Orientador: Sandra Helena Penha de Oliveira / Resumo: O remodelamento ósseo é um processo complexo que depende do balanço entre formação e reabsorção óssea, mecanismo regulado pelas células ósseas e fatores sistêmicos, como o Sistema Nervoso Simpático (SNS). Os mediadores deste sistema são capazes de regular o metabolismo ósseo através dos receptores adrenérgicos expressos na superfície dos osteoblastos. Entretanto, o papel dos receptores β-adrenérgicos ainda não está totalmente elucidado no processo de diferenciação osteogênica. Objetivos: avaliar o papel dos receptores β-adrenérgicos na diferenciação osteoblástica de células tronco mesenquimais da medula óssea de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (SHR). Métodos: Ratos machos Wistar e SHR (10 semanas) foram utilizados para a coleta da medula óssea a partir do fêmur, as quais foram plaqueadas em garrafas de cultivo celular e depois em placas de 24 poços, onde receberam o meio osteogênico (MO: MEM, mais 50 µg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de β-glicerofosfato e 10-8 M de dexametasona), e o tratamento com Isoprenalina (0,01 µM), Carvedilol (1 µM), antagonista adrenérgico não seletivo, ou Nebivolol (0,1 µM), antagonista β1-adrenérgico. O ensaio de proliferação celular (MTT) e a atividade de fosfatase alcalina (Fal) foram realizados nos dias 7, 10 e 14. A mineralização foi avaliada no dia 14 através do vermelho de Alizarina. A expressão gênica dos marcadores osteogênicos e dos receptores β1 e β2 adrenérgicos foi avaliada no dia 7 por RT-PCR em tempo real. A atividade pro... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000425136-Texto+Completo-0.pdf: 6824100 bytes, checksum: a0f00fc5697ef7ef0055b9577b7dbbbe (MD5) Previous issue date: 2010 / Type I diabetes mellitus (DM1) is an organ-specific autoimmune syndrome characterized by the selective destruction of insulin-producing β cells in the pancreatic islets. The search for therapeutic alternatives for DM1, the β cell mass and consequently the reconstitution of physiological secretion of insulin have been extensively done. Among different treatments strategies studied, cell therapy based on mesenchymal stem cells is one of the most extensively studied. Searching for a product that mimics qualitative and quantitatively the characteristics of pancreatic β cells, protocols must be improved and the capacity of (trans) differentiation of new sources of tissue-specific must be explored. In this way, the aim of this work was to compare the capacity of expansion and differentiation in vitro of murine mesenchymal stem cells, isolated from kidney, pancreas and bone marrow, evaluating its capacity of differentiation into insulin-producing cells (IPCs). From the results, it was evident that these cell populations were able to (trans) differentiate into the pancreatic endocrine cell-like phenotype. When cultured in vitro in a rich inducing-media, cells were characerized by cluster formation with spherical morphology, positive dithizone staining and expression of insulin-1 at the mRNA and protein level. Moreover, IPCs derived from mesenchymal stem cells reversed the pancreatic hyperglycemic state when transplanted into the kidney capsule of chemically induced diabetic mice, indicating that in vitro they are able to differentiate into functional IPCs. / O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma síndrome auto-imune órgão-específica caracterizada pela destruição seletiva de células β produtoras de insulina nas ilhotas pancreáticas. A busca por alternativas terapêuticas para o DM1, voltadas à preservação e/ou regeneração da massa de células β e, consequentemente, à reconstituição do padrão fisiológico de secreção de insulina, tem sido exaustivamente realizada. Dentre as estratégias de tratamento estudadas, destaca-se a terapia celular baseada na utilização de células-tronco mesenquimais. Na busca por um produto que mimetize qualitativamente e quantitativamente as características das células β pancreáticas, protocolos devem ser aperfeiçoados e a capacidade de (trans)diferenciação de novas fontes celulares tecido-específicas devem ser exploradas. Assim, o objetivo deste trabalho foi comparar a capacidade de expansão e diferenciação in vitro de células-tronco mesenquimais murinas, isoladas do rim, pâncreas e medula óssea, avaliando sua capacidade de diferenciação em células produtoras de insulina. Evidenciou-se que estas populações celulares são capazes de se (trans) diferenciar em células com fenótipo pancreático endócrino, quando cultivadas em meio rico em indutores, incluindo morfologia esférica, formação de clusters, secreção de insulina (com a conseqüente coloração positiva para ditizona) e expressão in vitro do gene e da proteína da insulina-1. Além disso, células produtoras de insulina (CPIs) derivadas de células-tronco mesenquimais pancreáticas reverteram o estado hiperglicêmico quando transplantadas em cápsula renal de camundongos diabéticos, indicando que são capazes de diferenciarem-se in vitro em CPIs funcionais e de manterem esta funcionalidade in vivo.

A medicina regenerativa é um campo fascinante e tem chamado a atenção, nos últimos anos, pelo crescente esforço multidisciplinar em busca de metodologias adequadas para a reposição de tecidos danificados no corpo humano. Entre as técnicas utilizadas para desenvolver matrizes para o uso em engenharia tecidual está o electrospinning. Essa técnica que permite a produção de nanofibras através do uso de forças electrostáticas e tem sido empregado para a produção de matrizes fibrosas. As células-tronco mesenquimais (CTM) são células-tronco adultas com alta plasticidade e por isto alvo de muitos estudos terapêuticos. O presente trabalho foi dividido em dois capítulos sendo que cada um tratou de um objetivo, como segue: (1) cultivar e diferenciar células-tronco mesenquimais em matrizes de nanofibras de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) produzidas através da técnica de electrospinning e investigar o envolvimento de receptores integrina- 1 no processo de adesão em matrizes de PLGA; (2) avaliar a viabilidade celular de células-tronco mesenquimais ou células mononucleares (CMNs) misturadas a uma solução de poli(álcool vinílico) (PVA) e submetidas a produção de fibras por electrospinning. No capítulo I, as CTM foram isoladas de camundongos da linhagem C57BL/6, cultivadas e submetidas a diferenciação condrogênica em matrizes de nanofibras de PLGA produzidas por electrospinning. Análises realizadas 24 horas após a semeadura demonstraram que as CTM eram responsívas e apresentavam morfologia semelhante a de fibroblastos com a presença de fibras de estresse de actina. O bloqueio dos receptores integrina- 1 reduziu (em cerca de 20%) a adesão celular e as observações demonstraram a perda das fibras de estresse de actina. Estes resultados demonstraram a habilidade das nanofibras de PLGA em ativar respostas celulares mediadas por adesão via integrina. No capítulo II foi avaliada a viabilidade de CTM e CMNs após terem sido processadas pelo electrospinning. As CTM foram extraídas da parede de cordão umbilical e as CMNs do sangue de cordão umbilical. Ambas as células foram misturadas a uma solução de PVA 10% e esta suspensão foi utilizada para produzir fibras pelo processo de electrospinning durante 30 minutos utilizando-se uma voltagem de 21 kV. Após o procedimento a viabilidade celular foi mensurada através de contagem celular com exclusão de células mortas por coloração com Trypan Blue. As CTM tiveram a viabilidade reduzida para 19.6%, e as CMNs para 8.38%. Os dados coletados sugerem a necessidade de mais estudos na busca de estratégias de proteção celular durante o electrospinning, uma vez que a elevada perda da viabilidade celular pode estar relacionada à alta viscosidade da solução polimérica, levando a redução do acesso ao meio nutritivo, associada aos efeitos do estresse mecânico e elétrico inerentes do procedimento. Os resultados gerais destes capítulos (1) demonstraram a habilidade das matrizes de nanofibras de PLGA em ativar respostas celulares via receptores integrinas- 1; (2) sugerem que a incorporação de células em matrizes fibrosas durante a produção de fibras através da técnica de electrospinning é um procedimento viável e pode ser utilizado como estratégia para a melhor distribuição celular na matriz formada. Juntamente, estes dados contribuem para o entendimento do comportamento das CTM em matrizes biodegradáveis e biocompatíveis produzidas por electrospinning, as quais podem ser utilizadas como material carreador em tratamentos clínicos envolvendo transplante celular. / Regenerative medicine is an amazing field that has called attention, in the last years, due to the multidisciplinary efforts to find suitable methodologies to regenerate damage tissues. Electrospinning is an important technique used to produce nanofibers and is employed to develop fibrous scaffolds. Mesenchymal stem cells (MSC) are adult stem cells with high plasticity and, for this reason, are widely studied in therapeutic approaches. The present study is composed by two chapters, with different aims, as follow: (1) culture MSC on poly(D, Llactide- co-glycolide) (PLGA) nanofiber scaffolds and induce them to condrogenic differentiation and, analyze the influence of the integrin- 1 receptor in the adhesion of MSC on PLGA scaffolds; (2) analyze the viability of MSC and mononuclear cells (MNCs) mixed to a PVA solution after electrospinning. In the Chapter I, MSCs were isolated from C57BL/6 mice, cultured on PLGA scaffold produced by electrospinning technique and differentiated into chondrogenic lineage. After seeding, MSCs were responsive and become flattened with fibroblast-like morphology demonstrated by the presence of actin stress fibers. Integrin- 1 receptor blockage reduced (about 20%) cell adhesion with loss of actin stress fibers, demonstrating the ability of PLGA nanofiber to trigger integrin receptor-mediated cell adhesion. In the Chapter II, the viability of MSC and MNC after electrospinning were analyzed. MSC were extracted from the wall of the umbilical cord, and MNC from the umbilical cord blood. Cells were resuspended in a solution of poly(vinil alcohol) (PVA) 10% and subjected to electrospinning during 30 minutes under a voltage of 21kV. Cell viability was assessed before and after the procedure by exclusion of dead cells by Trypan Blue staining. After electrospinning the MSC viability reduced to 19.6%, and the MNCs viability to 8.38%. These data suggest the need for more investigations looking for strategies to protect cell from the damages caused by electrospinning, as the loss of viability can be related to the high viscosity of the polymeric solution which reduced the access to nutrients associated to the electric and mechanical stress during electrospinning. The results of both chapters (1) demonstrated the ability of PLGA nanofiber to trigger integrin receptor-mediated cell adhesion; (2) suggested that the cellular incorporation into fibrous scaffolds produced by electrospinning is a viable process and can be used to improve the cellular distribution into scaffolds. The present data contribute to the understanding of MSCs´ behavior on these biodegradable and biocompatible scaffolds that can be used as carriers in treatments involving cell transplantation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T17:13:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 293140.pdf: 2869221 bytes, checksum: afc89617168db8d6bb0fad6205bad8a8 (MD5) / Apesar do recente avanço e evolução no desenvolvimento de medicamentos cada vez mais específicos para o tratamento de neoplasias, continuam sendo observados e relatados efeitos inespecíficos destes agentes, que além de atuar nas células neoplásicas exercem efeitos em células normais. O Mesilato de Imatinibe (MI) foi racionalmente desenvolvido para inibir a atividade de proteínas e receptores do tipo tirosinoquinase, especialmente a proteína BCR-ABL anômala característica da leucemia mielóide crônica (LMC). As células-tronco mesenquimais (CTM) compõem o microambiente hematopoiético (MH), com função de suporte e regulação da hematopoese, sendo células precursoras de outras células que também constituem o MH, como os fibroblastos, adipócitos e osteoblastos. Estudos relataram efeitos citotóxicos de diferentes agentes quimioterápicos nas CTM, porém, os efeitos que o MI exerce nesta população de células ainda são desconhecidos. O objetivo do trabalho foi avaliar, in vitro, os efeitos do MI em CTM normais isoladas da placenta humana. Aplicamos um protocolo de cultivo celular de CTM, expondo as mesmas a diferentes concentrações do MI e avaliamos parâmetros como viabilidade celular, proliferação, morfologia, diferenciação e morte celular. Também foi avaliada a expressão de marcadores de células indiferenciadas (Oct-4 e Nanog) e da molécula de matriz extracelular fibronectina. Inicialmente, caracterizamos as células isoladas da placenta humana como CTM, de acordo com características morfológicas, fenotípicas e um painel de expressão imunofenotípica preconizados para este tipo celular. O MI exerceu efeito citotóxico nas CTM a partir da concentração de 1,0 µM, com valor de IC50 de 8,7 µM. A maioria das células expostas ao medicamento demonstrou morfologia alterada em comparação com as células normais e fibroblastóides do grupo controle. O MI reduziu a taxa de proliferação das CTM de modo concentração-dependente nos diferentes tempos de exposição testados. Nos ensaios de diferenciação celular, observamos que o medicamento estimulou a diferenciação das CTM para os fenótipos osteogênico e adipogênico. Com a análise da expressão de Nanog e Oct-4, observamos que, nas menores concentrações do MI (2,5 e 5,0 µM), as células indiferenciadas são mais resistentes aos efeitos do MI quando comparadas a células possivelmente já diferenciadas. A expressão imunocitoquímica de fibronectina também foi reduzida pelo MI. Na avaliação do processo de morte celular observado nos primeiros experimentos, indicamos que este mecanismo foi provavelmente por apoptose, devido à maior quantidade de núcleos picnóticos nas CTM expostas ao MI e também pela captação do corante brometo de etídio. É importante ressaltar que todos os efeitos observados, principalmente nos ensaios quantificados, foram classificados como concentração-dependente. Estes resultados confirmam o efeito do MI em CTM normais, o que pode representar danos até mesmo irreversíveis no MH de pacientes que utilizam o medicamento por período prolongado. Estes dados indicam a necessidade do desenvolvimento de medicamentos mais específicos para o tratamento das diferentes neoplasias que acometem a população.

Resumo não disponível.

A terapia celular utilizando células tronco mesenquimais (MSC) derivadas da medula óssea surge como uma alternativa para o tratamento das doenças neurodegenerativas. Apesar dos resultados positivos com o uso dessas células nos ensaios pré-clínicos e clínicos após a isquemia cerebral, seus efeitos colaterais e seu mecanismo de ação permanecem desconhecidos. Os benefícios alcançados após a terapia celular para o tratamento da isquemia não são atribuídos à diferenciação dessas células em novos neurônios, mas sim aos fatores que elas podem secretar. Na tentativa de compreender como os fatores secretados pelas MSC podem influenciar o tecido hipocampal que sofreu ou não privação de oxigênio e glicose (POG) e como os fatores liberados pelo tecido lesionado podem atuar sobre as MSC, nós utilizamos culturas organotípicas de hipocampo expostas ao meio condicionado pelas MSC e MSC expostas ao meio condicionado pelas culturas organotípicas de hipocampo expostas à POG. Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que o meio condicionado pelas MSC é tóxico para as culturas organotípicas de hipocampo, induzindo morte celular especificamente nas regiões do Corno de Ammon (CA) e agravando a lesão causada pela POG. Essa toxicidade parece ser específica das MSC, uma vez que o meio condicionado por outros tipos celulares não tem o mesmo efeito. As MSC isoladas tanto de rato como de camundongo e tanto de medula óssea como de pulmão induzem a morte celular de uma maneira semelhante, sugerindo que o efeito não é espécie ou órgão específico. Ainda, nós observamos que os fatores secretados pelas MSC ativam a microglia e os astrócitos, induzindo a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o aumento da iNOS e um aumento de IL-6 e TNFα nas culturas organotípicas. O efeito tóxico do meio condicionado pelas MSC pode ser atenuado por antioxidantes, anti-inflamatórios, antagonistas NMDA e AMPA, bloqueadores de canal de cálcio dependentes de voltagem e por agonista GABA. Quando as MSC foram analisadas após a sua exposição ao meio condicionado pelo tecido hipocampal lesionado, nós não observamos morte celular ou mudanças morfológicas aparentes nessas células após 24 h de exposição ao meio. Surpreendentemente, as MSC aumentaram a proliferação quando expostas ao meio condicionado pelo hipocampo lesionado, não apresentando nenhum marcador neural após 72 h em contato com esse meio condicionado. Em conjunto, nossos resultados mostram um possível efeito adverso de fatores secretados pelas MSC, introduzindo uma nota de cautela na utilização dessas células. / Cell therapy using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) seems to be a new alternative for the treatment of neurodegenerative diseases. In spite of several good and promising results with the use of these cells in preclinical and clinical studies after stroke, their side effects and their mechanism of action are still unknown. The benefits reached after cell therapy to treat stroke are not attributed to the differentiation of the cells in new neurons, but to the factors that these cells can secrete. In an attempt to understand how MSC secreted factors can influence the hippocampal tissue that suffer or not from oxygen and glucose deprivation (OGD) and how the factors secreted from the injured hippocampus can influence MSC behavior, we used organotypic hippocampal slice cultures exposed to MSC conditioned medium and MSC exposed to organotypic hippocampal cultures conditioned medium. The results obtained in this work show that MSC conditioned medium is toxic to organotypic hippocampal slice cultures, inducing cell death specifically in the CA (Cornus Ammonis) region of hippocampus and aggravating the lesion induced by OGD. This toxicity seems to be specific to MSC, once the medium conditioned by other cell types do not induce cell death. Also, MSC isolated from rat or mice and from bone marrow and lungs induce cell death in a similar manner, suggesting that the effect is not organ- or specie- specific. In addition, we have observed that MSC secreted factors activate microglia and astrocytes, inducing reative oxygem species (ROS) generation and iNOS, TNFα and IL-6 increase in organotypic cultures. The MSC conditioned medium-induced toxic effect can be attenuated by antioxidants, antiinflammatory drugs, NMDA and AMPA antagonists, Ca2+ voltage-dependent channel blockers and GABA agonist. When MSC behavior was investigated after these cells were exposed to the conditioned medium from the lesioned hippocampus, we observed that these medium is not able to induce cell death or any apparent change in MSC morphology after a 24 h exposure period. Surprinsingly, MSC increase proliferation in response to the conditioned medium from the injured hippocampal tissue, do not presenting any neural marker after 72 h of contact with this medium. Taken together, our results show a possible side effect of MSC secreted factors, introducing a note of caution in the use of these cells.

OBJETIVO: Examinar o efeito do meio condicionado da linhagem HepG2 nas célulastronco mesenquimais in vitro no que se refere à sua diferenciação em hepatócito. MATERIAIS E MÉTODOS: As CTM foram isoladas da medula óssea de ratas Wistar combinando a centrifugação por gradiente de densidade e a aderência à superfície de cultivo. As CTM foram cultivadas em meio de diferenciação osteogênico e adipogênico e coradas com Alizarin Red S e Oil Red-O respectivamente. Para induzir a diferenciação hepática, CTM foram cultivadas com 70% de meio condicionado de HepG2 ou com 50 ng/mL de fator de crescimento de hepatócito (HGF) durante 3 semanas. Foram realizadas RT-PCR e analises imunocitoquímica para marcadores de células-tronco (Thy-1) e marcadores hepáticos como ALB, AFP, CK-8 e CK-18. Adicionalmente foram realizadas colorações de Oil Red-O em CTM tratadas com meio condicionado de HepG2. RESULTADOS: Combinando a centrifugação por gradiente de densidade com a aderência à superfície de contacto, isolamos uma população homogênea de CTM nas quais as colorações de Alizarin Red S e Oil Red-O foram positivas quando tratadas. Logo de 3 semanas de tratamento, com meio condicionado de HepG2 ou HGF, não foram observados câmbios morfológicos nem expressão gênica (RT-PCR ou análise imunocitoquímica) para proteínas hepáticas (AFP, ALB, CK8 e CK18). A expressão de Thy-1 foi positivo antes e depois do tratamento em ambos grupos. Surpreendentemente as CTM tratadas com meio condicionado de HepG2 apresentaram acúmulos de lipídeos perinucleares corados com Oil Red-O. Estes acúmulos de gordura foram distintos às observados nas CTM tratadas com meio adipogênico, mas seu fenótipo foi similar às células HepG2 quando coradas com o mesmo método. CONCLUSÕES: Apesar de que o meio condicionado de HepG2 não foi capaz de induzir a diferenciação de CTM a hepatócitos, ele tem algum efeito sobre as CTM conduzindo a um fenótipo que se assemelha a uma esteatose microgoticular. / AIM: In the present study, we examined the effect of conditioned medium from the HepG2 cell line upon mesenchymal stem cells and their ability to differentiate into hepatocyte-like cells in vitro. METHODS: MSCs were isolated from bone marrow of Wistar rats by combining gradient density centrifugation with plastic adherence. The cells were cultured in osteogenic or adipogenic differentiation medium and analyzed by Alizarin Red S and Oil Red-O staining. To induce hepatic differentiation, MSC were cultured with 70% of HepG2-CM or with 50 ng/mL hepatocyte growth factor (HGF) for 3 weeks. RT-PCR and immunocytochemistry analysis for the stem cell marker Thy-1 and hepatic markers, ALB, AFP, CK-8 and CK-18 were performed. In addition, Oil Red-O and Alizarin Red S staining were also performed in the MSC treated with HepG2-CM. RESULTS: By combining gradient density centrifugation with plastic adherence, we isolated a homogeneous population of MSC and differentiated them into osteocytes and adipocytes. After 3 weeks of treatment no changes in morphology were observed in either group (HepG-CM or HGF). RT-PCR and antibody staining for hepatic proteins (AFP, ALB, CK8 and CK18) were also negative. Expression of Thy-1, a marker of mesenchymal stem cell was positive both before and after treatment in both groups. Surprisingly MSC treated with HepG2-CM for 3 weeks presented lipid droplets that were stained with Oil Red-O. These droplets were very distinct from the ones observed in MSC treated with adipogenic medium but resembled those seen in HepG2 cells stained by the same method. CONCLUSIONS: However, HepG2-CM was not able to induce differentiation of MSC in a hepatocyte-like, they had an effect upon MSC leading to a phenotype resembling mild steatosis.

Submitted by PMBqBM null (pmbqbm@ufba.br) on 2017-03-28T14:02:01Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Brysa Mariana Dias Silveira_PMBqBM-UFBA.pdf: 10348506 bytes, checksum: 834113d4760fa2ead263f8a996b57e9c (MD5) / Approved for entry into archive by Uillis de Assis Santos (uillis.assis@ufba.br) on 2017-03-28T14:07:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Brysa Mariana Dias Silveira_PMBqBM-UFBA.pdf: 10348506 bytes, checksum: 834113d4760fa2ead263f8a996b57e9c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T14:07:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Brysa Mariana Dias Silveira_PMBqBM-UFBA.pdf: 10348506 bytes, checksum: 834113d4760fa2ead263f8a996b57e9c (MD5) / FAPESB / O transplante de ilhotas pancreáticas é uma alternativa promissora no tratamento do Diabetes Tipo 1. Entretanto, após o isolamento há perda de uma massa considerável da amostra, prejudicando o sucesso do transplante. O co-cultivo de células tronco mesenquimais , com ilhotas pancreáticas contribui para a melhoria da qualidade do enxerto. O objetivo do trabalho foi a avaliação in vitro do potencial angiogênico do meio condicionado (MC)de células tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTMAD), por meio da revascularização e aumento da viabilidade das ilhotas pancreáticas. As células obtidas de 8 amostras de lipoaspirado foram caracterizadas (citometria de fluxo) e testadas quanto ao potencial multilinhagem. Para avaliação do potencial angiogênico , coletou-se MC em normóxia e hipóxia. Utilizou-se modelo com HUVEC para ensaio de migração e proliferação celular e ilhotas de ratos para análise da viabilidade intra ilhota. Análise proteômica foi realizada para avaliação da qualidade do MC. Dados obtidos demonstraram que HUVEC cultivadas na presença dos MC apresentaram aumento da capacidade proliferativa, migratória e redução do índice de apoptose. O MC em normóxia demonstrou maior capacidade angiogênica (p<0.001) e proliferativa (p<0.05) comparado ao MC em hipóxia. Ambos os MC estimularam a migração celular (p<0.01) e induziram a expressão da proteína Akt fosforilada em HUVEC. A presença de fatores de crescimento nos MC deu suporte aos efeitos observados no estudo. Desta forma, pode-se concluir que os MCde CTM-AD apresentam grande potencial para manutenção da integridade de ilhotas pancreáticas recém isoladas, devido aos seus efeitos protetor e angiogênico. / The islet transplantation is a promising alternative in the treatment of Diabetes Type 1. Nevertheless, after isolation there is loss of a part sample, hurting transplant sucess. Co-cultivation of mesenchymal stem cells with pancreatic islets contributes to improving the quality of the graft. The objective of this study was to evaluate in vitro angiogenic potential CM from MSC-AT through revascularisation and increase the viability of pancreatic islets. The cells obtained from 8 lipoaspirate samples were characterized (flow cytometry) and tested for multilineage potential. To evaluate the angiogenic potential, was collected CMs in normoxia and hypoxia. HUVEC model were used to migration and proliferation cell assay and rat islets for analysis intra islet viability. Proteomic analysis was performed to evaluate the CM quality. Results obtained showed that HUVEC cultured with CMs exibith increased proliferative, migratory capacity and reduced apoptosis index. CM in normoxia showed greater angiogenic capacity (p <0.001) and proliferative (p <0.05) compared to the CM in hypoxia. Both CM stimulated cell migration (p <0.01) and induced expression of the phosphorylated Akt protein on HUVEC. The presence of growth factors in CM gave support to the effects seen in this study. Thus, one can conclude that MSC-AT CM have great potential for maintaining the integrity of freshly isolated pancreatic islets due to its protective and angiogenic effects.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-05-29T15:33:48Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Brysa Mariana Dias Silveira.pdf: 10348506 bytes, checksum: 834113d4760fa2ead263f8a996b57e9c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-29T15:33:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Brysa Mariana Dias Silveira.pdf: 10348506 bytes, checksum: 834113d4760fa2ead263f8a996b57e9c (MD5) / FAPESB / O transplante de ilhotas pancreáticas é uma alternativa promissora no tratamento do Diabetes Tipo 1. Entretanto, após o isolamento há perda de uma massa considerável da amostra, prejudicando o sucesso do transplante. O co-cultivo de células tronco mesenquimais , com ilhotas pancreáticas contribui para a melhoria da qualidade do enxerto. O objetivo do trabalho foi a avaliação in vitro do potencial angiogênico do meio condicionado (MC)de células tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTMAD), por meio da revascularização e aumento da viabilidade das ilhotas pancreáticas. As células obtidas de 8 amostras de lipoaspirado foram caracterizadas (citometria de fluxo) e testadas quanto ao potencial multilinhagem. Para avaliação do potencial angiogênico , coletou-se MC em normóxia e hipóxia. Utilizou-se modelo com HUVEC para ensaio de migração e proliferação celular e ilhotas de ratos para análise da viabilidade intra ilhota. Análise proteômica foi realizada para avaliação da qualidade do MC. Dados obtidos demonstraram que HUVEC cultivadas na presença dos MC apresentaram aumento da capacidade proliferativa, migratória e redução do índice de apoptose. O MC em normóxia demonstrou maior capacidade angiogênica (p<0.001) e proliferativa (p<0.05) comparado ao MC em hipóxia. Ambos os MC estimularam a migração celular (p<0.01) e induziram a expressão da proteína Akt fosforilada em HUVEC. A presença de fatores de crescimento nos MC deu suporte aos efeitos observados no estudo. Desta forma, pode-se concluir que os MCde CTM-AD apresentam grande potencial para manutenção da integridade de ilhotas pancreáticas recém isoladas, devido aos seus efeitos protetor e angiogênico.

Submitted by PMBqBM null (pmbqbm@ufba.br) on 2017-05-24T11:48:23Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Tiago Oliveira Ribeiro_PMBqBM-UFBA.pdf: 3905396 bytes, checksum: 787178064bf80c2b44514b51172abf04 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-03T14:40:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Tiago Oliveira Ribeiro_PMBqBM-UFBA.pdf: 3905396 bytes, checksum: 787178064bf80c2b44514b51172abf04 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-03T14:40:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Tiago Oliveira Ribeiro_PMBqBM-UFBA.pdf: 3905396 bytes, checksum: 787178064bf80c2b44514b51172abf04 (MD5) / FAPESB / O diabetes mellitus têm se configurado como uma grave doença que acomete aproximadamente 415 milhões de pessoas no mundo. O transplante de ilhotas pancreáticas surge como uma alternativa terapêutica para esta doença. No entanto, a viabilidade reduzida das ilhotas após o isolamento, e a perda dos capilares sanguíneos que irrigam as ilhotas acarreta uma diminuição na sobrevivência das células e a rejeição imunológica ao enxerto. As células tronco mesenquimais (CTMs) surgem como uma opção interessante devido a sua capacidade de promover a vascularização por meio da liberação de fatores de crescimento e citocinas próangiogênicas. O objetivo desde estudo foi monitorar in vitro o potencial angiogênico do meio condicionado (MC) de CTMs provenientes de medula óssea sobre células endoteliais visando aperfeiçoar a revascularização e a viabilidade de ilhotas pancreáticas humanas. As CTMs de medula óssea foram caracterizadas pela expressão de marcadores moleculares, potencial de multi-linhagem e dobramento populacional. O MC de CTMs promoveu a migração, proliferação, viabilidade e angiogênese de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). O MC ativou a via de sinalização PI3K/Akt em HUVECs. PCR quantitativo em tempo real e array do perfil proteômico do MC demostraram que as células tronco expressam e secretam diversos fatores tróficos e citocinas sob condições de hipóxia. Ensaios in vitro demonstraram que o MC promoveu um aumento na viabilidade das ilhotas, assim como na manutenção da expressão de insulina e de CD31 nas células endoteliais intra-ilhotas. Com estes dados nós concluímos que o MC das CTMs em hipóxia demonstrou potencial angiogênico e contribuíram para a manutenção da viabilidade das ilhotas pancreáticas através da presença de fatores protéicos solúveis. Ainda, estes efeitos foram mediados através da via de AkT nas células endoteliais. Nossos dados corroboram o uso de MC de CTM para otimizar o transplante de ilhotas pancreáticas. / Diabetes mellitus has been characterized as a serious disease that affects approximately 415 million people worldwide. The islet transplantation emerged as an alternative treatment for diabetes. However, the reduced islet cell viability after the isolation and the loss of islet vasculature cause a decrease in the survival of the cells and the immunological graft rejection. Mesenchymal stem cells (MSCs) appear as an interesting option to reduce barriers for this therapy due to its ability to promote vascularization through the release of growth factors and pro-angiogenic cytokines. The goal of this study was investigate in vitro the angiogenic potential of contidioned medium derived from bone marrow on endothelial cells aiming to improve revascularization and viability of human pancreatic islets. MSCs from bone marrow was characterized by the expression of molecular markers, multi-lineage potential and population doubling. MSC derived conditioned medium showed ability to promote migration, proliferation, viability and angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Conditioned Medium activated the PI3K/Akt signaling pathway in HUVECs. q-PCR and proteome profiler array of conditioned medium fractions showed that the stem cells expressed and secrete several trophic factors and cytokines under hypoxic conditions. Insights in vitro proposed that conditioned medium promoted an increase in islet viability as well as increased in insulin secretion and maintenance of intra-islet endothelial cells. With this information we conclude that CM from MSCs in hypoxia showed angiogenic potential and contributed to maintaining the viability of pancreatic islets by the presence of soluble protein factors. Furthermore, these effects were mediated by Akt pathway in endothelial cells. Our data support the use of CM from CTM to optimize islet transplantation.