A epilepsia é uma desordem neurológica que afeta aproximadamente 65 milhões de pessoas em todo o mundo. Apesar dos erros inatos do metabolismo (EIM) não serem a causa frequente de epilepsia, o sintoma mais comum presente em desordens metabólicas são crises epilépticas. Dentro dos EIM, estão as acidemias orgânicas que podem levar a geração de crises epiléticas durante um episódio de descompensação metabólica aguda, como por exemplo a acidemia glutárica tipo I (AG I). A AG I é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima glutaril-CoA desidrogenase (GCDH). Tal alteração leva ao acúmulo de ácidos orgânicos em fluidos e tecidos. Se não diagnosticada e tratada precocemente, a doença evolui com sinais clínicos de macrocefalia, déficits neurológicos e epilepsia. O aumento dos níveis de ácidos orgânicos no cérebro diminui a atividade da enzima Glutamato Descarboxilase (GAD) no parênquima cerebral e inibe a atividade da enzima Na+,K+,-ATPase. De acordo com estes achados, prévias análises bioquímicas de neocórtex e comportamentais de um modelo animal de AG I, camundongo nocaute para a enzima GCDH tratado com dieta com sobrecarga de lisina (4,7%) (Gcdh-/--Lis), mostram decréscimo do imunoconteúdo da GAD cortical, diminuição da liberação de ácido ϒ-aminobutírico (GABA) e diminuição da atividade Na+,K+,-ATPase e presença de crises epilépticas espontâneas Neste trabalho (aprovado pelo CEP-HCPA-140270) usamos este modelo animal de AG I para avaliar a função sináptica GABAérgica neocortical através de estudos eletrofisiológicos e bioquímicos, além de avaliar a expressão e o estado de fosforilação subunidade α da Na+,K+,-ATPase no neocórtex. A atividade da enzima GAD neocortical foi medida pela técnica de HPLC; as correntes inibitórias pós-sinápticas espontâneas e miniaturas (CIPS) nos neurônios piramidais foram avaliadas através da técnica eletrofisiológica de patch-clamp in vitro e avaliação da expressão total e a fosforilação do resíduo de Ser943 da Na+,K+,-ATPase neocortical foi feita através da técnica de Western Blot em camundongos Gcdh-/--Lis (P30-P45). Os resultados foram comparados com animais Gcdh-/- e Gcdh+/+ tratados com dieta normal (Gcdh-/--N e Gcdh+/+, respectivamente). Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa da atividade da GAD neocortical nos animais Gcdh-/--Lis quando compara aos animais Gcdh+/+ (P<0,05). A frequência das CIPS espontâneas e miniaturas nas células piramidais da camada V do neocórtex dos animais Gcdh-/-- Lis foi significativamente menor quando comparada às células dos animais Gcdh-/--N e Gcdh+/+ (P<0,0003). A curva de probabilidade cumulativa e a análise estatística de Kolmogorov-Smirnov confirmaram a diminuição na frequência das CIPS espontâneas e miniaturas (P<0,0001). A expressão da subunidade α da bomba Na+,K+-ATPase mostrou-se aumentada no neocórtex dos animais Gcdh-/--Lis quando comparada aos demais grupos (P<0,001). A avaliação do estado de fosforilação do resíduo de Ser943 revelou que os animais Gcdh-/--Lis apresentaram um aumento significativo da expressão do resíduo943 no neocórtex quando comparada aos demais grupos (P<0,001). Nossos dados sugerem que os animais Gcdh-/--Lis apresentam uma redução na transmissão sináptica GABAérgica neocortical que pode estar associada à disfunção da enzima GAD; e uma diminuição da atividade da bomba Na+,K+-ATPase neocortical possivelmente causada pela diminuição da expressão da enzima e pelo aumento da fosforilação do resíduo Ser943 da subunidade α no neocortical. Estas alterações em conjunto podem estar contribuindo para os mecanismos de epileptogênese na AG I. / The epilepsy is a neurological disorder that affects approximately 65 million people throughout the world. Despite of inborn errors of metabolism (IEM) not being a frequent cause of epilepsy, the most common symptom in metabolic disorders are epileptic seizures. Within the IEM, are the organic acidemias, such as, glutaric acidemia type I (GAI), that are associated with epileptic seizures during acute metabolic decompensation. The GAI is an autosomal recessive disease caused by deficiency of the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (GCDH).This deficiency leads to the accumulation of organic acids in body fluids and tissues. If not diagnosed and treated early, this disease evolves to neurological deficits, macrocephaly and epilepsy. The increased levels of organic acids in the brain, such as glutaric, glutaconic and 3-hydroxyglutaric acids, decreases the activity of the enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) in the brain parenchyma and cause the inhibition of the enzyme activity NA+,K+-ATPase. Interestingly, previous biochemical and behavioral analysis of an animal model of GAI, the GCDH knockout mice treated with lysine overload diet (4.7%) (Gcdh-/--Lis), had shown decreased GAD immune content, reduced GABA release and decreased activity Na+,K+-ATPase in the neocortex; and development of spontaneous seizures. In this work (approved by the CEP-HCPA-140270) we used this animal model to study the neocortical GABAergic synaptic function and the expression and the phosphorylation state of Na+,K+-ATPase α subunit in the neocortex. The GAD activity was measured by HPLC technique; the spontaneous and miniature inhibitory post-synaptic currents (IPSC) were evaluated by in vitro patch-clamping recordings from pyramidal cells; and the expression and the phosphorylation of total residue to Ser943 of Na+, K+- ATPase was performed by Western Blot in mice Gcdh-/--Lis (P30-P45). As controls we used Gcdh (Gcdh-/--N) and Gcdh+/+ animals treated with normal diet. Our results showed a significant decrease in the neocortical GAD activity in Gcdh-/--Lis mice when compared to Gcdh+/+ group (P<0.05). The spontaneous and miniature IPSC frequencies onto layer V pyramidal cells from Gcdh-/--Lis mice were significantly lower when compared to Gcdh-/--N and Gcdh+/+ mice (P<0.0003). The cumulative probability and the statistical analysis the Kolmogorov-Smirnov confirmed the decrease in the frequency of spontaneous and miniature IPSC (P<0.0001). The expression of Na+,K+-ATPase α subunit was higher in the neocortex from Gcdh-/--Lis when compared to the other groups (P<0.001). Also, the Gcdh-/--Lis mice had a significant increased fosforilation of Na+,K+-ATPase residual Ser943 in the neocortex when compared to the other groups (P<0.001). Our data suggested that the neocortex of Gcdh-/--Lys mice exhibited reduction in GABAergic inhibition that may be attributed to a GAD dysfunction level; and decreased Na+,K+-ATPase activity that could be caused by decrease in its expression and increased phosphorylation of residue Ser943 α subunit. Taken altogether, these alterations could contribute to the mechanisms of epileptogenesis observed in GAI.

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por perda da memória e das demais funções cognitivas. Sua patogenia envolve a produção do peptídeo β-amiloide (Aβ), através da clivagem da proteína precursora amiloide (APP) por β- e γ-secretases (amiloidogênese), e a posterior agregação do Aβ em oligômeros e/ou fibrilas. A toxicidade do Aβ tem sido associada a diversos mecanismos, a incluir desde seu efeito oxidante e inflamatório, até sua propriedade de induzir necrose por ruptura das membranas neurais, ou apoptose via ativação de cascatas sinalizatórias. Como etapa comum a estes mecanismos de toxicidade, a interação do peptídeo com membranas neurais, em particular com o gangliosídio GM1 (constituinte dos rafts), parece ser indispensável ao dano neural associado ao peptídeo, bem como à ativação da cascata amiloide que caracteriza o ciclo patológico Aβ-amiloidogênese. O GM1 é um gangliosídio de membrana que, quando administrado exogenamente, apresenta propriedades neurotróficas e neuroprotetoras, inclusive em modelos de DA. Os mecanismos envolvidos nesta neuroproteção, no entanto, ainda precisam ser melhor elucidados. Com isto, o objetivo da presente tese foi avaliar o potencial efeito neuroprotetor do GM1 em modelo in vivo e in vitro de toxicidade do Aβ1-42 fibrilado, e propor mecanismos para esta neuroproteção. Inicialmente, demonstramos que o GM1 (0,30 mg/kg), quando co-administrado (icv) com Aβ (2 nmol) previne o déficit cognitivo induzido pelo peptídeo (teste de reconhecimento de objetos), bem como a redução na atividade da Na+,K+-ATPase (enzima envolvida na regulação da transmissão sináptica) no hipocampo de ratos Wistar machos. Demonstrou-se, além disso, que este efeito neuroprotetor do GM1 é acompanhado de aumento nas defesas antioxidantes, em córtex e hipocampo (TRAP). Como a toxicidade do Aβ e a modulação da amiloidogênese parecem ser dependentes de alterações na estrutura dos microdomínios de membrana (rafts), investigamos o efeito da injeção (icv) de Aβ e do tratamento (icv) com GM1 sobre a integridade dos rafts e sobre a distribuição das proteínas APP e BACE1 (β-secretase) nestes microdomínios. Observamos que o Aβ promoveu um desmonte parcial nos rafts, acompanhado de um aumento na distribuição de APP e BACE1 nestes microdomínios, efeitos estes que foram prevenidos pelo tratamento com GM1. Em virtude de os rafts modularem diversas funções neurais, e de a co-localização de APP e BACE1 nos rafts ser um evento necessário a amiloidogênese, os resultados aqui obtidos, reforçam a ideia de que o GM1 exerça sua função neuroprotetora ao preservar a arquitetura das membranas e que o mesmo poderia frear a ativação da amiloidogênese induzida pelo Aβ, ao prevenir a redistribuição das proteínas APP e BACE1 aos rafts lipídicos. A fim de avaliar a atividade neuroprotetora do GM1 em modelo in vitro da DA, e de investigar a sua propriedade de interagir com o Aβ impedindo a interação deste às membranas neurais, avaliamos o efeito da incubação de GM1 (10, 20 e 30μM) frente à toxicidade do Aβ (0,5μM) em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y, bem como, verificamos o efeito de uma prévia incubação Aβ-GM1 (in vitro) sobre a toxicidade induzida pelo peptídeo. Como resultado, observamos que o GM1 promoveu neuroproteção nas três concentrações testadas e que esta neuroproteção foi, pelo menos parcialmente, mediada por sua capacidade de interagir in vitro com o Aβ. Nossos dados, em conjunto, reforçam as evidências que apontam o GM1 como uma potencial droga neuroprotetora em modelos de DA. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a loss of memory and impairment of other cognitive functions. Its pathogenesis involves the production of β-amyloid peptide (Aβ) by cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by β- and γ-secretases (amyloidogenesis) and the subsequent aggregation of Aβ into oligomers and/or fibrils. Aβ toxicity has been associated with several mechanisms, ranging from its oxidant and inflammatory effects until their property to induce necrosis by neural membrane rupture, or apoptosis via activation of signaling cascades. As a common step to these toxicity mechanisms, the peptide interaction with neural membranes, particularly with GM1 ganglioside (component of membrane rafts), seems to be pivotal to the peptide induced neural damage, as well as the amyloid cascade activation that characterizes the pathological vicious cycle Aβ- amyloidogenesis. GM1 is a membrane ganglioside provided of neurotrophic and neuroprotective properties in AD models, when exogenously administered. The mechanisms of neuroprotection, however, need to be further elucidated. By this way, the aim of this PhD thesis was to evaluate the potential neuroprotective effect of GM1 in in vivo and in vitro models of fibrilar Aβ1-42 toxicity, and to propose mechanisms for this neuroprotection. Initially, we demonstrated that GM1 (0.30 mg/kg.), when co-administered (icv) with Aβ (2nmol), prevents the peptide induced cognitive deficit (object recognition task), as well as Aβ induced reduction in Na+,K+-ATPase activity (a enzyme involved in synaptic transmission regulation) in the hippocampus from male Wistar rats. We have shown, furthermore, that this neuroprotective effect of GM1 is accompanied by an increase in antioxidant defenses in the cortex and hippocampus (TRAP). As Aβ toxicity, as well as the modulation of amyloidogenesis, appear to be dependent on changes in the structure of membrane microdomains (rafts), we have investigated the effect of Aβ icv injection and GM1icv treatment on raft integrity and on the distribution of APP and BACE1 (β- secretase) proteins in these microdomains. As result, Aβ promoted a partial raft disassemble, accompanied by an increase in the distribution of APP and BACE1 to these microdomains, effects that were prevented by GM1 treatment. Considering that rafts modulate several neural functions, and that APP and BACE1 co-localization into lipid rafts is pivotal to amyloidogenesis, our results reinforce the idea that GM1 neuroprotection is mediated by membrane architecture preservation, and that GM1 treatment could slow down the Aβ induced activation of amyloidogenesis, by prevention of APP and BACE1 redistribution into lipid rafts. In order to evaluate the GM1 neuroprotective activity in an in vitro AD model, and to investigate GM1 property of interacting with Aβ and preventing its interaction with neuronal membranes, we evaluated GM1 (10, 20 and 30μM) effect against Aβ (0,5 μM)-induced toxicity in SHSY5Y human neuroblastoma cells, as well as, we verified the effect of a Aβ-GM1 in vitro preincubation on the peptide-induced toxicity. As our results indicate, the three tested GM1 concentrations promoted neuroprotection and this effect was, at least partially, mediated by its ability to in vitro interact with Aβ peptide. Our data, when taken together, reinforce the evidence suggesting GM1 as a potential neuroprotective drug in AD models.

A cafeína é um psicoestimulante muito consumido na dieta, tendo como principais fontes alimentares o café, o chá verde, refrigerantes de cola e energéticos. Uma vez que a cafeína ultrapassa a placenta e a barreira hematoencefálica, o consumo de cafeína durante a gestação pode afetar o feto em qualquer momento da gravidez. Alguns estudos têm mostrado que o consumo excessivo de cafeína em humanos pode estar associado com o aumento de aborto espontâneo e de baixo peso ao nascer. No entanto, é difícil de controlar fatores de confusão; dessa maneira, estudos experimentais são importantes para avaliar o efeito do consumo de cafeína no desenvolvimento encefálico. No primeiro capítulo desta tese, ratas Wistar foram tratadas com cafeína na água de beber (0,1; 0,3 e 1,0 g/L, o que corresponde à baixa, moderada e elevada ingestão, respectivamente), durante o ciclo escuro em dias de semana, duas semanas antes do acasalamento e durante toda a gestação. As ratas foram sacrificadas no dia embrionário 18 ou 20 (E18 ou E20, respectivamente), e o córtex e o hipocampo dos fetos foram dissecados para análise por Western Blot. Verificamos o imunoconteúdo cortical e hipocampal das seguintes proteínas: Proteína Associada ao Cone de Crescimento (GAP-43), Sonic Hedgehog (Shh), Proteína Associada ao Sinaptossoma (SNAP-25), Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo (BDNF) e seu receptor Tirosina Cinase B (TrkB). Além disso, foi avaliado o número de células neuronais e não-neuronais em ambas idades e regiões encefálicas pela marcação de NeuN. Em E18 no hipocampo, a maior dose de cafeína diminuiu TrkB e aumentou Shh, e a dose moderada (0,3 g/L) reduziu GAP-43; no córtex, houve uma diminuição de BDNF e um aumento de Shh nos embriões expostos à dose mais alta de cafeína nessa idade. No E20, o BDNF cortical foi aumentado pela dose mais elevada, e as doses de 0,3 g/L e 1,0 g/L de cafeína aumentaram Shh no hipocampo. Não houve efeito da dose mais baixa (0,1 g/L) no imunoconteúdo das proteínas estudadas em ambas as estruturas encefálicas e idades embrionárias. O número de células neuronais foi aumentado pela dose mais baixa de cafeína no córtex em E20, e a dose moderada aumentou o número de neurônios hipocampais em E18. A exposição de cafeína durante a embriogênese em roedores influenciou em modificações de proteínas cruciais para o desenvolvimento encefálico. Por isso, seria necessário analisar se estas modificações poderiam refletir em alterações pós-natais no desenvolvimento. Para isso, utilizando a mesma escala de tratamento de cafeína durante a gestação e lactação, verificamos o desenvolvimento motor e reflexo, o metabolismo da cafeína e a sinalização glutamatérgica nos dias pós-natal (DPN) 7, 14 e 21. Não houve diferença no desenvolvimento reflexo dos animais que receberam cafeína. A atividade locomotora aumentou com a idade, mas a cafeína não influenciou na locomoção. No entanto, cafeína a 1,0 g/L reduziu o peso corporal dos filhotes nos DPN 14 e 21, enquanto a exposição à 0,3 g/L de cafeína reduziu o peso corporal no DPN 21. Os níveis plasmáticos de cafeína e teobromina não foram afetados pela idade, mas encontramos interação de idade e tratamento nos níveis plasmáticos de paraxantina e teofilina. No DPN 7, a ingestão moderada de cafeína (0,3 g/L) aumentou o GLT-1 e a razão pGluN1/GluN1 no córtex, enquanto que a dose mais elevada (1,0 g/L) diminuiu o GLT-1 e aumentou a razão pGluN1/GluN1 no hipocampo; todas as doses de cafeína aumentaram o GluA1 hipocampal nesta idade. A dose moderada de cafeína aumentou o mGlu5 em ambas as estruturas encefálicas e aumentou o GluA1 no córtex no DPN 14. Cafeína a 0,3 g/L diminuiu GluA1 e mGlu5 no córtex e aumentou GluN2A hipocampal no DPN 21, e a dose mais elevada também diminuiu o mGlu5 cortical no DPN 21; a dose moderada reduziu o imunoconteúdo hipocampal de GluA1 e mGlu5 nesta idade. A ligação específica ao glutamato (binding) foi transitoriamente reduzida no córtex no DPN 14 pela dose moderada (0,3 g/L), retornando a níveis semelhantes ao controle no DPN 21. Com este trabalho enfatizamos a importância de haver um controle do consumo de cafeína durante um período crítico para o desenvolvimento e maturação encefálica, no entanto mais estudos são necessários para investigar o impacto dessas alterações a longo prazo. / Caffeine is the most consumed psychostimulant worldwide, present in coffee, green tea, cola soft drinks and energy drinks. Since caffeine freely crosses placenta and blood-brain barrier during pregnancy, epidemiology studies have found association between caffeine intake and miscarriage and low birth weight; however, some confounding factors may affect the results. Therefore, animal studies are an important tool to evaluate caffeine intake during brain development. In the first chapter of this thesis, adult female Wistar rats received caffeine in the drinking water (0.1, 0.3 and 1.0 g/L) during the active cycle in weekdays, two weeks before mating and throughout pregnancy. Cerebral cortex and hippocampus from embryonic stages 18 or 20 (E18 or E20, respectively) were collected for immunodetection of the following synaptic proteins: brainderived neurotrophic factor (BDNF), TrkB receptor, Sonic Hedgehog (Shh), Growth Associated Protein 43 (GAP-43) and Synaptossomal-associated Protein 25 (SNAP-25). We also estimated the number of NeuN-stained nuclei (mature neurons) and non-neuronal nuclei in both brain regions and embryonic periods. At E18 in hippocampus, high caffeine intake (1.0 g/L) decreased TrkB and increased Shh, whereas the moderate dose reduced hippocampal GAP-43. In whole cortex, BDNF was decreased and Shh was increased in fetuses exposed to the highest dose of caffeine. At E20, BDNF in whole cortex increased at the highest dose, and Shh in hippocampus increased at both moderate and high caffeine doses of caffeine. The lowest dose of caffeine has no effect in all proteins assessed in whole cortex and hippocampus for both embryonic stages. NeuNstained nuclei was increased in the cortex at E20 and in the hippocampus at E18 by lower and moderate doses of caffeine, respectively. Caffeine exposure during rat embryogenesis modified key proteins in brain development. Therefore, it is essential to evaluate whether these changes may reflect in alterations postnatally. For this, using the same protocol of caffeine administration, we studied whether different doses of caffeine intake during pregnancy and lactation may affect reflex and motor development, caffeine metabolism, ontogeny of glutamate receptors and transporter and glutamate binding in cortex and hippocampus in pups at post-natal days (PND) 7, 14 and 21. We did not find differences in reflex development. However, the highest dose decreased body weight from PND 14 up to weaning (PND 21), whereas 0.3 g/L caffeine decreased body weight at PND 21. Locomotor activity increased with age, but it was not modified by caffeine at any dose. Caffeine and theobromine plasma levels were unaffected by age, but there was interaction between age and dose in plasma levels of paraxanthine and theophylline. At PND 7, moderate caffeine intake (0.3 g/L) increased GLT-1 and pGluN1/GluN1 ratio in whole cortex, whereas the highest dose decreased GLT-1 and increased pGluN1/GluN1 ratio in hippocampus. All doses of caffeine increased hippocampal GluA1 at this age. Moreover, moderate dose of caffeine increased mGlu5 in both brain structures and increased GluA1 in whole cortex at PND 14. Caffeine 0.3 g/L decreased cortical GluA1 and mGlu5 and increased hippocampal GluN2A at PND 21. The highest dose also decreased cortical mGlu5 at this age. Conversely, the moderate dose decreased GluA1 and mGlu5 in hippocampus at this age. Glutamate binding were transiently reduced in cortex from rat pups exposed to the lowest dose of caffeine up to PND 14, but it was normalized at PND 21. This work emphasizes the importance of controlling caffeine intake during critical periods of rat brain development and maturation, and more research is needed to evaluate the impact of these changes later in life.

A deficiência da 3-metilcrotonil-CoA carboxilase (3MCCD) é uma doença autossômica recessiva do metabolismo da leucina, caracterizada bioquimicamente por um acúmulo tecidual de 3-metilcrotonilglicina (3MCG), ácido 3-hidroxi-isovalérico e ácido 3-metilcrotônico (3MCA), bem como de uma deficiência secundária de L-carnitina. A apresentação clínica nos pacientes é bastante variável, mas geralmente apresentam sintomas neurológicos, atraso no desenvolvimento, cardiomiopatia, bem como desenlace fatal em crianças. Tendo em vista que a patogênese da doença ainda é desconhecida, no presente trabalho foram investigados os efeitos da 3MCG e do 3MCA sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Demonstrou-se que a 3MCG e o 3MCA aumentaram os níveis das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) bem como a formação de grupamentos carbonila, indicando que esses metabólitos provocam oxidação lipídica e proteica. Além disso, a elevação de TBA-RS provocada pela 3MCG foi prevenida pelos antioxidantes melatonina e trolox, sugerindo o envolvimento de espécies reativas na indução de lipoperoxidação. Considerando que o inibidor da óxido nítrico sintase Nω-nitro-L-arginina metill éster (L-NAME) não alterou os efeitos da peroxidação lipídica e que a produção de óxido nítrico não foi alterada pela 3MCG, presume-se que espécies reativas de oxigênio estão envolvidas nesse efeito. Por outro lado, os níveis de glutationa reduzida (GSH) e a oxidação de grupamentos sulfidrila não foram alterados por 3MCG e 3MCA. Da mesma forma, a atividade de importantes enzimas antioxidantes como a glutationa peroxidase, catalase, superóxido dismutase e glutationa redutase não foi alterada pela 3MCG. Os dados apresentados demonstram que os metabólitos acumulados na 3MCCD induzem oxidação lipídica e proteica e que esses danos podem estar envolvidos, ao menos em parte, na patogênese da doença e nas anormalidades cerebrais apresentadas pelos pacientes. / Isolated 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency (3MCCD) is an autosomal recessive disorder of leucine metabolism biochemically characterized by tecidual accumulation of 3-methylcrotonylglycine (3MCG), 3-hydroxyisovaleric acid and 3-methylcrotonic acid (3MCA), besides that, patients can present a secondary deficiency of L-carnitine. The clinical presentation is highly variable, ranging from severe neurological abnormalities, developmental delay, cardiomyopathy and death in infants, the pathogenesis is poorly known. In the present study, we investigated the in vitro effects of 3MCG and 3MCA on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex of young rats. Considering that pathophysiology of this disorder is poorly known, in this present work we investigated the role of 3MCG and 3MCA on important parameters of oxidative stress in cortex cerebral of young rats. Our results show that 3MCG and 3MCA increased thiobarbituric acid-reactive species (TBA-RS) and carbonyl formation, indicating that these compounds provoke lipid and protein oxidation, respectively. Furthermore, 3MCG-induced elevation of TBA-RS were prevented by melatonin and trolox (soluble α-tocopherol), indicating that these effects were due to reactive species. Considering that the nitric oxide inhibitor Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) did not alter lipid oxidation and that nitric oxide production was not affected by 3MCG, it is presumed that reactive oxygen species were involved in these effects. In contrast, reduced glutathione (GSH) levels and sulfhydryl oxidation were not changed by 3MCG and 3MCA. Similarly, the activity of important antioxidants enzymes such as glutathione peroxidase, catalase, superoxide dismutase and glutathione reductase were not altered by 3MCG. The present data demonstrate that metabolites accumulating in 3MCCD induce lipid and protein oxidative damage that may be involved, at least in part, in the pathophysiology of the brain abnormalities found in this disorder.

A deficiência da 3-metilcrotonil-CoA-carboxilase (3-MCCD) é uma desordem autossômica recessiva do catabolismo da leucina. Os pacientes afetados pela 3-MCCD apresentam acúmulo tecidual de 3-metilcrotonil-CoA, o que leva a um aumento da formação e excreção urinária do ácido 3- hidroxiisovalérico (3-HIVA), 3-metilcrotonilglicina (3-MCG) bem como elevação das concentrações no plasma de 3-hidroxiisovaleril-carnitina (C5- OH). A apresentação clínica é extremamente variável e caracterizada principalmente por uma disfunção neurológica severa com encefalopatia e paralisia cerebral. Os pacientes também apresentam retardo psicomotor, hipotonia muscular, cardiomiopatia e leucodistrofia. Infelizmente os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral apresentado por esses pacientes ainda são pouco conhecidos. Considerando a importância do metabolismo energético para o sistema nervoso central e que os pacientes afetados por 3-MCCD acumulam e excretam grandes quantidades de 3- MCG, o presente estudo se propôs a investigar a influência deste metabólito sobre importantes parâmetros do metabolismo energético cerebral em ratos jovens. Inicialmente, observamos que a 3-MCG diminuiu a produção de CO2 a partir de acetato [1-14C], sugerindo que houve comprometimento no funcionamento do ciclo do ácido cítrico. Além disso, a 3-MCG diminuiu a atividade do complexo II-III da cadeia transportadora de elétrons, indicando que o fluxo de elétrons através dessa cadeia está prejudicado.Também verificamos que as atividades das enzimas creatina-quinase e Na+,K+- ATPase foram alteradas pela 3-MCG. Tomados em seu conjunto, esses achados indicam que a produção e transferência de energia estão comprometidas bem como a neurotransmissão que é dependente de uma atividade normal da Na+,K+-ATPase. Observamos também que antioxidantes foram capazes de atenuar ou prevenir completamente o efeito inibitório da 3- MCG sobre as atividades da creatina-quinase e da Na+,K+-ATPase, sugerindo o envolvimento de radicais livres nesses efeitos. Essa hipótese foi reforçada pela observação de que a 3-MCG provoca dano oxidativo lipídico (peroxidação lipídica). Nossos resultados sugerem que a 3-MCG prejudica a homeostase mitocondrial e o potencial de membrana que podem estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados pela deficiência da 3-metilcrotonil-CoA-carboxilase. / Deficiency of 3-methylcrotonyl-CoA-carboxylase (3-MCCD) is an autosomal recessive disorder of leucine catabolism. Affected patients usually present accumulation of 3-methylcrotonyl-CoA in tissues, leading to high synthesis and urinary excretion of 3-hydroisovalerate (3-HIVA), 3- methylcrotonylglycine (3-MCG), as well as increased levels of 3- hydroxyisovaleryl-carnitine (C5-OH) in plasma.The clinical presentation is highly variable and mainly characterized by severe neurological dysfunction with encephalopathy and cerebral paralysis.Patients also present important psychomotor retardation, muscular hypotonia, cardiomyopathy and leukodystrophy. Unfortunately, the underlying mechanisms involved in the cerebral damage of these patients are practically unknown. Considering the importance of energy metabolism to the central nervous system and that patients affected by 3-MCCD accumulate and excrete large amounts of 3- MCG, the present study investigated the influence of this metabolite on important parameters of brain energy metabolism in young rats. Initially, we observed that 3-MCG decreased CO2 production from acetate [1-14C], suggesting impairment in the function of the citric acid cycle. Furthermore, 3- MCG decreased the activities of complex II-III of the respiratory chain, indicating that the electron transport chain flow is impaired in the presence of this metabolite. We also verified that the activities of enzymes creatine-kinase and Na+,K+-ATPase from synaptic membrane were altered by 3-MCG.Taken together, these findings indicate that energy production and transfer are compromised. We also observed that antioxidants were able to attenuate or fully prevent the inhibitory effect of 3-MCG on creatine-kinase and synaptic membrane Na+,K+-ATPase activities, suggesting the involvement of free radicals in these effects.This hypothesis was reinforced by the observation that 3-MCG causes oxidative lipid damage (lipid peroxidation). Our results suggest that 3-MCG compromises mitochondrial homeostasis and membrane potential and it may be involved in the neurological damage found in patients affected by 3-MCCD.

Orientador: Iscia Teresinha Lopes-Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T13:10:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Torres_FabioRossi_D.pdf: 9761976 bytes, checksum: 5bf6571c4665ed95a3d8ae8ccbb18717 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) e os distúrbios do desenvolvimento cortical (DDC) são duas das mais importantes causas de epilepsia. Avanços nos estudos de genética molecular levaram a descoberta de genes responsáveis por vários DDCs como a heterotopia nodular periventricular (HNP), o espectro da lissencefalia-heterotopia subcortical em banda (LIS-HSB), a esquizencefalia, a polimicrogiria e para um subtipo de ELT, a epilepsia autossômica dominante com auras auditivas (EADAA). Os principais objetivos deste projeto foram: 1) realizar uma triagem de mutações nos quatro principais genes associados aos DDC (FLN1, LIS1, DCX e EMX2) em um grande grupo de pacientes com este tipo de malformação, 2) mapear os loci para a EADAA, 3) investigar o mecanismo molecular das mutações identificadas. A triagem de mutações foi realizada através da técnica de denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) e subseqüente sequenciamento automático dos fragmentos alterados. Para estudo funcional das mutações identificadas foi utilizada a técnica de HUMARA e PCR em tempo real. A análise de ligação foi realizada através da amplificação por PCR de marcadores microsatélites marcados com fluoróforos e análise dos alelos com os programas Fragment Profiler® e MLINK®. Um total de 108 pacientes com diferentes formas de DDC foi estudado, 13 pacientes possuem HNP, 19 são portadores do espectro LIS-HSB, 46 possuem esquizencefalia, enquanto 30 são afetados por polimicrogiria perisilviana bilateral. Nosso grupo também identificou quatro famílias segregando EADAA, sendo que duas possuem poder estatístico significativo para estudos de análise de ligação. Uma mutação deletéria G987C que altera o sítio de splicing do sexto intron do gene FLN1 foi identificada em dois indivíduos relacionados, portadores da forma clássica e bilateral de HNP. Diferença no padrão de inativação do cromossomo X foi detectada como o provável fenômeno responsável pelas diferenças clínicas entre os dois pacientes. No grupo de pacientes com o espectro LIS-HSB, foi identificada uma mutação deletéria A1385C que altera uma histidina por uma prolina no aminoácido 277 da proteína LIS. Apenas alterações neutras foram identificadas no gene DCX. No grupo de indivíduos com esquizencefalia e polimicrogiria foram encontradas apenas variações neutras no gene EMX2. A análise de ligação foi positiva para um locus no cromossomo 10 apenas para uma família com EADAA. O sequenciamento automático de indivíduos afetados identificou uma mutação no gene LGI1 (IVS7-2A>G), além do mais, estudos de neuroimagem identificaram malformações corticais em pacientes com mutações em LGI1. Análise genética e de mutações na família de genes LGI e em MASS1 identificou apenas variantes neutras nestes genes para as demais famílias estudadas. A análise de ligação genômica randômica em uma família com EADAA informativa e sem mutações em LGI1 identificou uma região candidata a possuir um gene implicado com esta síndrome no cromossomo 6q22 que, no entanto não foi confirmado pela análise subseqüente de marcadores adicionais na região candidata. Através deste trabalho podemos concluir que: a) Mosaicismo, mutações em regiões não codificantes, grandes deleções e rearranjos, além da presença de casos atípicos, são fatores que podem estar influenciando na baixa freqüência de mutações encontradas em pacientes com HNP e o espectro LIS-HSB, b) mutação no gene FLN1 foi encontrada em casos familiares de HNP bilateral, c) o mecanismo patológico desta mutação é uma destruição do sito de splicing do sexto intron do gene FLN1, d) as diferenças fenotípicas entre os dois pacientes portando esta mutação podem ser explicadas por diferenças no padrão de inativação do cromossomo X, e) mutações de sentido trocado no gene LIS1 são raras em pacientes com LIS-HSB e a localização das mesmas em domínios terminais WD não estão relacionados a fenótipos menos severos, f) a esquizencefalia e a polimicrogiria não têm base genética relacionada com o gene EMX2, g) a EADAA é uma entidade geneticamente heterogênea, já que mutações em LGI1 foram identificadas em apenas uma família com esta síndrome, h) malformações corticais em pacientes com EADAA e mutações em LGI1 foram descritas pela primeira vez, i) os genes pertencentes à família LGI e MASS1, não estão envolvidos com a etiologia da EADAA nas demais famílias analisadas, j) um locus candidato para o segundo gene responsável pela EADAA foi identificado no cromossomo 6q22, no entanto a saturação da região com marcadores adicionais não confirmou este achado / Abstract: Temporal Lobe Epilepsy (TLE) and malformations of cortical development (MCD) are two of the most important causes of epilepsy. Extensive molecular genetic studies have resulted in gene discovery for MCD such as periventricular nodular heterotopia (PNH), lisencephaly/ subcortical band heterotopia spectrum (LIS-SBH), schizencephaly, polymicrogyria and for a subtype of TLE, the autossomic dominant partial epilepsy with auditory features (ADPEAF). The main goals of this project were 1) to screen for mutations in the four main genes responsible for abnormal cortical development (FLN1, LIS1, DCX and EMX2) in a large cohort of patients with different types of cortical malformations 2) to map the loci for ADPEAF and 3) to investigate molecular mechanisms of mutations identified. Mutation screening was performed by the polymerase chain reactions (PCR). PCR products were analyzed by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) and were subsequently sequenced using standard automatic sequencer. In addition, HUMARA marker and Real Time PCR were performed to study molecular mechanisms resulting from the mutations identified. Linkage analysis was carried out by amplifying microsatellites markers by PCR and analyzing alleles with Fragment profiler® software and MLINK® package program. We have studied a total of 108 patients with MCD. Thirteen had PNH, 19 had the LIS-SBH spectrum, 46 individuals had schizencephaly and 30 had polymicrogyria. In addition we have identified four families segregating ADPEAF. Two families were considered informative for linkage analysis. We found a G987C mutation that alters the splicing site of the 6th intron of the FLN1 gene in two related patients with classical PNH findings, skewed X chromosome inactivation was detected as the possible mechanism responsible for clinical differences between the two patients. In the LIS-SBH group, one patient with agyria/pachygyria had an A1385C transversion, which changes a histidine for a proline in amino acid 277 of the LIS1 protein. Furthermore, in the group of the schizencephalies and polymicrogyria we have detected only neutral variants in the EMX2 gene. Linkage analysis in ADPEAF showed linkage to chromosome 10q in only one family. Automatic sequencing identified a mutation in the LGI1 gene. In addition, neuroimaging studies showed cortical malformations in patients with LGI1 mutations. Mutation and genetics analysis of the LGI gene family and MASS1 in other pedigrees failed to show a role for these genes in the etiology of ADPEAF. A genome wide scan performed in a large family segregating ADPEAF point to a potential candidate region on chromosome 6q22, which was not confirmed after further investigation with additional microsatellite markers. We conclude that: a) Mosaicism, mutations in non coding regions, large deletions and the presence of atypical cases could have contributed for the low frequency of mutations found in patients with PNH and the LIS-SBH spectrum b) we found mutations in the FLN1 gene in familial cases of bilateral PNH, c) the pathologic mechanism of this mutation is the splicing site destruction of the 6th FLN1 gene intron, d) phenotypic differences between the two related patients harboring this FLN1 mutation were explained by a non random X chromosome inactivation, e) missense mutations in the LIS1 gene are a rare finding in patients with the LIS-SBH spectrum and its localization in latter WD domains are not always related with less severe LIS, f) schizencephaly and polymicrogyria appear not to have a genetic background in the EMX2, since our study detected only a neutral polymorphism in these patients, g) ADPEAF is a genetically heterogeneous entity, since mutations in the LGI1 gene were identified only in one family with this syndrome, h) cortical malformation in the left temporal lobe was detected by the first time in individuals with ADPEAF and LGI1 mutations, i) MASS1 and LGI gene family were not involved with ADPEAF etiology in the other pedigrees studied, j) a potential candidate locus to contain the second gene responsible for ADPEAF was identified in chromosome 6q22, however additional studies failed to confirm linkage in this region / Doutorado / Neurociencias / Doutor em Fisiopatologia Medica

Introdução: A anemia aguda tem sido associada com distúrbios neurofisiológicos e cognitivos em pacientes saudáveis. Evidências experimentais sugerem que a hemodiluição pode aumentar lesões cerebrais, limitando o suprimento de oxigênio ao tecido cerebral. No entanto, o mecanismo exato pelo qual as lesões cerebrais ocorrem em pacientes anêmicos ainda não está claramente definido. O objetivo desse estudo foi avaliar os precursores da apoptose neuronal Bax, Bcl-x no córtex frontal, atividade das caspases 3 e 9 na fração citosólica do hipocampo e na fração mitocondrial do córtex frontal, assim como a fragmentação do DNA na fração nuclear e mitocondrial do córtex frontal, após hemodiluição normovolêmica aguda. Métodos: Vinte e quatro porcos foram anestesiados e randomizados em 4 grupos de 6 animais: Controle, hemodiluição normovolêmica aguda (HNA) com hematócrito alvo de 15% (Ht 15%), HNA com hematócrito alvo de 10% (Ht 10%) e hipóxia-hipóxica (HH). A HNA foi realizada com 1ml de hidroxetil amido (130/0,4) por ml de sangue retirado, até o hematócrito alvo desejado (10 ou 15%). O HH consistiu de ventilação com baixa fração expirada de O2 (FiO2), sendo de 6% por 60 minutos, servindo como grupo controle positivo. Os animais do grupo controle não sofreram nenhuma dessas intervenções. As proteínas pró-apoptótica Bax e anti-apoptótica Bcl-x foram avaliadas por Western blotting nas frações nucleares e mitocondriais do córtex frontal. A atividade das caspases 3 e 9 foi avaliada nas frações mitocondrial e citosólica do hipocampo por espectrofluorometria. A fragmentação do DNA foi avaliada por eletroforese nas frações nuclear e mitocondrial do córtex frontal. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por teste de Tukey (p<0,05). Resultados: Não foi observada diferença significativa entre os grupos controle, Ht 15% e Ht 10% em relação à proteína pró-apoptótica Bax nas frações nuclear e mitocondrial. Entretanto, o grupo HH foi significativamente diferente dos grupos controle e Ht 15% na fração nuclear e de todos os grupos na fração mitocondrial. Não foi encontrada diferença significativa em relação à Bcl-x. A atividade das caspases 3 e 9 nas frações mitocondrial e nuclear foi diferente no grupo HH quando comparado com os demais grupos. Não foi observada diferença significativa em relação à fragmentação do DNA entre os grupos controle, Ht 15% e Ht 10%. Conclusão: A avaliação dos precursores da apoptose demonstrou que a hemodiluição normovolêmica aguda com hematócrito alvo de 15% e 10% não induziu apoptose, sugerindo que a oxigenação cerebral foi preservada / Background: Acute anemia has been associated with neurophysiologic and cognitive dysfunctions in healthy patients. Experimental evidences suggest that hemodilution may increase cerebral lesions, limiting oxygen supply to the brain tissue. Nevertheless, the exact mechanisms through which cerebral lesions occur in anemic patients havent been clearly defined. Therefore, the objective of the present study was to evaluate neuronal apoptosis precursors Bax, Bcl-x in the frontal cortex, caspase 3 and 9 activity in the mitochondrial and cytosolic fractions of the hippocampus, even as DNA fragmentation in the mitochondrial and nuclear fractions of the frontal cortex after acute normovolemic hemodilution. Methods: Twenty four pigs were anesthetized and randomized into 4 groups of 6 animals: sham, acute normovolemic hemodilution (ANH) to reach a hematocrit of 15% (Ht 15%), ANH to reach a hematocrit of 10% (Ht 10%) and hypoxic-hipoxia (HH). ANH was performed with 1ml hydroxyethyl starch 130/0.4 (HES) per ml of blood withdrawn to the desired target hematocrit (10 or 15%). HH consisted of ventilation with low fraction of inspired oxygen (FiO2) of 6% for 60 minutes, serving as a positive control group. Sham animals were not involved in any of these interventions. Pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-x proteins were evaluated by Western blotting in nuclear and mitochondrial fractions of the frontal cortex and activities of caspases-3 and-9 were evaluated in the mitochondrial and cytosolic fractions of the hippocampus by spectrofluorometry. DNA fragmentation was evaluated by electrophoresis in the mitochondrial and nuclear fraction. Data were compared by analysis of variance (ANOVA) followed by Tukeys test (p<0.05). Results: No statistical significance was found among sham, Ht 15% or Ht 10% groups regarding pro-apoptotic protein Bax, in nuclear or mitochondrial fractions. However, group HH presented significant difference from sham and Ht 15% groups in the nuclear fraction and from all groups in the mitochondrial fraction. No statistical significance was found with Bcl-x. The activities of caspases-3 and-9 in cytosolic and mitochondrial fractions were statisticaly different in group HH when compared with all other groups. No statistical significance was found in relation to DNA fragmentation among sham, Ht 15% or Ht 10%. Conclusion: The evaluation of apoptosis precursors demonstrated that ANH with target hematocrit 15% and 10% did not induce neuronal lesion, suggesting that cerebral oxygenation was preserved

Os ácidos fitânico (Fit) e pristânico (Prist) são ácidos graxos saturados de cadeia lateral ramificada, cujas concentrações estão aumentadas em diversas doenças peroxissomais. Os pacientes afetados por essas desordens apresentam manifestações clínicas heterogêneas com envolvimento neurológico importante. O aumento nas concentrações do Fit e Prist, que podem chegar a 5000 μM e 300 μM no plasma, respectivamente, parece estar correlacionado com a severidade das doenças, indicando que estes ácidos graxos possam ser neurotóxicos. Considerando que a fisiopatologia dos sintomas neurológicos dessas doenças ainda não está bem estabelecida e tendo em vista a importância do metabolismo energético para o sistema nervoso central, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos in vitro dos ácidos Fit e Prist sobre vários parâmetros do metabolismo energético. Inicialmente, observamos que o Fit não diminuiu a produção de CO2 a partir de D-[U-14C] glicose e ácido [1-14C] acético, sugerindo que não houve comprometimento da via glicolítica ou do ciclo do ácido cítrico (CAC). Esse último resultado foi confirmado pela determinação da atividade das enzimas do CAC, onde não foram observadas alterações. Por outro lado, o Fit diminuiu significativamente a atividade dos complexos I, I-III, II, II-III e IV da cadeia respiratória, indicando que o fluxo de elétrons por essa cadeia está prejudicado na presença desse ácido graxo. Também verificamos que a atividade da enzima creatina quinase não foi alterada pelo Fit. Finalmente, medimos a atividade da enzima Na+,K+-ATPase na presença de Fit e observamos que esse ácido graxo diminuiu de maneira acentuada essa atividade, indicando que a neurotransmissão está prejudicada por esse metabólito. Por outro lado, investigamos a ação do Prist sobre a produção de CO2 a partir de ácido [1-14C] acético e observamos que esse metabólito diminuiu esse parâmetro, indicando o comprometimento do CAC. Avaliamos se esse efeito deletério pudesse ter sido causado pela diminuição de coenzima A devido a uma possível competição entre o Prist e acetato por essa coenzima. Observamos que os efeitos inibitórios sobre essa atividade não foram devidos a uma depleção de coenzima A. Em seguida, investigamos o efeito do Prist sobre as atividades dos complexos da cadeia respiratória e observamos que esse ácido graxo diminuiu a atividade dos complexos I, II e II-III sem interferir com a atividade do complexo IV, o que indica claramente que esse ácido graxo interfere no fluxo dos elétrons pela cadeia respiratória, podendo potencialmente comprometer a geração de ATP. Também observamos que a atividade da enzima creatina quinase não foi alterada pelo Prist. Entretanto, foi observada uma diminuição acentuada na atividade da enzima Na+,K+-ATPase causada pelo Prist, o que indica que pode haver um comprometimento na manutenção do potencial da membrana necessário para o funcionamento da neurotransmissão. Nossos resultados sugerem que os ácidos graxos Fit e Prist acumulados em algumas doenças peroxissomais comprometem o metabolismo energético e possivelmente a neurotransmissão e que esses mecanismos podem estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas desordens. / Phytanic acid (Phyt) and pristanic acid (Prist) are branched-chain saturated fatty acids whose concentrations are elevated in various peroxisomal disorders. Patients affected by these disorders present heterogeneous clinical manifestations with predominant neurological involvement. The elevation of plasma, Phyt and Prist concentrations, that can reach up to 5000 μM and 300 μM, respectively, seems to be correlated with the severity of the symptoms, indicating that these fatty acids may be neurototoxic. Considering that the pathophysiology of the neurological symptoms of these diseases are not well established and the importance of the energy metabolism to the central nervous system, the present work proposed to investigate the in vitro effects of Phyt and Prist on various parameters of energy metabolism. Initially, we observed that Phyt did not reduce CO2 production from labeled glucose and acetate, suggesting that this acid did not alter glycolysis and citric acid cycle (CAC) activity. CAC enzyme activities were also not modified by Fit reinforcing the view that the CAC is not disturbed by Fit. On the other hand, Phyt diminished the activities of complexes I, I-III, II, II-III and IV of the respiratory chain, indicating that the electron flow through this chain is impaired by this fatty acid that could lead toa disturbance of ATP generation. We also verified that the activity of creatine kinase was not altered by this metabolite. Finally, we measured the activity of Na+,K+-ATPase in the presence of Phyt and observed that this fatty acid drastically reduced this activity, indicating that the maintenance of membrane potential and consequently neurotransmission is probably compromised by this metabolite. On the other hand, we investigated the effect of Prist on CO2 production from labeled acetate and observed that this metabolite decrease this parameter, indicating an impairment of CAC functioning. We also evaluated if this effect could be due to a decrease of coenzyme A due to a possible competition between Prist and acetate for this coenzyme. We observed that the inhibitory effects on this activity was not caused by depletion of coenzyme A. Next, we investigated the effect of Prist on the activities of the respiratory chain complexes and observed that this fatty acid reduced the activity of complexes I, II and II-III without interfering with complex IV, which clearly indicates that this fatty acid compromises the electron flow through the respiratory chain that could potentially reduce ATP generation. We also verified that the activity of creatine kinase was not altered by Prist. However, we observed a large decrease on the activity of Na+,K+-ATPase caused by Prist, which indicates that there can be a compromise on the maintenance of membrane potential necessary to a normal neurotransmission Our results suggest that the fatty acids Phyt and Prist accumulated in some peroxisomal diseases compromise energy metabolism and possibly the neurotransmission and that these mechanisms may be involved with the neurological damage presented by patients affected by these disorders.

A deficiência da semialdeído succínico desidrogenase, ou acidúria γ-hidroxibutírica, é um erro inato do metabolismo do ácido γ-aminobutírico. Bioquimicamente, é caracterizada pelo acúmulo de elevadas concentrações do ácido γ-hidroxibutírico nos tecidos, líquido cefalorraquidiano, sangue e urina dos pacientes. As manifestações clínicas descritas nesses pacientes são muito variadas e inespecíficas, mas observa-se que os principais sintomas e sinais clínicos são neurológicos. Entretanto, os mecanismos responsáveis pela disfunção neurológica desses pacientes são pouco conhecidos. Neste trabalho, o efeito in vitro do ácido γ-hidroxibutírico foi investigado sobre a quimiluminescência, as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o potencial antioxidante total (TRAP), a reatividade antioxidante total (TAR) e as atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPX) em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens com o intuito de esclarecer, ao menos em parte, a etiopatogenia dos sintomas neurológicos característicos dessa doença. O ácido γ-hidroxibutírico aumentou significativamente a quimiluminescência e os níveis de TBA-RS, enquanto que o TRAP e o TAR foram marcadamente reduzidos. No entanto, as atividades das enzimas antioxidantes não foram alteradas pelo ácido γ-hidroxibutírico. Esses resultados indicam que o ácido γ-hidroxibutírico estimula a lipoperoxidação e reduz as defesas antioxidantes não-enzimáticas, sugerindo a participação do estresse oxidativo na neuropatologia da deficiência da semialdeído succínico desidrogenase. Porém, esses achados devem ser confirmados em pacientes afetados por essa doença.

Cistinose é um erro inato do metabolismo, associado ao acúmulo de cistina nos lisossomos, causado pelo efluxo defeituoso de cistina. O acúmulo de cistina provoca uma série de sintomas, dependendo do tecido envolvido. Atrofia cortical é uma possível conseqüência do acúmulo de cistina no córtex cerebral. Contudo, os mecanismos pelos quais a cistina é tóxica para os tecidos estão longe de serem esclarecidos. Considerando que a creatinaquinase é uma enzima tiólica crucial para a homeostasia energética, e que dissulfetos como a cistina podem alterar enzimas tiólicas pela troca tiol/dissulfeto, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da cistina sobre a atividade da creatinaquinase em homogeneizado total e frações citosólica e mitocondrial de córtex cerebral de ratos Wistar de 21 dias de idade. Nós também fizemos estudos cinéticos e investigamos o efeito da glutationa reduzida, um protetor natural de grupos tiólicos, e cisteamina, a droga usada para o tratamento da cistinose, sobre a atividade da creatinaquinase. Os resultados mostraram que a cistina inibe a atividade enzimática nãocompetitivamente de uma maneira tempo e dose dependente. Resultados mostram ainda que a glutationa preveniu e reverteu parcialmente a inibição causada pela cistina, enquanto a cisteamina preveniu e reverteu completamente aquela inibição, sugerindo que a cistina inibe a atividade da creatinaquinase por interação com os grupos sulfidrílicos da enzima. Devido ao envolvimento da creatinaquinase na homeostasia energética do córtex cerebral, estes resultados sugerem um possível mecanismo para a toxicidade da cistina e também um possível efeito benéfico no uso da cisteamina em pacientes cistinóticos.