A pele dos vertebrados é alvo da maioria das 15.000 espécies de artrópodes hematófagos existentes e pouco se sabe sobre as estratégias imunológicas utilizadas pelos hospedeiros para expulsar esse tipo de ectoparasitos. É fato que carrapatos, como artrópodes hematófagos, são capazes também de induzi-las. Entre a grande variedade de hospedeiros, os bovinos, que apresentam fenótipos variáveis de resistência ao Ripicephalus (Boophilus) microplus, constituem o único modelo no qual é possível correlacionar as respostas imunológicas entre os fenótipos contrastantes na mesma espécie hospedeira. Para tal, as populações celulares do infiltrado induzido na pele pelo carrapato foram quantificadas nos bovinos resistentes, Bos taurus indicus e nos suscetíveis, Bos taurus taurus. Como esperado, o carrapato induziu inflamação cutânea local nos bovinos estudados e a composição celular do infiltrado apresentou diferenças que variaram entre os fenótipos contrastantes de infestação. A pele resistente apresentou maior número de basófilos em comparação a pele suscetível infestada pelo carrapato adulto (P < 0,05) o que sugere a participação desse tipo de granulócito na resposta imune, prejudicando a hematofagia do carrapato. Eosinófilos não foram observados na pele naïve, mas sim na pele normal e infestada, apresentando maiores quantidades (P < 0,05) na pele resistente infestada por ninfa e por adulto. Esse granulócito também se mostrou importante para a aquisição de resistência a carrapatos, a cinética observada na pele dos animais sugere um efeito sistêmico de eosinófilos na infestação. Já mastócitos se mostraram reduzidos de forma semelhante na pele resistente e suscetível infestada por ninfa e adulto em comparação a pele não infestada das mesmas (P < 0,05), sugerindo desgranulação induzida pela saliva do carrapato. As citocinas e mediadores inflamatórios liberados por mastócitos poderiam desencadear e até modular as respostas imunes de contra o carrapato. Neutrófilos estavam em 9 quantidades semelhantes na pele infestada de ambas as raças, apresentando maior quantidade na fase de adulto em relação à fase de ninfa (P < 0,05). Esse fato sugere que a saliva da ninfa expressa desintegrinas contendo RGD, que possivelmente são específicas para esse granulócito. Em contrapartida, as células mononucleares foram mais abundantes na pele resistente e suscetível infestadas por ninfa em relação às infestadas por adulto (P = 0,001). Entre as populações mononucleares fenotipadas, as células T CD3+ foram recrutadas em maior número na pele resistente infestada por ninfa e adulto que na pele suscetível nas mesmas fases (P < 0,05), indicando sua importância na regulação da resposta imune de resistência ao ectoparasito. Células CD4+ foram mais numerosas na pele resistente infestada por adulto que a pele suscetível infestada pela mesma fase (P < 0,05); já as células CD8+ estavam em maior número na pele resistente infestada por ninfa do que na pele suscetível na mesma fase de infestação (P < 0,05). Células T gd/WC1+ foram mais abundantes (P < 0,05) na pele resistente infestada por adulto que a mesma não infestada, indicando que esses linfócitos podem desempenhar papel importante na aquisição de resistência. Já os linfócitos B estiveram em número reduzido na pele suscetível infestada por ninfa e por adulto em comparação à mesma não infestada (P < 0,05). Entretanto, na pele resistente infestada por adulto, o número desses linfócitos foi maior (P < 0,05) em comparado ao encontrado na pele suscetível infestada pela mesma fase, sugerindo a participação de anticorpos na aquisição de resistência a carrapatos. Embora não significativa, o maior número de células Natural Killers na pele resistente, sugere seu envolvimento na proteção contra doenças transmitidas por carrapatos. Em suma, os resultados obtidos sugerem que a resposta imune local envolve células residentes e recrutam outras que, em conjunto, atuam na imunorregulação e na elaboração de respostas imunes efetoras e de memória eficazes contra carrapatos. / The skin of vertebrates is the largest for over 15,000 species of hematophagous arthropods. Among them are ticks, which are long-term feeders and interact with host defenses for days to weeks. Little is known about specialized strategies for eliminating ectoparasites, but ticks can induce immune responses in host. Bovines present variable and heritable levels of resistance to the Ripicephalus (Boophilus) microplus and are the only model in which distinct outcomes of infestation can be examined in the same species of host. In order to obtain some of the immune correlates of these outcomes, we quantified populations of leukocytes and lymphocytes present in the inflammatory infiltrates elicited by tick bites in skin of resistant and susceptible bovine breeds, respectively, Bos taurus indicus and Bos Taurus taurus. As expected, ticks induce cutaneous inflammatory infiltrates around their mouthparts. However the composition of infiltrate presented with significant differences that varied according to the phenotype of infestation. Inflammation of resistant breed contained significantly more basophils than in susceptible adult-infested skin (P<0.05). Eosinophils were absent in skin from naïve animals, but were present in normal and infested skin. They were present in infested skin of both breeds and more significantly so in nymph and adult-infested skin of resistant breed (P<0.05). However, mast cell numbers were equally diminished in nymph and adult-infested skin of both breeds when compared with non-infested skin (P<0.05). The neutrophils were equally present in infested skin of both breeds, but they are more numerous in skin infested with adults than with nymphs (P<0.05). Conversely, mononuclear cells were more abundant in skin infested with nymphs than with adults (P=0.001). Bites by nymphs and adults recruit more CD3+ T cells in skin of resistant breeds than in that of susceptible ones (P<0.05). The CD4+ populations of cells 11 were more numerous in adult-infested skin of resistant than in that of susceptible (P<0.05); CD8+ cells were increased in nymph-infested skin of resistants relative to that of susceptibles (P<0.05). The population of gd/WC1+ T cells were more abundant (P<0.05) in adult-infested skin of resistant when compared with those found in control skin of the same animals. The numbers of B lymphocytes were diminished in nymph and adult-infested skin of susceptibles when compared with those found in control skin (P<0.05); in adult-infested skin of resistants, B lymphocytes were more numerous (P < 0,05) than in skin of susceptibles. Bites by nymph and adult tends to recruited more Natural Killers cells to skin in resistant breed than in susceptible one (P > 0,05). The results suggest that mast cells are source of cytokines and inflammatory mediators that play effectors and modulator roles in immune responses, their reduction possibly due to degranulation by tick saliva. Amount of neutrophils in infested skin may reflect the fact that only nymphs express RGD-containing disintegrins, which are possibly neutrophils-specific. Eosinophils, as well as basophils, are important to ticks resistance, their skin kinetic suggesting a systemic effect of tick infestations. Basophils resistant host increasing suggesting that they are the pivotal cells that impair haematophagy. The observed increase of CD3+ T cells in nymph and adult-infested skin of resistants suggests their importance to regulate anti-tick immune responses. The diminished numbers of B cells in susceptible breed indicate that antibodies are important in acquired resistance to ticks. On the other hand, the reduction of gd/WC1+ T cells seen in the infested skin of susceptible bovines indicates that these cells may play a role in resistance to ticks. Natural Killers cells could help the development of efficacious immune responses to ticks-borne diseases. In conclusion, these results reflect the fact that local responses involve resident and infiltrating leukocytes and lymphocytes that are sources of immunoregulatory, effectors and memory responses elicited against ticks.

O coronavírus bovino (BCoV) e rotavírus (RV) são importantes agentes da diarréia neonatal bovina, causando grandes perdas econômicas. O BCoV é também responsável pela disenteria de inverno em vacas adultas e por desordens respiratórias e o RV possui um aspecto zoonótico de importância na saúde pública. Este estudo teve o objetivo de desenvolver uma multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção simultânea de BCoV e RV do grupo A com a utilização de um controle interno. Para tanto, foram desenhados três primers dirigidos ao gene N de BCoV (306pb) e três primers dirigidos ao gene VP1 do RV do grupo A (228pb); para o controle interno, foram utilizados dois primers dirigidos ao mRNA do gene mitocondrial bovino ND5 (191pb). Foram utilizados como controles positivos a amostra Kakegawa de BCoV (título HA de 256), a amostra 8209 de rotavírus do grupo A (título viral de 101.66TCID50%/200µL) e suspensão de células MDBK para o controle interno. A extração de RNA foi realizada com o reagente comercial TRIzol, de acordo com as recomendações do fabricante. Foram realizados gradientes de temperatura para a determinação da temperatura ótima de hibridação para cada par de primers, resultando em 50ºC para PCR e 55ºC para a hemi-nested. Doze protocolos com diferentes concentrações de Taq DNA polymerase, MgCl2, primers e DNA-alvo foram testados. Para determinação do limiar de detecção, o protocolo final foi utilizado em diluições dos dois vírus em suspensão de amostras fecais negativas para BCoV e RV adicionadas de 10% de suspensão de células MDBK, obtendo o limiar de detecção de 10-8 para os dois vírus e aplicado em amostras fecais de bezerros (53) e vacas adultas (22). Todas as amostras foram previamente testadas para BCoV por uma nested RT-PCR dirigida ao gene RdPd, sendo 15 positivas, e para rotavírus pela PAGE, sendo 3 positivas. Para a multiplex, 15 amostras foram positivas para BCoV e 6 para rotavírus. O seqüenciamento de DNA das amostras positivas para multiplex demonstrou a especificidade do teste. Uma concordância ótima foi encontrada para BCoV (0,833) e substancial para rotavírus (0,648) calculada pela estatística kappa, comparando-se com os testes de referência. Estes resultados demonstram que a padronização da multiplex foi eficiente para a detecção de BCoV e RV, com elevadas sensibilidade e especificidade. Além disso, o diagnóstico simultâneo dos dois agentes permite um diagnóstico rápido e a um menor custo devido à utilização de reduzidas quantidades de reagentes e mão de obra, fornecendo uma importante ferramenta para o diagnóstico e estudo da etiologia da diarréia em bovinos. / Bovine coronavirus (BCoV) and rotavirus (RV) are important agents of neonatal diarrhea in cattle, causing large economic losses. BCoV is also responsible for winter dysentery in adult cattle and respiratory disorders and RV has a zoonotic aspect of importance in public health. This study aimed to develop a multiplex hemi-nested RT-PCR for simultaneous detection of BCoV and RV of group A with an internal control. For this purpose, three primers were designed targeting the N gene of BCoV (306pb) and three primers targeting to the VP1 gene of group A RV (228pb); for internal control, two primers targeting to the mRNA of ND5 bovine mitochondrial gene (191pb) were used. Positive controls were BCoV Kakegawa strain (HA titer 256), group A bovine rotavirus strain 8209 (viral titer of 101.66TCID50%/200µL), and MDBK cells suspension for internal control. The RNA extraction was performed with the commercial reagent TRIzol. Temperature gradients were carried out for each primers pair for the determination of the optimal hybridization temperatures, resulting in 50°C for PCR and 55°C for the hemi-nested. Twelve protocols were tested with different concentrations of Taq DNA polymerase, MgCl2, primers and target DNA. The final protocol was used in 10-fold dilutions of the two viruses in suspension of fecal sample negative for BCoV and RV added to 10% of MDBK cells suspension, obtaining the detection limit of 10-8 for the two viruses, and applied to 75 fecal samples from calves (53) and cows (22). All samples were previously tested for BCoV by a nested RT-PCR to RdPd gene, being 15 positive; and for rotavirus by PAGE, being 3 positive. For multiplex, 15 samples were positive for BCoV and 6 for RV. The DNA sequencing of multiplex-positive samples substantiates the specificity of the test. A great agreement was found for BCoV (0.833) and substantial for RV (0.648) by calculating the kappa statistic in comparison to the reference tests. These results demonstrate that the multiplex standard was effective in the detection of BCoV and RV, with high sensitivity and specificity. In addition, simultaneous diagnosis of both agents allows a faster and at lower cost diagnosis due to use of smaller quantities of reagents and labor, providing an important tool for the diagnosis and study on the etiology of diarrhea in cattle.

A tolerância materno-fetal envolve, além do sistema imune, muitas peculiaridades quanto ao tipo de placenta e placentação. A placenta em bovinos é considerada não invasiva, e como conseqüência de uma implantação superficial, sem invasão endometrial, se estabelece uma barreira placentária complexa que se interpõe entre a circulação materna e fetal. Aliado a isso, a placenta um órgão que se encontra em constante diferenciação e proliferação celular além da alta atividade metabólica, fontes constantes de estresse e desafio para o sistema imune. Atuando nesse contexto, destacamos as proteínas de choque térmico (heat shock proteins HSP), proteínas que são expressadas em condições fisiológicas mas, em situações de estresse, sua expressão aumenta. Na placenta bovina já se constatou a expressão das HSP 60 e 70; contudo notou-se uma maior peculiaridade na expressão da HSP 60, que é maior no primeiro trimestre da gestação. Observando-se o perfil da presença e expressão dessa proteína na placenta bovina e, tendo em vista a característica desse órgão em apresentar populações leucocitárias funcionalmente distintas das do sangue periférico, levantou-se a hipótese da influência desta proteína sobre as células placentárias, particularmente sobre os leucócitos no processo de tolerância materno fetal. Desta forma, esse trabalho analisou a participação da HSP 60 em mecanismos imunes junto à alguns leucócitos placentários por meio de ensaio de proliferação pela técnica de CFSE, ensaio de fagocitose e ensaios bioquímicos como peroxidação lipídica; ciclo celular e potencial de membrana mitocondrial de células placentárias em cultivo. Nossos resultados mostraram que a HSP 60 não influencia a proliferação de linfócitos e outras células placentárias nas diversas condições testadas. Em contrapartida a HSP 60 aumenta a fagocitose e apoptose no terceiro terço gestacional, bem como a produção de radicais oxidados poliinsaturados e o potencial de membrana mitocondrial. Tendo em vista esses resultados, podemos observar que a HSP 60 nas células da placenta bovina possivelmente esteja modulando a cinética da ativação de mecanismos de sinalização de morte celular programada entre as células da placenta e o sistema imunológico. Esta hipótese assegura que, no concepto a termo, as variações hormonais e o sistema imune possam estar regulando o processo para o nascimento do feto. / The maternal-fetal tolerance involves, besides the immune system, many peculiarities regarding the type of placenta and placentation. The bovine placenta is considered not invasive and, as consequence of a superficial implantation without endometrial invasion, it establishes itself as complex barrier that interposes between the maternal and fetal circulation. In addition to that, placenta is an organ that undergoes continuous differentiation and cellular proliferation besides the high metabolic activity that represents a constant source of stress and challenge for the immune system. As an important component in this context, we highlight the heat shock proteins - HSP, that are usually expressed in physiological conditions but, in situations of stress, their expression increases. In the bovine placenta the expression of HSP 60 and 70 has already been verified; however HSP 60 showed a peculiar expression behavior, with higher staining in the first trimester of pregnancy. Considering the presence and expression profiles of HSP 60 in the bovine placenta allied to the particularity of presenting functional distinct leucocytes populations, a hypothesis was raised regarding the influence of this protein on the placental cells, particularly on the leucocytes in the process of fetal-maternal tolerance. Therefore, this work analyzed the role of HSP 60 in immune mechanisms related to some placental leucocytes by several approaches like proliferation assay by CFSE technique, phagocytosis assay and biochemical assays as lipoperoxidation; cell cycle phases and mitochondrial membrane potential of placental cells in culture. Our results showed that HSP 60 does not influence the proliferation of lymphocytes or any other placental cells in various conditions tested. On the other hand, HSP 60 increases phagocytosis and apoptosis in the third trimester, as well as the production of polyunsaturated oxide radicals and the mitochondrial membrane potential. In view of these results, we may infer that HSP 60 may be modulating the kinetics of activation mechanisms for signaling programmed cellular death between placental and immune cells. This hypothesis assures that, on the termed conceptus, the hormonal variation and the immune tolerance may be responsible for regulating the parturition process.

A sexagem espermática tem um grande impacto na produção animal, pois permite a escolha do sexo dos descendentes, tendo o seu uso aumentado consideravelmente nos últimos anos. Atualmente, as taxas de blastocistos produzidos in vitro com sêmen sexado são semelhantes às com sêmen não sexado. Entretanto, quando utilizado na inseminação artificial (IA) e/ou transferência de embriões (TE) as taxas de gestação ou produção de embriões ainda são inferiores às obtidas com sêmen convencional. Esses resultados indicam que são necessários mais esclarecimentos sobre o efeito da sexagem nas células espermáticas. Este estudo teve o objetivo de avaliar possíveis alterações moleculares e funcionais dos espermatozoides causadas pelo processo de sexagem, além de tentar identificar diferenças entre espermatozoides contendo o cromossomo X ou Y. Para isto, um ejaculado de cada touro Nelore (n=4) foi colhido e separado em três frações: não sexado (NS), sexado X (SX) e sexado Y (SY), sendo utilizado em 3 experimentos. Nos experimentos 2 e 3, um quarto grupo foi formado pelo pool de espermatozoides sexados X e Y (XY). No primeiro experimento, utilizando a técnica de bisulfito de sódio, foi realizada a avaliação do padrão de metilação dos genes imprinted IGF2 e IGF2R em espermatozoides sexados e não sexados. No segundo experimento, foi avaliado o efeito da sexagem no tamanho e na forma da cabeça do espermatozoide e as possíveis diferença entre espermatozoides contendo cromossomo X ou Y. No último experimento, verificou-se o efeito da sexagem espermática na longevidade dos espermatozoides mantidos em meio de cultivo por 12 horas e na sua capacidade de se ligar às células da tuba uterina (CTU). No experimento relacionado à epigenética, não foi encontrada diferença no padrão de metilação dos genes IGF2 e IGF2R. Entretanto, identificou-se um polimorfismo no gene IGF2, e um padrão de metilação específico do gene IGF2R, provavelmente devido a uma característica epigenética especifica de animais Bos indicus. No experimento 2, não foi encontrada diferença em nenhuma das 23 variáveis estudadas entre os grupo X e Y. Entretanto, usando simultaneamente diversos parâmetros por meio de análise discriminante, na tentativa de diferenciar os grupos, o modelo mais discriminante atingiu 100% de precisão na identificação de espermatozoides de cada grupo NS, SX, SY e SXY. No experimento 3 foi identificado que o processo de sexagem afeta características estruturais da célula espermática, induzindo umacapacitação e reação acrossômica. Porém, ao longo de 12 horas de cultivo, a cinética dos espermatozoides sexados foi semelhante a do sêmen convencional. Além disto, foi identificado que o processo de sexagem comprometeu a capacidade dos espermatozoides de se manterem ligados às CTU. Em relação aos espermatozoides X e Y, foi observada uma menor capacidade do grupo X de se ligar às CTU, assim como uma diferença em características relacionadas à motilidade e acrossoma. Esses resultados podem contribuir no estabelecimento de procedimentos mais adequados para melhorar o aproveitamento e os resultados quando da utilização do sêmen sexado e em melhorias no processo de sexagem, ou mesmo no desenvolvimento de novas tecnologias para a separação de espermatozoides X ou Y. / Sperm sorting can have a great impact on breeding programs because it allows sex selection of the offspring, being its use increased considerably in last few years. Currently the rate of in vitro produced blastocyst using sexed sperm is similar to that obtained with no sexed sperm. However, lower rates of pregnancy and blastocyst are observed when sexed sperm are used for artificial insemination or embryo transfer compared to the conventional sperm. These results suggest that further studies are needed to clarify the effects of sexing process on sperm cells. This study aimed to evaluate molecular and functional changes caused by the sorting process, as well as to identify possible differences between sperm containing the X or Y chromosome. Each ejaculate of Nelore bulls (n=4) was collected and separated into three fractions: non-sexed (NS), sexed for X-sperm (SX), and sexed for Y-sperm (SY), being used in 3 experiments. For the experiment 2 and 3 a fourth group was formed by pooling SX and SY samples (SXY). On the first experiment, methylation pattern of the IGF2 and IGF2R imprinted gene in sexed and non sexed sperm was assessed using sodium bisulfite method. On the experiment 2, we evaluated whether sexing by flow cytometry changes the shape and size of the sperm head, and if these measurements differ between cells that bearing the X or Y chromosome. In the last experiment, the effect of sorting process on sperm longevity during 12 h incubation and their ability to bind to oviduct cells were evaluated. In the experiment related to methylation patterns, sex-sorting procedures have not affected DNA methylation patterns of the IGF2 and IGF2R genes. However, a polymorphism was found in IGF2 gene, and a very specific methylation patterns was observed in the IGF2R gene, probably due to an epigenetic characteristic in Bos indicus cattle. On experiment 2, no differences between X and Y sperm group were observed for any of the studied characteristics. However, using different parameters simultaneously in discriminator analysis, in an attempt to differentiate groups, the greatest discriminator model had 100% accuracy to identify the sperm from NS, SX, SY and SXY group. On experiment 3, it was identified that sorting process affected structural sperm characteristics, inducing a pre capacitation status and acrosome reaction. However, after 12 hours of incubation the kinetics of the sexed sperm was similar to the non sexed sperm. Furthermore, sexing process affected the ability of sperm to maintained bound to the oviduct cells. Regarding X and Y sperm, it was observed that X group had a lower ability to bind to the CTU, being the X sperm more susceptible to sorting process than the Y sperm. These results can contribute to improve the use and results of the sexed sperm, as well as to induce enhancements in the sexing process, or even to develop new technologies for separation of X or Y sperm cell.

Os processos inflamatórios na glândula mamária são especialmente freqüentes e importantes em bovinos leiteiros, sendo responsáveis por grandes prejuízos à pecuária leiteira. A mastite infecciosa é a mais importante doença sob o ponto de vista econômico e de saúde pública. A contagem de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) de leite proveniente diretamente de uma glândula mamária permitiria avaliar o comportamento de cada um dos agentes etiológicos da mastite infecciosa. A comparação desta informação com a contagem de células somáticas (CCS/mL) na amostra de leite permitiria uma avaliação mais acurada do processo infeccioso e inflamatório na glândula mamária. O presente trabalho teve como objetivos: avaliar o \"status\" microbiológico de amostras de leite de vacas em lactação que apresentaram mastite e comparar a quantidade de UFC/mL de colônias dos diferentes microrganismos com as respectivas CCS/mL, levando em consideração a diferenciação de células polimorfonucleares (PMN/mL) e mononucleares (MN/mL) nas amostras. Quinhentas e seis amostras de 15 propriedades de exploração leiteira do Estado de São Paulo, Brasil, foram submetidas aos testes de Tamis e California Mastitis Test (CMT), e realizados os exames microbiológicos, contagem de UFC/mL e CCS/mL. Destas, 112 não apresentaram crescimento de microrganismos, e das amostras com crescimento foram isolados: 94 Corynebacterium spp., 104 Staphylococcus spp., 73 Streptococcus spp., 36 Prototheca zopfii, 08 Candida spp., 02 Nocardia spp. e 77 associações entre os microrganismos. Houve correlação entre o número de UFC/mL com a CCS/mL, assim como entre PMN/mL e entre MN/mL. Concluiu-se que existe um aumento da CCS/mL, PMN/mL e MN/mL no leite quando há um aumento das contagens de UFC/mL. As quantidades de UFC/mL no leite com isolamento de Streptococcus spp. foram maiores estatisticamente (P < 0,05) que as quantidades de UFC/mL com isolamento de Corynebacterium spp. e Staphylococcus spp. Concluiu-se também que, em havendo necessidade de tratamento de mastite clínica e subclínica no rebanho devido às altas contagens de UFC/mL, deve-se tratar inicialmente os quartos nos quais foram isolados Streptococcus spp. e deixar para uma segunda etapa ou para o processo de secagem o tratamento das mastites associadas à Staphylococcus coagulase-positivo, Staphylococcus coagulase-negativo e Corynebacterium spp. nessa mesma ordem. / Mastitis is a complex pathologic condition which may have different etiology and consequences. Mastitis usually starts with the penetration of microorganisms through the teat canal towards mammary parenchyma and secretory cells, and an inflammatory response occurs due to the products of the microbial growth. The aim of this work was to evaluate the microbial status of milk samples collected from lactating cows with mastitis and comparing the colonies forming units (CFU)/mL and the somatic cell counts (SCC)/mL, taking into consideration the differentiation of polymorphonuclear (PMN/mL) and mononuclear (MN/mL) cells. From primiparous and pluriparous dairy cows, 506 milk samples were collected from 15 dairy farms located in the State of São Paulo, Southeastern Brazil. Samples were submitted to strip cup test and California Mastitis Test (CMT) and evaluated for CFU and SCC procedures. For microbial examinations, 112 (22.13%) samples were found negative and from the other 394, the following microorganisms were isolated: 94 (18.58%) Corynebacterium spp., 104 (20.55%) Staphylococcus spp., 73 (14.42%) Streptococcus spp., 36 (7.11%) Prototheca zopfii, 8 (1.60%) Candida spp., 2 (0.39%) Nocardia spp., and 77 (15.21%) associations among distinct microorganisms. Significant correlations were found between the CFU/mL and SCC/mL, and also with the PMN and MN cell countings. With the increased CFU/mL countings, it was observed the increase in SCC, PMN, and MN countings. The CFU/mL counts in samples with Streptococcus spp were statistically higher (P < 0.05) than the ones positive for Staphylococcus spp. and Corynebacterium spp. In case of treatments of mastitis, target must be primarily oriented to treat the mammarial glands showing clinical or subclinical mastitis with Streptococcus spp. showing high CFU/mL, and at the second stage, in case of treatment or drying the cows, therapy must be directed against coagulase-positive Staphylococcus, coagulase-negative Staphylococcus and Corynebacterium spp.

O 17&#946;-E2 estimula a expressão de receptores endometriais, ER e OXTR. A ativação de OXTR induz a ativação da cadeia de síntese de PGF2&#945;. A hipótese do presente estudo é que as enzimas de síntese de PGF2&#945; são reguladas pelo 17&#946;-E2. Objetivou-se determinar os efeitos do 17&#946;-E2 na expressão gênica e proteica, assim como na localização de proteínas envolvidas na síntese de PGF2&#945;. Vacas Nelore multíparas, solteiras e cíclicas foram sincronizadas por aplicação de BE e inserção de dispositivo de P4. Após 8 dias realizou-se a remoção do dispositivo de P4 e aplicação de PGF2&#945;, seguido por 4 dias de observação de estro (D0=dia do estro). Entre D14 e D27 foram realizadas avaliações diárias da área do CL (cm2), fluxo sanguíneo (%) e concentração plasmática de progesterona (P4). No D15 as vacas foram divididas em três grupos: Controle (C; não tratado;N= 10), Placebo (P; 6mL de etanol 50%; IV; N= 21) e Estradiol (E; 3mg 17&#946;-E2; 6mL de etanol 50%; IV;N=21). Subsequente aos tratamentos, biópsias uterinas foram coletadas nos tempos 0h (C; N=10); 4h (E4h, N=11 e P4h; N=10) ou 7h (E7h, N=10 e P7h, N=11). Amostras de sangue foram obtidas nos tempos 0h a 7h, para mensuração das concentrações PGFM no D15. O grupo E apresentou acentuada diminuição da área do CL, fluxo sanguíneo e concentração de P4 (P&lt;0,05), comparado ao grupo P. Comparado ao grupo P, as vacas do grupo E anteciparam o dia da luteólise funcional e estrutural em 2 e 3 dias, respectivamente. O grupo E apresentou maior concentração de PGFM nos tempos 4h, 6h e 7h (P&lt;0,05), comparado ao grupo P. A quantificação dos transcritos realizada por qPCR (N=6/grupo). Na hora 4, a abundância dos genes ESR1, ESR2, PRKC&#945;, PRKC&#946;, PLA2G4, AKR1B1 e AKR1C4 foi menor nas amostras E4h, enquanto OXTR foi maior nas mesmas amostras comparando-se com as amostras P4h (P&lt;0,05). A expressão gênica de PTGS2 não diferiu entre os grupos E4h e P4h (P&gt;0,05). Na hora 7, as amostras E7h também apresentaram menor abundância de ESR1, PRKC&#945;, PRKC&#946;, AKR1B1 e AKR1C4 (P&lt;0,05) e houve tendência para menor expressão de ESR2, comparado às amostras P7h. Contudo, não houve diferença na abundância de OXTR, PLA2G4 e PTGS2 entre as amostras E7h e P7h (P&gt;0,05). A abundância da enzima PKC&#945; analisada por Western Blotting (N=3/grupo) foi diminuída tanto nas amostras E4h como nas E7h, em relação às amostras P4h e P7h, respectivamente. Na avaliação por imunohistoquímica (N=5/grupo), o grupo E4h apresentou maior imunomarcação de PGR no epitélio glandular (P&lt; 0,05) e houve tendência para maior imunomarcação de PKC&#978; no epitélio luminal, comparado ao grupo P4h (P=0,08). Houve tendência para menor imunomarcação de ER&#945; no epitélio glandular do grupo E4h comparado ao grupo E7h (P=0,1). Concluí-se que a aplicação do 17&#946;-E2 levou a redução da maioria dos transcritos das moléculas de síntese de PGF2&#945;, assim como da abundância de PKC&#945;. O possível mecanismo para a estimulação de PGFM por 17&#946;-E2 pode incluir o aumento da ativação de enzimas que participam na cascata de síntese de PGF2&#945;. / 17&#946;-E2 stimulates the expression of endometrial receptors, ER and OXTR. Activation of OXTR induces the activation of the synthesis of PGF2&#945; pathway. The central hypothesis is that the enzymes involved in PGF2 synthesis are reguleted by 17&#946;-E2. The objective of this study was to determine the effects of 17&#946;-E2 on gene and protein expression and localization of the enzymes involved in PGF2&#945; synthesis. Multiparous, non-lactating and cyclic Nelore cows were synchronized by BE application and P4 device insertion. After 8 days the P4 device was removed and a single dose of PGF2&#945; applied, followed by 4 days of estrus detection (D0 = day of estrus). Daily measurements of CL area (cm2), blood flow (%), and plasma progesterone concentration (P4) were performed between D14 and D27. On D15 cows were divided into three groups: Control (C, untreated, N = 10), Placebo (P; 6mL of ethanol 50%, IV; N = 21) and Estradiol (E; 3mg 17&#946;-E2; Ethanol 50%, IR: N = 21). After the treatments administration, uterine biopsies were collected at times 0h (C; N = 10); 4h (E4h, N = 11 and P4h, N = 10) or 7h (E7h, N = 10 and P7h, N = 11). Blood samples were obtained from time 0h to 7h for the measurement of the PGFM concentrations on D15. Group E showed a marked decrease in CL area, blood flow, and P4 concentration (P &lt;0.05) compared to group P. Also, when compared to group P, cows from group E anticipated the day of functional and structural luteolysis in 2 and 3 days, respectively. Group E presented higher concentration of PGFM at 4h, 6h and 7h (P &lt;0.05), compared to group P. The transcripts abundance was performed by qPCR (N = 6 / group). The transcripts abundance of ESR1, ESR2, PRKC&#945;, PRKC&#946;, PLA2G4, AKR1B1, and AKR1C4 genes was lower in the E4h samples, while OXTR was higher in the same samples compared to the P4h (P &lt;0.05) samples in the time 4h. The gene expression of PTGS2 did not differ between groups E4h and P4h (P&gt; 0.05). At time 7h, samples E7h also had lower abundance of ESR1, PRKC&#945;, PRKC&#946;, AKR1B1 and AKR1C4 (P &lt;0.05) and there was a tendency for lower ESR2 expression, compared to samples P7h. Nevertheless, there was no difference in the abundance of OXTR, PLA2G4, and PTGS2 between samples E7h and P7h (P&gt; 0.05). The abundance of the PKC&#945; enzyme analyzed by Western Blotting (N = 3 / group) was decreased in both the E4h and E7h samples, relative to the samples P4h and P7h, respectively. In the evaluation by immunohistochemistry (N = 5 / group), the E4h group presented greater PGR immunostaining in the glandular epithelium (P &lt;0.05) and there was a tendency for a greater immunostaining of PKC&#978; in the luminal epithelium, compared to the P4h group (P = 0,08). There was a tendency for lower ER&#945; immunostaining in the glandular epithelium of the E4h group compared to the E7h group (P = 0.1). It was concluded that the application of 17&#946;-E2 led to the reduction of most of the transcripts of the PGF2&#945; synthesis molecules, as well as the abundance of PKC&#945;. The possible mechanism for stimulation of PGFM by 17&#946;-E2 may include increased activation of enzymes that participate in the cascade of PGF2&#945; synthesis.

Para comparar o risco de intoxicação por uréia granulada (G) e extrusada (E) 24 garrotes, nunca alimentados com uréia, foram distribuídos em quatro grupos de seis animais, onde foi administrada, de uma só vez, (G) ou (E) em duas diferentes doses: alta (A; 0,5 g/kg PV) ou padrão (B; 0,22 g/kg PV). Em seguida, foram acompanhados o pH e os teores de amônia no rúmen, as concentrações sangüíneas de amônia, uréia, creatinina, glicose, lactato-L, potássio, as atividades de gama glutamiltransferase, aspartato aminotransferase e creatina quinase, perfil hemogasométrico e hematócrito, além de acompanhamento quadro clínico no decorrer de 240 min após as administrações de G ou E. Alguns animais dos grupos GB e EB tiveram um discreto quadro de intoxicação, se recuperando sem quaisquer tratamentos. Por outro lado, cinco garrotes de ambos grupos GA e EA tiveram severo quadro tóxico que exigiram tratamento, sendo que um animal GA sucumbiu. A velocidade de hidrólise ruminal da uréia G e E foi semelhante, embora as manifestações clínicas tenha sido iniciadas mais tardiamente no grupo EA. Quanto mais intensa foi a hiperamoniemia mais destacada foi o grau de acidose metabólica, desidratação, a glicólise anaeróbica e a gliconeogênese. Pela análise das atividades enzimáticas comprovou-se que os danos bioquímicos foram intensos na musculatura, mas não nos hepatócitos. Concluiu-se que tanto a uréia G como E quando oferecidas subitamente, em especial em doses altas, podem oferecer igual risco de intoxicação por amônia. / To compare the toxicity potential of prilled urea (G) and extruded grain with urea (E), both were administered all at once in two different doses, high (A; 0,5 g/kg BW) or standard (B; 0,22 g/kg BW), to 24 steers divided into four groups of six animals, which had never been fed nonprotein nitrogen compounds. For 240 min after the administration of urea the following variables were determined: rumen fluid pH and ammonia level, blood ammonia, urea, creatinine, glucose, L-lactate, potassium, and activities of gama glutamiltranspeptidase, aspartate aminotransferase and creatine kinase, haemogasometric profile and hematocrit. The clinical picture was also followed. Some steers from groups GB and EB showed slight signs of ammonia toxicity, overcoming it without treatment. On the other hand, five steers from either groups GA and EA showed severe signs of ammonia toxicity that required treatment; even though one animal from group GA succumbed. The speed of ruminal urea hydrolysis of G and E was similar, although the clinical signs started later in group EA. The higher the hyperammonemia, the higher the metabolic acidosis, dehydration, anaerobic glycolysis and gluconeogenesis. The enzymatic profile showed that biochemical damage occurred in the striated muscular tissue, but not in the hepatocytes. The results showed that both G and E had similar potential to cause ammonia poisoning, principally when high doses were administered all at once.

Clonagem ou técnica de transferência nuclear (TN) permite a geração de um organismo geneticamente idêntico a outro. Inúmeras aplicações da TN têm sido descritas para uso em pecuária e em medicina humana. O sucesso na clonagem de ovinos, bovinos, suínos e caprinos confirma a utilidade da TN para o propósito de expansão clonal de animais de valor zootécnico. Diversos trabalhos mostram que há uma perda de embriões e neonatos de animais clonados, sendo que má formações de órgãos e alterações de tamanho e peso destes animais são freqüentemente descritas. Mediante o exposto este trabalho visa esclarecer do ponto de vista morfológico as principais alterações apresentadas por animais que vieram a óbito, usando como método de estudo a biometria de órgãos e a avaliação dos que apresentam algum tipo de alteração. Este estudo foi conduzido na fazenda Tambaú, no período compreendido entre 2004 e 2008, foram necropsiados 13 animais clonados pela TN, pertencentes à espécie bovina, das raças Nelore e Simental, com idade variando de 1 a 19 dias, de ambos os sexos. Foram registrados o peso do animal, dos órgãos, bem como avaliação morfológica, histológica e imunoistoquímica destes. As alterações do tamanho e da morfologia de órgãos são os problemas mais freqüentemente encontrados, se alocando dentro da síndrome do bezerro anormal onde estão envolvidos alterações morfológicas, como o gigantismo, presente em 92,3 % dos animais necropsiados neste estudo. Houve uma importância muito grande em descrever estas anormalidades, através de estudos morfológicos e imunoistoquímicos, para uma melhor caracterização e entendimento dos problemas envolvendo a clonagem animal e também contribuir no desenvolvimento da neonatologia bovina. / Cloning or Nuclear Transfer (NT) allows generation of identical organisms. Innumerous applications of NT in veterinary and human medicine have been described. The success of cloning bovine, ovine, caprine and swine confirms the utility of NT in clonal expansion of valuable animals with high zootechnical performance. Many articles show that there is an important embryonal and neonatal loss of cloned animals, in which malformations of organs and alteration of size and weight are the most frequent problems described. This work aims to clarify, through morphological evaluation, the main alterations found in neonatally dead cloned bovines, using biometric rates of organs and evaluation of those that present any alteration. This work was conducted at the Tambaú Farm, São Paulo State, Brazil, from 2004 to 2008, and 13 bovine cloned by NT, male and female, belonging to Nelore and Simental breeds, aging from 01 to 19 days of life. The weight of animals and organs were registered and also morphological, histopathological and immunohistochemical analyses were performed during this work. The alterations of size and morphology of the animals and organs were the most frequent problems found in our study, referred to as abnormal offspring syndrome that describes morphological alterations such as gigantism, present in 92,3% of necropsied animals of this study. It is very important to identify and describe these abnormalities, by morphological, immunohistochemical approach aiming a better characterization of the problems related to cloning procedure, and also to contribute to the development of neonatal medicine bovines.

O objeto de estudo desse trabalho é a identificação de metodologias relacionadas aos testes de preços para a determinação de mercado relevante. A aplicação empírica foi feita ao mercado de compra de bovinos no Brasil, especificamente de boi gordo e vaca gorda. Utilizou-se o método simultâneo apresentado por Haldrup, Mollgaard e Nielsen (2005), bem como o método seqüencial para a identificação das relações de co-integração. No método simultâneo delineia-se conjuntamente o mercado de produto e geográfico, enquanto que no método seqüencial define-se primeiro o mercado de produto e somente depois o mercado geográfico. A partir dos resultados obtidos, constatou-se, que boi gordo e vaca gorda não estavam, simultaneamente, no mesmo mercado de produto e geográfico, para as praças analisadas. Tratando-se do método seqüencial, quanto ao mercado na sua dimensão produto, verificou-se que boi gordo e vaca gorda não estão no mesmo mercado, com exceção da praça de Coxim. Em relação ao mercado relevante geográfico, que foi testado a integração entre as praças num raio de 300 km, pôde-se concluir pela integração entre as praças do Estado de São Paulo bem como a integração entre as praças do Estado de Goiás, salientando que os resultados encontrados para as praças do Estado de São Paulo mostram que algumas praças não são integradas. Houve também integrações entre praças de Estados diferentes. Observou-se a convergência de resultados da metodologia aplicada com estudo qualitativo citado no Relatório do Processo Administrativo referente ao Auto nº. 08012.002493/2005-16, o que indica a validade do método empregado. / The aim of this study is to identify price-related methodologies to determine relevant market. Empirical application was carried out on the Brazilian fed cattle, especially on fed calf and steer. The simultaneous method presented by Haldrup, Mollgaard and Nielsen (2005) was utilized, as well as the sequential method to identify co-integration relations. Geographic and product markets are concomitantly delineated in the simultaneous method, whereas the market product is delineated first and, then, the geographical market is delineated in the sequential method. Results show that the fed calf and steer are not in the same market, except in the Coxim region. Regarding the relevant geographic market, in which region integration was tested in a range of 300 km, integration among regions in São Paulo state as well as in Goiás state was verified. Results highlight that some regions in São Paulo state are not integrated. There was also integration among regions in other states. It was observed convergence of results of the applied methodology with those reported in the qualitative study cited in the Administrative Process Report nº. 08012.002493/2005-16, which validates the method used.

Para comparar indicadores no diagnostico laboratorial da carência energética e avaliar sua influencia no quadro clínico, 12 garrotes foram aleatoriamente distribuídos em três grupos iguais e receberam , por 140 dias, as seguintes dietas: (G1) adequada, para ganho de peso de 900g/dia (13% de PB e 17,7 Mcal/d de ED); (G2) 80% dos requerimentos de mantença (7% de PB e 5,8 Mcal/d de ED); e (G3) 60% desses requerimentos (5% de PB e 4,7 Mcal/d de ED). Dois animais do G3 sucumbiram ao término do experimento. A carência provocou menor consumo de alimentos, diminui9ao do escore de condição corporal, sem alterar o peso vivo. Embora o volume ruminal tenha sido semelhante entre todos os grupos, as taxa de passagem e de renovação de líquidos foram menores nos grupos carentes. O déficit energético reduziu a produção ruminal de ácidos graxos voláteis totais e de suas frações, o tempo de redução de azul de metileno no suco ruminal foi maior, enquanto que os índices de excreção urinaria de alantoína e de ácido úrico foram menores nos grupos carentes. Os melhores indicadores do status energético foram a glicemia e os teores de &#946;-hidroxibutirato plasmáticos, que reduziram durante a carência: os AGLs não foram eficientes devido a alta variabilidade dos resultados. Não foram detectados corpos cetônicos na urina. O hematócrito e os teores séricos de ureia, albumina, globulinas e creatinina não se mostraram úteis no diagnóstico, porem o índice de excreção urinaria de ureia se reduziu, indicando maior conservação de nitrogênio pelo organismo carente. O déficit energético provocou diminui980 nos batimentos cardíacos, atingindo em quadros avançados 30 bat/min; na frequência respiratória; nos movimentos e tonicidade ruminal. Quanto menor foi a glicemia menores foram os batimentos cardíacos (r= 0,55), a frequência respiratória (r = 0,49) e a tonicidade ruminal (r= 0,81). A temperatura retal permaneceu dentro dos valores de normalidade, mas hipotermia foi detectada precedendo a morte. Levando-se em conta a facilidade, praticidade e custo dos exames, sugere-se o diagnóstico de carência requisitando analise de glicose, &#946;-hidroxibutirato plasmáticos, tempo de redução do azul de metileno no suco ruminal e índice de excreção urinária de ácido úrico. / In order to compare laboratory diagnosis indicators of energetic deficit and evaluate their influence in the clinical picture, 12 steers were randomly distributed in 3 groups of 4 animals, which received the following diets for 140 days : (G1) adequate diet for weight gain of 900g/day (CP: 13% and DE: 17,7 Mcal/d); (G2) 80% of the maintenance requirements (CP: 7% and DE: 5,8 Mcal/d); (G3) 60% of the same requirements (CP: 5% and DE: 4,7 Mcal/d). Two animals from G3 died by the end of the experiment. The nutritional deficit led to lower feed intake and a decrease in the body condition score; without changing body weight. Although the rumen volume was similar in all three groups, the rates of liquid passage and ruminal turnover were lower in G2 and G3. The energetic deficit led to a reduced rumen production of total and fractions of volatile fatty acids. The time of blue methylene reduction in the rumen juice was longer, whereas the index of urinary excretion of allantoin and uric acid was lower in G2 and G3. The best indicators of the energetic status were glycemia and the plasma level of &#946;-hydroxybutirate, which were both reduced during the deficit energetic. NEFA levels were not effective, due to the high variability of the results. Ketone bodies were not detected in the urine. Hematocrit and serum levels of urea, albumin, globulin and creatinin were not useful for malnutrition diagnosis, but the index of urinary excretion of urea was decreased, indicating that malnourished bodies were keeping Nitrogen. The energetic deficit caused a gradual decrease in cardiac rates , falling to 30 beats/min in advanced deficit of energy. Reduced respiratory frequency and rumen tonus was also altered in this condition. Low glycemia was related to decreased heart beat frequency (r=0.55), to respiratory frequency (r=0.49) and to rumen tonus (r=0.81). The rectal temperature remained within normal values; however hypothermia was detected preceding death. Taking into account costs and friendly usage of assays, we suggest the analysis of glucose, plasma &#946;-hydroxybutirate, time of reduction of methylene blue in the rumen juice, and index of urinary excretion of uric acid for the diagnosis of energetic deficit.