallel research using same samples. Inside the slaughterhouse, ambient temperatures of 15°C were observed for places that should be at 0-6°C or 7°C (maximum). From slaugther house ambient and contact surfaces 38 isolates were recovered but only 2, 1 from leather and 1 for stunning aisle/meat cutting conveyor belt (same isolate from both points), were identified as Clostridium, other were characterized as psychrotrophic facultative Bacillus. These 2 isolates were identified as C.gasigenes. The occurrence of viable Clostridium on meat cutting conveyor belt is a risk for meat as a focus of blown pack spoilage clostridia. For confirmation blowing ability tests, abuse temperature decrease the time to first sign of blown pack from 30 days at 2°C to 4 days at 15°C and the isolate that better reproduce (more quickly) the spoilage was C2I5EXCHPC (C.algidicarnis) showing gas production, proteolysis and pH alteration (5.5 to 7.5) after 4 days/15°C and after 30 days/2°C. Similar results we re obtained for C.estertheticum (positive control). In addition, others two isolates that also quickly reproduced the spoilage were C2I8EXCHPC and LMI13CA/EC ¿ isolated from stunning aisle/meat cutting conveyor belt slaughterhouse, both identified as C.gasigenes, however the defect was not intense than for samples inoculated with C2I5EXCHPC (C.algidicarnis). All isolates were capable to reproduce the spoilage at the end of 8 weeks at 15°C while at 2°C, only 5 iso lates reproduce the defect. So, abuse temperature (15°C) accelerate the onset of Clostridium mediate blown pack spoilage and 2°C does not control it. Samples inocu lated with C2I5EXCHPKP (C.algidicarnis) treated with heat shrink of 83 e 84°C/6mBar showed similar perio ds for initial spoilage (~14 days), but applying heat treatment at 87°C, it was observed an increase in t his period to 4 weeks. So, using vacuum at 6mBar (industrial practice) the deterioration is retarded, but does not cease to exist, applying heat shrink of 87°C/3s, probably because this condition inactivated some heat sensitive spores. On other side, samples treated with same conditions of heat shrink but applying vacuum at 9mBar showed a decrease of time to spoilage from 14 to 4 days at 83 and 84°C/3s as lower vacuum may stimulate clostridia germination. However, for samples heat shrinked at 87°C the initial spoilage was only observed after 7 weeks at 1°C. So the condition th at more extended meat shelf-life, when inoculated, was 87°C /9mBar, but this condition not prevented C.algidicarnis development and delay of blown pack was still smaller than product shelf-life. Primary and secondary packs were according to manufacture¿s specifications. Concerning transport simulation, after 500km only one primary pack showed alterations that could support facultative anaerobes activity. In this research, it was observed coincidence between slaughterhouses and spoiled samples flora. Besides, the more rigorous condition applied (87°C/3s/9mBar) was only capable to retard the blown pack not inhibit and the time to deterioration first sign was smaller than product shelf-life. In regard to this fact, the defect prevention of blown pack spoilage is associated with the elimination of vegetative and sporeformers from slaughterhouses that after germination process could induce spoilage, besides, temperature control of production lines and storage environment at = 2°C, must be apply. In addition, abuse temperature accelerate the onset of Clostridium mediate blown pack spoilage, if psychrotrophic clostridia are present, in special, C.algidicarnis, and the industry process condition (vacuum and heat shrink - 6mBar/83°C/3s) are not capable to prevent the spoilage, being necessary the application of more efficient hurdles as efficient sanitization of process line as well as reduce temperature of the refrigerate environment / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Arnaldo Yoshiteru Kuaye / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:04:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kawaichi_MarisaEmiko_M.pdf: 2974509 bytes, checksum: a8445980822038413faf0819712260d1 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Casos de estufamento de carne bovina embalada à vácuo, causado por Clostridium estertheticum e Clostridium gasigenes, mantida sob temperatura de refrigeração vêm sendo observados em diversas regiões do Brasil, principalmente no Centro-Oeste, onde foi detectada a presença destes microrganismos em ambientes de abatedouros-frigoríficos. A complexidade analítica da técnica utilizada em pesquisas com esses microrganismos faz com que sejam escassos os trabalhos que visam o controle desse tipo de deterioração. Diante do exposto e considerando-se a importância da exportação de carne para a economia brasileira, o presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da inoculação de esporos de Clostridium estertheticum e Clostridium gasigenes em carne bovina embalada a vácuo e a eficiência esporicida in vitro do uso de ácidos orgânicos sobre estes microrganismos. Além disso, avaliou-se a capacidade de formação de biofilmes por C. estertheticum em superfície de aço inoxidável, e a eficiência de agentes químicos para sua remoção. Observou-se em carnes embaladas a vácuo, que C. gasigenes produzem maiores quantidades de gases, promovendo o estufamento da embalagem mais rápido em relação ao C. estertheticum. O primeiro indício da formação de bolhas por C. gasigenes foi observado aos 21 dias de incubação à temperatura de 7°C de armazenamento, enquanto que para C. estertheticum observou-se somente aos 35 dias na mesma temperatura. Notou-se uma produção de gás mais intensa à temperatura de armazenamento mais alta. Na carne inoculada com C. gasigenes houve um aumento progressivo no valor do pH, atingindo valores maiores em temperaturas mais elevadas, por volta de 49-77 dias, seguido por uma queda. Por sua vez, a inoculação com C. estertheticum não promoveu a mesma variação de pH, notando-se uma acentuada queda até 21-35 dias, seguido por um progressivo aumento. A utilização, de ácidos orgânicos mostrou reduzido ou nenhum efeito sobre esporos, de C. gasigenes e C. estertheticum, não sendo viável sua aplicação em cortes de carnes bovinas com a finalidade de inibir ou minimizar o blown pack. Observou-se que tanto a cepa de C. estertheticum padrão DSM 8809T quanto a cepa LHCE-13 isolada de equipamento (rolete de retirada do couro) foram capazes de formar biofilmes após 07 dias de contato com a superfície de aço inoxidável e os sanitizantes, ácido peracético (500mg/L) e peróxido de hidrogênio (200 mg/L) em contato por 15 minutos, mostraram-se eficientes no controle destes. São necessários programas de higienização mais rigorosos e efetivos para o controle de C. estertheticum e C. gasigenes nos abatedouros-frigoríficos, pois eles podem estar presentes no ambiente em forma de esporos e também como biofilmes, em locais com grande acúmulo de material orgânico ou em associações com outros microrganismos / Abstract: Occurrence of blown pack in vacuum packaged refrigerated meat caused by Clostridium estertheticum and Clostridium gasigenes have been reported by studies from several Brazilian states where these microorganisms were detected in abattoir environment such as the Midwestern region. Analytical complexity of the researches with C. estertheticum e C. gasigenes makes the studies to prevent or to control this spoilage scarce. For these reasons and it is considering the importance of Brazil¿s beef export to economy, the current study aim to assess the effect of inoculated spores of C. estertheticum and C. gasigenes on vaccum packaged meat and the efficiency in vitro of organic acid on reported microorganisms spores. Furthermore this study tested, for the first time, the ability of C. estertheticum to form biofilm in stainless steel surface and the use of some sanitizers to remove it. Results obtained from behavior analysis of C. estertheticum and C. gasigenes spores inoculated in vacuum packaged meat, showed us differences in growth between these microorganisms. C. gasigenes produced more amount of gas, leading the blown pack faster than C. estertheticum. The first evidence of gas bubble production by C. gasigenes was observed after 21 storage days at 7°C, whereas C. estertheticum started to produce bubbles only after 35 days at the same storage conditions. Gas production was intense in higher storage temperatures. Through the pH measurement it was possible verify that C. gasigenes increases progressively the pH, reaching maximum values after 49-77 days at higher storage temperatures, followed by decreasing. Moreover C. estertheticum do not cause variation in the pH, but it may be seen an accentuated decrease until 21-35 days, followed by an increase of the values, probably because of C. estertheticum ability to revert a falling pH through fast lactate fermentation, started when availability of glucose ends. Regarding to use of organic acids, there is reduced or none effect on C. gasigenes and C. estertheticum spores, it becomes this technique no viable to reduce or control blown pack in vacuum packaged meat. For the first time is demonstrate that C. estertheticum forms biofilm. Strains of C. estertheticum DSM 8809T and C. estertheticum LHCE-13 isolated from abattoir equipment (leather removal drums) are able to colonize surfaces of stainless steel in 07 days. The sanitizers peracetic acid (500mg/L) and hydrogen peroxide (200 mg/L) exposure in 5-25 day-old biofilms at least 15 minutes were effective to control them. Severe and effective hygienization program is needed to control C. estertheticum and C. gasigenes in abattoir environment, mainly because they may be present on equipment surfaces in spore forms and also through biofilm formation in places with high organic material presence / Mestrado / Engenharia de Alimentos / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-12-21T16:24:41Z No. of bitstreams: 2 Tese - Kelly Nobre Marra - 2012.pdf: 2565911 bytes, checksum: f0057800bcb5bba97865ae5ccc3e4507 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-12-26T14:21:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Kelly Nobre Marra - 2012.pdf: 2565911 bytes, checksum: f0057800bcb5bba97865ae5ccc3e4507 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-26T14:21:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Kelly Nobre Marra - 2012.pdf: 2565911 bytes, checksum: f0057800bcb5bba97865ae5ccc3e4507 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2012-05-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The involvement of Clostridium estertheticum as agents of deterioration of chilled beef packaged under vacuum from slaughterhouse brazilian, has been reported since 2007. Once detected, and presents the main sources of contamination in slaughter establishments, there was the need to advance the search for new knowledge about this Clostridia, however, the classical microbiological methods for their detection are considered difficult to implement because they require hard work and take a long time. PCR can be a quick and efficient detection of clostridia incriminated in the deterioration of beef chilled vacuum packaged and refrigerated environments slaughterhouses, without isolation of pure cultures. The objective of this study was to develop a test for realtime PCR for detection of Clostridium estertheticum in bovine meat and environments of slaughterhouse brazilian, as well as the molecular identification of isolates of Clostridium estertheticum by means of AFLP and RFLP techniques - PCR. The analytical results were compared with conventional PCR and confirmed by isolation. The Real-Time PCR assay for detection of Clostridium estertheticum in bovine meat and environments of slaughterhouse brazilian, was efficient. Evidence for the presence and distribution of C. estertheticum the sources studied and the technique of RT-PCR provided the highest percentage of positive samples from slaughterhouses that refrigerators Conventional PCR, and this is confirmed by isolation, which has become an important alternative for the detection of C. estertheticum in bovine meat and environments of slaughterhouse without isolation. The isolates used showed general similarity of 42.4%, suggesting high genetic diversity. In addition, the isolates obtained from samples of ambient and refrigerated meat tufted not show significant similarity, greater than 80%, used with any typical strain. The similarity found between the isolates may be indicative of possible similarity between those from meats and puffed from between those environments and equipment. The study revealed that additional steps necessary x for the characterization of Brazilian isolates, especially sequencing of other regions of the DNA so as to determine their taxonomic position. / O envolvimento de Clostridium estertheticum como agente de deterioração de carnes bovinas refrigeradas embaladas a vácuo provenientes de ambientes de frigoríficos no Brasil, vem sendo relatado desde 2007. Uma vez detectados, bem como apontadas as principais fontes de contaminação nos estabelecimentos de abate, surgiu à necessidade de avançar na busca de novos conhecimentos sobre esses clostrídios. No entanto, os métodos microbiológicos clássicos para sua detecção são considerados de difícil execução, pois exigem muito trabalho e demandam muito tempo. A PCR pode ser uma alternativa rápida e eficiente para detecção de clostrídios incriminados na deterioração de carnes bovinas refrigeradas embaladas a vácuo e ambientes de matadouros-frigoríficos, sem a necessidade de isolamento em culturas puras. Objetivou-se com o presente estudo desenvolver um ensaio de PCR em Tempo Real para detecção de Clostridium estertheticum em carnes bovinas e superfícies diversas de matadouros-frigoríficos brasileiros, assim como a identificação molecular de isolados de Clostridium estertheticum, por meio das técnicas RFLP e AFLP – PCR. Os resultados analíticos foram comparados com PCR Convencional e confirmados pelo isolamento. O ensaio PCR em Tempo Real desenvolvido para detecção de Clostridium estertheticum em carnes bovinas e superfícies diversas de matadouros-frigoríficos brasileiros, mostrou-se eficiente. Evidencia-se a presença e disseminação de C. estertheticum nas fontes estudadas e a técnica de PCR em Tempo Real proporcionou maior percentual de positividade para amostras de matadouros- frigoríficos que a técnica de PCR Convencional, sendo este confirmado pelo isolamento, o que demonstra ser uma alternativa importante na detecção de C. estertheticum de carnes bovinas e superfícies diversas de matadouros-frigoríficos sem a necessidade de isolamento. Os isolados utilizados revelaram similaridade geral de 42,4%, sugerindo alta diversidade genética. Além viii disso, os isolados obtidos a partir de amostras de ambientes frigoríficos e carnes tufadas não apresentaram similaridade significativa, maior que 80%, com nenhuma cepa padrão utilizada. A similaridade encontrada entre os isolados pode ser indicativa de possível semelhança entre aqueles provenientes de carnes tufadas e entre aqueles provenientes de ambientes e equipamentos. O estudo mostrou serem necessárias etapas complementares de caracterização dos isolados brasileiros, principalmente sequenciamento de outras regiões do DNA para assim determinar sua posição taxonômica.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Camila Silveira de Melo.pdf: 1600630 bytes, checksum: 775f7bf932366a49562642895c0c3764 (MD5) Previous issue date: 2011-10-07 / Abstract: Blown Pack is a process of spoilage which characterizes by the build-up of gas in the package of chilled meat cuts, causing a repulsing aspect. In Brazil, this spoilage has been described in many States, mainly meat for export, which needs longer shelf-life. The main cause of blown Pack is attributed to Clostridium estertheticum, a bacteria which multiplies easily in long-term storage at refrigeration temperatures and also in anaerobic organisms found in vacuum-packed chilled meat. The management of these bacteria in the flowchart of slaughter is very difficult due to its sporulated shape, easy dissemination and growth during the meat processing. Having said that, this work aimed to propose a decision support system for risk management for Clostridium estertheticum in the flowchart of bovine slaughter and vacuum-packed chilled beef cuts. Hence, it was carried out an identification of Control Point and Critical Point Control for bacteria as well as a risk classification and quantification in the process of vacuum-packed chilled beef cuts. The decision support system was based on the concept of Risk Assessment and Bayesian Networks. The system elaboration was performed at Shell Netica program. The probabilistic was manually input during the meeting with experts on the area. The first proposed structure of the system was elaborated for classification and quantification for microbiological risks, having as a parent node, a Risk Characterization of blown pack. The children nodes, linked to the parent node, were elaborated and based on Risk Exposure and Hazard Characterization for microbial deterioration in blown packed spoilage in meat cuts. In the second part of the proposition of the system, it was selected the slaughter operations and the determining factors of contamination in the processes. The parent nodes indentified the contamination risks and the children nodes the slaughter conditions. The system performance was assessed by specificity and sensibility. The proposed model presented a satisfactory performance, being reliable to the productive reality. The system presented high risk for blown pack for C. estertheticum, lactic acid bacteria and Enterobacteriaceae. Concerning its performance in identifying the contamination risk on the flowchart of slaughter, it has been high, with 100% of specificity and sensibility. The proposed model presented clear diagnosis, showing the operations that need more attention by the risk manager‟s part. / O tufamento é um processo de deterioração que se caracteriza pelo acúmulo de gases no interior da embalagem de cortes cárneos, provocando aspecto repugnante. No Brasil, essa deterioração já foi observada em vários Estados, principalmente em lotes destinados a exportação, que necessitam de maior vida de prateleira. O principal causador do tufamento é o Clostridium estertheticum, uma bactéria que se multiplica com facilidade em temperaturas de refrigeração e em anaerobiose, sendo essas condições encontradas em carnes embaladas a vácuo. O gerenciamento dessa bactéria no fluxograma de abate é muito difícil devido à sua forma esporulada e facilidade de disseminação e crescimento durante o processamento da carne bovina. Diante do exposto, objetivou-se com o presente trabalho propor um sistema de apoio à decisão de gerenciamento de risco de Clostridium estertheticum, no fluxograma de abate de bovinos e em cortes cárneos embalados a vácuo. Para isso, foi realizada a identificação dos Pontos de Controle e Pontos Críticos de Controle para a bactéria, além da classificação e quantificação de riscos no processo de obtenção de cortes cárneos refrigerados embalados a vácuo. O sistema de apoio a decisão foi baseado no conceito de Avaliação de Risco e Redes Bayesianas. A elaboração do sistema foi realizada no programa Shell Netica, com as probabilidades inseridas de forma manual durante reuniões com especialista da área. A primeira estrutura do sistema proposto foi elaborada para classificação e quantificação de riscos microbiológicos, possuindo como nó pai a Caracterização do Risco de tufamento. Os nós filhos, ligados ao nó pai, foram elaborados com base na Exposição de Risco e Caracterização de Perigo para deteriorantes incriminados em tufamento de cortes cárneos. Na proposição da segunda parte do sistema, foram elencadas as operações de abate e os fatores determinantes da contaminação dos processos, assim sendo, os nós pais identificaram o risco de contaminação e os nós filhos as condições de abate. O desempenho do sistema foi avaliado por meio da especificidade e sensibilidade. O modelo proposto apresentou desempenho satisfatório, sendo fidedigno à realidade produtiva. O sistema apresentou alto risco de tufamento para C. estertheticum, bactérias ácido láticas e Enterobacteriaceae. Quanto ao seu desempenho em identificar risco de contaminação no fluxograma de abate, esse se mostrou elevado, com 100% de especificidade e sensibilidade. O modelo proposto apresentou diagnósticos claros, apontando as operações que necessitam de maior atenção por parte do gestor de riscos.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Claudia peixoto bueno.pdf: 2154558 bytes, checksum: e3212e2f2e948a89b381b38c7ab473b7 (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / The deterioration of vacuum packed refrigerated meat accompanied by large gas production - a phenomenon called blown pack - is considered a major cause of economic losses of the meat industry in several regions of Brazil and the world. Several psychrophilic and psychrotrophic microorganisms may be involved, especially species of Clostridium. The objective of the present study was to perform the molecular characterization, through the use of the PCR technique, and the molecular isolation by conventional bacteriology, of the main microorganisms that cause blown pack in refrigerated meat from Brazil, New Zealand and the United Kingdom. Thus, typing techniques were used to differentiate the species and subspecies involved in this type of deterioration. Tirty-six samples of Brazilian blown pack meat, 6 samples from the UK and 12 experimental blown pack samples of venison from the North Island of New Zealand were analyzed. Three pairs of primers, the RFP / RRP, the 16SEF/16SER and the pair EISRF / EISRR were used for C. estertheticum estertheticum and Clostridium estertheticum like, and one for C. gasigenes (16DBF/16DBR). The samples with the PCR results were sent to a microbiology laboratory for conventional isolation of Clostridium estertheticum. It was concluded that Clostridium estertheticum estertheticum is responsible for the deterioration of meat and hence the blown pack in the UK. Samples of blown pack Brazilian meat have Clostridium estertheticum like as primary causal agent. The typing was carried out in isolates and strains - donated by Mirinz Center / Ruakura Agresearch / Hamilton / New Zealand - together with two isolates from Brazil, involved in this type of deterioration. The selected techniques AFLP and RFLP - PCR were able to distinguish species and subspecies of psychrophilic and psychrotrophic clostridia. However, the AFLP showed the highest discriminatory power, being able to distinguish 100% of the species - C. estertheticum, C. frigoris, C. bowmani, C. lacusfryxellense and C. psychrophylum - and also the subspecies C. estertheticum estertheticum, C. estertheticum laramiense, C. estertheticum like k21 and k24. Through the technique of RFLP, it was possible to differentiate the species of clostridia psychrotrophic, psichrophilic and also the subspecies C. estertheticum estertheticum and Clostridium estertheticum like, along with the use of four restriction endonucleases - AluI, CfoI, TaqI and HaeIII. The HaeIII provided greater variety of fragments and the ability to differentiate the species of clostridia psychrophilic and psychrotrophic, whereas TaqI was the only enzyme capable of differentiating the subspecies of C. estertheticum estertheticum and C. estertheticum laramiense of C. estertheticum like. The Brazilian samples isolated fit into the group of Clostridium estertheticum like, although there is no confirmation of the absence of Clostridium estertheticum estertheticum in the country. / A deterioração de carnes refrigeradas embaladas a vácuo acompanhada de grande produção de gás - fenômeno denominado tufamento de embalagens - é considerada uma das principais causas de perdas econômicas da indústria cárnea, em várias regiões do Brasil e do mundo. Diversos microrganismos psicrofílicos e psicrotróficos podem estar envolvidos, destacando-se espécies do gênero Clostridium. Objetivou-se com o presente estudo a caracterização molecular, por meio do emprego da técnica de PCR e o isolamento pela bacteriologia convencional, dos principais microrganismos causadores do tufamento de embalagens de carnes refrigeradas procedentes do Brasil, Nova Zelândia e Reino Unido. Para tanto, foram empregadas técnicas de tipagem visando a diferenciação das espécies e subespécies envolvidas neste tipo de deterioração. Foram analisadas 36 amostras tufadas de carnes brasileiras, 6 amostras tufadas oriundas do Reino Unido e 12 amostras experimentais tufadas de carne de cervo provenientes da Ilha Norte da Nova Zelândia. Foram utilizados três pares de primers, o RFP/RRP, o 16SEF/16SER e o par EISRF/EISRR para C. estertheticum estertheticum e Clostridium estertheticum like e um para C. gasigenes (16DBF/16DBR). As amostras com os resultados positivos ao PCR foram enviadas para a microbiologia convencional para isolamento do Clostridium estertheticum. Concluiu-se que o Clostridium estertheticum estertheticum é responsável pela deterioração das carnes e, consequentemente, pelo tufamento das embalagens no Reino Unido. As amostras tufadas de embalagens de carnes brasileiras têm como principal agente causador o Clostridium estertheticum like. A tipagem foi relizada em cepas e isolados doados pelo Mirinz Centre/ Ruakura AgResearch/ Hamilton/NZ - juntamente a dois isolados brasileiros, envolvidos nesse tipo de deterioração . As técnicas eleitas AFLP e RFLP PCR foram capazes de distinguir as espécies e subespécies de clostrídios psicrofílicos e psicrotróficos, porém, o AFLP apresentou maior poder discriminatório, sendo capaz de diferenciar 100% das espécies C. estertheticum, C. frigoris, C. bowmani, C. lacusfryxellense e C psychrophylum - e também as subespécies - Clostridium estertheticum estertheticum, Clostridium estertheticum laramiense, o Clostridium estertheticum like K21 e Clostridium estertheticum like K24. Por meio da técnica de RFLP foi possível diferenciar as espécies do clostrídio psicrofílicos e psicrotróficos e também as subespécies C. estertheticum estertheticum e Clostridium estertheticum like, utilizando em conjunto as quatro endonucleases de restrição AluI, CfoI, TaqI e HaeIII. A HaeIII proporciona maior variedade de fragmentos e capacidade de diferenciar as espécies de clostrídios psicrofílicos e psicrotróficos. Já a TaqI foi a única enzima capaz de diferenciar as subespécies C. estertheticum estertheticum e C. estertheticum laramiense do C. estertheticum like. As amostras brasileiras isoladas se enquadraram no grupo do Clostridium estertheticum like.