Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Com o objetivo de verificar a influÃncia dos hormÃnios tireoideanos no desenvolvimento de hiperreatividade traqueal, ratos machos (200 - 250 g) eutireÃideos, hipotireÃideos (propiltiouracil [PTU] - v.o. 0,05% p/v, durante 4 semanas) ou hipertireÃideos (L- tiroxina [T4] - 0,5 mg/kg s.c., por 7 ou 9 dias) foram sensibilizados à ovalbumina (OVA) e, 14 dias depois, desafiados atravÃs da inalaÃÃo de OVA (1 mg/ml, seguida de 5 mg/ml, 15 min cada). O sacrifÃcio dos animais para a realizaÃÃo dos experimentos ocorreu 24 h apÃs o desafio antigÃnico por anestesia com hidrato de cloral (400 mg/Kg). A traquÃia isolada foi montada em cubas contendo 10 ml de Krebs-Henseleit modificado (37 oC, 5% de CO2 em O2). Foram obtidas curvas concentraÃÃo-efeito (CCE) para cloreto de potÃssio (KCl), carbacol (CCh) ou serotonina (5-HT). TambÃm foram realizadas CCE ao Ca2+ em preparaÃÃes estimuladas por KCl, CCh ou 5-HT e mantidas em soluÃÃo sem Ca2+. A reapresentaÃÃo do antÃgeno promoveu significativo aumento (p < 0,05, two-way ANOVA) da resposta mÃxima (RM) das CCE ao KCl de 0,96  0,10 gF para 1,53  0,11 gF (n = 7), ao CCh de 1,98  0,06 gF para 2,92  0,07 gF (n = 7) e à 5-HT de 1,64  0,14 gF para 2,41  0,15 (n = 6) nos tecidos obtidos de animais sensibilizados ou desafiados, respectivamente. As traquÃias tambÃm apresentaram aumento (p < 0,05, two-way ANOVA) da RM ao Ca2+ quando estimuladas com KCl de 0,54  0,06 gF para 0,86  0,07 gF (n = 6), com CCh de 1,20  0,14 gF para 1,77  0,14 gF (n = 6) ou com 5-HT de 0,59  0,10 gF para 1,15  0,05 gF (n = 6) nos tecidos obtidos de animais sensibilizados ou desafiados, respectivamente. O hipotireoidismo nÃo alterou significativamente a RM induzida por KCl e CCh, enquanto que aquela induzida pela 5-HT foi reduzida de 1,64  0,14 gF nos animais eutireÃideos para 0,34  0,07 gF nos animais hipotireÃideos (p < 0,001, two-way ANOVA). ApÃs desafio, a 5-HT produziu 0,56  0,11 gF (n = 7) no tecido hipotireÃideo (p < 0,001, two-way ANOVA). O hipotireoidismo aboliu o desenvolvimento de hiperreatividade para KCl e CCh. Ocorreu um aumento na CE50 nas CCE obtidas ao CCh de 0,49 x 10-6M para 4,65 x 10-6M (P < 0,05, two-way ANOVA ). O desafio reduziu a CE50 novamente para 1,53 x 10-6M (n = 6, p<0,05, two-way ANOVA). As traquÃias de animais hipotireÃideos desafiados apresentaram diminuiÃÃo da RM ao Ca2+ quando estimuladas com KCl, CCh e 5-HT. Ocorreu aumento na CE50 nas CCE ao Ca2+ em traquÃias desafiadas e estimuladas com CCh de 5,77 x 10-4 M para 22,50 x 10-4 M (n = 6, p<0,01 two-way ANOVA). O hipertireoidismo promoveu um significativo aumento na RM das CCE apenas ao KCl (0,96  0,10 gF no controle versus 1,58  0,15 no tecido hipertireÃideo). NÃo houve desenvolvimento de hiperreatividade apÃs o desafio antigÃnico (RM = 1,87  0,14 gF). Ocorreu diminuiÃÃo da CE50 ao CCh de 0,67 x 10-4 M no controle para 0,14 x 10-4 M apÃs tratamento com T4. Os resultados mostram que hà envolvimento dos hormÃnios tireoideanos no desenvolvimento de hiperreatividade em traquÃia de rato, induzida apÃs reapresentaÃÃo do antÃgeno a animais previamente sensibilizados. / In other to verify the influence of thyroid hormones on the tracheal hyperreactivity development, euthyroid, hypothyroid (propiltiouracil [PTU] - p.o. 0.05% w/v, 4 weeks) or hyperthyroid (L-tiroxine [T4] â 0.5 mg/kg s.c.,7 or 9 days) male rats (200 - 250 g) were sensitized to ovalbumine (OVA) and, 14 days later, challenged with OVA inhalation, (1 mg/ml, followed by 5 mg/ml, 15 min each). Animals sacrifice was carried out 24 later by means of anaesthesia with chloral hydrate (400 mg/Kg). Isolated trachea was mounted in 10 ml bath chamber filled with modified Krebs-Henseleit (37 oC, 5% de CO2 em O2). Concentration-effect curves (CEC) were carried out for potassium chloride (KCl), carbachol (CCh) or serotonin (5-HT). CEC to Ca2+ added in tissues maintained in Ca2+-free medium stimulated with KCl, CCh or 5-HT also were carried out. Antigenic challenge produced significant increase (p < 0.05, two-way ANOVA) of the maximal response (Emax) of the CCE for KCl from 0.96  0.10 gF to 1.53  0.11 gF (n = 7), for CCh from 1.98  0.06 gF to 2.92  0.07 gF (n = 7) and for 5-HT from 1.64  0.14 gF to 2.41  0.15 (n = 6) in tissues obtained from sensitized or challenged animals, respectively. Tracheae also showed increase on the Emax to Ca2+ (p < 0.05, two-way ANOVA) when stimulated with KCl from 0.54  0.06 gF to 0.86  0.07 gF (n = 6), with CCh from 1.20  0.14 gF to 1.77  0.14 gF (n = 6) or with 5-HT from 0.59  0.10 gF to 1.15  0.05 gF (n = 6) on sensitized or challenged tissues, respectively. The hypothyroidism did not modify significantly the KCl- or CCh-induced Emax, while the 5-HT-induced contractile effect was reduced from 1.64  0.14 gF in euthyroid tissues to 0.34  0.07 gF in hypothyroid tissues (p < 0.001, two-way ANOVA). After challenge, 5-HT produced in hypothyroid tissues a contraction corresponding to 0.56  0.11 gF (n = 7, p < 0.001, two-way ANOVA). Hypothyroidism prevented hyperreactivity development for KCl and CCh. It was observed an increased EC50 value in CCE for CCh from 0.49 x 10-6M to 4.65 x 10-6 M (p < 0,05, two-way ANOVA). After challenge, CE50 value was reduced to 1.53 x 10-6 M (n = 6, p < 0,05, two-way ANOVA). Tracheae from challenged hypothyroid animals showed decreased Emax to Ca2+ when they were stimulated with KCl, CCh and 5-HT. It was observed an increased EC50 value in CCE to Ca2+ in challenged tissues stimulated with CCh from 5.77 x 10-4 M to 22.50 x 10-4 M (n = 6, p < 0.01, two-way ANOVA). Hyperthyroidism significantly increased Emax of the KCl-induced CCE (0.96  0,10 gF in control versus 1.58  0.15 on hyperthyroid tissue). Hyperreactivity was not showed after antigenic challenge (Emax = 1.87  0.14 gF). It was observed a reduction of the EC50 value to CCh from 0.67 x 10-4 M in control to 0.14 x 10-4 M after T4 treatment. Our results show that there is a putative thyroid hormones involvement in hyperreactivity development on rat trachea, after an antigenic challenge.

INTRODUÇÃO: As infecções pulmonares constituem uma das principais causas de morbidade e mortalidade após o transplante pulmonar. O transplante expõe a árvore brônquica a uma série de condições, como à lesão de secção e anastomose brônquica e à ação dos imunossupressores, alterando os componentes do epitélio mucociliar. O sistema mucociliar presente nas vias aéreas do sistema respiratório é o principal mecanismo de defesa do trato respiratório, assim a influência de drogas neste sistema precisa ser investigada. A prednisona é um importante corticosteróide usado após o transplante de pulmão, no entanto seu uso pode estar associado ao aumento da mortalidade no período pós por complicações como baixa cicatrização e infecções. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da secção brônquica e da terapia com prednisona na depuração mucociliar. MÉTODOS: Foram utilizados 180 ratos machos Wistar distribuídos em 6 grupos (P1, P2, P3, ScP2, ScSal e Sal). Os animais dos grupos P1, P2 e P3 receberam diferentes doses de prednisona (0,625, 1,25 e 2,5 mg/kg/dia); os do grupo ScP2 foram submetidos à cirurgia de secção e anastomose brônquica e terapia com 1.25 mg/kg/dia de prednisona; do grupo ScSal foram submetidos à cirurgia de secção e anastomose brônquica e gavagem diária de solução fisiológica; por fim, os animais do grupo Sal receberam gavagem de solução fisiológica. Após o período de tratamento (7, 15 ou 30 dias), os animais foram sacrificados, e as medidas de freqüência de batimento ciliar (FBC), velocidade de transporte mucociliar (VTMC) e transportabilidade do muco (TM) coletadas. Para avaliar os efeitos da droga realizamos a análise estatística comparativa entre os grupos P1, P2, P3 e Sal. Para avaliar a possível interação da droga com o procedimento cirúrgico comparamos os grupos ScP2, ScSal e P2. RESULTADOS: A administração das diferentes doses de prednisona estudadas prejudicaram a TM e a dosagem mais alta (P3) diminuiu a VTMC. Os animais submetidos à secção e anastomose brônquica mostraram redução significativa de VTMC e FBC após 7 e 15 dias da cirurgia (p<0.001) Observamos a recuperação desses parâmetros após 30 dias do procedimento cirúrgico. A droga melhorou a TM dos animais submetidos à secção e anastomose brônquica (p<0,02). CONCLUSÕES: Altas dosagens de prednisona prejudicam a depuração mucociliar. A terapia com prednisona associada à cirurgia de secção e anastomose brônquica não altera a depuração mucociliar visto que, apesar de melhorar a transportabilidade do muco, a freqüência de batimento ciliar e a velocidade de transporte mucociliar não são influenciadas / INTRODUCTION: Infections have been and still are the major cause of morbidity and mortality after lung transplantation. Since mucociliary clearance (MCC) plays an important role on the human defense mechanism, the influence of drugs on MCC of patients submitted to lung transplantation must be examined. Prednisone is the most important corticosteroid used after lung transplantation. The aim of this study was to evaluate the effects of bronchial transection and prednisone therapy (P) on mucociliary clearance. METHODS: 180 rats were assigned to 6 groups (P1, P2, P3, ScSal, e Sal) according to surgical procedure or drug therapy: P1 (0.625mg/kg/day), P2 (1.25 mg/kg/day), P3 (2.5mg/kg/day), ScP2 (bronchial section and reanastomosis + 1.25 mg/kg/day ), Sal (saline solution 2ml/day) and ScSal (bronchial section + saline solution 2ml/day). After 7, 15 or 30 days they were killed and lungs were removed from thoracic cavity. Mucociliary transport velocity (MCTV), ciliary beting frequency (CBF) and mucus transportability (MT) were evaluated. RESULTS: The administration of different doses of prednisone studied harmed MT and the highest dosage (P3) decreased MCTV. FBC and MCTV was significantly impaired 7 and 15 days after bronchial transection and reanastomosis (p<0.001), but they showed a partial recovery on the 30th day after surgery procedure. Prednisone therapy improved MT after surgery procedure (p<0,02). CONCLUSION: High dosages of prednisone affect mucociliary clearance. The Prednisone therapy after section and reanastomosis surgery not affect mucociliary clearance since, despite improving MT, the CBF and MCTV are not influenced

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Résumé : Dans les maladies respiratoires chroniques, les propriétés biochimiques et mécaniques des muscles lisses des voies respiratoires (MLVR) ont été analysées, mais les modes d’action des médiateurs lipidiques endogènes dérivés des oméga-3 (époxy- ou polyhydroxy- éicosanoïdes) restent à clarifier. Mon travail de recherche a pour but de caractériser le rôle potentiel de monoacyglycéride de l’acide éicosapentaénoϊque (MAG-EPA) et de monoacylglycéride de l’acide docosahexaénoϊque (MAG-DHA) ainsi que leurs métabolites (acide 17,18-époxyéicosatétraénoϊque : 17,18-EpETE, résolvine D1 : RvD1), sur le statut inflammatoire et l’activité contractile des voies respiratoires mises en culture organoϊde avec des cytokines pro-inflammatoires. Sur des trachées de cobayes (TC) natives précontractées au U-46619 (agoniste du récepteur thromboxane prostanoϊde), le 17,18-EpETE relaxe les tissus de manière plus importante que son précurseur, le MAG-EPA. Dans les TC mises en culture pendant 3 jours, les niveaux de TNF-α ont augmenté dans les fractions microsomales par rapport aux trachées natives. Sur ces tissues cultivés et traités avec 0.3 µM 17,18-EpETE, une réduction de la sensibilité au Ca2+ a été démontrée. De plus, une diminution de niveaux de détection des P-p65-NFκB, c-fos et c-Jun a été quantifiée en présence de 17,18-EpETE et des inhibiteurs de PKC ou Rho kinase lorsque les TC sont préalablement traités par 10 ng/ml TNF-α. Les cytokines pro-inflammatoires (IL-13 et TNF-α, etc…) jouent un rôle majeur dans la physiopathologie de l’asthme. Le projet de bronchioles humaines évalue l’effet de la RvD1 et de ses précurseurs (MAG-DHA, MAG-DPA et 17(S)-HpDoHE) sur le statut inflammatoire et la bronchoréactivité, in vitro. Dans les bronchioles stimulées par l’IL-13 pendant 48 h, le MAG-DHA ainsi que ces métabolites diminuent l’activation de la voie TNF-α/NFκB et la sensibilité au Ca2+ des tissus prétraités avec l’IL-13 vers des niveaux proches des conditions contrôles. Dans les bronchioles prétraitées par le TNF-α, l’inflammation et l’hypersensibilité au Ca2+ sont abolies par 1 µM MAG-DPA. De plus, l’aspirine combinée au MAG-oméga-3 potentialise les effets inhibiteurs de ce dernier sur l’inflammation et l’hyperréactivité bronchique induite par les cytokines, tout en régulant à la hausse les niveaux de détection du GPR-32 (le récepteur de RvD1). En conclusion, les dérivés des oméga-3 à longue chaîne pourraient résoudre l’inflammation et contrer les causes de l’hyperréactivité bronchique (HRB). / Abstract : In chronic respiratory diseases, the biochemical and mechanical properties of airway smooth muscle were analyzed, but the mode of action of omega-3 derivatives (epoxy or polyhydroxy-eicosanoids) remains to be clarified. My research work aims to characterize the potential role of eicosapentaenoic acid monoacyglyceride (MAG-EPA) and docosahexaenoic acid monoacylglyceride (MAGDHA) and their bioactive metabolites (17,18-epoxyeicosatetraenoic acid: 17 18-EpETE, resolvin D1: RvD1) on the inflammatory status and the contractile activity of organcultured airway explants with pro-inflammatory cytokines. On 30 nM U-46619 (Thromboxane prostanoid receptor agonist) pre-contracted fresh guinea pig trachea, 17,18 EpETE displays a greater ability than its precursor, MAG-EPA to relax airways. In 72-h-cultured tracheal rings, TNF-α levels increase in the microsomal fractions when compared to native trachea. In cultured and pre-treated tracheal rings with 0.3 µM 17,18-EpETE, the Ca2+ hypersensitivity is alleviated in comparaison to 3 day cultured tracheal rings. In addition, the detection levels of P-NFκB, c-fos and c-Jun were abolished in the presence of 17,18-EpETE and PKC or Rho kinase inhibitors in short term-TNF-α- incubated tracheal rings. Pro-inflammatory cytokines (IL-13, TNF-α, etc…) play a major role in asthma pathophysiology. The human bronchi project evaluates the effect of RvD1 and its precursors (MAG-DHA, MAG-DPA and 17 (S)-HpDoHE) on the inflammatory status and bronchial reactivity, in vitro. In IL-13 stimulated human bronchi for 48 h, the MAG-DHA and its metabolites decrease the activation of TNF-α / NFκB pathway and blunt the Ca2+ hypersensitivity triggered by IL-13. In TNF-α-pretreated human bronchi, airway inflammation and Ca2+ hypersensitivity are reversed by 1 µM MAG-DPA. Hence, aspirin combined with MAG-omega-3 potentiate the inhibitory effects of MAG-DHA on inflammation and bronchial hyperrresponsiveness triggered by pro-inflammatory cytokines, while upregulating the GPR-32 detection levels (RvD1 receptor). In conclusion, omega-3 derivatives could counteract the causes of airway hyperrresponsiveness (AHR).

Law Tsui Ying. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2000. / Includes bibliographical references (leaves 64-70). / Abstracts in English and Chinese. / Acknowledgments --- p.ii / Chapter 1 --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- Structure of Bronchus --- p.3 / Chapter 1.2 --- Existing Systems --- p.4 / Chapter 1.2.1 --- Virtual Endoscope System (VES) --- p.4 / Chapter 1.2.2 --- Virtual Reality Surgical Simulator --- p.4 / Chapter 1.2.3 --- Automated Virtual Colonoscopy (AVC) --- p.5 / Chapter 1.2.4 --- QUICKSEE --- p.5 / Chapter 1.3 --- Organization of Thesis --- p.6 / Chapter 2 --- Three Dimensional Visualization in Medicine --- p.7 / Chapter 2.1 --- Acquisition --- p.8 / Chapter 2.1.1 --- Computed Tomography --- p.8 / Chapter 2.2 --- Resampling --- p.9 / Chapter 2.3 --- Segmentation and Classification --- p.9 / Chapter 2.3.1 --- Segmentation by Thresholding --- p.10 / Chapter 2.3.2 --- Segmentation by Texture Analysis --- p.10 / Chapter 2.3.3 --- Segmentation by Region Growing --- p.10 / Chapter 2.3.4 --- Segmentation by Edge Detection --- p.11 / Chapter 2.4 --- Rendering --- p.12 / Chapter 2.5 --- Display --- p.13 / Chapter 2.6 --- Hazards of Visualization --- p.13 / Chapter 2.6.1 --- Adding Visual Richness and Obscuring Important Detail --- p.14 / Chapter 2.6.2 --- Enhancing Details Incorrectly --- p.14 / Chapter 2.6.3 --- The Picture is not the Patient --- p.14 / Chapter 2.6.4 --- Pictures-'R'-Us --- p.14 / Chapter 3 --- Overview of Advanced Segmentation Methodologies --- p.15 / Chapter 3.1 --- Mathematical Morphology --- p.15 / Chapter 3.2 --- Recursive Region Search --- p.16 / Chapter 3.3 --- Active Region Models --- p.17 / Chapter 4 --- Overview of Centerline Methodologies --- p.18 / Chapter 4.1 --- Thinning Approach --- p.18 / Chapter 4.2 --- Volume Growing Approach --- p.21 / Chapter 4.3 --- Combination of Mathematical Morphology and Region Growing Schemes --- p.22 / Chapter 4.4 --- Simultaneous Borders Identification Approach --- p.23 / Chapter 4.5 --- Tracking Approach --- p.24 / Chapter 4.6 --- Distance Transform Approach --- p.25 / Chapter 5 --- Automated Extraction of Bronchus Area --- p.27 / Chapter 5.1 --- Basic Idea --- p.27 / Chapter 5.2 --- Outline of the Automated Extraction Algorithm --- p.28 / Chapter 5.2.1 --- Selection of a Start Point --- p.28 / Chapter 5.2.2 --- Three Dimensional Region Growing Method --- p.29 / Chapter 5.2.3 --- Optimization of the Threshold Value --- p.29 / Chapter 5.3 --- Retrieval of Start Point Algorithm Using Genetic Algorithm --- p.29 / Chapter 5.3.1 --- Introduction to Genetic Algorithm --- p.30 / Chapter 5.3.2 --- Problem Modeling --- p.31 / Chapter 5.3.3 --- Algorithm for Determining a Start Point --- p.33 / Chapter 5.3.4 --- Genetic Operators --- p.33 / Chapter 5.4 --- Three Dimensional Painting Algorithm --- p.34 / Chapter 5.4.1 --- Outline of the Three Dimensional Painting Algorithm --- p.34 / Chapter 5.5 --- Optimization of the Threshold Value --- p.36 / Chapter 6 --- Automatic Centerline Determination Algorithm --- p.38 / Chapter 6.1 --- Distance Transformations --- p.38 / Chapter 6.2 --- End Points Retrieval --- p.41 / Chapter 6.3 --- Graph Based Centerline Algorithm --- p.44 / Chapter 7 --- Experiments and Discussion --- p.48 / Chapter 7.1 --- Experiment of Automated Determination of Bronchus Algorithm --- p.48 / Chapter 7.2 --- Experiment of Automatic Centerline Determination Algorithm --- p.54 / Chapter 8 --- Conclusion --- p.62 / Bibliography --- p.63

Introduction<p><p>Avec plus de 7000 cas diagnostiqués par an en Belgique, le cancer bronchique est l’un des cancers les plus fréquents chez l'homme. Son pronostic est très réservé, la survie à 5 ans tous stades confondus étant inférieure à 15 %. Ce faible taux de guérison s’explique en grande partie par le fait que le diagnostic se réalise généralement à un stade avancé de la maladie. Une méthode de détection précoce, l’endoscopie en autofluorescence, exploite des variations de la fluorescence bronchique sous l'effet d'un laser et permet ainsi de dévoiler des lésions précancéreuses invisibles en lumière blanche. Réalisée à l’Institut Jules Bordet depuis 1996, la photodétection nous a permis de constituer une banque de biopsies d’épithélium bronchique à tous les stades de la carcinogenèse bronchique, conservées initialement en blocs paraffinés et, depuis 2003, par congélation. <p><p>Hypothèse<p><p>Nous avons émis l’hypothèse que la compréhension de la genèse du carcinome épidermoïde bronchique par la caractérisation de l’évolution des anomalies moléculaires dans les lésions précancéreuses et cancéreuses de l'arbre bronchique nous permettrait d’identifier de nouvelles cibles de détection et éventuellement de chimioprévention pour le cancer bronchique. L'objectif de nos travaux a donc été de caractériser les modifications moléculaires successives et/ou cumulatives sous-jacentes à la transition entre les différents stades histologiques de la carcinogenèse épidermoïde bronchique (épithélium bronchique normal du fumeur, hyperplasie, métaplasie, dysplasies légère, modérée et sévère, CIS et les carcinomes invasifs). Différentes techniques complémentaires ont été successivement utilisées à cet effet :1) étude de l’expression protéique par immunohistochimie (IHC) et immunofluorescence (IF), 2) étude de l’expression des ARNs messagers par microdamiers, 3) étude de l’expression des microARNs par RT-PCR quantitative.<p><p>Travaux réalisés<p><p>Afin de sélectionner les protéines à étudier aux différents stades de la carcinogenèse épidermoïde bronchique, nous avons réalisé une étude méthodologique de la littérature chez les patients atteints de cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC). En effet, d’une part, la petite taille des biopsies bronchiques que nous projetions d’étudier et, d’autre part, le faible taux de découvertes de lésions de haut grade lors de la réalisation de bronchoscopies en fluorescence limitent le nombre d’analyses réalisables. Les revues systématiques de la littérature, intégrant une analyse méthodologique des études publiées et une méta-analyse de leur impact pronostique en terme de survie, ont permis de choisir une série de marqueurs sur base de leur intérêt potentiel grâce à la puissance apportée par l’agrégation de grands nombres de cas. <p><p>La mutation de KRAS identifiée par PCR constitue un facteur péjoratif pour la survie des patients atteints de CBNPC et plus spécifiquement des adénocarcinomes (ADC). Etant donné que notre projet est consacré à la genèse du carcinome épidermoïde bronchique (CEB), nous n’avons pas étudié ce facteur dans nos biopsies. <p><p>Par contre, les revues systématiques ont montré un impact en terme de survie dans les CBNPC, y compris dans les CEB, pour l’angiogenèse, des récepteurs de facteurs de croissance épithéliale (EGFR et c-erbB-2) et des marqueurs de la prolifération cellulaire (Ki-67). Nous avons donc étudié l’expression de ces protéines par IHC dans les lésions précurseurs de CEB et dans les CEB. L’expression de Ki-67 est augmentée aux stades de dysplasie sévère et de CIS par rapport à ceux de dysplasies légère et modérée. La mesure de l’expression de Ki-67 dans ces biopsies aide donc à les classifier en lésions de bas et de haut grade. L’étude de la corrélation de l’expression de plusieurs protéines (EGFR, c-erbB-2 et Ki-67) dans les mêmes lésions bronchiques a montré que la majorité des biopsies de haut grade (dysplasies sévères et CIS) expriment anormalement EGFR et/ou Ki-67. Par contre, l’homologue d’EGFR, c-erbB-2, n’apparaît que plus tardivement, dans les carcinomes invasifs. <p><p>Nous avons également caractérisé l’expression de protéines impliquées dans les voies de l'apoptose dans les lésions précurseurs de CEB. L’expression du facteur suppresseur de tumeurs p53 s’est avérée être un marqueur pronostique péjoratif important pour la survie des patients atteints de CNBPC et augmente dès les premières étapes de la tumorigenèse bronchique et même déjà dans l’épithélium morphologiquement normal du fumeur. L'altération de l'expression de p53 est donc un événement très précoce dans la genèse du CEB et la positivité de p53 augmente ensuite avec la sévérité des lésions. Dans le but de caractériser les voies de contrôle de p53 au cours de la carcinogenèse épidermoïde bronchique, nous avons analysé l'expression de 3 autres protéines, MDM2, p14arf et la nucléophosmine (NPM), dans une série de 200 biopsies. L’expression de MDM2, NPM et p14arf est respectivement altérée aux stades de dysplasie légère, modérée et sévère. Au stade de dysplasie sévère, l’expression de p14arf, inhibiteur de MDM2, peut soit disparaître, soit se concentrer dans les nucléoles. Tant la perte de p14arf que sa concentration dans les nucléoles sont associées à une augmentation de l’expression de MDM2. Nous avons également observé que la délocalisation de NPM depuis le nucléoplasme vers le nucléole est hautement corrélée à celle de p14arf. En IF, NPM et p14arf colocalisent dans le nucléoplasme dans les échantillons de bas grade ou dans les nucléoles dans les lésions de haut grade. Par contre, la protéine MDM2 n’est détectée dans les nucléoles quelles que soient les localisations de p14arf ou de NPM et quel que soit le stade. Ces données sont en faveur de l’hypothèse selon laquelle la localisation de p14arf dans les nucléoles empêcherait la formation des complexes p14arf–MDM2 et pourrait ainsi faciliter la carcinogenèse pulmonaire. Nos résultats suggèrent également que la présence de NPM dans le nucléoplasme pourrait jouer un rôle protecteur contre le dommage cellulaire et la transformation maligne tandis que sa délocalisation vers les nucléoles et ce, peut-être par la délocalisation de p14arf, favoriserait la carcinogenèse bronchique. Enfin, suite à la réalisation d’une méta-analyse montrant le rôle de la cyclooxygénase 2 (COX-2) en tant que facteur pronostique dans les CBNPC de stade précoce, l’expression de la protéine COX-2 a été analysée par IHC dans 106 biopsies. Cette étude montre que cette protéine s’accumule exclusivement à partir du stade de dysplasie sévère, permettant ainsi de séparer les lésions bronchiques de bas et de haut grade. Avec une haute valeur prédictive positive (100 %) et une bonne valeur prédictive négative (82,35 %), COX-2 apparaît donc comme un marqueur précoce potentiel à tester pour le dépistage du cancer bronchique.<p><p>En parallèle à ces travaux, nous avons collecté des biopsies fraîchement congelées aux différents stades de la carcinogenèse épidermoïde pour une analyse du transcriptome. La première étape a consisté à définir le profil d’expression génique par la technique des microdamiers. Après son extraction et sa rétrotranscription, l’ARN a été marqué et hybridé sur des lames commercialisées par Agilent Technologies. Au total, 122 échantillons, dont minimum 12 de chaque catégorie, ont été hybridés avec un contrôle commun (issu d’un mélange de biopsies bronchiques normales de non-fumeurs). Une analyse en composante principale a montré que la hiérarchie de la classification histologique était bien représentée par les profils d’expression génique des biospies aux différents stades. Quelle que soit la liste de gènes de départ sélectionnée pour réaliser le regroupement hiérarchisé, nous avons observé, de manière constante et robuste, une différence majeure de profil d’expression génique entre, d’une part, les tissus bronchiques les plus « normaux » (normal normofluorescent, histologiquement normal mais hypofluorescent et hyperplasie) et, d’autre part, toutes les autres catégories histologiques dites « anormales ou modifiées » à partir de la métaplasie jusqu’au carcinome invasif. Parmi les épithéliums bronchiques « modifiés », deux grands groupes se distinguent :d’un côté, les métaplasies et dysplasies légères, qui sont très souvent bénignes et réversibles pour la plupart, et de l’autre côté, les dysplasies sévères, les CIS et les carcinomes invasifs, lésions à risque beaucoup plus élevé d’évoluer vers un cancer ou déjà malignes. Les échantillons au stade de dysplasie modérée se classent tantôt dans le deuxième groupe avec les dysplasies légères tantôt dans le troisième avec les dysplasies sévères. Il semble donc que le stade histologique de la dysplasie modérée soit un groupe hétérogène n’ayant pas de réalité biologique et qu’il serait plus adéquat de les reclasser dans un des 2 autres groupes sur base des arguments moléculaires. Nous avons obtenu les listes de gènes dont l’expression varie de manière statistiquement significative entre les différentes étapes de la carcinogenèse épidermoïde bronchique. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence un profil d’expression génique permettant de discriminer les lésions bronchiques de mauvais pronostic (dysplasies sévères ou plus) de celles de meilleur pronostic (tissu normal et anomalies morphologiques de bas grade). Les gènes qui constituent ce profil permettant d’identifier les lésions de mauvais pronostic sont des candidats pour la détection précoce du cancer bronchique. De plus, nos données de génomique confirment la surexpression de certains ARNs messagers correspondant à des protéines dont la surexpression a été rapportée dans les études d’IHC comme COX-2, MDM2, Ki-67, les cytokératines, les métallopeptidases, les cyclines. Par ailleurs, certaines protéines dont le rôle dans les cancers pulmonaires invasifs a déjà été décrit mais pas aux stades pré-invasifs, parmi lesquelles la protéine PTH-like, des protéines liées à TNF ou d’autres liées à IGF, E2F ou à Wnt, semblent impliquées aux stades précoces de la carcinogenèse épidermoïde bronchique. Enfin, de nouveaux acteurs possibles de ce processus ont été mis en évidence.<p><p>Nous avons également étudié l’évolution de l’expression des microARNs au cours de la carcinogenèse bronchique par des RT-PCR quantitatives (LDA) sur 60 des biopsies dont nous avons étudié le transcriptome (6 par catégorie) et en utilisant la classification en 3 groupes issue des analyses des microdamiers d’expression génique. Cette étude montre que plusieurs miARNs sont différentiellement exprimés durant la carcinogenèse bronchique. De plus, deux étapes successives et distinctes ont été mises en évidence pour l’évolution de l’expression des miARNs au cours de la carcinogenèse bronchique. Aux stades les plus précoces, correspondant à la progression de l’épithélium normal du non-fumeur vers l’épithélium histologiquement normal du fumeur et l’hyperplasie jusqu’au groupe des anomalies morphologiques relativement bénignes (métaplasie, dysplasies légère et modérée), on observe une réduction significative de l’expression de la grande majorité des miARNs. Aux stades plus tardifs de la carcinogenèse (dysplasie sévère, CIS et CEB), même si 74 % des miARNs altérés restent encore régulés négativement par rapport à leur niveau d’expression dans l’épithélium normal du non-fumeur, la proportion de miARNs dont l’expression est augmentée (43 %) s’accroît par rapport à leur niveau d’expression dans les stades qui les précèdent (métaplasie, dysplasies légère et modérée). En outre, lorsque l’on compare ce dernier groupe à celui des lésions plus sévères (dysplasie sévère et CIS), qui progressent fréquemment vers des carcinomes invasifs, 80 % des miARNs augmentent leur niveau d’expression. Par ailleurs, l’expression de certains microARNs évolue de manière linéaire. En particulier, l’expression de miR 34c, cible transcriptionnelle de p53, et celle de miR 15a, inhibiteur de Bcl2, diminuent progressivement entre les différents stades à partir du tissu bronchique normal du non-fumeur jusqu’au CEB. Enfin, les profils d’expression des miARNs permettent de prédire avec précision la classification histologique non seulement entre les lésions de bas grade (métaplasie, dysplasies légère et modérée) et de haut grade (dysplasie sévère et CIS) mais également entre les CIS et les carcinomes invasifs. Les miARNs qui constituent ces signatures sont donc des candidats potentiels pour la détection précoce du cancer bronchique.<p><p>Conclusions<p><p>Nos travaux montrent que les anomalies moléculaires apparaissent aux stades les plus précoces de la transformation maligne de l’épithélium bronchique. L’expression protéique des marqueurs étudiés -p53, MDM2, p14arf, NPM, Ki-67, COX-2, c-erbB-2, et EGFR- permet d’affiner la classification des lésions bronchiques précancéreuses et de mieux comprendre les voies de la carcinogenèse précoce. Les profils d'expression des gènes et des microARNs apportent une approche originale des étapes successives du processus de carcinogenèse épidermoïde bronchique et ont mis en évidence des signatures permettant de discriminer les lésions qui sont à très haut risque de progression vers un cancer invasif ou qui sont déjà néoplasiques de celles de meilleur pronostic. Les marqueurs qui constituent ces profils sont des candidats potentiels pour la détection précoce du cancer bronchique.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

As partículas eliminadas na exaustão do diesel (DEP) são importantes fontes diárias de partículas inaladas, responsáveis por gerar espécies reativas de oxigênio no sistema respiratório, fazendo com que as células ativem mecanismos de defesa, como o sistema Keap1-Nrf2 e a autofagia. Para investigar o papel do Nrf2 no processo de autofagia induzida pelas DEPs, BEAS-2B foram expostas às DEP, coletadas diretamente de um motor a diesel. BEAS-2B foram tratadas com sulforafano, bafilomicina e EBSS para testar a relação entre as vias autofágica e antioxidante. A quantidade relativa de mRNA foi verificada por RT-PCR para os seguintes genes: Nrf2, NQO1, HO-1, p62, Atg5 e LCB3. A seguir, BEAS-2B foram transfectadas com RNA silenciador (siRNA) para Nrf2, expostas ou não às DEPs (10 e 50 micro g/mL por 1h e 2 h), e mRNA detectado por RT-PCR e Western blot para proteínas. Bafilomicina (inibidor de autofagia) mostrou uma diminuição significativa nos marcadores antioxidantes Nrf2 (p = 0,024), HO-1 (p = 0,002) e NQO1 (p = 0,003), enquanto sulforafano (ativador de Nrf2) aumentou os marcadores autofágicos LC3B (p = 0,004) e Atg5 (p = 0,007). BEAS-2B expostas às DEP na concentração de 50 micro g/mL por 2hs mostraram um aumento significativo nos genes autofágicos LC3B (p = 0,018) e p62 (p = 0,007) e nos genes da via antioxidante Nrf2 (p = 0,007) e NQO1 (p = 0,025). Houve uma diminuição significativa no mRNA de LC3B (p < 0,001), p62 (p = 0,001) e Atg5 (p = 0,024) nas células transfectadas com siRNA, expostas ou não à DEP. Western blotting mostrou uma redução das proteínas Nrf2, p62 e LC3II nas BEAS-2B siRNA, indicando que a exposição ao silenciamento de Nrf2 modificou a expressão de marcadores de autofagia (R < 1). Os resultados deste estudo mostram que, em células brônquicas expostas às DEP, o sistema Nrf2 e a autofagia trabalham em conjunto para tentar manter a homeostase celular / Diesel Exhaust Particles (DEPs) are main sources of daily inhaled particles, responsible for generating reactive oxygen species in the respiratory system, and causing the cells to activate defense mechanisms, such as the Keap1-Nrf2 system and autophagy. In order to investigate the role of Nrf2 in Dep-induced autophagy, BEAS-2B cells collected directly from a diesel engine were exposed to DEP and treated with sulforaphane, bafilomycin and BESS to test the relationship between autophagic and antioxidant pathways. The relative amount of mRNA was verified by RT-PCR for the following genes: Nrf2, NQO1, HO-1, p62, Atg5 and LCB3. Next, BEAS-2B cells were transfected with silencer RNA (siRNA) specific to Nrf2, exposed or not to DEPs (10 and 50 micro g/mL 1h and 2hs), and mRNA detected by RT-PCR and Western blotting for protein. Bafilomycin ( autophagy inhibitor) showed a significant decrease in the antioxidant markers Nrf2 (p=0.024), HO-1 (p = 0.002) and NQO1 (p = 0.003), whereas sulforaphane (Nrf2 activator) increased the expression levels of autophagic markers LC3B (p=0.004) and Atg5 (p=0.007). BEAS-2B exposed to DEP at a concentration of 50 micro g/mL for 2hs showed a significant increase in autophagic genes LC3B (p=0.018) and p62 (p=0.007),and in the antioxidant pathway markers Nrf2 (p=0.007) and NQO1 (p=0.025). There was a significant decrease in mRNA of the LC3B (p < 0.001), p62 (p=0.001) and Atg5 (p=0.024) in cells transfected with siRNA, exposed or not to DEP. Western blotting showed a reduction of Nrf2, p62 and LC3II proteins in BEAS-2B transfected with siRNA, indicating that Nrf2 silencedexposed to DEP modulated the expression of autophagy markers (R < 1). The results of this study show that, in bronchial cells exposed to DEP, the Nrf2 system and autophagy work together in order to try to maintain cellular homeostasis

As partículas eliminadas na exaustão do diesel (DEP) são importantes fontes diárias de partículas inaladas, responsáveis por gerar espécies reativas de oxigênio no sistema respiratório, fazendo com que as células ativem mecanismos de defesa, como o sistema Keap1-Nrf2 e a autofagia. Para investigar o papel do Nrf2 no processo de autofagia induzida pelas DEPs, BEAS-2B foram expostas às DEP, coletadas diretamente de um motor a diesel. BEAS-2B foram tratadas com sulforafano, bafilomicina e EBSS para testar a relação entre as vias autofágica e antioxidante. A quantidade relativa de mRNA foi verificada por RT-PCR para os seguintes genes: Nrf2, NQO1, HO-1, p62, Atg5 e LCB3. A seguir, BEAS-2B foram transfectadas com RNA silenciador (siRNA) para Nrf2, expostas ou não às DEPs (10 e 50 micro g/mL por 1h e 2 h), e mRNA detectado por RT-PCR e Western blot para proteínas. Bafilomicina (inibidor de autofagia) mostrou uma diminuição significativa nos marcadores antioxidantes Nrf2 (p = 0,024), HO-1 (p = 0,002) e NQO1 (p = 0,003), enquanto sulforafano (ativador de Nrf2) aumentou os marcadores autofágicos LC3B (p = 0,004) e Atg5 (p = 0,007). BEAS-2B expostas às DEP na concentração de 50 micro g/mL por 2hs mostraram um aumento significativo nos genes autofágicos LC3B (p = 0,018) e p62 (p = 0,007) e nos genes da via antioxidante Nrf2 (p = 0,007) e NQO1 (p = 0,025). Houve uma diminuição significativa no mRNA de LC3B (p < 0,001), p62 (p = 0,001) e Atg5 (p = 0,024) nas células transfectadas com siRNA, expostas ou não à DEP. Western blotting mostrou uma redução das proteínas Nrf2, p62 e LC3II nas BEAS-2B siRNA, indicando que a exposição ao silenciamento de Nrf2 modificou a expressão de marcadores de autofagia (R < 1). Os resultados deste estudo mostram que, em células brônquicas expostas às DEP, o sistema Nrf2 e a autofagia trabalham em conjunto para tentar manter a homeostase celular / Diesel Exhaust Particles (DEPs) are main sources of daily inhaled particles, responsible for generating reactive oxygen species in the respiratory system, and causing the cells to activate defense mechanisms, such as the Keap1-Nrf2 system and autophagy. In order to investigate the role of Nrf2 in Dep-induced autophagy, BEAS-2B cells collected directly from a diesel engine were exposed to DEP and treated with sulforaphane, bafilomycin and BESS to test the relationship between autophagic and antioxidant pathways. The relative amount of mRNA was verified by RT-PCR for the following genes: Nrf2, NQO1, HO-1, p62, Atg5 and LCB3. Next, BEAS-2B cells were transfected with silencer RNA (siRNA) specific to Nrf2, exposed or not to DEPs (10 and 50 micro g/mL 1h and 2hs), and mRNA detected by RT-PCR and Western blotting for protein. Bafilomycin ( autophagy inhibitor) showed a significant decrease in the antioxidant markers Nrf2 (p=0.024), HO-1 (p = 0.002) and NQO1 (p = 0.003), whereas sulforaphane (Nrf2 activator) increased the expression levels of autophagic markers LC3B (p=0.004) and Atg5 (p=0.007). BEAS-2B exposed to DEP at a concentration of 50 micro g/mL for 2hs showed a significant increase in autophagic genes LC3B (p=0.018) and p62 (p=0.007),and in the antioxidant pathway markers Nrf2 (p=0.007) and NQO1 (p=0.025). There was a significant decrease in mRNA of the LC3B (p < 0.001), p62 (p=0.001) and Atg5 (p=0.024) in cells transfected with siRNA, exposed or not to DEP. Western blotting showed a reduction of Nrf2, p62 and LC3II proteins in BEAS-2B transfected with siRNA, indicating that Nrf2 silencedexposed to DEP modulated the expression of autophagy markers (R < 1). The results of this study show that, in bronchial cells exposed to DEP, the Nrf2 system and autophagy work together in order to try to maintain cellular homeostasis