Doctora en Bioquímica / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo hasta diciembre de 2015, en el Portal de Tesis Electrónicas / El catabolismo de proteínas es un proceso celular fundamental que ha captado la atención de distintos investigadores en los últimos años. Existen dos mecanismos por los cuales la célula degrada proteínas defectuosas: uno extralisosomal, mediado esencialmente por el proteosoma, y otro denominado lisosomal, en el cual este organelo tiene un papel protagónico en la degradación de proteínas, especialmente en las de vida media prolongada. La célula utiliza tres vías para degradar las proteínas a través del lisosoma: macroautofagia, microautofagia y autofagia mediada por chaperonas (AMC). Esta última se activa bajo condiciones de estrés fisiológico tales como la privación de nutrientes. Proteínas citosólicas con una secuencia aminoacídica particular son reconocidas por un complejo de proteínas chaperonas y destinadas al lisosoma para ser degradadas vía AMC, esta última se distingue de la macroautofagia principalmente en que no requiere tráfico vesicular. Las proteínas sustrato a ser degradadas se unen a la proteína receptora LAMP-2A, presente en la membrana lisosomal por lo que tanto sus niveles como los de Hsc70 (chaperona requerida para este proceso proteolítico) en el lisosoma se relacionan directamente con la velocidad de degradación de AMC. El recambio de proteínas intracelulares es de particular importancia en células terminalmente diferenciadas como son los cardiomiocitos y las neuronas, pues cualquier desequilibrio induce la acumulación de proteínas anormales. Diferente es lo que ocurre en células con alta capacidad proliferativa, en las cuales este efecto se mitiga por dilución a través de múltiples divisiones celulares. La oxidación de proteínas es una consecuencia del metabolismo aeróbico, así como la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs). Paralelamente, también se ha observado aumento de EROs en estados de estrés fisiológico, modificando las proteínas y favoreciendo su agregación al interior de la célula. Finalmente, este último proceso se asocia a diferentes estados patológicos por lo cual su remoción o la prevención de su formación son fundamentales para la sobrevida celular. Siendo la AMC un mecanismo involucrado en la degradación de proteínas especialmente bajo condiciones de estrés, se requiere establecer si ella se activa en cardiomiocitos privados de nutrientes, conocer cómo se regula y cuál es su interdependencia con la formación de EROs. Con esta finalidad, esta tesis tiene como hipótesis: “La privación de nutrientes estimula la autofagia mediada por chaperonas en el cardiomiocito como un mecanismo protector frente a daño oxidativo”. / The catabolism of proteins is a fundamental cellular process that has captured the attention of several researchers in the recent years. There are two mechanisms by which the cell degrades defective proteins: one extralysosomal, mediated primarily by the proteasome, and another called lysosomal, in which this organelle has a key role in protein degradation, especially in the long half-life proteins. In the last case, the cell may use three mechanisms to degrade proteins: macroautophagy, microautophagy and chaperone-mediated autophagy (CMA). The latter is activated under physiological stress conditions such as nutrient deprivation. Cytosolic proteins with a specific amino acid sequence are recognized by a chaperone protein complex and destined into the lysosome for degradation via CMA, the latter is distinguished mainly from macroautophagy by requiring no vesicular traffic. The substrate protein to be degraded bind to the receptor protein LAMP-2A present in the lysosomal membrane, therefore substrate protein and Hsc70 levels (chaperone required for this proteolytic process) in the lysosome are directly related to the rate of degradation AMC. The turnover of intracellular proteins is of particular importance in terminally differentiated cells such as cardiomyocytes and neurons, since any imbalance induces the accumulation of abnormal proteins. In those cells with high proliferative capacity, this effect is mitigated by dilution through multiple cell divisions. The protein oxidation is a consequence of aerobic metabolism and the production of reactive oxygen species (ROS). In parallel, it has been shown that the increase in ROS during physiological stress, modifying proteins and promoting their aggregation into the cells. Finally, this latter process is associated with various disease states for which removal or prevention of their formation are essential for cell survival. Being the AMC a mechanism involved in protein degradation, especially under stress, it is important to establish whether AMC is activated in nutrient-deprived cardiomyocytes, how is regulated and its interdependence with ROS generation. To this end, we propose the following hypothesis: "The deprivation of nutrients stimulates chaperone-mediated autophagy in cardiomyocytes as a protective mechanism against oxidative damage." / CONICYT FONDAP Anillo ACT 1111

Doctor en Bioquímica / En las tres regiones más australes de Chile, existen especies endémicas de microalgas productoras de toxinas del veneno diarreico de mariscos (DSP). El florecimiento de estas microalgas afecta severamente a la acuicultura, una de las principales actividades comerciales de esta zona, pues los mariscos contaminados, al ser consumidos, producen una intoxicación severa que incluye diarrea, vómitos y náuseas, y actualmente está en discusión si es que las toxinas del DSP pueden incrementar el riesgo de contraer cáncer gastrointestinal ya que actúan como promotores tumorales. Es por ello que la legislación internacional ha fijado un límite máximo de 160 g de toxinas del DSP totales/kg de carne de mariscos. Se consideran toxinas del DSP el ácido okadaico (OA) y sus derivados, las dinophysistoxinas (DTXs) 1, 2 y 3. Desde el punto de vista químico, estas toxinas son largas cadenas de poliéteres cíclicos de 38 carbonos como estructura base, con carácter lipofílico y termoestables. En Chile, las principales toxinas detectadas en los moluscos son DTX-1 y DTX-3, a diferencia de los países europeos donde las toxinas predominantes son OA y DTX-2. El blanco molecular de las toxinas del DSP son las proteínas fosfatasas, principalmente la PP2A, la cual participa en múltiples vías de señalización. A través de su inhibición, generan desregulación celular por hiperfosforilación, que puede llevar a la célula a apoptosis, así como también puede generar proliferación. Nosotros planteamos que, a dosis sub-letales, las toxinas del DSP pueden activar vías de transducción de proliferación, sobre vida e inflamación, en epitelios gástricos y de colon, lo que generaría en exposiciones crónicas, un ambiente tumorigenico, ya que estas toxinas tendrían un efecto acumulativo. Confirmamos nuestra hipótesis al demostrar un efecto positivo de OA y DTX-1 sobre la proliferación en dos modelos de epitelio gástrico (AGS y MKN-45) y de colon (Caco 2), a dosis sub letales, activándose el ciclo celular y dos vías canónicas de proliferación, diferenciación y sobrevida, como AKT y ERK; siendo las células Caco 2 más resistentes al efecto de estas toxinas. Además, demostramos que ambas toxinas gatillan la secreción de señales pro-inflamatorias en macrófagos y células dendríticas, a dosis subletales. La concentración en la cual generan un efecto proliferante y de secreción de factores pro-inflamatorios no es igual en ambas toxinas: DTX-1 es un orden de magnitud más potente que OA, lo cual comprueba que no son equivalentes como lo establece la legislación. Nuestro trabajo aporta antecedentes para que nuestra legislación establezca la no presencia de toxinas del DSP en los alimentos; dado el riesgo de sus efectos crónicos / In the three southern regions of Chile, there are endemic species of toxin-producing microalgae of diarrhetic shellfish poison (DSP). The algae blooms affect severely the aquaculture, a major commercial activities in this area, because the seafood contaminated, when it is consumed, can produce a intoxication that includes diarrhea, vomiting and nausea. It is currently in discussion if the DSP toxins may increase the risk of colon and gastric cancer as they act as tumor promoters. That is why international law has set a maximum limit of 160 g of total toxin / kg shellfish meat DSP. Okadaic acid (OA) and its derivatives, the dinophysistoxinas (DTXs) 1, 2 and 3 are considered DSP toxins. From a chemical viewpoint, these toxins are long chain of cyclic polyethers with a base structure of 38 carbons and are lipopylic and thermosets molecules. In Chile, the major toxins detected in shellfish are DTX-1 and DTX-3, unlike European countries where the predominant toxins are OA and DTX-2. The molecular target of DSP toxins are the protein phosphatases, PP2A majorly, which is involved in multiple signaling pathways. Through its inhibition, cell deregulation generated by hyperphosphorylation can lead to cell apoptosis and also proliferation. We believe that DSP toxins at sub-lethal doses, can activate transduction pathways of proliferation, survival and inflammation in gastric and colon epithelia, at chronic exposures, generate a tumorigenic environment, as these toxins could have a cumulative effect. For demonstrating our hypothesis, we analyzed the effect of OA and DTX-1 on the viability of two models of gastric epithelial (AGS and MKN-45) and colon epithelium (Caco 2), since both epithelia are physiological targets of these toxins. We studied the cell cycle and activation of canonical pathway of proliferation, differentiation and survival as AKT and ERK; and the effect on cells secreting pro-inflammatory signals, comparing both toxins, in order to prove that they are not equivalent as indicated by the legislation. Our work provides background for our legislation to set the absence of DSP toxins in food; given the risks of their chronic effects / FONDECYT

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Mediante la tecnología del DNA recombinante, en esta memoria se pretendió aportar nuevos antecedentes en relación con la interacción hospedero-parásito, fundamentalmente acerca de los mecanismos moleculares que utilizan las larvas infectantes de Toxocara canis para evadir la respuesta inmune. Con dicho objetivo se procedió al clonamiento, secuenciación y análisis computacional de cDNAs expresados por estas larvas infectantes. Para ello se rastreó una genoteca lamda - ZAP de cDNA de T. canis, de la cual se aislaron y purificaron 72 clones. En base a estudios de PCR se seleccionaron 12 clones que posteriormente fueron secuenciados desde su extremo 5’, y analizados usando bancos de datos y programas de computación. Finalmente, con el objetivo de obtener más antecedentes sobre la función de las proteínas codificadas por estos clones, se intentó la expresión de algunos de ellos mediante vectores de alta expresión. De los 12 clones analizados, sólo uno de ellos no pudo ser estudiado debido a que poseía un inserto demasiado pequeño. Los clones B-3 y E-7, no presentaron ninguna similitud significativa con secuencias de los bancos de datos. Esto sugiere fuertemente que ambos clones codifican para moléculas aún no descritas de T. canis. Otros dos clones, A-3 y A-6, presentaron similitud con genes que codifican para una proteína ribosomal y otra de "shock térmico de Drosophila sp. Los clones B-7 y B-13 presentaron un alto grado de similitud con transcritos de T. canis abundantemente expresados denominados Tc-ant-095 y Tc-ant-30. El clon D-10, presentó similitud con una secuencia denominada K023h06.yl de T. canis, la cual es un transcrito expresado en estadios adultos del parásito. Los clones 01 y 02, presentaron similitud con secuencias llamadas lectinas tipo - C de T. canis. A su vez los clones D-13 y A14, mostraron gran similitud con mucinas de T. canis, previamente descritas por otros autores. En base diversos antecedentes experimentales, se ha sugerido que tanto las lectinas tipo - C como las mucinas, podrían estar involucradas en estrategias de evasión de la respuesta inmune en estos parásitos. Finalmente, todos los intentos de expresar proteínas recombinantes codificados por nuestros clones fueron infructuosos, futuros trabajos serán necesarios para lograr estos objetivos. / PROYECTO DID TNAC 24-02/01.

Memoria (licenciado en ciencias jurídicas y sociales) / No autorizada por los autores para ser publicada a texto completo / Esta memoria pretende desentrañar misteriosos caminos para quienes optamos por la vía del Derecho, no sólo en el área de la ciencia médica, sino también incorporarlos al ámbito de la llamada Bio-jurídica. A la luz de la importancia que tendrá este tema en el futuro, exponemos, cómo podríamos llegar a disponer de nuestra carga genética y de nuestras células sexuales reproductoras, óvulo y espermio, llamadas genéricamente gametos humanos. Para ello proponemos en una primera parte, cómo ellos, que pertenecen o emanan del cuerpo humano, pueden desligarse y pasar pertenecer a otra persona; como los podemos defender en el ámbito constitucional, civil, penal e internacional; que naturaleza jurídica tienen, si pueden o no ser considerados bienes. Luego pedimos ayuda a la ciencia para que nos informe cómo se forman y los usos que se les puede dar de acuerdo al estado actual de la misma y que, hoy por hoy, tiene al mundo sumido en un total asombro y temor a lo desconocido. Todo esto con apoyo de la ética.

Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Magíster en Ciencias Biológicas. / Se ha demostrado que la terapia con oxigeno hiperbárico (HBOT) promueve la proliferación de células troncales somáticas in vivo en diversos modelos animales. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen este efecto no han sido estudiados en profundidad. El intestino de mamíferos tiene un alto índice de recambio celular debido al desgaste que sufre en el ejercicio de las funciones de degradación, absorción de nutrientes y evacuación de los restos innecesarios. Es por ello que en este órgano hay un gran volumen de células troncales en constante división y diferenciación, convirtiendo al intestino en un modelo atractivo para evaluar el impacto de HBOT. Mediante el uso de HBOT en esta tesis se logró modular gradualmente en el tiempo la proliferación y migración de las células troncales intestinales (CTI) murinas. La exposición a HBOT por veinte días promueve un aumento sincronizado de la proliferación de las CTI por cripta. Dado que la enzima metabólica mTORc1 modifica su actividad dependiendo de los niveles de oxígeno, en respuesta a factores intermediarios tales como HIF-1α o REDD1, se ensayó a continuación si la vía mTORc1 está mediando los efectos de HBOT. Ratones inyectados con Rapamicina (inhibidor alostérico de mTORc1) aumentan la proliferación de las CTI, a similares niveles observados en animales sometidos a HBOT por 20 días. Rapamicina, en nuestro modelo, estaría provocando una respuesta similar a lo que se ha descrito previamente ante una restricción calórica (RC). Sin embargo, llama la atención que el uso combinado de HBOT con Rapamicina no genera dicho aumento en la proliferación de 2 las CTI. Se ha planteado que la RC pudo ser simulada por la administración de Rapamicina, esto último evaluado mediante la disminución en los niveles de fosforilación de una de las proteínas efectoras de la vía mTORc1, S6K1. No obstante, tratamientos de 20 días con uso combinado de HBOT y Rapamicina logran recuperar la fosforilación sobre de S6K1 a niveles controles. Se propone por tanto que el aparente efecto antagónico entre la inhibición por Rapamicina y una posible estabilización del complejo mTORc1 por parte de HBOT se traduciría en la anulación del aumento de la proliferación de las CTI, esto último sería por un mecanismo que aún se desconoce y que debería ser abordado en futuros estudios. Se concluye que HBOT promueve la proliferación de las CTI y por tanto el funcionamiento del intestino. Extrapolando nuestros resultados, HBOT se podría utilizar como parte de un plan de tratamiento integral para tratar eficazmente afecciones intestinales, al ser administrado en conjunto con otras terapias y medicamentos que se adapten a las necesidades individuales del paciente. / It has been described that hyperbaric oxygen therapy (HBOT) promotes somatic stem cell proliferation in vivo in several animal models. However, the molecular mechanisms underlying this effect have not been studied in depth. The mammalian intestinal epithelium has one of the highest cells turn-over rates due the constant attrition suffered due to its functions of degradation, absorption of nutrients and evacuation of unnecessary remains. As such, in this organ there is a large volume of stem cells in constant division and differentiation, making the intestine an attractive model to evaluate the impact of HBOT. In this thesis we were able to modulate gradually murine intestinal stem cell (ISC) proliferation and migration using HBOT. Exposure to HBOT for twenty days in an experimental hyperbaric chamber promotes a synchronized increase in the proliferation of CTIs per crypt. Since the metabolic enzyme mTORc1 modifies its activity depending on oxygen levels, in response to intermediary factors such as HIF-1α or REDD1, it was tested whether the mTORc1 pathway is mediating the effects of HBOT. Interestingly, mice injected with Rapamycin (an allosteric inhibitor of mTORc1) increased the proliferation of ISCs, at similar levels observed in animals submitted to HBOT for 20 days. However, it is striking that the combined use of HBOT with Rapamycin does not generate such an increase in the proliferation of ISC. Rapamycin effects can be explained due its ability to mimic a caloric restriction (CR). It has been suggested that CR could be simulated by the administration of Rapamycin, the latter evaluated by the decrease in phosphorylation levels of one of the

Orientador: Hebe de las Mercedes Villullas / Banca: Antonio Carlos Dias Angelo / Banca: Elisabete Inacio Santiago / Resumo: Este trabalho visou contribuir ao desenvolvimento de materiais com bom desempenho para a catálise da reação de redução de oxigênio, que ocorre nos cátodos de células a combustível, através do estudo da influência da composição e da nanoestrutura de nanopartículas de PtNi suportadas em carbono na atividade eletrocatalítica. Os estudos envolveram a preparação de catalisadores contendo nanopartículas de PtNi com diferentes composições pelo método do poliol modificado. Partes destes materiais foram submetidas a tratamento térmico em hidrogênio a 300ºC com o intuito de promover um aumento da incorporação de Ni na rede da Pt sem provocar severas modificações no tamanho e distribuição das nanopartículas sobre o suporte. As propriedades físicas dos materiais foram estudadas pelas técnicas de difração de raios X e microscopia eletrônica de transmissão. Os resultados mostraram que os catalisadores de PtNi têm um elevado grau de liga e boa homogeneidade de distribuição das partículas sobre o carbono suporte. As propriedades eletrônicas foram avaliadas por espectroscopia de absorção de raios X in situ. A atividade eletrocatalítica para a redução do oxigênio foi estudada utilizando-se a técnica de eletrodo de disco-anel rotatório. Em meio ácido, a presença de Ni nos catalisadores promove um aumento da vacância da banda 5d da Pt, ao tempo que o tratamento térmico provoca uma diminuição da vacância em relação aos materiais como preparados. Foi verificada uma maior atividade catalítica dos materiais de PtNi em relação à Pt. Em meio alcalino, os catalisadores que contêm Ni mostraram a banda 5d mais preenchida, provavelmente resultado da formação de óxidos de Ni. De modo geral, os catalisadores PtNi são menos ativos que a Pt em meio alcalino. A tolerância à presença de metanol foi avaliada através de comparação entre as curvas de polarização obtidas em soluções ácida e alcalina com as... / Abstract: This study aimed to contribute to the development of materials with good performance for the catalysis of the oxygen reduction reaction, which occurs at the cathodes of fuel cells, by studying the influence of composition and nanostructure of carbon-supported PtNi nanoparticles on the electrocatalytic activity. The studies involved the preparation of catalysts containing PtNi nanoparticles of different compositions by the modified polyol method. Parts of these materials were submitted to a heat treatment in hydrogen at 300 °C aiming to promote an increase of the incorporation of Ni into the Pt lattice without causing severe changes on the size and distribution of particles on the support. The physical properties of the materials were evaluated by X-ray diffraction and transmission electron microscopy. The results showed that PtNi catalysts have a high degree of alloying and that particle distribution on the carbon support has good homogeneity. The electronic properties were evaluated in situ by X-ray absorption spectroscopy. The electrocatalytic activity for the oxygen reduction reaction was studied by the rotating ring disk technique. In acid medium, the presence of Ni in the catalysts causes an increase in the Pt 5d band, while the heat treatment resulted in a Pt 5d band vacancy decrease. A catalytic activity for PtNi materials higher than that of Pt was verified. In alkaline medium, the catalysts containing Ni showed a Pt 5d band more filled, probably resulting from the formation of Ni oxides. In general, Pt Ni catalysts are less active than Pt in alkaline medium. The tolerance to the presence of methanol was evaluated by comparing the polarization curves obtained in acid and alkaline solutions containing alcohol. A decrease of catalytic activity in the presence of methanol in acid medium and good tolerance in alkaline medium were observed. / Mestre

O envelhecimento é um processo gradual e intrínseco que ocorre devido a mudanças fisiológicas e fenotípicas com o avanço da idade e que acarreta na diminuição da capacidade de manter a homeostase e reparo tecidual. A perda do controle homeostático e o possível envolvimento de células-tronco e progenitores, provavelmente, é uma das causas das fisiopatologias do sistema hematopoético que acompanham o envelhecimento. O declínio na competência do sistema imune adaptativo, o aumento de doenças mielóides, leucemias e o desenvolvimento de anemias são algumas mudanças significantes e decorrentes do processo de envelhecimento. Durante a transição ontológica, a habilidade de células-tronco hematopoéticas originarem células progenitoras diminui progressivamente, sugerindo perda da capacidade de autorrenovação e diferenciação das células-tronco com o avanço da idade. O microambiente medular se divide em duas áreas distintas: nicho endosteal e nicho vascular, conhecidos por controlar a homeostase das células-tronco hematopoéticas; e é composto por uma mistura heterogênea de células, dentre elas as células-tronco mesenquimais que expressam moléculas que controlam algumas funções das células-tronco hematopoéticas. De acordo com estas observações, este trabalho investiga o papel do envelhecimento das células-tronco mesenquimais no processo de autorrenovação, multipotência e diferenciação das células-tronco hematopoéticas. Neste trabalho, avaliamos a percentagem de células-tronco hematopoéticas Lin-CD34+ e subpopulações em co-cultura com células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea de diferentes idades, bem como sua capacidade de autorrenovação, diferenciação, secreção da quimiocina CXCL-12 e a expressão do receptor CXCR-4. Nossos resultados mostraram diferenças significativas nos parâmetros fenotípicos e funcionais das células-tronco hematopoéticas co-cultivadas com células-tronco mesenquimais de doadores idosos. Estes dados sugerem que o envelhecimento das células-tronco mesenquimais podem influenciar na homeostase do microambiente medular / Certainly, aging is one of the best identified features of the human biology, and is also the least understood. This is largely attributed to the fact that aging is gradual and fundamentally complex, due to all modifications in the physiological and phenotypic aspects occurred during the age advancing. One of the most striking features of aging is the decreased ability to maintain homeostasis and tissue repair. Consistent with those findings, many of the pathophysiological conditions affecting aging, such as anemia, dysplasia, leukemia and anemia suggest an imbalance between cell losses and the ability to self-renew or differentiation. The decline in homeostatic maintenance and regenerative potential of tissues during aging has been associated with changes in stem cells. Increasing evidences point to the stem cells as major accountable for the aging pathophysiology in several tissues. Thus, studies in mammals comprise a careful evaluation of mechanisms connected to stem cells. The increasing age is accompanied by many pathophysiological changes in the hematopoietic system wherein the etiology suggests loss of homeostatic control and a possible involvement of stem and progenitor cells. The clinically relevant changes are related to adaptive immune system diminished competence, the increase of myeloid diseases including leukemia and the onset of anemia in the elderly. The hematopoietic stem cell microenvironment is located in the bone marrow and is divided in two domains: the endosteal niche near to the bone surface and vascular niche associated with the sinusoidal endothelium; the niche consist of several heterogeneous cells types, among them, the mesenchymal stem cells. The mesenchymal stem cells express molecules that control hematopoietic stem cells functions. Therefore, this study investigates the role of mesenchymal stem cells aging in the self-renewal, multipotency and differentiation of hematopoietic stem cells. This study evaluated the percentage of hematopoietic stem cell Lin-CD34+ and subpopulations in co-culture with mesenchymal stem cell bone marrow-derived from donors with different ages, their ability of self-renewal, differentiation, secretion of chemokine CXCL-12 and expression of the CXCR-4 receptor. Our results suggest that the mesenchymal stem cells aging can affect the bone marrow niche homeostasis

A grande evolução tecnológica tem sido responsável pela introdução de diferentes contaminantes no ambiente, dentre os quais estão os éteres difenílicos polibromados (PBDEs). Os PBDEs representam uma importante classe de retardantes de chama adicionada aos diversos bens de consumo da vida moderna com a finalidade de retardar o processo de ignição e impedir a propagação de chamas. Atualmente, a crescente presença desses compostos em compartimentos ambientais e em amostras de fluídos biológicos tem levantado preocupações relacionadas com os possíveis efeitos tóxicos à saúde, no entanto tais efeitos são incertos devido à baixa disponibilidade de dados relacionados com a ação direta sobre o organismo humano. Desta forma, esse trabalho objetivou investigar os efeitos dos principais representantes de PBDEs: congênere PBDE-209, PBDE-99 e PBDE-47 sobre células de hepatoblastoma humano (HepG2) na faixa de concentração de 0.1-25µmol/L, em períodos de 24 e 48 horas, como uma alternativa de esclarecer os efeitos tóxicos dos PBDEs sobre a saúde humana, bem como correlacionar os efeitos entre os diferentes congêneres. As células HepG2 foram escolhidas devido as semelhanças com o metabolismo das células hepáticas normais. Também foi investigado o potencial dos três congêneres em induzir a morte celular após exposição aos PBDEs, sendo demonstrado potencial citotóxico diferenciado de acordo com o congênere investigado. Pela avaliação de ensaios de proliferação celular (SRB) e viabilidade celular (MTT) foi obtido que o congênere PBDE-209 induz morte celular em altas concentrações (10µmol/L, 25µmol/L) sendo esses efeitos iniciados primeiramente, por mecanismos citostáticos em concentrações menores. Enquanto isso, os PBDE-99 e PBDE-47 demonstraram elevado potencial citotóxico de forma concentração dependente, apresentando diferenças nas intensidades das concentrações avaliadas, relacionando-as com a facilidade de absorção e com os possíveis metabólitos formados. A investigação dos mecanismos citotóxicos foi realizada pelos ensaios de avaliação do potencial de membrana mitocondrial, exposição da fosfatidilserina na membrana externa celular e fragmentação nuclear. Esses ensaios evidenciaram que os congêneres investigados agem por indução de mecanismos apoptóticos, sendo os maiores resultados relacionados com os menores congêneres investigados. A avaliação dos mecanismos por vias necróticas foi realizada pela avaliação da atividade da LDH devido ao rompimento da membrana celular característico de mecanismos necróticos, não sendo obtidos resultados significativos. A avaliação do acúmulo de EROs ocasionado pela exposição aos congêneres demonstrou que os compostos investigados apresentam elevado potencial para induzir o estresse oxidativo, sendo inclusive relacionado com os efeitos citostáticos preliminares do congênere PBDE-209. A diferença dos resultados obtidos entre os três congêneres foi relacionada com as diferenças estruturais, as quais facilitam a absorção dos menores congêneres e com os possíveis metabólitos oriundos formados. Concluindo, estes resultados mostram os efeitos tóxicos dos PBDEs em células hepáticas e sugere a presença de efeitos adversos à saúde. Além disso, embora os congêneres PBDE-99 e PBDE-47 apresentem os maiores potenciais tóxicos, o efeito do congênere PBDE-209 não deve ser ignorado uma vez que o mesmo pode se intensificado com a exposição prolongada / Technologic demand has increased the different pollutants released in the environment. Polybrominated diphenyl ether (PBDE) is an important class of the flame retardants added in several good products with a wide range of toxic effects on biotic and abiotic systems. These compounds are release into environment through the loss during manufacture and of products containing PBDEs. Their toxic mechanisms on biologic systems still have not understood due to the existence of several different congeners, with different chemical and biological characteristics in the environment, and absence of their effects on the body. Therefore, in this study we examine effects of congeners PBDE-209, PBDE-99 and PBDE-47 on HepG2 cell line in order to understand their mechanism of action and their effects on the human health. Firstly, we evaluated citotoxic mechanism by SRB assay followed by MTT assay. This way, we showed that all tested PBDEs seem to cause cell death although PBDE-209 also causes cystostatic mechanism in lower concentration. The cytotoxic mechanism was observed in higher concentrations and it was suggested be evidences of apoptosis. Apoptotic mechanism was investigated by mitochondrial membrane potential, phosphatidyl serine exposure and nuclear fragmentation. Our results showed that all tested congeners were able to decrease mitochondrial membrane potential, to cause phosphatidyl serine exposure and a nuclear fragmentation with higher results found for BDE-99 and BDE-47 due structural difference that may facilities their absorption and their toxic metabolites Exclusion of necrotic mechanism was performed by LDH release assay. We evaluated reactive oxygen species (ROS) production and it was showed that apoptotics mechanisms is followed by oxidative stress in all congeners tested and suggest cytostatic mechanism is also mediated by ROS. These results are evidences of toxic effects of PBDEs on the cell line and health

As células de Sertoli são células fundamentais que fornecem fatores essenciais para a progressão da espermatogênese. Do período fetal ao imaturo, as células de Sertoli estão proliferando. A via não-clássica dos androgênios é caracterizada por rápido evento que conduz à ativação de cascatas de sinalização citosólicas desencadeadas por receptores de membrana. Diferente dessa, na via clássica são necessárias horas ou até mesmo dias para a produção de novas proteínas. Existe um receptor de membrana específico para os andrógenos que estimula a cascata de sinalização não-clássica nas células de Sertoli por interação com o ZIP9, um transportador de zinco. Esse estudo teve por objetivos: avaliar o envolvimento do receptor ZIP9 nos efeitos de membrana de células de Sertoli produzidos em resposta à aplicação de testosterona ou de nandrolona. Avaliar o papel do quelante de zinco (TPEN), nas concentrações 10 nM, 20 nM e 40 nM, sobre o potencial de membrana das células de Sertoli de ratos imaturos e avaliar o papel do quelante de zinco (TPEN), nas concentrações 10 nM, 20 nM e 40 nM, sobre a resposta eletrofisiológica da testosterona e da nandrolona em túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos imaturos. O potencial e a resistência de membrana das células de Sertoli foram registrados através da técnica eletrofisiológica de registro intracelular. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares de borossilicato preenchidos com KCl 3 M acoplados a um eletrômetro. Nos túbulos seminíferos de animais entre o 12º e o 15º dpn foram aplicados e/ou perfundidos, DMSO (veículo) n = 8; quelante de zinco (TPEN) nas concentrações 10 nM n = 7; 20 nM n = 6; e 40 nM n = 8; Testosterona (T) 1 μM n = 15; T + TPEN 10 nM n = 10; T + TPEN 20 nM n = 9; T + TPEN 40 nM n= 7; Nandrolona (N) 1 μM n = 19; N + TPEN 10 nM n = 13; N + TPEN 20 nM n =12; N + TPEN 40 nM n= 9. Os dados foram analisados por ANOVA de medidas repetidas, seguida do pós-teste de Bonferroni. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA/UFRGS nº 29644. A aplicação tópica de DMSO e a perfusão de TPEN nas diferentes concentrações não altera o potencial de membrana de células de Sertoli. A aplicação tópica de T e de N resultou em despolarização do potencial de membrana de células de Sertoli e em aumento da resistência da membrana de células de Sertoli. A aplicação tópica da T e da N em meio com perfusão de TPEN, nas concentrações 10 nM, 20 nM e 40 nM, não alterou o potencial de membrana e a resistência da membrana de células de Sertoli de ratos imaturos. Concluímos que o quelante de zinco afeta o receptor de membrana de andrógenos na membrana de células de Sertoli de ratos entre o 12º e o 15º dpn. E podemos inferir que há envolvimento do ZIP9 nos efeitos de membrana de células de Sertoli produzidos em respostas à aplicação de T e de N. / Sertoli cells are key cells that provide essential factors for the progression of spermatogenesis. From the fetal to the immature period, Sertoli cells are proliferating. The non-classical signaling pathway is characterized by a rapid event that leads to the activation of cytosolic signaling cascades triggered by membrane receptors. On the other hand, in the classical pathway it takes hours or even days are necessary for the production of new proteins. There is an androgen-specific membrane receptor that stimulates the non-classical signaling cascade in Sertoli cells by interaction with ZIP9, a zinc transporter. This aim of this study was to evaluate the involvement of the ZIP9 receptor in the membrane effects of Sertoli cells produced in response to the application of testosterone or nandrolone. Also, to evaluate the role of zinc chelator TPEN at 10 nM, 20 nM and 40 nM concentrations on the membrane potential of Sertoli cells from immature rats and to evaluate the role of zinc chelator TPEN in 10 nM, 20 nM and 40 nM concentrations in the electrophysiological response of testosterone and nandrolone in seminiferous tubules isolated from testes of immature rats. The membrane potential and membrane resistance of Sertoli cells were recorded using a standard single microelectrode technique. The intracellular recording of Sertoli cells was performed using microcapillaries filled with 3 M KCl coupled to an electrometer. In the seminiferous tubules of animals between post-natal day (pnd) 12 and 15 were applied and/or perfused, DMSO (vehicle) n = 8; Zinc chelator (TPEN) at concentrations of 10 nM n = 7; TPEN 20 nM n = 6; and TPEN 40 nM n = 8; Testosterone (T) 1 μM n = 15; T + TPEN 10 nM n = 10; T + TPEN 20 nM n = 9; T + TPEN 40 nM n = 7; Nandrolone (N) 1μM n = 19; N + TPEN 10 nM n = 13; N + TPEN 20 nM n = 12; N + TPEN 40 nM n = 9. For statistical analyses it was used ANOVA for repeated measures followed by Bonferroni post-test. This study was approved by the Ethics Committee for Animal Research of UFRGS (CEUA/UFRGS nº 29644). Topical application of DMSO and perfusion of TPEN at different concentrations did not cause membrane potential depolarization of Sertoli cells. Topical application of T and N cause membrane potential depolarization of Sertoli cells and increased the cell resistance of Sertoli cells. Topical application of T and N in TPEN infusion at concentrations of 10 nM, 20 nM and 40 nM did not cause membrane potential depolarization and the cell resistance of the Sertoli cell membrane of immature mice. In summary, zinc chelator affects the androgen membrane receptor on the Sertoli cell membrane of rats between pnd 12 and 15. We can infer that there is the involvement of the ZIP9 in the membrane effects of Sertoli cells produced in response to T and N.

As Células Gigantes Multinucleadas (CGMs) são consideradas uma característica marcante da inflamação granulomatosa, pois podem desempenhar um papel essencial na resposta do hospedeiro contra patógenos, particularmente o Paracoccidioides brasiliensis (Pb). Este estudo caracteriza as CGMs encontradas na Paracoccidioidomicose (PCM) oral crônica e avalia sua correlação com a quantidade de fungos presentes nos tecidos orais. Foram incluídos neste estudo 26 casos de pacientes portadores de PCM com lesões em mucosa oral. As lesões foram classificadas em granulomas densos e frouxos e avaliou-se o número total de células gigantes, incluindo as do tipo Langhans e corpo-estranho, além do número total de fungos e de fungos intracelulares. Realizou-se a reação imunoistoquímica com o anticorpo antiCD163; as CGMs CD163 positivas foram também quantificadas. Os resultados revelaram que, nos granulomas densos, houve um número maior de células gigantes totais e do tipo corpo-estranho comparado aos granulomas frouxos (p<0,05). O número total de células gigantes demonstrou uma correlação linear positiva com o número de CGMs CD163 positivas (p=0,003; r=0,56) e com a quantidade de fungos localizados no interior das CGMs (p=0,045; r=0,40). Com base nestes resultados, concluiu-se que as lesões orais da PCM crônica contêm principalmente CGMs com fenótipo CD163 positivo, incluindo ambas as células tipo Langhans e corpo-estranho; esse perfil CD163+/M2 pode contribuir para manutenção da forma crônica da doença e persistência das lesões orais. Além disso, quanto maior o número de CGMs, maior a quantidade de fungos no interior das células gigantes, evidenciando que este tipo de CGMs são, de fato, capazes de realizar a fagocitose. / Multinucleated giant cells (MGC) are considered to be a hallmark of granulomatous inflammation; thus they may play an essential role in the host response against pathogens, particularly Paracoccidioides brasiliensis. This study characterizes the MGC found in oral chronic paracoccidioidomycosis and assesses their correlation with the amount of fungi within oral tissues. Twenty-six cases were included. They were classified as loose or dense granulomas and the total MGC, including foreign-body and Langhans giant cells, besides the total and intracellular fungi were taken into consideration. CD163 immunoexpression was performed and CD163+ multinucleated giant cells were also quantified. Our results showed that dense granulomas revealed more foreign-body type and total giant cells than loose granulomas (P < 0.05). Total giant cells showed a positive linear correlation with the CD163+cells (P = 0.003; r = 0.56) and intracellular fungi quantification (P = 0.045; r = 0.40). Oral chronic paracoccidioidomycosis lesions contain MGC that mainly belong to a CD163+ phenotype, also showing both Langhans and foreign-body arrangements; such CD163+/M2 profile may sustain the chronic form and persistence of PCM oral lesions; additionally, the higher the presence of MGC, the higher the amount of phagocyted fungi, evidencing that such kind of giant cells are indeed able to perform phagocytosis.