INTRODUÇÃO: Este estudo teve por objetivo investigar o efeito da injeção periuretral de células mononucleares derivadas de músculo estriado esquelético (CMDME) e a incorporação dessas células no esfíncter urinário de ratas, em modelo animal de incontinência urinária. MÉTODOS: As CMDMEs, foram isoladas de músculos dos membros pélvicos de ratos endogâmicos Whistar-Kyoto (WKY), machos. Os músculos foram submetidos à dissociação enzimática, seguida de isolamento das células mononucleares, sem necessidade de cultura e/ou expansão. A deficiência esfincteriana foi criada por uretrolise cirúrgica em 20 ratos endogâmicos WKY, fêmeas. Uma semana após, foi realizada a injeção periuretral de 1 x 106 de células, em 10 ratas (grupo CMDME), e 10 ratas receberam injeção de SF a 0,9% (grupo SF). Dez animais foram submetidos à cirurgia Sham e serviram como controle (grupo SHAM). Quatro semanas após a injeção, os ratos foram sacrificados, e as uretras, removidas. A incorporação das CMDMEs masculinas, na uretra feminina, foi confirmada pela detecção do cromossomo Y, através da hibridização in situ fluorescente. A porção média da uretra de cada animal foi processada para coloração pela hematoxilina-eosina e tricrômio de Masson e também imuno-histoquímica para actina e miosina. Usando software digital (Image Pro Plus 6.0), calcularam-se a proporção músculo/tecido conectivo e a proporção de actina e miosina em cada amostra de uretra, sendo as proporções comparadas entre os grupos. As mudanças morfométricas da uretra de cada animal, de cada grupo, foram avaliadas medindo-se o maior e o menor diâmetro da uretra e a espessura média da parede, utilizando software digital (Image J); áreas fracionais da luz, mucosa e camada muscular da uretra foram estimadas usando o método de contagem de pontos. RESULTADOS: No grupo CMDME, houve espessamento das camadas da musculatura lisa e estriada, e menor depósito de tecido conectivo, em relação aos animais do grupo SF. Uma diminuição da proporção músculo/tecido conectivo foi observada no grupo SF, em comparação ao grupo CMDME, e também em relação ao grupo SHAM (0,51 ± 0,28; 1,62 ± 0,53 e 2,27 ± 1,15, respectivamente, p < 0.001). A proporção de actina estava diminuída no grupo SF, em comparação com o grupo CMDME, e com o grupo SHAM (0,18 ± 0,04; 0,27 ± 0,02 e 0,27 ± 0,03, respectivamente, p < 0,001) sendo também observada esta diminuição na proporção de miosina (0,07 ± 0,01; 14 ± 0,02 e 0,15± 0,03, respectivamente, p < 0,001). Não houve diferença entre os grupos SF, CMDME e SHAM em relação ao diâmetro da uretra, espessura da parede uretral e áreas fracionais da luz, mucosa e parede muscular uretral. CONCLUSÕES: As CMDMEs foram incorporadas na uretra do grupo CMDME. Nestes animais, houve diminuição de tecido conectivo e aumento da quantidade de músculo liso e esquelético. As CMDMEs foram facilmente obtidas, sem necessidade de expansão celular, com pequeno tempo de preparo / INTRODUCTION: This study investigated the effect of periurethral injection of skeletal muscle-derived mononuclear cells (SMDMCs) into the urethral sphincter in an animal model of stress urinary incontinence (SUI). METHODS: SMDMCs were isolated from the hind limb muscles of male Wistar-Kyoto (WKY) isogenic inbred rats. The muscles were enzymatically dissociated, and SMDMCs were directly isolated without the need for culture or expansion. Urinary sphincter deficiency was created by surgical urethrolysis in 20 female WKY rats. One week later, 10 rats received an injection of 1 x 106 cells (SMDMC group) and 10 rats received saline injections (Saline group). In addition, 10 rats were subjected to sham surgery (Sham group). Four weeks later, the rats were euthanized and their urethras harvested. The incorporation of male SMDMC in the female urethras was confirmed by the detection of Ychromosomes by fluorescence in situ hybridization (FISH). In addition, hematoxylin and eosin (H&E) and Masson\'s trichrome staining, as well as immunohistochemistry analyses to actin and myosin were performed. Using digital software (Image Pro Plus 6.0), the muscle to connective tissue, actin and myosin ratios were calculated. A urethral morphological evaluation was conduced by measuring the diameters and mean wall thickness, using Image J software. Fractional areas of the lumen, mucosa and muscular layer were estimated using the point counting method. RESULTS: The SMDMCs were successfully incorporated into the urethra. Less collagen was observed among the muscle fibers and less atrophy was found in the smooth and skeletal muscle layers of the SMDMC group. A significant decrease in the muscle to connective tissue ratio was observed in the Saline group, compared with the SMDMC and Sham groups (0,51 ± 0,28 vs 1,62 ± 0,53 vs 2,27 ± 1,15, respectively; p < 0.001). The proportion of the actin was decreased in the Saline group, in comparison with the SMDMC and Sham groups (0,18 ± 0,04 vs 0,27 ± 0,02 vs 0,27 ± 0,03, respectively; p < 0,001); a decrease was also observed in the proportion of myosin (0,07 ± 0,01 vs 0,14 ± 0,02 vs 0,15± 0,03, respectively; p < 0,001). No significant differences were observed among the groups Sham, Saline and SMDMC in terms of urethral diameter, urethral wall thickness and fractional areas of the lumen, mucosa and muscular layer. CONCLUSIONS: The SMDMCs that were incorporated into the injured urethral sphincter resulted in decreased connective tissue and increased muscle content in the SMDMC group. SMDMCs were easily obtained, without need for cell expansion, and they only required a brief preparation time

A proteína dissulfeto isomerase (PDI) tem ganhado destaque em processos de sinalização celular. O objetivo deste trabalho foi investigar o papel da PDI na sinalização redox induzida por TNF-a em células endoteliais e por Angiotensina II (Ang II) em células musculares lisas vasculares (CMLV). Em cultura de células endoteliais isoladas da veia umbilical humana (HUVECs) os dados demonstraram que a PDI e a ERp46 regulam especificamente a fosforilação da ERK 1/2 induzida por TNF-a, possivelmente via alterações redox sobre a GTPase Ras e participa da angiogenese induzida por TNF-a. Em CMLV de artérias de resistência, os dados sugerem a participação da PDI na contração induzida por Ang II, bem como na disfunção vascular associada à hipertensão arterial, através da regulação da expressão e atividade da Nox1. Desta forma, podemos concluir que a PDI apresenta um papel na regulação da sinalização redox induzida por TNF-a e Ang II em células endoteliais e CMLV, respectivamente. Tais resultados apontam para um novo papel da PDI na fisiopatologia do sistema cardiovascular. / Protein disulfide isomerase (PDI), an oxidoreductase of endoplasmic reticulum, has emerged as a key player in cell signaling. The aim of the present study was to investigate the role of PDI in redox signaling induced by TNF-a in endothelial cells and by Angiotensin II (Ang II) in vascular smooth muscle cells (VSMCs). In human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) ERp46 or PDI inhibition reduced specifically TNF-a-induced ERK1/2 phosphorylation, possibly via redox modifications in Ras GTPase and TNF-a-induced angiogenesis. In VSMCs from resistance arteries, our results suggest that PDI positively regulates Nox1 dependent signaling and expression in VSMCs from resistance arteries and could be a new player in the oxidative stress and vascular dysfunction observed in hypertension. Altogether, the results provide evidence for a role for PDI in cardiovascular pathophysiology.

Orientadores: Jose Wilson Magalhães Bassani, Rosana Almada Bassani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Eletrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-05T08:06:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ricardo_RafaeldeAlmeida_M.pdf: 2095157 bytes, checksum: 9fa58fb47d65f96bb946104c547ac025 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A infusão intravenosa de solução hiperosmótica de NaCI tem se mostrado eficaz como tratamento único para a condição de choque hemorrágico, mas o conhecimento de seus efeitos sobre o coração ainda é limitado. Neste trabalho, desenvolvemos instrumentação para registro de encurtamento celular e investigamos o efeito direto de soluções hiperosmóticas de NaCI sobre a atividade contrátil e transientes de Ca2+ em miócitos ventriculares isolados de rato. A amplitude do encurtamento celular (?EC) e dos transientes de Ca2+ (?[Ca2+]i, medida com indo-1) foi registrada em miócitos estimulados a 0,5 Hz antes e depois do incremento da osmolaridade extracelular em 85 mOsm/l pela adição de sacarose (HiperSac) ou NaCI (HiperNac) à solução de perfusão. Variações do conteúdo de Ca2+ e da liberação fracional de Ca2+ do retículo sarcoplasmático (RS) também foram avaliadas. Simulação computacional (LabHeart v. 4.9.5) de transientes de Ca2+ e curva corrente-tensão da troca Na+-Ca2+ (NCX) foram usados para auxiliar o entendimento dos resultados. A perfusão dos miócitos com solução HiperNac provocou redução transitória, seguida de recuperação de ?[Ca2+]i e ?EC. Por outro lado, a perfusão com HiperSac reduziu de maneira persistente a ?EC, sem alterar ?[Ca2+];. O aumento da liberação fracional de Ca2+ do RS (p< 0,05) provocado pela solução HiperNac pode ter contribuído para a recuperação de ?[Ca2+];. A hiperosmolalidade per se prolongou o relaxamento, sem afetar a cinética de {Ca2+]j, possivelmente por aumento da viscosidade intracelular. A queda mais lenta de [Ca2+]; durante o transiente induzido por cafeína é compatível com redução da extrusão de Ca2+ via NCX devida ao acúmulo intracelular lento de Na+ na condição de hiperosmolaridade. Os resultados da simulação computacional estão de acordo com esta hipótese / Abstract: Intravenous injection of hyperosmolar NaCI solution has been used as the sole treatment for hemorrhagic shock, but its effects on heart muscle are not completely elucidated. In this work, we developed instrumentation for cell shortening measurement and investigated the direct effects of hyperosmolar NaCI solution on contractile activity and cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) in isolated rat ventricular myocyte. Cell shortening (LlEC) and Ca2+ transient amplitude (?[Ca2+]j, measured with indo-1) were recorded in myocytes stimulated at 0.5 Hz before and after increasing extracellular osmolarity in 85 mOsm/l by sucrose (HiperSac) or NaCI (HiperNac) addition to the perfusate. Sarcoplasmatic reticulum (RS) Ca2+ load and fractional release were estimated. Computational simulation (LabHeart, v. 4.9.5) of Ca2+ transient and Na+-Ca2+ exchange voltage-current relationship was performed. HiperNac perfusion caused transient decrease of ?[Ca2+]i and LlEC, followed bya gradual recovery. HiperSac perfusion caused a monophasic decrease of LlEC, but did not change ?[Ca2+]i. Increased fractional RS Ca2+ release (pc:; 0.05) in the presence of HiperNac may have contributed to the delayed recovery of ?[Ca2+]i. Hyperosmolarity per se prolonged cell relaxation, but did not affect [Ca2+]i decline kinetics, possibly by increased intracellular viscosity. Slower [Ca2+]i decay during caffeine-induced transients indicates decreased NCX-mediated Ca2+ efflux transport following progressive intracellular [Na+] accumulation due to extracellular hyperosmolarity. Computational simulation results agree with this hypothesis / Mestrado / Engenharia Biomedica / Mestre em Engenharia Elétrica

INTRODUÇÃO: Este estudo teve por objetivo investigar o efeito da injeção periuretral de células mononucleares derivadas de músculo estriado esquelético (CMDME) e a incorporação dessas células no esfíncter urinário de ratas, em modelo animal de incontinência urinária. MÉTODOS: As CMDMEs, foram isoladas de músculos dos membros pélvicos de ratos endogâmicos Whistar-Kyoto (WKY), machos. Os músculos foram submetidos à dissociação enzimática, seguida de isolamento das células mononucleares, sem necessidade de cultura e/ou expansão. A deficiência esfincteriana foi criada por uretrolise cirúrgica em 20 ratos endogâmicos WKY, fêmeas. Uma semana após, foi realizada a injeção periuretral de 1 x 106 de células, em 10 ratas (grupo CMDME), e 10 ratas receberam injeção de SF a 0,9% (grupo SF). Dez animais foram submetidos à cirurgia Sham e serviram como controle (grupo SHAM). Quatro semanas após a injeção, os ratos foram sacrificados, e as uretras, removidas. A incorporação das CMDMEs masculinas, na uretra feminina, foi confirmada pela detecção do cromossomo Y, através da hibridização in situ fluorescente. A porção média da uretra de cada animal foi processada para coloração pela hematoxilina-eosina e tricrômio de Masson e também imuno-histoquímica para actina e miosina. Usando software digital (Image Pro Plus 6.0), calcularam-se a proporção músculo/tecido conectivo e a proporção de actina e miosina em cada amostra de uretra, sendo as proporções comparadas entre os grupos. As mudanças morfométricas da uretra de cada animal, de cada grupo, foram avaliadas medindo-se o maior e o menor diâmetro da uretra e a espessura média da parede, utilizando software digital (Image J); áreas fracionais da luz, mucosa e camada muscular da uretra foram estimadas usando o método de contagem de pontos. RESULTADOS: No grupo CMDME, houve espessamento das camadas da musculatura lisa e estriada, e menor depósito de tecido conectivo, em relação aos animais do grupo SF. Uma diminuição da proporção músculo/tecido conectivo foi observada no grupo SF, em comparação ao grupo CMDME, e também em relação ao grupo SHAM (0,51 ± 0,28; 1,62 ± 0,53 e 2,27 ± 1,15, respectivamente, p < 0.001). A proporção de actina estava diminuída no grupo SF, em comparação com o grupo CMDME, e com o grupo SHAM (0,18 ± 0,04; 0,27 ± 0,02 e 0,27 ± 0,03, respectivamente, p < 0,001) sendo também observada esta diminuição na proporção de miosina (0,07 ± 0,01; 14 ± 0,02 e 0,15± 0,03, respectivamente, p < 0,001). Não houve diferença entre os grupos SF, CMDME e SHAM em relação ao diâmetro da uretra, espessura da parede uretral e áreas fracionais da luz, mucosa e parede muscular uretral. CONCLUSÕES: As CMDMEs foram incorporadas na uretra do grupo CMDME. Nestes animais, houve diminuição de tecido conectivo e aumento da quantidade de músculo liso e esquelético. As CMDMEs foram facilmente obtidas, sem necessidade de expansão celular, com pequeno tempo de preparo / INTRODUCTION: This study investigated the effect of periurethral injection of skeletal muscle-derived mononuclear cells (SMDMCs) into the urethral sphincter in an animal model of stress urinary incontinence (SUI). METHODS: SMDMCs were isolated from the hind limb muscles of male Wistar-Kyoto (WKY) isogenic inbred rats. The muscles were enzymatically dissociated, and SMDMCs were directly isolated without the need for culture or expansion. Urinary sphincter deficiency was created by surgical urethrolysis in 20 female WKY rats. One week later, 10 rats received an injection of 1 x 106 cells (SMDMC group) and 10 rats received saline injections (Saline group). In addition, 10 rats were subjected to sham surgery (Sham group). Four weeks later, the rats were euthanized and their urethras harvested. The incorporation of male SMDMC in the female urethras was confirmed by the detection of Ychromosomes by fluorescence in situ hybridization (FISH). In addition, hematoxylin and eosin (H&E) and Masson\'s trichrome staining, as well as immunohistochemistry analyses to actin and myosin were performed. Using digital software (Image Pro Plus 6.0), the muscle to connective tissue, actin and myosin ratios were calculated. A urethral morphological evaluation was conduced by measuring the diameters and mean wall thickness, using Image J software. Fractional areas of the lumen, mucosa and muscular layer were estimated using the point counting method. RESULTS: The SMDMCs were successfully incorporated into the urethra. Less collagen was observed among the muscle fibers and less atrophy was found in the smooth and skeletal muscle layers of the SMDMC group. A significant decrease in the muscle to connective tissue ratio was observed in the Saline group, compared with the SMDMC and Sham groups (0,51 ± 0,28 vs 1,62 ± 0,53 vs 2,27 ± 1,15, respectively; p < 0.001). The proportion of the actin was decreased in the Saline group, in comparison with the SMDMC and Sham groups (0,18 ± 0,04 vs 0,27 ± 0,02 vs 0,27 ± 0,03, respectively; p < 0,001); a decrease was also observed in the proportion of myosin (0,07 ± 0,01 vs 0,14 ± 0,02 vs 0,15± 0,03, respectively; p < 0,001). No significant differences were observed among the groups Sham, Saline and SMDMC in terms of urethral diameter, urethral wall thickness and fractional areas of the lumen, mucosa and muscular layer. CONCLUSIONS: The SMDMCs that were incorporated into the injured urethral sphincter resulted in decreased connective tissue and increased muscle content in the SMDMC group. SMDMCs were easily obtained, without need for cell expansion, and they only required a brief preparation time