Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

Estágio realizado na CUF - Químicos Industriais e orientado pelo Doutor Paulo Alexandre Pereira Araújo / Tese de doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2010

Tese de doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia. 2011

Tese de doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia. 2011

Tese de doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

Tese de doutoramento. Engenharia Industrial e Gestão. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2008

Título original: Avaliação bioquímica (sangue e urina) e morfohistológica (fígado) de coelhas expostas a acaricida obtido a partir do ácido ricinoléico do óleo de mamona / Orientador: Maria Izabel Souza Camargo / Coorientador: Patricia Rosa de Oliveira / Banca: Rusleyd Maria Magalhães de Abreu / Banca: Matheus Mantuanelli Roberto / Resumo: No presente trabalho verificou-se o efeito dos ésteres do ácido ricinoléico do óleo de mamona, acaricida químico natural pela avaliação dos parâmetros bioquímicos do sangue e da urina e a morfofisiologia do fígado de coelhas, aqui utilizadas como modelo de hospedeiros de carrapatos, alimentadas com ração enriquecida com os referidos ésteres. Os resultados obtidos a partir dos Bioensaios 1 (ração + NaCl) e 2 (ração + ésteres + NaCl) mostraram que os parâmetros clínicos nas análises das enzimas hepáticas fosfatase alcalina (FAT), gama glutamil transferase (GGT) e alanina aminotransferase (ALT) não foram significativamente alterados, exceto para a enzima hepática aspartato aminotransferase (AST) das coelhas do Bioensaio 2, que apresentou maior variância indicando que os ésteres são hepatotóxicos. Os resultados obtidos nas análises das amostras de urina para os parâmetros hemoglobina livre, proteína, bilirrubina e urobilinogênio demonstraram que os índices de referência não foram alterados. Os dados morfohistológicos e histoquímicos do fígado mostraram que as coelhas alimentadas com ração enriquecida tiveram o tecido hepático alterado, o que foi confirmado pela desorganização dos cordões hepáticos, aumento do espaço intercelular, presença de hepatócitos com limites celulares pouco distintos e de núcleos irregulares e picnóticos, geralmente deslocados para a periferia da célula devido a presença de vacúolos. Histoquimicamente detectou-se nas coelhas do Bioensaio 2 redução na prese... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present study verified the effects of castor oil ricinoleic acid, a natural chemical acaricide, on the clinical blood and urine parameters and on the liver morphophysiology of female rabbits (used as a model of tick hosts) fed with commercial food enriched with castor oil esters. Bioassays 1 (commercial food + NaCl) and 2 (food + esters + NaCl) demonstrated that the clinical parameters of the hepatic enzyme alkaline phosphatase (FAT), gamma glutamyl transferase (GGT) and alanine aminotransferase (ALT) were not significantly altered, except for the hepatic enzyme aspartate aminotransferase (AST) of the rabbits belonging to Bioassay 2, which presented greater variability, indicating that the esters are hepatotoxic. The analyses of the urine samples for the parameters free hemoglobin, protein, bilirubin and urobilinogen demonstrated that the esters were not toxic to the female rabbits. The morphohistological and histochemical data showed that the rabbits fed with enriched food had the hepatic tissue altered, which was confirmed by the disorganization of the hepatic cords, enlargement of the intercellular space, presence of hepatocytes with little evident limits and irregular and pyknotic nuclei, mostly dislocated to the cell periphery due to the presence of vacuoles. Histochemically, the female rabbits of Bioassay 2 presented a decrease in the number of lipids and increased amount of glycogen. In addition, the hepatic cells of these rabbits showed activity of acid phosphatas... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Tesis Magíster en Bioquímica, Área de Especialización en Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) es una coenzima con múltiples funciones. Participa en el metabolismo redox como molécula transportadora de electrones en procesos metabólicos, actúa como indicador del estado energético celular, y es también sustrato de numerosas enzimas implicadas en la desacetilación de reguladores transcripcionales y la movilización de Ca2+ intracelular, entre otros. Diversas investigaciones sugieren que la disminución de los niveles de NAD+ es un factor importante en la progresión de enfermedades cardiovasculares. En diferentes modelos de miocardiopatías se ha observado una disminución en la expresión de la enzima marcapaso de la síntesis de NAD+, Nampt. También se ha descrito que los niveles de NAD+ están disminuidos en condiciones de riesgo cardiovascular como son el envejecimiento, dislipidemia y diabetes mellitus tipo 2. El objetivo de este trabajo fue determinar los efectos de la disminución de NAD+ en el metabolismo y la capacidad adaptativa de los cardiomiocitos. Se utilizó el inhibidor de Nampt, FK866, para disminuir los niveles de NAD+ en cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas. Se evaluó la viabilidad, el metabolismo mitocondrial y la respuesta adaptativa del cardiomiocito a estímulos de insulina, peróxido de hidrógeno (H2O2) y norepinefrina (NE). Los resultados mostraron que la disminución de NAD+ por FK866 redujo el metabolismo mitocondrial sin afectar la viabilidad de los cardiomiocitos. Además, disminuyó la fosforilación de Akt en respuesta a insulina, la sobrevida frente a H2O2 y previno el aumento del área celular y sarcomerización en respuesta a NE. Para evaluar la relación de causalidad entre la disminución de NAD+ y estos efectos, se rescataron los niveles de NAD+ mediante la administración de nicotinamida mononucleótido (NMN). Se observó la recuperación de los parámetros metabólicos y la sobrevida a H2O2, pero no se restableció la respuesta hipertrófica. En conclusión, este trabajo muestra que NAD+ es esencial para el metabolismo mitocondrial del cardiomiocito, y sugiere su participación en la vía de señalización de insulina y en la respuesta adaptativa a H2O2 y NE. / The nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) is a coenzyme with multiple functions. In redox metabolism participates as an electron carrier in metabolic processes, is a cellular energetic status indicator and it is also substrate of many enzymes involved in transcription factor deacetylation and Ca2+ mobilization, among others. Several reports suggest that NAD+ levels are an important factor in cardiovascular diseases progression. In different cardiomyopathy models the expression of the NAD+ synthesis rate-limiting enzyme, Nampt is diminished. Also NAD+ levels are decreased in cardiovascular risk conditions such as aging, dyslipidemia and type 2 diabetes mellitus. The aim of this work was to determine the effects of NAD+ decrease on cardiomyocytes’ metabolism and adaptive capability. The Nampt inhibitor, FK866, was used to reduce NAD+ levels in primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes, and viability, mitochondrial metabolism, and cardiomyocytes adaptive response to insulin, hydrogen peroxide (H2O2) and norepinephrine (NE) stimuli were assessed. The results showed that the NAD+ reduction induced by FK866 decreased mitochondrial metabolism without affecting cardiomyocytes viability. Insulin-stimulated Akt phosphorylation and H2O2-survival were also diminished and cellular area increase and sarcomerization induced by NE was prevented. The causality between NAD+ decrease and those effects was assessed through NAD+ levels recovery by nicotinamide mononucleotide (NMN) administration. Both metabolism and H2O2-survival were reestablished, but not the hypertrophic response. In conclusion this work reveals that NAD+ is essential for cardiomyocyte mitochondrial metabolism, and suggest its participation on insulin signaling pathway and adaptive responses to H2O2 and NE. / Fondap; Fondecyt

One of the important challenges in surface bioengineering is the fabrication of robust and regular supramolecular structures, tuning the chemical and topographical properties of the surface, in order to include functional biomolecules, which preserve their activity and/ or induce the desired biological process.Laccases, are redox enzyme, that catalyse the oxidation of a broad range of polyphenols and aromatic substrates. Wide variety of application in the industry has been reported, and lately their use for biosensors development. Bacterial S-layers are very interesting systems since they self-assemble forming 2-D crystals (S-layers) on many type of surfaces, and they can be fused with other biomolecules maintaining their functionality.HegG2 cell line is an hepatoma cell line that has been used for cancer research. These cells maintain part of the normal metabolic capacity of hepatocytes, what make them a useful tool for high-throughput in vitro toxicity assays, as well as in the development of bioartificial livers. The objective of this work was to generate biocompatible surfaces to immobilise lacase, S-layers and HepG2 cells, on which they mantain they active. Different surfaces with defined functionalities have been constructed with synthetic polyelectrolytes, using the layer-by-layer technique and soft lithography. At the nanoscale, an enzyme (laccase) was covalently immobilised on a gold/polyethylenimineI/glutaraldhyde layer, preserving its activity. The immobilisation was studied with a quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and its activity assayed with a spectrophotometer.Besides, bacterial surface proteins (SbpA, SbpA-EGFP and SbpA-STV) were adsorbed on polyelectrolytes multilayers. The combination of soft-lithography with a protein resistant polyelectrolyte (PLL-g-PEG) led to the construction of micro-structured surfaces of functional bacterial proteins. Surface wetability, fluorescence and atomic force microscopy (AFM) were used to characterise those interfaces.Increasing the complexity, attachment of HepG2 cells on polyelectrolytes was studied. Cell adopted different morphologies depending on the hosting underlying polyelectrolyte as observed by transmission, scanning electron and atomic force microscopes. The adhesion and spreading of the cells that were monitored with QCM-D and transmission microscopy, and assayed with crystal violet, showed a higher affinity of the cells toward the adlayer formed on PEI, PAH and PLL in comparison with PSS and PLL-g-PEG. Force spectroscopy studies with AFM showed higher repulsion between PSS surfaces and the cell surface, and different local cell mechanical properties between cells attached to PEI and PSS. / La ingeniería de biomateriales busca obtener materiales biológicamente activos, ajustando las propiedades químico-físicas (y topográficas) de la superficie de interés. Las lacasas, son enzimas que catalizan la oxidación de un gran número de polifenoles con aplicación en la industria, así como en el desarrollo de biosensores. Las proteínas bacterianas S, son sistemas muy interesantes ya que se auto-ensamblan formando cristales en 2-D y se pueden fusionar con otras biomoléculas. La línea celular hepática cancerosaHepG2, se ha empleado en estudios relacionados con el cáncer, citotoxicidad , se ha incorporado en dispositivos extracorporales para suplir funciones hepáticas, ya que a pesar de su transformación mantienen ciertas funciones de los hepatocitos normales. El objetivo de este trabajo fue generar superficies biocompatibles en las que se inmovilizó lacasa y se adsorbieron proteínas (de fusión) bacterianas y células, comprobando su funcionalidad.El ajuste de la química superficial se realizó por adsorción capa tras capa de polielectrolitos y para su estructuración se utilizó litografía blanda ("micro-contact printing"). La lacasa se inmobilizó covalentemente sobre oro cubierto con PEI (polietilenimina) través de gluraldehído, para posteriormente recubrirla con otros polielectrolitos. Dicho proceso se monitoreó con QCM (microblanza de cuarzo) y espectrofotometría (actividad enzimática). Las proteínas bacterianas se adsobieron selectivamente sobre muliticapas de polielectrolitos previamente estructuradas. Su funcionalidad se comprobó usando AFM (microscopía de fuerza atómica) y microscopía de fluorescencia. Las células HepG2 se inmobilizaron sobre superficies homogéneas y estructuradas de con distintos polielectrolitos. Se comprobó su viabilidad por ensayos con MTT y se observaron con SEM (microscopía de escaneo de electrones). El proceso de adhesion de las células sobre las multicapas de polielectrolos se estudió en función del tiempo con QCM y microscopía de transmisión, y fue testado con cristal violeta. Se utilizó AFM para estudiar la interacción entre las células con los polielectrolitos.El protocolo de inmovilización usado es aplicable para la lacasa, la cual conserva su actividad catalítica en la presencia de ABTS. La enzima se recubrió con multicapas de polielectrolitos pero la determinación de su actividad se ve dificultada por la interferencia con el ABTS.Por primera vez se utilizó "micro-contact printing" para construir superficies estructuradas, en las que se adsorbieron proteínas (de fusión) S, generando superficies funcionales en escala nanométrica dentro de microestructuras. Cabe destacar que la posibilidad de manipular la distribución de la proteína en escala micro es un requerimiento básico para el desarrollo de biosensores. En lo que se refiere a la interacción célula/superficie, se encontró que las células HepG2 adoptan diferente morfología dependiendo del substrato al que se adhieren. Mientras polielectrolitos positivos (PEI, PAH) adsorben moléculas que inducen la expansión celular, PLL-g-PEG (interfase neutra e hidrofílica) y PSS (polielectrolito negativo) no favorecieron la expansión celular. El QCM-D revelan que las células no son detectadas cuando se depositan sobre PSS (lo opuesto sucede cuando se adhieren sobre PEI) aunque se mantiene adheridas. Las propiedades mecánicas de las células varían de acuerdo al sustrato al que se adhieren, más rígidas sobre PEI. La máxima adhesión de las puntas (funcionarizadas con PEI y PSS) del AFM a la superficie celular es independiente de la carga aplicada y de su recubrimiento, para un tiempo nulo de residencia de la punta sobre la superficie celular. La máxima adhesión observada fue de 750 pN para un tiempo de residencia de residencia de 3 s, cuando el tip fue funcionalizado con PEI.

En este trabajo se propuso un modelo de crecimiento celular, el cual considera tanto la proliferación como la difusión. A través de experimentos in silico del modelo propuesto, se estudió la dinámica de la interfaz del cultivo creciendo, obteniéndose que ésta pertenece a la clase de universalidad Kardar-Parisi-Zhang (KPZ) (exponente de rugosidad: α = 0,48(3), α = 0,46(4) y α = 0,51(4), para diferentes valores de la probabilidad de crecimiento; exponente de crecimiento: β = 0,32(3)). Los resultados obtenidos concuerdan con datos experimentales de cultivos in vitro realizados por otros autores. Además, para analizar la velocidad de la interfaz y los perfiles de ocupación de las células, se realizó una comparación de los resultados de los experimentos in silico del modelo con una aproximación de campo medio de una ecuación maestra. Una vez comprendido el comportamiento del modelo, se aplica una modificación, incorporando un ruido congelado en la matriz de crecimiento. Se estudia nuevamente su dinámica de crecimiento y se concluye que para bajos valores de ruido, la dinámica de la interfaz sigue perteneciendo a la clase de universalidad KPZ. A medida que el ruido toma relevancia, la velocidad de la interfaz va disminuyendo hasta que finalmente, en cierto valor crítico, la interfaz se congela experimentando una transición de fase de segundo orden. El exponente del parámetro de orden obtenido es θ = 0, 20(2). En el punto crítico, se verificó que el término no lineal de la ecuación KPZ tiende a cero, obteniendose los exponentes α = 1,03(4) y β = 0,81(3), pertenecientes a la clase de universalidad Edwards-Wilkinson congelado (QEW). En forma complementaria, se estudió la resolución numérica de la ecuación KPZ con ruido congelado para ciertos valores controversiales del término no lineal, es decir λ < 0 y λ = 0.