O câncer é uma doença que pode ser caracterizada pelo crescimento desordenado de células malignas, que podem se disseminar pelo organismo tornando-se agressivas e até mesmo incontroláveis. O câncer de pulmão é uma doença caracterizada por uma baixa sobrevida, em torno de 15% em cinco anos. O presente trabalho avaliou o perfil epidemiológico de câncer de pulmão na região de Governador Valadares e os fatores de risco associados, determinando a frequência do câncer de pulmão no período de 2010 a 2015. É um estudo observacional, analítico e retrospectivo com característica quantitativa que foi realizado a partir do banco de dados do Núcleo de Especialistas em Oncologia, foram analisados 7035 prontuários de pacientes preenchidos eletronicamente pelas equipes de saúde. A amostra selecionada corresponde a 227 pacientes com diagnóstico de câncer de Pulmão e suas sub localizações anatômicas sendo aplicado em dados estatísticos e encontrando alguns resultados relevantes como: relação entre sexo e Histórico familiar onde 65 pacientes afirmaram que possuíam casos de câncer na família. Outro fator é o consumo de bebida alcoólica e câncer de pulmão onde 27,65% entram em contato com a bebida alcóolica. Foi verificado que 161 pacientes entraram em contato com o tabaco diretamente ao longo da vida desenvolvendo o câncer de pulmão. Outro dado importante que 176 pacientes vieram do Sistema Único de Saúde, tornando-se uma importante via de atendimento aos pacientes com câncer de pulmão. / Cancer is a disease that can be characterized by the disordered growth of malignant cells, which can spread through the body becoming aggressive and even uncontrollable. Lung cancer is a disease characterized by a low survival rate, around 15% in five years. The present study aims to evaluate the epidemiological profile for lung cancer in the region of Governador Valadares and associated risk factors, determining the frequency of lung cancer in the period from 2010 to 2015. It is an observational, analytical and retrospective study with a quantitative trait which was carried out from the database of the Nucleus of Specialists in Oncology. 7035 medical records of patients, filled electronically by health teams were analyzed. The selected sample corresponds to 227 patients diagnosed with Lung cancer and its sub-anatomical locations being applied in statistical data and finding some relevant results such as: relationship between sex and family history where 65 patients stated that they had cases of cancer in the family. Another factor is the consumption of alcoholic beverage and lung cancer where 27.65% come in contact with the alcoholic beverage. It was verified that 161 patients came into contact with tobacco directly throughout their lives developing lung cancer. Another important fact is that 176 patients came from the Unified Health System, becoming an important route of care for patients with lung cancer.

Os nanocristais são partículas de fármacos cristalinos, com tamanho médio na faixa de submicrons, geralmente entre 200 e 500 nm, estabilizados por agentes estéricos ou eletrostáticos adsorvidos na superfície das partículas do fármaco. Sua dimensão reduzida proporciona propriedades especiais, como a adesividade às mucosas e o aumento de área superficial e da solubilidade de saturação, o que melhora significativamente a biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis em água. Outra aplicação emergente dos nanocristais é na melhoria da entrega e da retenção de fármacos em tecidos e células tumorais. Estudos demonstraram que o flubendazol é um fármaco capaz de induzir a morte celular em tumores malignos e retardar o seu crescimento, por meio da alteração que provoca na estrutura dos microtúbulos e pela inibição da polimerização da tubulina. Foi demonstrada sua atividade antiproliferativa em linhagens de leucemia, mieloma, câncer intestinal, câncer de mama e neuroblastoma. O flubendazol é também um fármaco eficaz contra os helmintos, demonstrando atividade superior na eliminação dos vermes adultos, quando comparado com a dietilcarbamazina. Embora o flubendazol pareça ser uma molécula promissora, é um fármaco praticamente insolúvel em água (0,005 mg/mL). Para atingir o efeito terapêutico desejado, é necessário o desenvolvimento de uma formulação com melhores solubilidade e biodisponibilidade. Nesse sentido, o presente trabalho apresenta o preparo e a caracterização físico-química de nanocristais de flubendazol por meio da microfluidização. Foram realizados ensaios exploratórios para avaliar a performance de diferentes agentes estabilizantes nas suspensões: o polissorbato 80, o polaxamer 188 e o D-α tocoferol polietilenoglicol 1.000 succinato (TPGS). A avaliação da distribuição do tamanho de partícula foi realizada por espalhamento de luz laser (LLS), espalhamento de luz dinâmica (DLS), análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). A utilização do TPGS favoreceu a obtenção de uma nanossuspensão com o menor diâmetro hidrodinâmico médio das partículas, de 253,9 ± 3,0 nm. Nos estudos exploratórios, também foram determinados os parâmetros ótimos de moagem do microfluidizador, sendo estabelecidos: 35.000 psi de pressão, temperatura do produto de 30°C (± 5°C) e tempo de recirculação de 2 horas/100 gramas. Objetivando alcançar o menor diâmetro hidrodinâmico médio dos nanocristais, executou-se um planejamento estatístico no qual foi avaliada a influência da concentração de flubendazol (% p/p) e de TPGS (% p/p) na formulação. A análise revelou a significativa influência da concentração do TPGS na redução do tamanho de partícula e na estabilidade físico-química da nanossuspensão. Ensaios complementares de solubilidade demonstraram que o nanocristal proporcionou incremento na solubilidade de 2,3 e 3,2 e 5,2 vezes em HCl 0,1 N, tampão fosfato pH 6,8 e tampão fosfato salino pH 7,4, respectivamente. No ensaio de dissolução conduzido em HCl 0,1 N e 0,1% TPGS, observou-se significativo incremento, de 41% de fármaco dissolvido após 60 minutos, quando comparado com o flubendazol micronizado. As características do estado sólido do nanocristal foram avaliadas por meio de análise térmica (calorimetria exploratória diferencial e termogravimetria) e difratometria de raios X, não sendo observadas significativas alterações da estrutura cristalina. O presente trabalho também avaliou a efetividade dos nanocristais de flubendazol em tumores de pulmão, demonstrando sua expressiva capacidade de retardar o crescimento e diminuir o tamanho desses tumores em camundongos xenotransplantados. / Nanocrystals are drug particles with an average size in the sub-micron range, generally between 200 and 500 nm, stabilized by steric or electrostatic agents adsorbed on the surface of the drug particles. The reduced size provides special properties such as mucosal adhesiveness, increase in surface area and saturation solubility, which significantly improves the bioavailability of poorly water-soluble drugs. Another emerging application of nanocrystals is in the enhancement of drug delivery and retention in tumor tissues. Studies have shown that flubendazole is a drug capable of inducing cell death in malignant tumors and decelerating their growth, by altering the structure of the microtubules and inhibiting the tubulin polymerization. Antiproliferative activity has been demonstrated in leukemia, myeloma, intestinal cancer, breast cancer and neuroblastoma lines. In addition, flubendazole is also an effective drug against helminths, demonstrating superior activity in eliminating adult worms when compared to diethylcarbamazine. Although flubendazole appears to be a promising molecule, it is an insoluble drug in water (0.005 mg / mL). To achieve the desired therapeutic effect, it is necessary the development of a formulation with better solubility and bioavailability. In this context, the present research reports the physico-chemical preparation and characterization of flubendazole nanocrystals through microfluidization. Exploratory experiments were carried out to evaluate the performance of different stabilizing agents in formulations: polysorbate 80, polaxamer 188 and D-α tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS). The determination of the particle size distribution determination was performed by laser light scattering (LLS), dynamic light scattering (DLS), nanoparticle scanning (NTA) and scanning electron microscopy (SEM). The use of TPGS favored the preparation of a nanosuspension with the lowest mean hydrodynamic size of the particles, of 253.9 ± 3 nm. In the exploratory studies, the optimum grinding parameters were also determined: 35,000 psi of microfluidizer pressure, product temperature of 30 ° C (± 5 ° C) and recirculation time of 2 hours for each 100 grams of suspension. In order to reach the lowest average hydrodynamic diameter, a statistical design was applied in which the influence of flubendazole concentration (% w / w) and TPGS (% w / w) on the formulation was evaluated. The analysis revealed a significant influence of TPGS concentration on the particle size reduction and on the physicochemical stability of the nanosuspension. Complementary solubility tests showed that the nanocrystal provided an increase in solubility of 2.3, 3.2 and 5.2-fold in 0.1 N HCl, phosphate buffer pH 6.8 and phosphate buffer saline pH 7.4, respectively. In the dissolution test performed in 0.1 N HCl with 0.1% TPGS, a 41% increase of the drug dissolved after 60 minutes was achieved, when compared to micronized flubendazole. The solid-state characteristics of the nanocrystal were accessed through thermal analysis (differential scanning calorimetry and thermogravimetry) and X-ray diffraction and the results indicated that the crystal structure was not significantly altered. This research also evaluated the action of flubendazole nanocrystals in lung tumors, demonstrating expressive ability to retard growth and decrease the size of these tumors in xenotransplanted mice.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade Gama, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-01-30T14:57:04Z No. of bitstreams: 1 2016_DouglasdeSousaEsteves.pdf: 7313428 bytes, checksum: 2dc67662e772e7a69736b3f90abf3649 (MD5) / Rejected by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br), reason: Boa tarde, A citação do item descrito não condiz com o item submetido. Atenciosamente, on 2017-02-13T18:07:10Z (GMT) / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-02-14T15:25:47Z No. of bitstreams: 1 2016_DouglasdeSousaEsteves.pdf: 7313428 bytes, checksum: 2dc67662e772e7a69736b3f90abf3649 (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2017-03-06T17:08:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DouglasdeSousaEsteves.pdf: 7313428 bytes, checksum: 2dc67662e772e7a69736b3f90abf3649 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-06T17:08:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DouglasdeSousaEsteves.pdf: 7313428 bytes, checksum: 2dc67662e772e7a69736b3f90abf3649 (MD5) / Esta pesquisa aborda a monitoração de sinais de pressão abdominal, vinculada à respiração de pacientes submetidos a tratamento de câncer de pulmão no Hospital Universitário de Brasília (HUB) durante a sessão de planejamento e as sessões iniciais do tratamento radioterápico. Neste trabalho, objetiva-se adquirir os sinais abdominais associados à respiração e implementar algoritmos que possam extrair do sinal de respiração as características de amplitude e frequência dos sinais coletados. A ideia é comparar estes parâmetros, verificando se as diferenças existentes entre planejamento e as sessões iniciais do tratamento tem alguma significância estatística que possa influenciar principalmente o tratamento de câncer de pulmão. A finalidade de extrair a frequência e a amplitude dos sinais de respiração no planejamento e nas duas sessões iniciais do tratamento é porque esses parâmetros estão correlacionados ao ciclo respiratório e podem sofrer alterações devido o estado emocional do paciente como por exemplo a ansiedade e o nervosismo que podem interferir no ciclo respiratório do paciente. Para captar os sinais foi utilizado o sensor \emph{Respiration Monitor Belt Logger sensor} (NUL-236). Para fazer o monitoramento da respiração colocou-se o aparelho na região abdominal do paciente, para uma associação do movimento do diafragma com a respiração. Como o objetivo inicial do estudo era verificar se havia diferenças entre a sessão de planejamento e as duas primeiras sessões de tratamento e avaliar se essas são estatisticamente significativas, foram feitos inicialmente testes de normalidade para verificar se cada um dos parâmetros analisados apresentavam uma distribuição normal, depois foi feito uma teste de hipótese alternativa para saber se os parâmetros relacionados aos sinais coletados durante as sessões iniciais do tratamento eram maiores que os coletados na sessão de planejamento. Foi feito também um teste com os vários parâmetros através de um teste estatístico multivariado, (PERMANOVA) com a finalidade de saber se quando todos os parâmetros fossem analisados simultâneamente continuariam a apresentar diferenças significativas entre as sessões de tratamento e a sessão de planejamento e qual desses parâmetros apresentariam maior peso nessa diferença. Ao final desse trabalho podemos concluir nem todos os parâmetros analisados apresentam uma distribuição normal, mas que existe uma diferença significativa entre os parâmetros analisados durante o planejamento e as sessões iniciais do tratamento radioterápico, de maneira que essas diferenças podem sim alterar a posição do tumor e influenciar principalmente no tratamento de câncer de pulmão que são realizados no setor de radioterapia do Hospital Universitário de Brasília (HUB), onde em um trabalho futuro e mais complexo seria viável criar um dispositivo que pudesse dar um sinal de aviso quando os parâmetros analisados durante o planejamento sofressem uma alteração durante o tratamento. / This research addresses the monitoring of abdominal pressure signals, linked to the breathing of patients undergoing lung cancer treatment at the University Hospital of Brasília (HUB) during the planning session and the initial sessions of the radiotherapy treatment. In this work, we aim at acquiring the abdominal signals associated with breathing and to implement algorithms that can extract from the breathing signals the amplitude and frequency characteristics of the collected signals. The idea is to compare these parameters, verifying if the differences between radiotherapy planning and the initial sessions of the treatment have some statistical significance that can influence mainly the treatment of lung cancer. The purpose of extracting the frequency and amplitude of the breathing signals in the planning and in the two initial sessions of the treatment is because these parameters are correlated to the respiratory cycle and may suffer changes due to the emotional state of the patient (e.g., due to anxiety). This change may interfere with the target volume, given changes in lung volume at different amplitudes as compared to those found during the treatment planning sessions. In order to acquire the signals, we used the Respiration Monitor Belt Logger sensor (NUL-236), by Neulog. We placed the device over the patient's abdominal region for an association of the movement of the diaphragm with breathing. As the initial objective of the study was to verify if there were differences between the planning session and the first two treatment sessions and to assess whether these are statistically significant, normality tests were initially performed to verify if each of the analyzed parameters had a normal distribution. We then proceeded to a hypothesis test was to determine whether the parameters related to the signals collected during the initial treatment sessions were larger than those collected in the planning session. A multivariate statistical test was also performed with the aim of knowing if, when all parameters were analyzed simultaneously, there would still be significant differences between the treatment sessions and the planning session and which of these Would present greater weight in this difference. At the end of this work we can conclude that not all the analyzed parameters present a normal distribution, but that there is a significant difference between the parameters analyzed during the planning and the initial sessions of the radiotherapy treatment, so that these differences can rather alter the position of the tumor and mainly in the treatment of lung cancer. In a future project, we intend to create a device that could give a warning signal when the parameters analyzed during the planning stage undergo a change above a pre-specified tolerance level during treatment.

Orientador: Rogério Antonio de Oliveira / Resumo: O adenocarcinoma pulmonar é um problema mundial na saúde pública e representa uma das maiores causa de morte por câncer no mundo. Os microRNAs são grandes reguladores e têm sido propostos como biomarcadores em diversos tipos de cânceres. O objetivo desta pesquisa é encontrar possíveis microRNAs para melhorar a classificação dos tecidos (normal ou tumoral) e a sobrevivência dos pacientes. Utilizou-se o banco de dados do projeto Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) para pacientes com adenocarcinoma pulmonar (LUAD). A análise estatística empregada foi baseada na construção de árvores de classificação, que encontrou o miR-21-5p, miR-133a-3p, miR-1287-3p e let-7g-3p estatisticamente significativos, e árvore de regressão para a sobrevivência dos pacientes, que encontrou o miR-887-3p, miR-1271-5p, miR-128-1-5p, miR-493-3p e miR-4999-5p estatisticamente significativos. / Abstract: Pulmonary adenocarcinoma is a worldwide public health problem and represents one of the biggest causes of cancer death in the world. MicroRNAs are strong regulators and have been proposed as biomarkers in several types of cancer. The objective of this research is to find possible microRNAs to improve the classification of tissues (normal or tumor) and patient survival. We used the database of the Atlas of Cancer Genome project (TCGA) for patients with pulmonary adenocarcinoma (LUAD). A statistical analysis employed was based on the construction of classification trees, which found miR-21-5p, miR-133a-3p, miR-1287-3p and let-7g-3p, with statistical classification, and regression tree for the situation of patients, who found miR-887-3p, miR-1271-5p, miR-128-1-5p, miR-493-3p and miR-4999-5p are statistically used. / Mestre

Os estudos epidemiológicos relativos ao denominado câncer ocupacional têm como objetivo o estudo do câncer em populações trabalhadoras e a identificação de fatores causais. O número de agentes que comprovadamente causam câncer em seres humanos é ainda pequeno, cerca de trinta. A estes fatores podem ser agregados algumas atividades ocupacionais e processos industriais onde agentes potencialmente cancerígenos existem mas não foram ainda identificados. A quase totalidade dos estudos epidemiológicos buscando relacionar ocupação e câncer foram realizados nos países desenvolvidos, com processos de industrialização mais antigos e consolidados. Nesta investigação o objetivo é estudar a relação trabalho e câncer no contexto de um país subdesenvolvido e recentemente industrializado. O estudo explora os riscos ocupacionais determinantes da neoplasia pulmonar na Região Metropolitana de São Paulo (RMSP). O trabalho está dividido em duas partes. Na primeira são discutidos aspectos relativos ao câncer com particular destaque ao carcinoma broncogênico e à aplicação da metodologia epidemiológica na área da saúde do trabalhador, em especial para o estudo do câncer relacionado à ocupação. A segunda parte contempla a descrição do estudo de caso-controle construído para atingir os objetivos definidos. Os dados do estudo foram levantados no período de 1º de julho de 1990 a 31 de janeiro de 1991 em quatorze hospitais que concentram o atendimento a pacientes com câncer de pulmão na RMSP. Um total de 316 casos e 536 controles, emparelhados com os casos por sexo e idade, foram selecionados para análise. Tabagismo, tabagismo passivo, história migratória, outros cânceres na família e estrato sócio-econômico, além de sexo e idade, foram as outras variáveis estudadas. A análise univariada permitiu identificar as variáveis que estavam interferindo na relação principal estudada. Posteriormente, utilizou-se as técnicas de análise estratificada e de regressão logística para controlar as variáveis tabagismo, referência à carcinoma de pulmão na família, sexo e idade. Os resultados revelam que os trabalhadores que estiveram ligados por tempo prolongado aos setores de produção, de ramos de atividades industriais nos quais há maior probabilidade de exposição à substâncias cancerígenas, têm cerca de duas vezes o risco de desenvolverem carcinoma broncogênico em relação aos trabalhadores com menor probabilidade de exposição a substâncias cancerígenas como os que referiram nunca terem trabalhado fora de casa. / Epidemiological studies on occupational cancer have as their objective the study of cancer in working populations and the distribution of causal factors. The number of agents proved to cause cancer in humans is still rather small, about thirty. It could be added some occupational activities and industrial processes where hazardous agents are known to exist, but have not been identified. Almost all epidemiological studies to evaluate the relationship between occupation and cancer were carried out in developed countries, where industrialization process is older and more structured. In this investigation the objective is to study the association between occupation and cancer in a developing and newly industrialized country context. In this sense, the study explores occupational risks for lung cancer in the Metropolitan Region of São Paulo (MRSP). This work is split in two parts. Firstly it was introduced a review of some aspects on cancer, particularly lung cancer, and the use of epidemiologic methodology related to worker\'s health, particularly cancer. In the second part it was described the hospital-based case-control study carried out to reach defined objectives. This research was conducted between 1st July 1990 and 31st January 1991 in fourteen hospitais which concentrate lung cancer cases in the MRSP. It has been selected a total of 316 cases and 536 controls, matched by hospital, sex and age with cases. Smoking, passive smoking, migratory history, cancer in the family and socio-economic status, besides sex and age, were other variables studied. Univariate analysis identified variables that could interfere in the main studied associatian. Through stratification and logistic regression approaches the variables gender and age, smoking and reference to lung neoplasy in family, were controlled. The results showed that workers linked to the production sectors of industries where there are higher risk of exposure to carcinogenic products have about two fold the risk of developing lung cancer rather than those workers with the lowest risk of exposure to carcinogens.

Os estudos epidemiológicos relativos ao denominado câncer ocupacional têm como objetivo o estudo do câncer em populações trabalhadoras e a identificação de fatores causais. O número de agentes que comprovadamente causam câncer em seres humanos é ainda pequeno, cerca de trinta. A estes fatores podem ser agregados algumas atividades ocupacionais e processos industriais onde agentes potencialmente cancerígenos existem mas não foram ainda identificados. A quase totalidade dos estudos epidemiológicos buscando relacionar ocupação e câncer foram realizados nos países desenvolvidos, com processos de industrialização mais antigos e consolidados. Nesta investigação o objetivo é estudar a relação trabalho e câncer no contexto de um país subdesenvolvido e recentemente industrializado. O estudo explora os riscos ocupacionais determinantes da neoplasia pulmonar na Região Metropolitana de São Paulo (RMSP). O trabalho está dividido em duas partes. Na primeira são discutidos aspectos relativos ao câncer com particular destaque ao carcinoma broncogênico e à aplicação da metodologia epidemiológica na área da saúde do trabalhador, em especial para o estudo do câncer relacionado à ocupação. A segunda parte contempla a descrição do estudo de caso-controle construído para atingir os objetivos definidos. Os dados do estudo foram levantados no período de 1º de julho de 1990 a 31 de janeiro de 1991 em quatorze hospitais que concentram o atendimento a pacientes com câncer de pulmão na RMSP. Um total de 316 casos e 536 controles, emparelhados com os casos por sexo e idade, foram selecionados para análise. Tabagismo, tabagismo passivo, história migratória, outros cânceres na família e estrato sócio-econômico, além de sexo e idade, foram as outras variáveis estudadas. A análise univariada permitiu identificar as variáveis que estavam interferindo na relação principal estudada. Posteriormente, utilizou-se as técnicas de análise estratificada e de regressão logística para controlar as variáveis tabagismo, referência à carcinoma de pulmão na família, sexo e idade. Os resultados revelam que os trabalhadores que estiveram ligados por tempo prolongado aos setores de produção, de ramos de atividades industriais nos quais há maior probabilidade de exposição à substâncias cancerígenas, têm cerca de duas vezes o risco de desenvolverem carcinoma broncogênico em relação aos trabalhadores com menor probabilidade de exposição a substâncias cancerígenas como os que referiram nunca terem trabalhado fora de casa. / Epidemiological studies on occupational cancer have as their objective the study of cancer in working populations and the distribution of causal factors. The number of agents proved to cause cancer in humans is still rather small, about thirty. It could be added some occupational activities and industrial processes where hazardous agents are known to exist, but have not been identified. Almost all epidemiological studies to evaluate the relationship between occupation and cancer were carried out in developed countries, where industrialization process is older and more structured. In this investigation the objective is to study the association between occupation and cancer in a developing and newly industrialized country context. In this sense, the study explores occupational risks for lung cancer in the Metropolitan Region of São Paulo (MRSP). This work is split in two parts. Firstly it was introduced a review of some aspects on cancer, particularly lung cancer, and the use of epidemiologic methodology related to worker\'s health, particularly cancer. In the second part it was described the hospital-based case-control study carried out to reach defined objectives. This research was conducted between 1st July 1990 and 31st January 1991 in fourteen hospitais which concentrate lung cancer cases in the MRSP. It has been selected a total of 316 cases and 536 controls, matched by hospital, sex and age with cases. Smoking, passive smoking, migratory history, cancer in the family and socio-economic status, besides sex and age, were other variables studied. Univariate analysis identified variables that could interfere in the main studied associatian. Through stratification and logistic regression approaches the variables gender and age, smoking and reference to lung neoplasy in family, were controlled. The results showed that workers linked to the production sectors of industries where there are higher risk of exposure to carcinogenic products have about two fold the risk of developing lung cancer rather than those workers with the lowest risk of exposure to carcinogens.

O câncer de pulmão é o tipo de câncer que apresenta o maior índice de mortalidade em todo o mundo. As alterações genéticas mais frequentes em câncer de pulmão são as mutações pontuais no oncogene que codifica a GTPase KRAS. Apesar destas mutações estarem diretamente ligadas à oncogênese, terapias que visam inibir diretamente a proteína Ras falharam em ensaios clínicos. Uma das propriedades mais importantes na oncogênese é a aquisição de capacidade metastática tumoral. Desta forma, o objetivo deste projeto é identificar alvos terapêuticos que inibam as metástases tumorais induzidas pelo oncogene KRAS no pulmão. Com base em relatos recentes mostrando que a forma oncogênica de KRAS promove, não só a iniciação tumoral, mas também promove a aquisição de um fenótipo metastático, a hipótese deste projeto é que (1) a capacidade mestastática tumoral induzida por KRAS no pulmão é potencializada pela quinase IKKβ; e (2) que a inibição desta quinase reduzirá a capacidade invasiva celular e metastática tumoral. Esta hipótese foi formulada com base em estudos anteriores, os quais demonstraram que o principal substrato da IKKβ, o fator de transcrição NF-κB, é ativado por KRAS em tumores pulmonares in situ de forma dependente da IKKβ, que o NF-κB é capaz de promover metástase em diferentes modelos tumorais, e que a inibição da atividade da IKKβ com um inibidor farmacológico em um modelo animal de câncer de pulmão induzido por KRAS, diminui o crescimento tumoral e a progressão tumoral para graus histológicos mais avançados. Nosso objetivo era avaliar se a inibição de IKKβ é capaz de afetar a migração e invasão de células portadoras de mutação em KRAS in vitro e se a inibição de IKKβ é capaz de afetar a capacidade metatática dessas células in vivo. Primeiramente, avaliamos a expressão de enzimas relacionadas ao fenótipo metastático, as metaloproteinases de matriz 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) e, também uma molécula intimamente relacionada ao processo de adesão mediado por integrinas, FAK (quinase de adesão focal), frente a inibição de IKKβ através de um inibidor farmacológico altamente especifico (Composto A) e frente a inibição genética de IKKβ por interferência de RNA (siRNA) em células A549 e H358. Avaliamos também a atividade das MMPs frente inibição genética de KRAS (siKRAS) e IKKβ (siIKKβ) e vimos que IKKβ parece modular a expressão ou atividade de MMP-9 e reduz a expressão de FAK. Já a expressão de MMP-2 não apresentou alteração. Posteriormente avaliamos migração na célula A549 e invasão nas células A549 e H358 com inibição de IKKβ, por ensaios Transwell, e observamos uma redução da migração e invasão celular in vitro. Em seguida, fomos gerar linhagens celulares paraa expressar luciferase, as linhagens A549 pLUC e H358 pLUC. Os clones A549 pLUC B4 e H358 pLUC F1 com inibição de KRAS e IKKβ por interferência de RNA, foram injetados pela veia da cauda nesses camundongos e as metástases foram monitoradas por imageamento in vivo. Houve metástases em 20% dos animais com siIKKβ na região anatômica da boca. Os animais que receberam siControle e siKRAS não apresentaram nenhuma metástase visível no equipamento, mas foi observado micrometástases nas análises histológicas dos pulmões. O resultado do experimento de metástase in vivo é inesperado, não só pelo fato de ocorrer no grupo experimental siIKKβ, mas também pelo local anatômico do tumor, sendo necessária uma maior investigação do papel de IKKβ nesse processo, podendo ser um resultado aleatório. Quando avaliamos em conjunto, nossos resultados sugerem que a quinase IKKβ desempenha um papel importante no fenótipo migratório e invasivo de células pulmonares portadoras de KRAS oncogênica, contribuindo para a capacidade metastática. / Lung cancer is the leading cause of cancer deaths worldwide. The most frequent genetic changes found in lung cancer are driver mutations in the KRAS proto-oncogene. Even though KRAS mutations have been causally linked to the oncogenic process, therapies targeted to oncogenic RAS have failed in clinical trials. One of the main characteristics in oncogenesis is the ability of tumors to acquire metastatic capability. The objective of this project is to identify therapeutic targets that reduce KRASinduced lung cancer metastasis. Based on previous reports that oncogenic KRAS, drives not only tumor initiation, but also promotes a metastatic phenotype, the hypothesis of this project is that (1) the acquisition of metastatic ability induced by KRAS in the lung is potentiated by the IKK kinase; and (2) that IKKβ inhibition will reduce KRAS-induced cell invasive properties and KRAS-induced tumor metastasis. This hypothesis has been formulated on the basis of previous studies showing that the main IKKβ substrate, the transcription factor NF-κB, is activated by KRAS in lung tumors in situ in an IKKβ-dependent manner, that NF-κB is known to promote metastasis in different tumor models, and that pharmacological IKKβ inhibition in a KRAS-induced lung cancer mouse model reduces tumor growth and progression to higher histological tumor grades. Our goal was evaluate how inhibition of IKKβ affects migration and invasion of KRAS-positive lung cells in vitro and whether inhibition of IKKβ is capable of affecting the metatactic capacity of these cells in vivo. First, we evaluated the expression of enzymes involved in the metastatic phenotype, matrix metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) and also a molecule involved in the integrinmediated adhesion, FAK (focal adhesion kinase), we targeted IKKβ by a highly specific IKK inhibitor (Compound A) or with RNA interference in A549 and H358 cells. We also used colorimetric Matrix Biotrak Activity Assay System to measure the activity of MMPs with RNA interference for KRAS (siKRAS) and IKKβ (IKKβ) and we have seen that IKKβ appears to modulate the expression or activity of MMP-9 and decreases the expression of FAK. The expression of MMP-2 did not change. Then we evaluated migration in A549 cell and invasion in A549 and H358 cells with inhibition of IKK by RNA interference or with Compound A treatment in Transwell assays, and observed a significantly reduced cell migration and invasion in vitro. We then generated cell lines to express luciferase, the A549 pLUC and H358 pLUC lines. A549 pLUC B4 and H358 pLUC F1 cells with RNA interference for KRAS and IKKβ were injected in the tail vein in nude (balb/c) mice and metastases were monitored by in vivo imaging. There were metastases in 20% of IKKβ animals in the anatomical region of the mouth. Animals that received siControl and siKRAS had no visible metastasis in the live imaging, but micrometastases were observed in the histological analyzes of the lungs. The result of this experiment is unexpected, not only due to the fact that it occurs in the IKKβ experimental group, but also due to the anatomical site of the tumor, and a further investigation of the role of IKKβ in this process, can be a random result. When evaluated together, our results suggest that the IKKβ kinase plays an important role in the migratory and invasive phenotype of in KRAS positive lung cancer cells, contributing to metastatic capacity.

O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo. Mutações em KRAS são altamente prevalentes no câncer e têm sido diretamente associadas ao processo tumorigênico. Apesar disso, até hoje todas as terapias visando inibir KRAS diretamente falharam e a caracterização de alvos indiretos, importantes para a oncogênese mediada por KRAS, é fundamental para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer de pulmão. Nós mostramos previamente que as quinases Aurora A (AURKA) e B (AURKB) são alvos a jusante de KRAS, importantes para o crescimento, viabilidade e oncogenicidade de linhagens celulares derivadas de tumores pulmonares mediados por KRAS. Aqui, nós aprofundamos os nossos estudos para melhor caracterizar AURKA e AURKB como potenciais alvos terapêuticos no câncer de pulmão. Os objetivos deste trabalho foram (1) investigar o mecanismo de perda de viabilidade induzido pela inibição de AURKA e/ou AURKB; (2) avaliar como a inibição de AURKA e/ou AURKB afeta propriedades oncogênicas relacionadas à agressividade tumoral; e (3) como a inibição destas quinases afeta o crescimento tumoral in vivo. Para tanto, nós utilizamos dois modelos celulares: (1) células A549 e H358, que apresentam mutações em KRAS, geneticamente modificadas para a expressão estável e induzível de shRNAs contra AURKA ou AURKB, e (2) células tumorais H1703, que não apresentam mutações em KRAS, geneticamente modificadas para a expressão induzível de KRASG12V, tratadas ou não com inibidores farmacológicos das quinases Aurora. A inibição farmacológica ou por interferência de RNA de AURKA e/ou AURKB em células H358 e A549 reduziu a proliferação celular, sendo esta inibição acompanhada de anomalias mitóticas, além de aneuploidia e poliploidia. A inibição destas quinases também induziu morte celular in vitro, tanto em mitose, quanto em interfase. Mais interessantemente, a inibição farmacológica dual de AURKA e AURKB induziu morte celular in vitro em células H1703, somente na presença de KRASG12V, indicando que a inibição das quinases Aurora afeta preferencialmente células portadoras de mutações em KRAS. Além disso, a inibição de AURKA e/ou AURKB reduziu propriedades malignas celulares relacionadas à agressividade tumoral, como migração, invasão e adesão. Finalmente, a inibição de AURKA por RNA de interferência em células A549 também reduziu a formação de tumores in vivo. Entretanto, como a inibição destas quinases levou a anomalias mitóticas e à instabilidade genética, nós resolvemos investigar se a inibição de TPX2, um substrato e ativador de AURKA, poderia ser uma abordagem alternativa para inibir esta via em câncer de pulmão induzido por KRAS. Primeiramente, nós observamos nos nossos modelos celulares que KRAS regula positivamente a expressão de TPX2. Além disso, a inibição de TPX2 em células pulmonares portadoras de KRAS oncogênica reduziu a viabilidade e proliferação celulares e induziu morte celular. Mais interessantemente, esses efeitos ocorreram preferencialmente em células que expressam KRAS oncogênica. Em conclusão, nossos resultados apoiam a hipótese de que a ativação de AURKA/TPX2 e AURKB por KRAS são eventos importantes no câncer de pulmão e sugerem a inibição destas vias, possivelmente em combinação com outras terapias citotóxicas, como uma nova abordagem terapêutica para o câncer de pulmão induzido por KRAS. / Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. KRAS mutations are widespread in lung cancer and have been causally linked to tumorigenesis. Nonetheless, therapies targeting KRAS directly have so far failed and characterization of indirect KRAS targets, which play important roles in KRAS-mediated oncogenesis, is crucial for the development of new therapies for lung cancer. We have previously shown that mitotic kinases Aurora A (AURKA) and B (AURKB) are downstream targets of oncogenic KRAS, important for the growth, viability, and oncogenicity of KRAS-transformed lung cancer cell lines. Here, we studied these kinases more in depth in order to better characterize them as potential therapeutical targets for KRAS-induced lung cancer. The aims of this study were (1) to investigate the mechanism leading to loss of viability upon AURKA and/or AURKB targeting; (2) to evaluate how AURKA and/or AURKB inhibition affects malignant properties associated with tumor aggressiveness; and (3) to determine whether AURKA and/or AURKB inhibition reduces KRAS-induced tumor growth in vivo. For that purpose, we used two cell-based models: (1) KRAS mutant A549 and H358 cells with stable and inducible shRNA-mediated knockdown of AURKA or AURKB, and (2) KRAS wildtype H1703 tumor cell lines, genetically engineered to inducibly express oncogenic KRASG12V treated or not with Aurora kinase pharmacological inhibitors. Targeting AURKA and/or AURKB pharmacologically or by RNA interference in H358 and A549 cells led to decreased cell proliferation, which was accompanied by mitotic abnormalities, leading to aneuploidy and hyperploidy. Aurora kinase targeting also induced cell death in vitro, both during mitosis and interphase. More importantly, AURKA and AURKB inhibition with a dual pharmacological inhibitor in H1703 cells induced cell death in vitro, but only in the presence of KRASG12V, indicating that Aurora kinase targeting affects preferentially lung cells harboring oncogenic KRAS. Furthermore, AURKA and/or AURKB targeting reduced malignant properties associated with tumor aggressiveness, such as cell migration, invasion and adhesion. Finally, AURKA targeting by RNA interference in A549 cells also reduced growth of xenograft tumors in vivo. Nonetheless, since Aurora targeting was associated with mitotic abnormalities and genetic instability, we decided to investigate if targeting TPX2, a substrate and an activator of AURKA, could constitute an alternative approach to targeting this pathway in KRAS-induced lung cancer. First, using our cell-based models, we determined that KRAS positively regulates TPX2 expression. In addition, TPX2 inhibition by RNA interference in KRAS-positive lung cells reduced cell viability and proliferation and induced cell death. Finally, these effects occurred preferentially in cells harboring oncogenic KRAS. In conclusion, our results support the hypothesis that activation of AURKA/TPX2 and AURKB by KRAS are important events in lung cancer and suggest inhibition of these pathways, possibly in combination with other cytotoxic therapies, as a new approach for KRAS-induced lung cancer therapy.

O câncer de pulmão está entre os tipos de câncer com maiores índices de mortalidade no mundo. Na década de 90, houve a descoberta de populações de células tumorais com características de células-tronco e implicou na hipótese das células-tronco cancerosas (CTCs). Se a hipótese das CTCs for correta, a recorrência/recidiva dos cânceres é gerada por uma porcentagem de células (CTCs) que prolifera pouco e é resistente a quimioterapia convencional. Desta forma, a busca por novos alvos terapêuticos que tenham como alvo estas CTCs tem enorme implicação no desenvolvimento de novos fármacos ou modalidades terapêuticas contra o câncer. O guaraná (Paullinia cupana Mart var. sorbilis) tem demonstrado efeitos promissores sobre o câncer, em especial efeitos quimiopreventivos e antineoplásicos. Portanto, objetivando-se neste projeto avaliar a presença de CTCs a partir de células tumorais de pulmão de camundongo, onde se possa conseguir rapidamente uma alta porcentagem deste tipo celular para posteriores estudos, além de avaliar os efeitos do extrato etanólico do guaraná e de suas frações butanólica e aquosa, sobre as células tumorais e em especial verificar os efeitos sobre a população rica em CTCs, onde foi possível observar a presença de possíveis CTCs, a partir de cultivo de células tumorais de pulmão de camundongo, como também que o guaraná apresentou um efeito sobre estas possíveis CTCs devido a diminuição da expressão dos genes ABCG2 e ALDH1a1. / Lung cancer is among the cancers with the highest mortality rates in the world. In the 90\'s, there was the discovery of tumor cell populations with stem cell characteristics implied in the case of cancer stem cells (CSCs). If the hypothesis is correct CSCs of the recurrence / relapse of cancers is generated by a percentage of cells (CSCs) that growth low and are more resistant to conventional chemotherapy. Thus, the search for new therapeutic targets that target these CSCs has huge implications in developing new drugs or therapeutic approaches against cancer. Guarana (Paullinia cupana Mart var. Sorbilis) has shown promising effects on cancer, especially chemopreventive and anticancer effects. Therefore, the objective in this project is to evaluate the presence of CSCs from tumor cells of mouse lung, where it can quickly get a high percentage of this cell type for further studies and to evaluate the effects of ethanol extract of guarana and its butanol and aqueous fractions on tumor cells and in particular to verify the effect on the population rich in CSCs, where it was possible to observe the possible presence of CSCs from cultivation of tumor cells from mouse lung, as well as guarana presented an effect on these CSCs possible to decreased expression of ABCG2 and ALDH1a1 genes.

As alterações genéticas mais frequentes em câncer de pulmão são mutações pontuais que ativam o oncogene KRAS. Embora estas mutações estejam causalmente relacionadas à oncogênese, até hoje diferentes abordagens para inibir as proteínas RAS diretamente não obtiveram sucesso. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis é necessário identificar os mecanismos moleculares ativados por KRAS que estão diretamente envolvidos com a aquisição de propriedades malignas importantes, como o desenvolvimento e a manutenção de um fenótipo tronco-tumoral pelas células iniciadoras de tumor (CITs). CITs, também conhecidas como células tronco-tumorais, são definidas como uma subpopulação de células tumorais capazes de se autorrenovar, iniciar a formação de tumores e sustentar o crescimento tumoral. O desenvolvimento de estratégias terapêuticas dirigidas a estas células é imprescindível para melhorar a eficácia da terapia antitumoral. Uma vez que KRAS está associada a manutenção de um fenótipo tronco-tumoral e ativa o fator de transcrição NF-kB através da quinase IKKβ para promover a tumorigênese pulmonar, nós hipotetizamos que a quinase IKKβ contribui para o fenótipo tronco-tumoral induzido por KRAS em câncer de pulmão. Nós utilizamos ensaios de formação de tumoresferas para enriquecer e avaliar a função de CITs das linhagens pulmonares positivas para KRAS A549 e H358. As células A549 e H358 formaram tumoresferas em cultura de baixa aderência e, quando comparadas às células derivadas da cultura aderente, as células oriundas da cultura de tumoresferas apresentaram maior crescimento clonogênico, maior expressão de genes associados ao fenótipo tronco por qPCR e maior atividade da quinase IKKβ. A inibição da atividade de IKKβ através de um inibidor farmacológico altamente específico (Composto A) diminuiu levemente a proliferação de células A549 e H358, sem resultar em morte celular significativa. Entretanto, a inibição da atividade ou da expressão de IKKβ por interferência de RNA reduziu a expressão de genes associados ao fenótipo tronco e diminuiu a formação de tumoresferas. A inibição da expressão de IKKβ em células A549 reduziu também a capacidade de autorrenovação de CITs. Estes resultados sugerem que IKKβ desempenha um papel importante na manutenção do fenótipo tronco-tumoral de CITs pulmonares induzidas por KRAS. Em seguida, nós demonstramos que a inibição da atividade de IKKβ afetou preferencialmente a proliferação celular e o crescimento clonogênico de células oriundas da cultura de tumoresfera, sugerindo que IKKβ desempenha um papel mais importante em CITs do que em células derivadas da cultura aderente. A análise por citometria de fluxo identificou que células derivadas da cultura de tumoresfera apresentam um enriquecimento para células CD24+ na linhagem A549 e células CD44+ na linhagem H358, sugerindo que estes possam ser marcadores promissores para purificação de CITs nestas linhagens. Adicionalmente, demonstramos, por ensaios de wound-healing de células A549 e H358, que a inibição da atividade de IKKβ reduziu a migração celular, uma outra uma propriedade aumentada em CITs. Além disso, mostramos que a atividade da quinase IKKβ em células A549 e H358 não depende das vias da MAPK ou PI3K/Akt. Interessantemente, a inibição combinada de IKK (um efetor downstream de KRAS) e de EGFR/ERRB2 (reguladores upstream de KRAS que ativam as vias MAPK e PI3K/Akt) reduziu de forma aditiva a formação de tumoresferas, proliferação e migração celular. Quando avaliados em conjunto, nossos resultados sugerem que a quinase IKKβ desempenha um papel importante na biologia de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica e que a inibição desta quinase sozinha ou em combinação com a inibição de outras vias pode representar uma estratégia terapêutica promissora a ser explorada para reduzir a recidiva e metástase no câncer de pulmão induzido por KRAS. / The most frequent genetic alterations in lung cancer are point mutations that activate the KRAS oncogene. Although these mutations are causally related to oncogenesis, different approaches to inhibit RAS proteins directly have not been successful to date. Therefore, for better therapeutic targets for lung cancer to become available, it is necessary to identify the molecular mechanisms activated by KRAS that are directly involved with important malignant features, such as the development and maintenance of a cancer stem-like phenotype by the tumour-initiating cells (TICs). TICs, also known as cancer stem cells, are defined as a subpopulation of tumour cells able to self-renew, promote tumour initiation, and sustain tumour growth. The development of therapeutic strategies to target these cells is imperative to improve the efficacy of antitumor therapy. Since KRAS is associated with the maintenance of a cancer stem-like phenotype and activates the transcription factor NF-kB through the IKKβ kinase to promote lung tumourigenesis, we hypothesised that IKKβ kinase contributes to the cancer stem-like phenotype induced by KRAS in lung cancer. We used tumoursphere formation assays to enrich and evaluate the function of TICs of KRAS-mutant cell lines A549 and H358. A549 and H358 cells formed tumourspheres in low adhesion culture and, when compared to cells grown in adherent culture, sphere-derived cells displayed increased clonogenic growth, higher expression of stemness genes by qPCR, and increased IKKβ kinase activity . Inhibition of IKKβ activity through a highly specific pharmacological inhibitor (Compound A) slightly decreased proliferation of A549 and H358 cells without inducing significant cell death. On the other hand, inhibition of IKKβ activity or expression by RNA interference reduced the expression of stemness genes and decreased tumoursphere formation. Inhibition of IKKβ expression in A549 cells also reduced TICs self-renewal . These results suggest that IKKβ plays an important role in maintaining the cancer stem-like phenotype of KRAS-driven lung TICs. Next, we demonstrated that IKKβ inhibition preferentially reduced cell proliferation and clonogenic growth of sphere-derived cells, suggesting that IKKβ plays a more important role in TICs than in adherent culture-derived cells. Flow cytometry analysis identified that sphere-derived cells display an enrichment for the surface marker CD24 in A549 cells and CD44 in H358 cells, indicating that these could be promising markers for the purification of TICs in these cell lines. Furthermore, we have shown by wound-healing assays of A549 and H358 cells that IKKβ inhibition reduced cell migration , another feature increased in TICs. In addition, we have shown that IKKβ activity in A549 and H358 cells does not depend on the MAPK or PI3K/Akt pathways. Interestingly, combined inhibition of IKKβ (a downstream effector of KRAS) and EGFR/ERBB2 (upstream regulators of KRAS that activate the MAPK and PI3K/Akt pathways) additively reduced tumoursphere formation, cell proliferation and migration. Taken together, our results suggest that IKKβ kinase plays an important role in the biology of KRAS-driven lung TICs, and that inhibition of this kinase alone or in combination with inhibition of other signalling pathways may represent a promising therapeutic strategy to be explored in order to reduce tumour recurrence and metastasis in KRAS-driven lung cancer.