Orientador: Carmino Antonio de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T00:04:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_MariaHelenade_M.pdf: 6715822 bytes, checksum: 42a90c000ac87aaeb8374cda8c816443 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: o Cateter tipo Hickman é um cateter venoso central, tune1ado, semi-implantável, de duplo lúmen e longa permanência, indicado para pacientes com acesso venoso escasso, que serão submetidos à tratamento que requeiram doses repetidas de quimioterápicos, antibióticos, nutrição parenteral, hemoderivados e que necessitarão de coletas freqüentes de amostras sangüíneas para exames laboratoriais. Possui algumas vantagens como a possibilidade de infusão de soluções em grande quantidade, simultaneamente e por tempo prolongado e como desvantagens podemos citar algumas complicações descritas em literatura como: infecção da inserção, túnel subcutâneo ou lúmen do cateter; migração da ponta; trombose de grandes ou pequenos vasos; rompimento ou perfuração com conseqüente extravasamento de soluções; obstrução por coágulos, medicações cristalizadas ou mecânica de um ou dos dois lumens. Na Enfermaria de Hematologia do Hospital das Clínicas da UNICAMP, este tipo de cateter é indicado para pacientes que serão submetidos à mobilização de células tronco hematopoéticas e transplante autólogo de medula óssea. Este estudo teve como objetivo quantificar e qualificar as complicações do cateter tipo Hickman de duplo lúmen, inseridos em pacientes que foram submetidos à mobilização de células tronco hematopoética e realização de transplante autólogo de medula óssea. Casuística e Métodos: um total de 55 cateteres tipo Hickman foram inseridos em 53 pacientes consecutivos submetidos à mobilização de células tronco hematopoética e transplante autólogo de medula óssea, no período de 24 de maio de 2000 à 29 de janeiro de 2003, na Enfermaria de Hematologia do Hospital das Clínicas da UNICAMP. Cinco pacientes foram excluidos do estudo. Todos os cateteres foram inseridos em Centro Círúrgico, sob anestesia local. Os dados para o estudo foram obtidos através da avaliação diária do cateter tipo Hickman quanto à sinais de infecção, fluxo e refluxo dos dois lumens, posicionamento, além de exames laboratoriais pertinentes. Resultados: os cateteres permaneceram locados por um mediana de 68 dias. Durante todo o período de observação p do estudo, foi registrado a freqüência de 96 cateteres com complicações relacionadas, 78% dos cateteres foram removidos devido à complicações e apenas dois permaneceram sem nenhum tipo de complicação no decorrer do período de observação. As causasde complicações que geraram a remoção dos cateteres foram: bacteremia (18%), colonização do cateter (14%), febre de origem indeterminada (12%), infecção do túnel (10%), óbito por septicemia (6%), septicemia (4%), problemas relacionados ao posicionamento ou fixação (12%) e trombose venosa profunda (2%). A complicação mais comum que gerou a remoção do cateter foi infecção. Discussão: a mediana de permanência, obtida em nosso estudo, é inferior a maioria dos dados descritos na literatura, porém encontra-se próxima, e até um pouco superior quando comparada à outros estudos que envolveram pacientes oncohematológicos. Em nosso estudo observamos elevado índice de infecção, quando comparado aos dados da literatura. Infecção da corrente sangüínea foi a ocorrência infecciosa mais freqüente (18%), seguida de colonização do cateter (14%), febre de origem indeterminada (12%), infecção do túnel (10%) e septicemia (10%). Alteração de permeabilidade foi observada em 10% dos cateteres, porém nenhum cateter foi removido por este motivo. Conclusão: um acesso venoso seguro é essencial para pacientes oncohematológicos. O cateter de Hickman mostrou ser factível e adequado para pacientes em IIlúbilizaçãode células tronco hematopoética e transplante autólogo de medula óssea, pois permite.a infusão de líquidos endovenosos em grande volume, por vias independentes e apre$enta fluxo suficiente para realização de aférese. Porém, em nosso serviço, a freqüência de complicações infecciosas relacionadas ao cateter é elevada, demonstrando. cuidados deficientes de manutenção / Abstract: Central venous catheters (CVCs) are essential for patients undergoing autologous bone marrow transplantation (ABMT). Hickman's catheter (HC) is a long-term, tunneled and cuffed venous access. This type of catheter constitutes a safe and useful line for administration of chemotherapy, antimicrobial agents, blood products, hydration, total parenteral nutrition and permits blood sampling and the accomplishment of leucoapheresis. Safety venous access is essential in patients with haematological diseases. Patients and Methods: a total of 55 Hickman's catheter were inserted in 53 consecutive patients undergoing ABMT, five patients were exc1udedof study. Fifty catheters were available for this study. All catheters were inserted in surgery room, with fluoroscopic guidance and local anaesthesia. AlI patients were followed daily during hospitalization time, from the time of catheter insertion to the time of catheter removal. A record of all complications and catheter loss cause were analyzed. Results: Catheters remained inserted in a median time of 68 days. A total of 96 episodes of complications with Hickman's catheter were documented. On1ytwo catheters did not present any complication and catheter 10ssrate due to complications was 78%. The most common complication for catheter requiring removal was infection. Discussion: this study aimed in a prospective observation defined the feasibility of this type of catheter in a general infirmary, in patients treated with high dose mobilizing chemotherapy. In our experience no data concerning catheter insertion are available, however no deaths related to the procedure occurred. The complication leading to catheter removal were infections (64%), tip migration (12%), thrombosis (2%), and others causes (22%). Difficulties of flow, particularly to collect samples, occurred in about 10% of cases but did not implicate in catheter removal. Therefore our study showed higher levei of infection compared to data from literature. Regarding the onset blood stream infection was the more frequent (18%), followed by catheter colonization (14%), pyrexia of unknown origin (PUü) (12%), tunnel infection (10%) and, septicemia (10%). Conclusion: A dependable central venous access is an essential prerequisite for the delivery of care to onco-hematological patients. The use of long-term venous access devices for chemotherapy, parenteral nutrition, antibiotic therapy and apheresis procedures is increasing. Acquisition of a reliable and sustained central venous access is a crucial point in the provision of comprehensive care to cancer patients. Many clinical adverse effects of antineoplastic drugs, particularly in heavily treated patients, as phlebitis, thrombosis, and fibrosis of peripheral veins, impose limitations on its repeated use. lndeed, patients needing to collect peripheral progenitor cell in order to perform autologous bone marrow transplantation should have a good access with ideal blood flow in the apheresis procedures. lndwelling Hickman's catheters are widely use and have proved to be a good devise for the delivery of drugs and apheresis procedure. ln addition, its use permits the best clínical control and monitoring of hydration, ions, central venous blood pressure, collection of samples for hematology, microbiology and biochemistry analysis. lndeed the uses of catheters are more cornfortable and lead a better quality of life during treatment / Mestrado / Clinica Medica / Clinica Medica

Estudos com células tronco (CT) têm despertado grande interesse devido ao seu promissor potencial terapêutico. Neste contexto, as CT mesenquimais (CTm) representam uma alternativa para o tratamento de diversas patologias em diferentes órgãos, inclusive o rim e as glomerulopatias que o acometem. As doenças glomerulares constituem uma freqüente causa de doença renal crônica e se caracterizam por apresentar proteinúria. Neste processo, os podócitos são células que apresentam um papel crucial, sendo que as podocitopatias se associam com o aparecimento de proteinúria e desenvolvimento de esclerose glomerular. A obtenção de um modelo de podocitopatia através da administração de aminonucleosídeo de puromicina (PAN), permite a melhor compreensão dessas células altamente diferenciadas que não possuem potencial de proliferação ou regeneração. O presente projeto teve como objetivo estabelecer o modelo experimental de nefropatia crônica induzida por PAN associado à nefrectomia unilateral (UniNx) para induzir lesões glomerulares mais exuberantes e, neste modelo experimental, avaliar o efeito da infusão de CTm derivadas da medula óssea. Ratos Wistar (n=52) foram divididos em três grupos: Controle (UniNx), PAN (PAN+UniNx) e PAN+CTm (PAN+UniNx+CTm). As CTm foram inoculadas na região subcapsular renal no dia 0 e os animais foram sacrificados após 30 e 60 dias. O efeito da infusão das CTm no tecido renal foi avaliado através de parâmetros clínicos e laboratoriais, além de análise histológica, imunohistoquímica, microscopia eletrônica e PCR em tempo real. Paralelamente, o projeto analisou a diferenciação in vitro de CTm em podócitos através do estímulo com colágeno tipo IV e através de cocultura de glomérulos isolados de ratos com CTm. A diferenciação celular das CTm foi analisada por citometria de fluxo, imunocitoquímica e PCR em tempo real para genes de proteínas podocitárias. No modelo in vivo foi possível observar a presença de CTm até 15 dias após a inoculação na região subcapsular renal. As CTm foram capazes de diminuir significativamente a proteinúria e a albuminúria com 30 e 60 dias, assim como a pressão arterial aos 60 dias. Não houve diferença nos valores de creatinina, uréia sérica, glomeruloesclerose e fibrose intersticial entre o grupo PAN e o grupo PAN+CTm. As CTm foram responsáveis pela diminuição significativa da fusão dos pedicelos à microscopia eletrônica, com melhora da expressão relativa de WT1 aos 60 dias e melhora parcial da expressão gênica de nefrina, podocina e sinaptopodina. A expressão proteica de WT1 também foi significativamente maior no grupo PAN+CTm em comparação ao grupo PAN. Além disso, houve melhora significante da expressão relativa de IL-4 e IL-10, e diminuição de IL-1? e TNF-? no grupo tratado. Ainda, as CTm promoveram aumento significativo da expressão gênica de VEGF aos 60 dias. Nos resultados in vitro não houve diferenciação das CTm em podócitos quando cultivadas com colágeno IV, assim como a cocultura com glomérulos não proporcionou alteração na expressão de marcadores de superfície das CTm. Concluímos que a terapia celular com CTm foi capaz de induzir proteção renal caracterizada por diminuição da proteinúria, da albuminúria e da pressão arterial, associado a menor fusão dos pedicelos, maior expressão gênica de proteínas podocitárias e de expressão celular de WT1. As citocinas inflamatórias IL-1?, TNF-?, IL-4 e IL-10, em conjunto com o VEGF, foram os possíveis mediadores responsáveis por estes resultados / Stem cells (SC) have emerged as a potential therapeutic approach for several diseases. In this context, the mesenchymal SC (mSC) are considered an alternative for the treatment of kidney diseases such as glomerulopathies. Glomerular diseases are an important cause of chronic kidney disease (CKD) and are characterized by proteinuria. In this process, the podocytes are cells that have a critical role, and the podocytopathies are associated with the onset of proteinuria and glomerular sclerosis. The achievement of a podocytopathy model through administration of puromycin (PAN) allows a better understanding of these highly differentiated cells which do not have the potential for proliferation or regeneration. The aim of the present study was to establish an experimental model of chronic nephropathy induced by PAN associated with unilateral nephrectomy (UniNx), to induce early and marked glomerular lesions and, in this experimental model, to evaluate the effect of bone marrow mSC infusion. Wistar rats (n=52) were randomly divided into three groups: Control (UniNx), PAN (PAN+UniNx) and PAN+mSC (PAN+UniNx+mSC). mSC were inoculated into the subcapsular renal region on day 0, and the animals were sacrificed after 30 and 60 days. The mSC infusion effects in renal tissue were evaluated by clinical and laboratory parameters, histology, immunohistochemistry, electron microscopy and real-time PCR. In parallel, we analyzed whether mSC could differentiate in vitro into podocytes through stimulation with collagen type IV or by means of co-culture of isolated rat glomeruli with mSC. The cell differentiation was analyzed by flow cytometry, immunocytochemistry and real-time PCR. In the in vivo model, mSC were detected until 15 days after inoculation in the renal subcapsular region. mSC were able to significantly reduce the proteinuria and albuminuria with 30 and 60 days, as well as blood pressure at 60 days. There was no difference in the values of creatinine, BUN, glomerulosclerosis and interstitial fibrosis between the groups PAN and PAN+mSC. The treated group showed lower effacement of foot process by electron microscopy, with significant improvement in the relative expression of WT1 in 60 days and partial improvement of nephrin, podocyn and synaptopodin. The WT1 protein expression was also significantly higher in the PAN+mSC group compared to the PAN group. In addition, mSC treatment significantly reduced gene expression of IL-1? and TNF-?, as well as increased the expression of IL-4 and IL-10. At 60 days mSC promoted significant increase of VEGF relative expression. In vitro results, mSC cultived with collagen type IV did not show differentiation to podocytes and the co-culture with glomeruli provided no change in expression of mSC surface markers. In conclusion, mSC therapy in the PAN model was able to induce renal protection characterized by the reduction of albuminuria, proteinuria and blood pressure, associated with a lower effacement of foot process, increased gene expression of podocytes proteins and cellular expression of WT1. Inflammatory cytokines IL-1?, TNF-?, IL-4 and IL-10 associated with VEGF were the probable mediators of these results, promoting podocyte protection

Made available in DSpace on 2014-06-12T22:59:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3839_1.pdf: 1515154 bytes, checksum: f3a65e6c7674cc10950da06386871bd9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A desnutrição constitui um problema de saúde pública caracterizado pela baixa ingestão de nutrientes essenciais para o crescimento e desenvolvimento do organismo. Pesquisas que envolvem desnutrição e a sua repercussão na vida adulta relevam que ela é capaz de provocar alterações na programação metabólica que repercutem ao longo da vida. No entanto, ainda pouco se conhece sobre as seqüelas envolvendo as células tronco adultas de medula óssea (CTAMO), especialmente sobre as células tronco mesenquimais em relação à quantidade e sua capacidade de diferenciação em tecido ósseo. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da desnutrição neonatal sobre o número de células tronco, bem como avaliar o reparo ósseo com essas células em lesões ósseas de animais desnutridos. Para isso, utilizou-se 64 ratos machos Wistar, dos quais 32 receberam dieta padrão (nutridos-N), com 23% de proteínas, e o restante recebeu Dieta Básica Regional (DBR) (desnutridos-D) com 7,87% de proteínas no período de aleitamento. O peso dos ratos foi aferido até completarem a idade adulta, quando eles foram subdivididos em 4 grupos (n=8): 1. N que receberam células tronco de N (G1); 2. D que receberam células tronco de D (G2); 3. N que receberam células tronco de D (G3) e 4. D que receberam células tronco de N (G4). Os outros ratos (N e D) foram usados como doadores de CTAMO que foram cultivadas por 12 dias e diferenciadas, in vitro, em osteoblastos que, por sua vez, foram implantados em defeitos críticos confeccionados nos ossos parietais dos ratos. Após 60 dias, estes foram eutanasiados e as calotas cranianas processadas para microscopia óptica. A leitura foi realizada por três patologistas e o índice Kappa foi utilizado para avaliar o grau de concordância entre eles. Para a análise dos pesos e do número de células tronco, utilizou-se o teste t-Student (p< 0,05). O teste de Mann- Whitney foi aplicado quando os resultados não passaram no teste de normalidade. Os ratos desnutridos tiveram redução do ganho de peso desde o segundo dia de vida, enquanto que o número de CTAMO não apresentou diferença entre N e D. As células tronco mesenquimais de D, entretanto, apresentaram-se em maior quantidade. Observou-se um pequeno grau de reparo ósseo entre os grupos, principalmente entre G2 e G4. Com esses dados, pode-se sugerir que a desnutrição neonatal interfere de forma permanente na vida adulta, sobre o número e a capacidade regenerativa tecidual das células tronco mesenquimais de medula óssea. Embora essas células tenham um grande potencial de diferenciação, o que permite o seu uso para estudos de regeneração de tecidos, a desnutrição no período crítico é uma agressão suficiente para diminuir o seu potencial terapêutico no tecido ósseo

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-19T13:29:29Z No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Approved for entry into archive by Gentil Jeorgina(jeorgina@icict.fiocruz.br) on 2013-11-26T11:00:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2014-09-26T10:49:49Z No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-03-10T13:27:33Z No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-07-18T13:01:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T13:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As células-tronco (CTs) têm potencial de se diferenciar em vários tipos celulares servindo como um sistema de reparação de tecidos. Quando uma CT se divide mantém o mesmo potencial da célula que a originou em um mecanismo chamado de autorrenovação. O entendimento desse mecanismo ajudará a compreender a senescência e a perda do potencial de diferenciação das CTs. Em nível de regulação pós-transcricional, as proteínas DZIP1 e PUM2 estão envolvidas na autorrenovação de CT embrionárias e germinativas de diversos organismos, incluindo humanos. Contudo, o trabalho visou o estudo do envolvimento de PUM2 e DZIP1 nos mecanismos de autorrenovação e diferenciação em CTs mesenquimais humanas (CTMs). Por RT-PCR, foi observada a expressão dos transcritos de dzip1 e pum2 em CTMs derivadas de medula óssea (MO), sangue de cordão umbilical e placentário (SCU) e tecido adiposo (TA). A expressão dos transcritos também foram analisada durante a adipogênese das CTMs por qRT-PCR. Os resultados demonstram que o perfil de expressão dos dois transcritos sofre redução durante o processo, enquanto o transcrito de fabp4 (marcador adipogênico) aumenta. Por citometria de fluxo foi verificada a porcentagem de CTMs de TA que expressam DZIP1 (mais de 90% da população) e PUM2 (cerca de 50% da população). A expressão das proteínas PUM2 e DZIP1 foi confirmada por western blot em extratos totais de CTMs. Durante a diferenciação celular, a expressão da proteína DZIP1 se manteve constante enquanto PUM2 sofreu redução após induzida da diferenciação. A discrepância entre os níveis de mRNA e da proteína DZIP1 sugere regulação pós-transcricional. As imunofluorescências de DZIP1 e PUM2 nas CTMs indicaram que essas proteínas são nucleares em células de culturas recém sub-cultivadas e a localização dessas são translocadas para o citoplasma ao longo do tempo da cultura. As células diferenciadas expressam as duas proteínas no citoplasma e/ou núcleo. Análise dos transcritos de dzip1 e pum2 também foi verificada em culturas com proliferação celular intensa e reduzida. Dzip1 não apresentou mudanças significativas de expressão nas duas situações. No entanto, a expressão de pum2 aumentou nas CTMs com proliferação intensa, sugerindo uma possível participação nesse processo. Ensaios futuros serão realizados para confirmar a participação de PUM2 na proliferação celular. Além disso, a interferência de dzip1 e pum2 por RNA será providenciada para análise funcional desses genes. / Stem Cells (SCs) have the potential of differentiating into several cellular types, serving as a repair system for the organism. The ability of stem cells to replicate themselves by dividing into the same non-specialized cell type over long periods is a mechanism knows as self-renewal. The understanding of this mechanism will also help to understand the senescence and hence, the loss of SCs differentiation potential. PUMILIO2 and DZIP1 RNA binding proteins regulate the translation of specific mRNAs during self-renewal and differentiation of germ-line and embryonic stem cells of diverse organisms, including humans. In this work, we aimed to study the relevance of PUM2 and DZIP1 in self-renewal and differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs). We have found that dzip1 and pum2 transcripts are expressed in hMSCs derived from bone marrow (BM), adipose tissue (AT) and umbilical cord blood (UC) by using RT-PCR analysis. We have found that more than 90% of the MSCs population express DZIP1 and about 50% express PUM2 by flow cytometry. The expression pattern of pum2 and dzip1 transcripts was followed during differentiation of adipose derived MSCs into adipocytes. Quantitative PCR analysis showed that mRNA levels of both genes drop during differentiation, showing an opposite pattern to the fabp4 adipocyte marker. The presence of the PUM2 and DZIP1 proteins was confirmed by western blot of total protein extracts of AT derived hMSCs. During cell differentiation, the expression of the protein DZIP1 was constant while PUM2 decreased. The discrepancy between the levels of the dzip1 mRNA and protein suggests a regulated transcriptional and post-transcriptional expression of these genes. DZIP1 and PUM2 in immunofluorescence assays in hMSCs indicated that they are nuclear in freshly plated cells and translocate to the cytoplasm over time. The differentiated cells present the two proteins in the cytoplasm and nucleus. The expression pattern of the dzip1 and pum2 transcripts was also followed in cultures of MSCs derived from AT undergoing intense and reduced cell proliferation. Dzip1 showed no significant changes of expression in both situations. However, the expression of pum2 is higher in hMSCs with intensive proliferation than with reduced proliferation suggesting a possible participation in this process. To pave the way to a better understanding of DZIP1 and PUM2 function in hMSCs, RNA interference experiment are in progress.

Orientador: Carlos Henrique Ribeiro Camargo / Banca: Mabel Mariela Rodríguez Cordeiro / Banca: Bruno das Neves Cavalcanti / Banca: Renata de Azevedo Canevari / Banca: Márcia Carneiro Valera Garakis / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a função da via de sinalização Wnt/β- catenina através dos receptores LRP6 e Frizzled6 na diferenciação de células-tronco de polpa dental de dentes permanentes (DPSC) em células endoteliais. DPSC foram transduzidas com marcadores eGFP e vetores lentivirais shRNA (LRP6, Frizzled6 ou vetor vazio - controle) para os experimentos. Os testes in vitro avaliaram a expressão de GSK3-β e β- catenina por western blot na presença de rhWnt1 e rhVEGF165 e de VEGF e CXCL-8 (IL-8) por ELISA. A expressão de marcadores endoteliais (western blot e PCR) e formação de túbulos capilares foram analisados após a diferenciação endotelial das DPSCs. In vivo, fatias dentárias/matrizes condutivas semeadas com DPSCs-shRNA foram implantadas em subcutâneo de dorso de camundongos imunodeprimidos por 28 dias e o número de vasos sanguíneos foi determinado por imunohistoquímica para eGFP e coloração por HE. β-catenina ativa foi mais expressa em shRNA-LRP6 e shRNA-Frizzled6 que nas células controle, e sua expressão aumentou com a suplementação com rhVEGF165 e rhWnt1. A expressão de GSK3-β fosforilado foi menor, porém também aumenta ou permanece estável com rhVEGF165 ou rhWnt1. Quanto à expressão de VEGF, em shRNA-Frizzled6 foi maior que nas células controle e em shRNA-LRP6 (p<0,05), enquanto que a expressão de IL8 foi menor em shRNA-LRP6, diferindo estatisticamente das outras células. A expressão dos marcadores endoteliais CD31 e VEGFR2 diminuiu nas células shRNA-LRP6, enquanto que em shRNAFrizzled6 a expressão de VEGFR2 foi aumentada. A formação de túbulos capilares de shRNA-Frizzled6 e shRNA-LRP6 foi menor quando comparado ao controle, porém shRNA-Frizzled6 obteve uma tendência de aumento na proliferação de capilares em 144h. In vivo, DPSC-shRNALRP6 apresentou menor número de capilares formados quando comparados com as outras duas... / Abstract: The aim of this study was to evaluate the function of Wnt/β-catenin signaling through LRP-6 and Frizzled-6 receptors in the differentiation of dental pulp stem cells from permanent teeth (DPSC) into endothelial cells. DPSC were transduced with EGFP-tagged lentiviral shRNA vectors (LRP6, Frizzled6 or empty vector - control) for experiments. In vitro assay evaluated GSK3-β and β-catenin expression by western blot in rhWnt1 and rhVEGF165 presence, and VEGF and CXCL-8 (IL-8) expression by ELISA. Endothelial markers expression (western blot and PCR) and tube formation were analyzed after endothelial differentiation of DPSCs. In vivo, tooth slices/scaffolds seeded with transduced DPSCs were implanted subcutaneously in back of immunodefficient mice and blood vessels were counted per immunohistochemistry for eGFP and HE staining. Active β- catenin was more expressed in shRNA-LRP6 and shRNA-Frizzled6 than in control cells, and increased with rhVEGF165 and rhWnt1 supplementation. Phosphorylated GSK3-β expression was lower, however also increased or maintained with rhVEGF165 or rhWnt1. VEGF expression was higher in shRNA-Frizzled6 than in control and shRNA-LRP6 (p<0,05), IL8 expression was lower in shRNA-LRP6, with statistically difference of the others cells. Endothelial markers CD31 and VEGFR2 expression decreased in shRNA-LRP6, but VEGFR2 expression increased in shRNAFrizzled6. shRNA-Frizzled6 and shRNA-LRP6 tube formation was lower when compared to control, however shRNA-Frizzled6 had tendency to increase proliferation in 144h. In vivo, shRNA-LRP6 showed fewer blood vessels formed than other cells (p<0,05). Collectively, the results of this study suggest that Wnt/β-catenin signaling regulates endothelial differentiation of DPSC through LRP6 / Doutor

A terapia celular baseada na utilização de células-tronco mesenquimais (CTMs) tem sido considerada uma estratégia promissora para regenerar o tecido ósseo. Apesar da medula óssea constituir a principal fonte de CTMs, o tecido adiposo tem sido investigado como uma fonte alternativa, devido a maior disponibilidade e facilidade de obtenção dessas células. Porém, as CTMs obtidas de fontes distintas podem exibir diferenças a nível molecular, que ainda não estão esclarecidas pela literatura e que poderiam influenciar o potencial regenerativo dessas células. Assim sendo, o objetivo desse estudo foi comparar os perfis de expressão gênica em larga escala de CTMs isoladas da medula óssea (CTMs-MO) e do tecido adiposo (CTMs-TA) de ratos, e de osteoblastos (OBs) diferenciados a partir dessas células (OBs-MO e OBs-TA, respectivamente). As células foram cultivadas em meio de crescimento para manutenção das características de CTMs ou em meio osteogênico para indução da diferenciação osteoblástica. O RNA total das células foi extraído e a análise genômica foi realizada pela tecnologia de microarray utilizando lâminas Agilent 4x44k. Os perfis de expressão gênica foram analisados pelo software GeneSpring 14.8 GX, considerando o tecido de origem (CTMs-TA vs CTMsMO e OBs-TA vs OBs-MO) e a diferenciação celular (OBs-MO vs CTMs-MO e OBs-TA vs CTMs-TA) como parâmetros de comparação entre os grupos (fold change 2.0; p 0.05). Os dados do microarray foram confirmados por PCR em tempo real para todos os genes de interesse avaliados. Os perfis de expressão gênica entre as CTMs obtidas de fontes distintas (CTMs-TA vs CTMs-MO) e entre os OBs diferenciados a partir destas células (OBs-TA vs OBs-MO) mostraram que as células provenientes da medula óssea apresentaram uma sobreexpressão de genes relacionados à osteogênese enquanto que, as células provenientes do tecido adiposo, uma sobre-expressão de genes relacionados à angiogênese, independente da diferenciação celular. Adicionalmente, as células provenientes do tecido adiposo (CTMs e OBs) apresentaram uma sobre-expressão de genes relacionados à diferenciação adipogênica. Esses resultados, em conjunto, mostraram que as células preservaram características do tecido de origem. As análises comparativas entre as células indiferenciadas e diferenciadas obtidas da mesma fonte (OBs-MO vs CTMs-MO e OBs-TA vs CTMs-TA) mostraram que as CTMs, independente do tecido de origem, apresentaram uma sobre-expressão de genes relacionados com os processos de angiogênese, diferenciação osteoblástica e morfogênese do osso, o que sugere que as CTMs podem estar mais envolvidas com os eventos iniciais que regem o processo regenerativo que os OBs. A análise do dendrograma mostrou que os OBs-TA apresentaram um padrão de expressão gênica mais próximo ao das CTMs, em termos de similaridade e, os OBsMO, um padrão mais distante, o que sugere que os OBs-MO possam ter atingido um estágio de diferenciação celular mais avançado que os OBs-TA. Os resultados mostraram diferenças moleculares entre as populações de células que poderiam implicar em utilizações terapêuticas específicas, sugerindo que as células provenientes do tecido adiposo seriam mais indicadas para terapias angiogênicas enquanto que, as células provenientes da medula óssea, mais indicadas para terapias osteogênicas / Cell therapy based on the use of mesenchymal stem cells (MSCs) has been considered a promising strategy to regenerate bone tissue. Although bone marrow represents the main source of MSCs, adipose tissue has been investigated as an alternative source due to the greater availability and ease of isolation of these cells. However, MSCs obtained from different sources may show differences at the molecular level, which are not yet established in the literature and that could influence the regenerative potential of these cells. Thus, the aim of this study was to compare the large-scale gene expression profiles of MSCs isolated from bone marrow (BMMSCs) and adipose tissue (AT-MSCs) of rats, and of the osteoblasts differentiated from these cells (BM-OBs and AT-OBs, respectively). Cells were cultured in growth medium to maintain the characteristics of MSCs or in osteogenic medium to induction of osteoblastic differentiation. Total RNA was extracted and genomic analysis was performed by microarray technology using Agilent 4x44k slides. The gene expression profiles were analyzed by GeneSpring 14.8 GX software, considering the source (AT-MSCs vs BM-MSCs and AT-OBs vs BM-OBs) and cell differentiation (BM-OBs vs BM-MSCs and AT-OBs vs AT-MSCs) as parameters of comparison between the groups (fold change 2.0; p 0.05). The microarray data were confirmed by real-time PCR for all the interest genes evaluated. The gene expression profiles between the MSCs obtained from different sources (AT-MSCs vs BM-MSCs) and between the OBs differentiated from these cells (AT-OBs vs BM-OBs) showed that the cells from the bone marrow presented an overexpression of genes related to osteogenesis whereas the cells from adipose tissue showed an overexpression of genes related to angiogenesis, independent of cell differentiation. In addition, cells from adipose tissue (MSCs and OBs) showed an overexpression of genes related to adipogenic differentiation. These results, together, showed that the cells preserved characteristics of the source. Comparative analyses between the undifferentiated and differentiated cells obtained from the same source (BM-OBs vs BM-MSCs and AT-OBs vs AT-MSCs) showed that MSCs, regardless of source, showed an overexpression of genes related to the angiogenesis, osteoblastic differentiation and bone morphogenesis process, suggesting that MSCs may be more involved with the early events that govern the regenerative process than OBs. Dendrogram analysis showed that AT-OBs had a gene expression profile closer to MSCs in terms of similarity and the BM-OBs had a more distant profile, suggesting that BM-OBs may have reached a stage of cell differentiation more advanced than AT-OBs. The results showed molecular differences between cell populations that could imply in specific therapeutic uses, suggesting that cells derived from adipose tissue would be better suited for angiogenic therapies, whereas bone marrow cells are more suitable for osteogenic therapies

Orientador: José Luis Laus / Coorientador; Marcela Aldrovani Rodrigues / Banca: João Antonio Tadeu Pigatto / Banca: Bruno Watanabe Minto / Banca: Alexandre Lima de Andrade / Banca: Annelise Carla Camplesi dos Santos / Resumo: Visando ao estudo de técnicas para a expansão "ex-vivo" de células destinadas à reconstrução de superfícies oculares com deficiência de células tronco limbais (LSCD), explantes superficiais obtidos do limbo de coelhos foram cultivados sobre membrana amniótica (MA) humana. Dois grupos, diferindo quanto à configuração do sistema de cultivo celular, foram concebidos: G-mono, contendo células epiteliais expandidas sobre a face de uma camada de MA (sistema de cultivo bidimensional), e G-Sand, composto por células "ensanduichadas" entre duas MAs (sistema de cultivo tridimensional). Seis culturas celulares de cada grupo foram avaliadas por imuno-histoquímica quanto à presença de células progenitoras ou indiferenciadas e a de células em proliferação (avaliação pré-transplante), enquanto 21 foram transplantadas para olhos de coelhos com LSCD (n=10). Os olhos receptores de células cultivadas foram clinicamente avaliados, por até 63 dias. A terapia limbal adotada na pesquisa foi autógena. Após avaliações clínicas, os coelhos foram aleatoriamente distribuídos em parcelas e submetidos à eutanásia, para colheita de córneas (dias 14 e 63 após o transplante) que foram avaliadas quanto à morfometria tecidual e à expressão quali-quantitativa de imunomarcadores de indiferenciação celular (fator de transcrição nuclear delta p63), de proliferação celular (antígeno nuclear da proliferação celular, PCNA) e de apoptose (teste de TUNEL). Diferenças com P < 0.05 foram consideradas significativas. As c... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / In order to study techniques for the ex vivo expansion of cells for the reconstruction ocular surfaces with limbal stem cell deficiency (LSCD), superficial explants obtained from rabbit limbus were cultured on human amniotic membrane (MA). Two groups, differing in the configuration of the cell culture system, were designed: G-mono, containing expanded epithelial cells on an MA layer (two-dimensional culture system), and G-Sand, composed of cells "sandwiched" between two MAs (three-dimensional culture system). Six cell cultures of each group were processed by immunohistochemistry to identify the presence of progenitor or undifferentiated cells and for proliferating cells (pre-transplant evaluation), and 21 constructs were transplanted onto rabbit eyes with LSCD. The limbal therapy adopted in the research was autogenous and the transplanted eyes were clinically evaluated for up to 63 days. After clinical evaluations, the rabbits were randomly distributed into subgroups and submitted to euthanasia, to harvest corneas (days 14 and 63 post-transplant) that were evaluated for tissue morphometry and the qualitative-quantitative expression of imunnomarkers of indiferentiated cells (delta-p63 transcriptional factor), proliferative cells (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) and apoptosis (TUNEL assay). Differences with P <0.05 were considered significant. G-Sand... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A produção de células-tronco induzidas (iPSC) a partir de fibroblasto fetal canino abre caminhos para a obtenção de células pluripotentes e o estudo de sua aplicabilidade para terapias alternativas na medicina veterinária. Neste contexto, este trabalho investigou metodologias adequadas avaliando a eficiência destas, para a produção de células-tronco pluripotentes no modelo canino in vitro (CTE-like), uma vez que a produção de células-tronco embrionárias verdadeiras, cultivadas a partir da MCI de blastocistos, ainda não foi completamente caracterizada em animais domésticos. Os experimentos visaram o aumento do conhecimento de fatores envolvidos no processo de reprogramação em cães, bem como a produção de tais linhagens e sua completa caracterização. No primeiro experimento, foi comparada a infecção retroviral, já padronizada por diversos grupos, com a reprogramação epissomal, inédita para a espécie, na tentativa de induzir células à pluripotência sem a integração viral, e ainda, estratégias para o aumento da eficiência de reprogramação, onde o plasmídeo epissomal foi somado a fatores de transcrição. A reprogramação epissomal gerou colônias quando acrescida do fator c-MYC, que provavelmente, aumentou a proliferação destas células produzindo colônias iPS com morfologia típica e positivas para o teste da fosfatase alcalina. Tais resultados, ainda preliminares pra conclusões, são essenciais para o processo de obtenção de linhagens sem a integração viral, aumentando a aplicabilidade na terapia celular. No segundo experimento objetivou-se avaliar os fatores OCT4 e SOX2 associados a proteínas repórteres. Os fibroblastos que receberam estes fatores, foram analisados por citometria de fluxo, permitindo a avaliação da influência de cada fator no processo de reprogramação, além de permitir a separação (sorting) das células que integraram o gene, aumentando a eficiência de reprogramação e o conhecimento biológico dos mecanismos de integração rastreados por uma proteína repórter. A análise por microscopia de fluorescência revelou que a distribuição de proteínas repórteres foi semelhante entre as duas diferentes construções proteicas e que não se restringe a uma região da célula em particular. OCT4 e SOX2 mostraram uma elevada expressão exógena de cada gene alvo, bem como células dupla positivas. No entanto, nenhuma interação foi observada pelo menos 6 dias após a transdução. O último capítulo experimental descreveu o mecanismo de reprogramação por integração lentiviral para indução da pluripotência em fibroblastos fetais de cão. As linhagens obtidas e completamente caracterizadas neste estudo foram independentes de LIF ou qualquer outra suplementação com inibidores, resistentes ao repique enzimático (Tryple Express), sendo apenas bFGF dependentes. Foram obtidas 66 linhagens clonais, das quais 10 (7 h+mOSKM e 3hOSKM) se mantiveram por 15 ou mais passagens e foram utilizadas para todos os testes de caracterização in vitro, com eficiência máxima de reprogramação de 0,001%. Todas as colônias foram positivas para o teste da fosfatase alcalina, bem como formaram corpos embrióides e se diferenciaram de forma espontânea, além de expressarem altos níveis dos fatores endógenos OCT4 e SOX2. In vivo, as colônias foram capazes de desenvolver tumor 120 dias após a inoculação (confirmado por análise histopatológica) comprovando sua origem predominantemente mesodérmica. A integridade cromossomal das linhagens foi avaliada por hidridização FISH, que não evidenciou qualquer tipo de anomalia. A completa caracterização de tais linhagens, bem como os experimentos não integrativos e com fatores associados a proteínas repórteres, aumentam o conhecimento da tecnologia de reprogramação, estabelecendo novas estratégias para indução da pluripotência de forma mais eficaz e segura para seu uso em testes clínicos e terapia celular / The production of induced pluripotent stem cells (iPSC) from canine fetal fibroblast opens new ways for obtaining pluripotent cells and study its applicability for alternative therapies in veterinary medicine. In this context, this study investigated appropriate methods for producing pluripotent stem cells using a in vitro canine model (ESC-like), so far the production of true embryonic stem cells from ICM cultured blastocysts has not been fully characterized in domestic animals. The experiments aimed at increasing knowledge of the factors involved in reprogramming process in dogs, as well as the production of such strains and complete characterization. In the first experiment, a retroviral infection was compared to episomal reprogramming (never done for this specie) in an attempt to induce cells to pluripotency state without viral integration, also to observe the development of cells receiving separately the episomal plasmid plus transcription factors. The generation of colonies was possible only in the episomal plus c-MYC factor group, leading to increased cell proliferation producing iPS colonies with typical morphology and positive for the alkaline phosphatase detection. These results, so far as preliminary conclusions, are essential to obtaining strains without viral integration, increasing its applicability for clinical cell therapy. In the second experiment, we aimed to evaluate the OCT4 and SOX2 factors associated with fluorescent reporter proteins. These were analyzed by flow cytometry allowing the performance evaluation of each factor on the reprogramming process the fluorescence activated separation of cells containing the integrated gene, increasing the enriching the efficiency of reprogramming. Fluorescence microscopy analysis showed that the distribution of reporter protein was similar between the two different protein structures and not restricted to a particular cell region. OCT4 and SOX2 showed a high exogenous expression of each target gene, and double positive cells. However, no colony formation was observed at least 6 days after transduction. The last experimental chapter aimed to described the reprogramming mechanism of lentiviral integration to induce pluripotency in dog fetal fibroblasts. The lines obtained were fully characterized in this study, showing independency of LIF or any other supplemental inhibitors, resistance to enzymatic process (Tryple Express) and bFGF dependency only. A total of 66 clonal strains were obtained (hOSKM and h+mOSKM) while 10 (7 h+m and 3h) were maintained for 15 or more passages and used for in vitro characterization tests, with maximum efficiency of reprogramming 0.001% . All colonies were positive for the alkaline phosphatase detection, embryoid bodies formation, spontaneously differentiated and expressed high levels of endogenous OCT4 and SOX2. In vivo, the colonies were able to developed tumors 120 days after inoculation (confirmed via histopathology analysis), with predominantly mesodermal tissues. Chromosomal evaluations were made by FISH hybridization showing no chromosomal abnormality in iPSCs canine lines. The fully characterization of such lines as well as non-integrated experiments and factors associated via reporter proteins increases the knowledge of the iPSCs technology, establishing new strategies for more efficient and safe induction of pluripotency for potential use in cell therapy and clinical trials

As células tronco possuem a capacidade de auto renovação ilimitada e de se manterem indiferenciadas durante um período prolongado de tempo, até se diferenciarem em uma linhagem celular específica. Devido as dificuldades encontradas na utilização de células embrionárias por questões éticas, de segurança e histocompatibilidade e a limitada plasticidade das células tronco adultas, as células tronco fetais, derivadas de tecidos extraembrionários, aparecem no cenário terapêutico como uma alternativa promissora. Uma vez que apresentam alta capacidade de proliferação e expansão in vitro, além de sua característica imunogênica, por se encontrarem na interface materno fetal. Por conta destas características, a membrana amniótica surgiu como uma nova e importante fonte de células tronco em diferentes espécies. Neste trabalho, foram utilizados 8 fetos de coelhos para a coleta da membrana amniótica. A membrana foi isolada pela técnica de explante, as amostras foram cultivadas em meio DMEM-HIGH, e posteriormente criopreservadas nas passagens P4 e P8 para realizar os experimentos. Em cultivo, essas células apresentaram aderência a placa, alta capacidade de proliferação e morfologia semelhante à fibroblastos. Na caracterização imunofenotípica, houve expressão de marcadores de citoesqueleto, de células mesenquimais, proliferação, pluripotência e para precursores de células hematopoiéticas, embora não tenha ocorrido a expressão de marcadores de células hematopoiéticas (CD-45) e de células precursoras neuronais. Quando induzidas a diferenciação in vitro, as células amnióticas tiveram capacidade de se diferenciarem nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica. Além disso, quando injetadas em camundongos nude, não foi verificada a formação de tumor. Nossos resultados demostram que células de membrana amniótica de coelho podem ser consideradas células tronco mesenquimais com possibilidade de serem utilizadas no futuro na terapia celular / Stem cells are capable of unlimited self renewal and to remain undifferentiated for a prolonged period of time up to differentiate into a specific cell lineage. Due to the difficulties in the use of embryonic cells due ethical reasons, security and histocompatibility, and in the other hands, the limited plasticity of adult stem cells, fetal stem cells, derived from extraembryonic tissues, appear in the therapeutic setting as a promising alternative. They have high capacity of proliferation and in vitro expansion, as well as immunogenic properties, since they are at the maternal-fetal interface. Due to these characteristics, the amniotic membrane has emerged as an important new source of stem cells in different species. In this work, we used 8 fetuses of rabbits to collect amniotic membrane. The membrane was isolated by the explant technique. Samples were cultured in DMEM-HIGH, and cryopreserved in the passages P4 and P8 in order to perform the experiments. In culture, these cells exhibited adhesion to the dishes, high proliferative capacity and fibroblast-like morphology. In immunophenotypic characterization, there was expression of markers related to cell cytoskeleton, mesenchymal stem cells, proliferation, pluripotency, and hematopoietic precursor cells. And there was no expression of hematopoietic cell markers (CD-45) and neuronal precursor cells. When induced to in vitro differentiation, the amniotic cells were able to differentiate in osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. Furthermore, when injected into nude mice, tumor formation has not been verified. Our results demonstrate that rabbit amniotic membrane cells can be considered mesenchymal stem cells with possibility to be used in the future in cell therapy

Orientador: Reinaldo Marchetto / Coorientador: Gildásio de Cerqueira Daltro / Banca: Ademario Galvão Spínola / Banca: Luis Schiper / Resumo: Pseudoartrose é definida como a ausência de evidências radiográficas do processo de consolidação de uma fratura. Células-tronco, são células com capacidade de proliferar e originar células de qualquer linhagem, formando qualquer tecido do organismo. Estudos com animais demonstraram que o uso de medula óssea contendo células do estroma melhoram os resultados do tratamento das pseudoartroses, mas os dados ainda são experimentais e necessitam de mais testes, com número relevante de pacientes, para demonstrar sua segurança e eficácia. Desta forma, este trabalho objetiva a comparação do método tradicional de tratamento da pseudoartrose da tíbia, realizado com o uso de fixador externo, haste ou placa e parafuso com o tratamento combinado do uso das técnicas convencionais e infiltração de células-tronco mesenquimais autólogas. Para isso, foram feitos ensaios clínicos randomizados, aberto, com cegamento dos grupos experimentais, com 18 pacientes diagnosticados com pseudoartrose divididos em dois grupos: grupo controle, formado por 9 pacientes e grupo experimental, também com 9 pacientes. A idade média do grupo foi de 38,3 anos e a maioria se autodeclarou pardo ou negro. O nível de escolaridade mostrou-se baixo, com 72 % dos participantes não tendo concluído o Ensino Médio. Cinco pacientes foram tratados com uso de haste metálica e apenas três tiveram a colocação de fixador externo. O tempo de doença (pseudoartrose) e o tempo cirúrgico não mostraram influenciar no desfecho. Em relação... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Pseudoarhrosis is defined such as no radiographic evidence during consolidation fracture process. Stem cells are undifferentiated cells, multipotent, capable of proliferating and originating cells of any lineage, forming any tissue of the body. Animal studies have shown that using bone marrow containing stromal cells improves the results of pseudoarthrosis treatment, but the results are still experimental and require further testing with a significant number of patients to demonstrate their safety and efficacy. Thus, this study aims to compare the traditional method of treatment of tibial pseudoarthrosis, performed with the use of external fixator, rod or plate and screw with the combined treatment of the use of conventional techniques and infiltration of autologous mesenchymal stem cells. For this, randomized, open-label clinical trials with blinded experimental groups were performed with 18 patients diagnosed with pseudoarthrosis divided into two groups: a control group consisting of 9 patients and an experimental group, also with 9 patients. The mean age of the group was 38.3 years old and the majority self-declared brown or black. The level of schooling was low, with 72% of the participants not having finished high school. Five patients were treated with metal rod and only three had external fixator placement. Disease duration (pseudoarthrosis) and surgical time did not influence the outcome. Regarding the clinical outcome, patients treated with the combination of convent... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre