Orientadores: Maria Alice da Cruz-Hofling, Anibal Eugenio Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T03:04:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_ErikaMariaSilva_D.pdf: 24578708 bytes, checksum: bf9367ecdbc315a07f58411feea40089 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A veratrina, uma mistura de alcalóides obtidos da espécie de planta Shoenocaulon officinale, é uma toxina lipossolúvel que possui como sítio de ação primária os canais de sódiodependentes de voltagem. Recentemente, nossos estudos mostraram que a veratrina pode causar mionecrose e as evidências sugerem que as mitocôndrias e o retículo sarcoplasmático (RS) possam ser os alvos intracelulares da ação da veratrina. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos tóxicos induzidos por diferentes concentrações de veratrina sobre o consumo de oxigênio, a atividade dos complexos da cadeia respiratória e a ultraestrutura das mitocôndrias através de análises bioquímicas, citoquímicas e morfométricas e de microscopia eletrônica de transmissão...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The veratrine, a mixture of alkaloids obtained from plant Schoenocaulon officinale, is a lipid soluble toxin, which target voltage-gated Na+ channels for their primary action site. Recently, our studies showed that the veratrine may cause myonecrosis and evidences suggested mitochondria and sarcoplasmic reticuIum (SR) as intracellular cell targets. The aim of this work was to investigate the effects caused by variabIe concentration of veratrine on mitochondrial oxygen consumption, respiratory chain enzymes activities and ultrastructure, combining electron microscopy with biochemical, cytochemical and morphometrical analysis. Moreover, we investigated whether the interference on physiology of sodium channels by veratrine it alters the ultrastructure of SR on different types of muscles. Ultrastructural changes were observed on skeletal muscle mitochondria after intramuscular injection or incubation with veratrine...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

A diabetes mellitus (DM) está entre as 10 principais causas de morte global e é considerada um dos principais fatores de risco para as doenças cardiovasculares. Dados da Federação Internacional de Diabetes indicam que 425 milhões de pessoas possuem esta doença e seu tratamento é considerado uma das prioridades de saúde. No coração, as alterações a nível celular causadas pela DM levam ao surgimento de anormalidades estruturais e funcionais que resultam na chamada cardiomiopatia diabética. A DM pode ser estudada a partir de modelos experimentais em animais, como a DM induzida pela estreptozotocina, uma substância citotóxica para as células pancreáticas que produzem insulina. Objetivos: O objetivo este trabalho foi avaliar a existência de alterações cardíacas precoces na contratilidade de miócitos isolados, na morfologia e função cardíaca por ecocardiograma de alta resolução e na atividade elétrica do coração. Metodologia: Foram utilizados ratos Wistar machos para indução da DM com estreptozotocina. Os cardiomiócitos foram isolados por dissociação enzimática utilizando-se a preparação de Langendorff e a contratilidade estudada através da medição da variação do comprimento da célula e dos sarcômeros de cardiomiócitos estimulados eletricamente. A avaliação da morfologia e da função cardíaca foi feita por ecocardiografia de alta resolução e o eletrocardiograma foi obtido nos animais anestesiados. Resultados: A DM resultou em alteração da contratilidade dos cardiomiócitos medida pela variação do comprimento da célula e pela variação do comprimento do sarcômero. Comparados aos controles, os animais diabéticos apresentaram aumento dos intervalos de tempo para atingir o pico de contração (0,049 vs 0,068 s, e 0,043 vs 0,063 s, P<0,001) aumento do relaxamento (0,028 vs 0,038 s e 0,025 vs 0,035 s, P<0,03) e do intervalo até a máxima velocidade de encurtamento (0,019 vs 0,024 s, P<0,001) e relaxamento (0,021 vs 0,032 s e 0,020 vs 0,025 s, P<0,03) em relação ao grupo controle medidos pelo comprimento da célula e pelo comprimento do sarcômero, respectivamente. O ecocardiograma evidenciou mudanças morfológicas com aumento do diâmetro diastólico (24,4 vs 28,0 mm/kg, P<0,01) e sistólico (11,0 vs 18,2 mm/kg, P<0,01), aumento da massa do ventrículo esquerdo (1,9 vs 2,5 mg/g, P<0,02) e manutenção da espessura relativa da parede posterior, caracterizando um quadro de hipertrofia excêntrica. Foram também observadas mudanças funcionais, como a diminuição significativa da fração de ejeção (73,4 vs 62,1%, P<0,01), da fração de encurtamento (44,2 vs 34,7%, P<0,01) e da onda S\' (46,9 vs 38,1 mm/s, P<0,01) avaliada pelo Doppler tecidual, indicando uma disfunção sistólica inicial nesse modelo experimental. No eletrocardiograma foi possível verificar um aumento na duração da onda P (9,15 vs 14,15 ms, P<0,005). Conclusão: Os resultados obtidos permitiram identificar alterações precoces nesse modelo de DM. Foi observada uma correlação entre as alterações da contratilidade observadas diretamente ao nível celular através da medição da variação do comprimento da célula e do sarcômero com as alterações na morfologia e função cardíaca em decorrência da DM. / Diabetes mellitus (DM) is among the top 10 causes of global death and is considered a major risk factor for cardiovascular disease. Data from the International Diabetes Federation indicate that 425 million people have this disease and its treatment is considered one of the health priorities. In the heart, changes at the cellular level caused by DM lead to the appearance of structural and functional abnormalities that result in so-called diabetic cardiomyopathy. DM can be studied from experimental models in animals including induction by streptozotocin, a cytotoxic substance for pancreatic cells that produce insulin. Objectives: The objective of this study was to evaluate the existence of early cardiac changes in the contractility of isolated myocytes, in the morphology and cardiac function by high resolution echocardiogram and in the heart electrical activity . Method: Male Wistar rats were used for induction of DM with streptozotocin. Cardiomyocytes were isolated by enzymatic dissociation using the Langendorff preparation and the contractility studied by measuring cell and sarcomere length variation in electrically stimulated cardiomyocytes. The evaluation of cardiac morphology and function was performed by high resolution echocardiogram and eletrocardiogram was was obtained in anesthetized animals. Results: DM resulted in alteration of cardiomyocyte contractility with measurement of cell length variation and with sarcomere length variation. Compared to controls, diabetic animals presented an increase in the time intervals to reach the peak of contraction (0.049 vs 0.068 s and 0.043 vs 0.063 s, P<0.001) increase in relaxation (0.028 vs 0.038 s and 0.025 vs 0.035 s, P<0.03) and the intervals until the maximum shortening velocity (0.019 vs 0.024 s, P<0.001) and relaxation (0.021 vs 0.032 s and 0.020 vs 0.025 s, P<0.03) in relation to the control group measured by length and by sarcomere, respectively. The echocardiogram evidenced morphological changes with an increase in the diastolic (24.4 vs 28.0 mm/kg, P<0.01) and systolic diameter (11.0 vs 18.2 mm/kg, P<0.01) increase in left ventricle mass (1.9 vs 2.5 mg/g, P<0.02) and maintenance of the relative thickness of the posterior wall in relation to the control group, characterizing eccentric hypertrophy in DM. Functional changes were also observed, such as a significant reduction in ejection fraction (73.4 vs 62.1 %, P<0.01), of the fractional shortening (44.2 vs 34.7 %, P<0.01) and the S\' wave (46.9 vs 38.1 mm/s, P<0.01) evaluated by tissue Doppler, indicating an initial systolic dysfunction in this experimental model. With the electrocardiogram it was possible to verify an increase in P wave duration (9.15 vs 14.15 ms, P<0.005). Conclusion: The results obtained allowed to identify early changes in this model of DM. A correlation was observed between contractility changes observed directly at the cellular level by measuring cell and sarcomere variation with changes in cardiac morphology and function as a result of DM.

Aumento nos níveis circulantes de alguns ácidos graxos (AGs) está relacionado com o quadro de resistência à insulina em músculo esquelético. Os mecanismos pelos quais os AGs diminuem a ação da insulina não estão elucidados, entretanto a participação destas biomoléculas no controle do NF-kB, SREBP-1c, HIF-1<font face=\"Symbol\">&#945;, LXR<font face=\"Symbol\">&#945; e PPARg considerados reguladores do Slc2a4, já foi sugerida. O objetivo deste estudo foi investigar a ação dos ácidos graxos, oléico (OFA) e linoléico (LFA), em células musculares L6, na regulação do Slc2a4. Redução no conteúdo protéico e de mRNA GLUT4 foi verificada na presença de ambos AGs. Esta redução foi relacionada com aumento na expressão e na atividade de ligação do NF-kB e diminuição na expressão e na atividade de ligação do SREBP-1 ao gene Slc2a4, na presença de OFA e LFA. Ambos AGs aumentaram a expressão do mRNA de LXR<font face=\"Symbol\">&#945;, PPARg and HIF-1<font face=\"Symbol\">&#945;, todavia apenas na presença de LFA foi detectada uma diminuição na ligação de PPARg ao Slc2a4. Ambos AGs reduzem a expressão do GLUT4 devido modulação da ligação do NF-kB e SREBP-1 ao gene Slc2a4. / High elevated levels of some free fatty acids (FFAs) are associated with insulin resistance in skeletal muscle. The mechanisms by which FFAs impair this hormone sensitivity need to be clarified; nevertheless, its effects in the modulation of NF-kB, SREBP-1c, HIF-1<font face=\"Symbol\">&#945;, LXR<font face=\"Symbol\">&#945; and PPARg which are related with Slc2a4 gene regulation have been suggested. The goal of this study was to investigate the action of oleic (OFA) and linoleic (LFA) fatty acids, in L6 muscle cells, in Slc2a4 regulation. The GLUT4 protein and mRNA expression decreased in the presence of OFA and LFA. The reduced GLUT4 expression was related to a significative enhancement of the NFkappaB mRNA expression and binding activity in presence of both FFAs and a decrease of SREBP-1 mRNA and binding activity in the Slc2a4. OFA and LFA increase LXR<font face=\"Symbol\">&#945;, PPARg and HIF-1<font face=\"Symbol\">&#945; mRNA expression, but only a reduction in PPARg binding activity was verified in presence of the LFA. A reduction in GLUT4 expression in the presence of OFA and LFA was detected and related with NF-kB and SREBP-1 binding activity in the Slc2a4 gene.

Altas concentrações de ácidos graxos saturados desencadeiam resistência à insulina no músculo esquelético e o estresse de retículo endoplasmático (RE) é sugerido neste processo. Este estudo objetivou investigar, em células musculares L6, os efeitos do tratamento com palmitato sobre o estresse de RE e a ativação do NF-kB, relacionando-os com o prejuízo na expressão do GLUT4. Pelos resultados, observou-se que o tratamento com 0,75 mM de palmitato induziu redução no conteúdo de GLUT4 e Slc2a4. Os marcadores de estresse como GRP78, PERK/EIF2a e IRE1a/XBP-1/TRAF2 apresentaram pouca ativação. O fator transcricional NF-kB apresentou-se aumentado em seu conteúdo proteico e RNAm. A atividade de ligação do NF-kB à região promotora do Slc2a4 mostrou aumento independente do grau de fosforilação de IKK. Em suma, observou-se que o palmitato reprime a expressão do Slc2a4 e que induz pouco estresse de RE em células L6. Por outro lado, a participação do NF-kB parece ser importante no controle deste fenômeno reduzindo a expressão do Slc2a4 e prejudicando a homeostasia da glicose. / High concentrations of saturated fatty acids trigger insulin resistance in skeletal muscle and endoplasmic reticulum stress (ER) is suggested in this process. This study aimed to investigate, in L6 muscle cells, the effects of palmitate treatment on ER stress pathways and activation of NF-kB, relating them to the impaired expression of GLUT4. The results showed that treatment with 0.75 mM of palmitate induced reduction in the amount of GLUT4 and Slc2a4. Stress markers such as GRP78, PERK/EIF2a and IRE1a/XBP-1/TRAF2 showed little activation. The transcription factor NF-kB were increased in protein content and mRNA. The binding activity of NF-kB to the promoter region of Slc2a4 showed increased independent from the phosphorylation of IKK. Finally, it was observed that palmitate represses the expression of Slc2a4 and that this fatty acid induces little activation of reticulum stress pathways in L6 cells. On the other hand, the involvement of NF-kB appears to be important to control this phenomenon, reducing the expression of Slc2a4 and impairing glucose homeostasis.

A Síndrome de Marfan (MFS) é uma doença autossômica dominante do tecido conjuntivo, que acomete principalmente os sistemas esquelético, ocular e cardiovascular. O fenótipo cardiovascular, em especial o aneurisma de aorta, é responsável pela maior parte da morbi-mortalidade. MFS é resultante da mutação da fibrilina-1, uma glicoproteína que além de ser um dos principais componentes estruturais da matriz extracelular, tem como função a regulação da atividade do TGF-Beta, por meio de seu sequestro mecânico na matriz extracelular. No entanto, os mecanismos pelos quais a mutação da fibrilina-1 determina aneurismas de aorta torácica com elevada variabilidade fenotípica são ainda pouco elucidados. Um alvo central na fisiopatologia do aneurisma são células musculares lisas vasculares (VSMC), que constituem a maior porção da camada média da aorta. Por meio do controle do tônus contrátil da aorta, da estrutura do citoesqueleto e da interação com a matriz extracelular controlam a estrutura da aorta e a resposta a estímulos patológicos. Mutações que geram perda de função no aparato contrátil de VSMCs prejudicam força contrátil e respostas mecanoadaptativas. No entanto, o papel da VSMC na MFS foi pouco estudado. Neste estudo, investigamos se alterações do fenótipo de VSMCs correlacionam-se a prejuízos na geração de força e alterações em respostas biomecânicas em VSMC cultivadas a partir de aortas obtidas de camundongos com ou sem a mutação mgDeltalpn para MFS na fase inicial (3 meses) e tardia (6 meses). Aos 3 meses de evolução, detectamos importantes alterações fenotípicas nas MFS-VSMC, com maior proliferação celular e redução de alguns marcadores de diferenciação (calponina-1), porém aumento de outros (alfa-actina e SM22). Ao mesmo tempo, ocorreu mudança morfológica, com aumento da área da célula e perda do formato fusiforme. Tais alterações foram consistentes com transição para fenótipo mesenquimal, que foi confirmada pela expressão de vários marcadores. Marcadores de estresse do retículo endoplasmático (RE) aumentaram em MFS-VSMC vs. WT (wild-type) -VSMC condição basal, sem aumento pós estiramento mecânico. Correção da matriz de fibrilina-1 defeituosa em MFS-VSMC promoveu reversão de alguns aspectos do fenótipo, mas não do estresse do RE. MFS-VSMC mostra perfil protêomico divergente de WT-VSMC, em particular menor expressão de proteínas regulatórias do citoesqueleto. Importante, MFSVSMC têm reduzida capacidade de gerar força de tração quando semeadas em substrato com rigidez fisiológica e geram momento contrátil in vitro, no entanto, sem perda na capacidade de adesão. Importante, MFS-VSMC têm forte atenuação da resposta de tração a aumentos da rigidez do substrato. Em paralelo, MFS-VSMC exibem menor densidade em fibras de estresse de actina em relação às WT-VSMC. A maioria destas alterações não foram observadas aos 6 meses de evolução da doença. Os dados indicam que na fase precoce da doença, MSF-VSMC exibem mudanças fenotípicas que vão além de uma simples modulação fenotípica, com aspectos de transição mesenquimal e reduzida capacidade de geração de força tensional associada não à adesão celular, porém à menor capacidade de geração de fibras de estresse de actina. Estes mecanismos, descritos pela primeira vez, contribuir para elucidar a fisiopatologia da MFS, com alguns aspectos comuns, porém outros distintos de outras modalidades de aneurisma de aorta / Marfan Syndrome (MFS) is an autosomal dominant connective tissue disease affecting to variable extents the musculoskeletal, ocular and cardiovascular systems. Cardiovascular phenotype and in particular thoracic aorta aneurysm/dissection (TAAD), is responsible for the bulk of disease morbimortality. MFS is due to mutations in fibrillin-1, one of the main structural proteins of the extracellular matrix (ECM), which in addition regulates TGF-Beta activity by means of its physical retention in the ECM. However, mechanisms by which fibrillin-1 mutation determines TAAD with elevated phenotypic variability are yet poorly understood. Vascular smooth muscle cells (VSMC), the main component of aortic medial layer, are central targets of aneurysm pathophysiology in general. By exerting regulation of contractile tone, cytoskeletal structure and ECM interaction, VSMC control aortic structure and response to pathologic stimuli. Mutations that promote loss of VSMC contractile apparatus impair contractile function and mechanoadaptative responses and associate with distinct types of TAAD. However, the role of VSMC mechanobiology in MFS pathophysiology is poorly known. In this study, we investigated whether VSMC loss of force-generating capacity occurs in MFS and whether it associates with specific changes in cell phenotype. Biomechanical VSMC responses were assessed in cells cultured from aortas collected from mice with the mgDeltalpn MFS mutation at early (3-monthold mice, the main focus of our study) and advanced (6-month-old mice) stages of disease evolution. At 3 months of disease evolution, we detected important phenotypic alterations in MFS-VSMC, with enhanced expression of markers for cellular proliferation and lower expression of some differentiation markers (calponin-1), but, increase in others (SM alfaactin and SM22). In parallel, there were important morphologic changes, with increased VSMC area and loss of its fusiform shape. Such alterations are consistent with a transition towards a mesenchymal-like phenotype, which was confirmed through the expression of several markers. Endoplasmic reticulum (ER) stress markers increased in MFS-VSMC vs. WT (wild-type)-VSMC in basal condition, without augmentation after cyclic mechanical stretching. Replacement of defective fibrillin-1 ECM from MFS-VSMC with a normal fibroblast-derived ECM promoted reversion of some aspects of the phenotype but not of ER stress. MFS-VSMC exhibited a proteomic profile divergent from that of WT-VSMC, particularly with respect to the lower expression of cytoskeleton regulatory proteins. Importantly, MFS-VSMC displayed a lower traction force-generating capacity when seeded in ECM under physiological stiffness and generated an impaired contractile moment in this situation. In particular, MFS-VSMC depicted a strong attenuation of the traction force response to enhanced ECM stiffening. These defects did not occur as a result of lower adhesion structure and decreased adhesion capacity of MFS-VSMC. In parallel, MFS-VSMC exhibited lower density of actin stress fiber vs. WT-VSMC. With 6 months of disease evolution, several of these alterations were not detectable. Both WTVSMC and MFS-VSMC showed reduced capacity of force generation, without evidence of cell senescence. In summary, starting already in the early stages of disease evolution, MSF-VSMC display important phenotypic changes which go beyond a simple reversible phenotypic modulation, with some aspects suggesting a transition mesenchymal-like phenotype, accompanied by reduced force-generating capacity not linked to loss of cell adhesion properties but rather to impaired organization of action stress fibers. These mechanisms, described for the first time, contribute to elucidate MFS pathophysiology, depicting both some aspects in common with the pathophysiology of other types of aortic aneurysm and some aspects peculiar to MFS

Processos celulares que governam as NADPH oxidases vasculares em condições patológicas não estão claros ainda. Como os processos redox são parte intrínseca da resposta da célula ao estresse, temos investigado se o estresse oxidativo pode convergir com outros tipos de estresse via Nox(es). No presente estudo, focamos na inibição do proteasoma como uma condição relevante de estresse. A incubação de células musculares lisas com concentrações não apoptóticas de inibidores do proteasoma, MG132 e lactacistina, promoveu aumento na produção basal de superóxido e na atividade da NADPH oxidase, diminuição da atividade da SOD e da razão GSH/GSSG. Por outro lado, a inibição do proteasoma diminui a atividade da Nox após estímulo com Angiotensina II ou Tunicamicina, conhecido estressor do retículo endoplasmático. Em condições basais, MG132 induz a expressão de mRNA da Nox1, entretanto o aumento de Nox1 induzido por Angiotensina II foi diminuído na presença de MG132. O mesmo efeito ocorre com a indução de Nox4 pela Tunicamicina, que nesse caso foi drasticamente reduzida na presença de MG132. Além disso, tanto Angiotensina II quanto Tunicamicina induziram a atividade lítica do proteasoma 20S. A seguir, investigamos as conseqüências fisiológicas do MG132 na sinalização do estresse do RE, uma conhecida resposta mediada por Nox4. Células vasculares incubadas com MG132 induzem a expressão de marcadores do estresse do RE, GRP78 e XBP1, e também os marcadores mais tardios ATF4 e o próapoptótico CHOP/GADD153. Resultados similares ocorrem também com a Tunicamicina. Entretanto, a co-incubação de Tunicamicina e MG132 diminui e a sinalização do estresse do RE. AKT e p38 MAPK foram ativados por MG132, possivelmente como resposta ao estresse induzido pela inibição do proteasoma. Assim, a inibição do proteasoma bloqueia a NADPH oxidase, com aumento da atividade basal e expressão da Nox1 versus forte inibição da ativação e expressão da Nox4 frente ao estímulo. A inibição da Nox4 associa-se e pode contribuir para a inibição pelo MG132 da sinalização do estresse do RE. Portanto, o proteasoma parece exercer papel na integração de estresses celulares envolvendo a NADPH oxidase. A inibição do proteasoma pode ter papel na terapia de doenças associadas a estresse do RE. / Cellular processes governing vascular Nox family NADPH oxidases in disease conditions are unclear. Since redox processes are intrinsic to cell stress response, we asked whether oxidative stress merges with other types of stress via Nox(es). We focused on proteasome inhibition as a relevant stress condition. Vascular smooth muscle cells (VSMC) incubation with non-apoptotic concentrations of proteasome inhibitors MG132 or lactacystin promoted increased baseline superoxide generation (HPLC/DHE products) and NADPH oxidase activity, decreased SOD activity and GSH/GSSG ratio. Conversely, proteasome inhibitors decreased by Nox response to Angiotensin II (AngII) and abrogated Nox response to endoplasmic reticulum (ER) stressor tunicamycin. With MG132, basal Nox1 mRNA levels were increased, while Nox1 response to AngII was blunted. Moreover, MG132 abolished Nox4 mRNA levels TN-induced. Both AngII and TN (at 2 and 4 hs) promoted increased 20S proteasome lytic activity. We next assessed physiological consequences of MG132 in ER stress signaling, a known Nox4- mediated response. VSMC incubation with MG132 alone enhanced expression of the ER stress markers Grp78 and XBP1 and late markers such as ATF4 and proapoptotic CHOP/GADD153. Similar results occurred with the known ER stressor TN. However, co-incubation of TN and MG132 decreased Grp78, Grp94 and CHOP/GADD153, indicating that proteasome inhibition interrupts ER stress. AKT and p38 are activated by MG132 as response to stress and recover to survival. Thus, proteasome inhibition disrupts NADPH oxidase, with increased baseline activity and Nox1 expression vs. strong inhibition of stimulated Nox1 and Nox4 activation/expression. The later effect may underlie MG132-mediated inhibition of ER stress signaling. (Support: FAPESP, CNPq Milênio Redoxoma)

Orientador: Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:44:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Yano_ClaudiaLumy_D.pdf: 4912629 bytes, checksum: 823824d694d0140eada41a1aa8e689a5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Metais pesados como o cádmio são considerados agentes tóxicos devido sua extensiva utilização nas indústrias e agropecuária e, como conseqüência, são amplamente dispersados no meio ambiente. No entanto, o cádmio tem sido foco, também, de inúmeras pesquisas relacionadas a exposição humana e suas conseqüências patológicas como o câncer. Estudos, claramente, caracterizam as relações de tumor de pulmão com a inalação do cádmio e mostram a possível participação deste metal tanto na iniciação quanto na progressão tumoral. Por outro lado, são raros os relatos da literatura envolvendo o mecanismo de ação do cádmio em tecido muscular, uma vez que já foi observado acúmulo desse metal em musculatura esquelética de animais. A administração do cloreto de cádmio, metal pesado designado como carcinogênico, em linhagem de células musculares esqueléticas C2C12 promoveu lesões consistentes com estresse oxidativo, observado pela diminuição da viabilidade celular, aumento da peroxidação de lipídios (conteúdo de malondialdeído) e conseqüente diminuição da enzima antioxidante glutationa transferase (GST). O estresse oxidativo, possivelmente, alterou a adesão celular e, conseqüentemente, houve retração dos miotúbulos, observada através de microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura (Capítulo I- Trabalho publicado no periódico Free Radical Biology & Medicine, 2005). A atenuação das lesões promovidas pelo cloreto de cádmio em linhagem de células C2C12 foi verificada com o pré-tratamento com o sulfato de zinco antecedendo o tratamento com cloreto de cádmio. Os efeitos protetores foram observados através da preservação da viabilidade celular, da GST, e diminuição do conteúdo de malondialdeído. A ação protetora foi verificada, também, na maior preservação da adesão celular, principalmente, contra as maiores concentrações de cádmio (Capítulo II- Trabalho a ser submetido ao periódico Free Radical Biology & Medicine). Por outro lado, a exposição crônica de células tumorais, linhagem de adenocarcinoma de cólon MAC13, ao cloreto de cádmio promoveu alterações morfológicas associadas ao aumento da atividade mitocondrial, interferência quanto à atividade lisossomal e diminuição da viabilidade celular, principalmente, na maior concentração de cádmio, após 24hs de exposição (Capítulo III- Trabalho a ser submetido ao periódico International Journal of Cancer) / Abstract: The heavy metals as cadmium are a toxic agent since it is extensively utilized in industry and can be amply distributed in environment. The cadmium is research focused as its pathological consequences in human exposure as it has been classified as carcinogenic agent. This fact is evident since the cadmium inhalation can be related to lung tumour and many studies show the possible participation of the cadmium on tumoral cells initiation and progression. However, few studies observed that cadmium can be accumulated in animal skeletal muscle cells and its action mechanisms are not completed known. The cadmium chloride exposure promoted oxidative stress and morphologic changes in C2C12 myotubes cell, in vitro, associated to decrease on cellular viability, high lipid peroxidation (increase on malondialdehyde content, MDA) and decrease on glutathione-S-transferase (GST) activity. The cadmium chloride produced chances on the cellular adhesion, integrity and retraction in C2C12 myotubes cells. These effects could be attenuated by zinc sulphate pre-treatment, which maintained the cellular viability, GST activity, reducing the MDA content. The zinc sulphate pre-treatment preserved the cellular adhesion, especially in high cadmium chloride concentration. Additionally, the tumoral cells (colon adenocarcinoma MAC 13) chronically exposed to cadmium chloride showed increase on the mitochondrial activity, and reduction on lysosomal and cellular viability, especially at high cadmium chloride concentration after 24h of treatment, probably indicating the tumoral cell changes / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2016-05-17T20:16:41Z No. of bitstreams: 1 Adriano Silvio dos Santos.pdf: 1418434 bytes, checksum: 4ac5ef78eb225e6693c107993f6ee978 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T20:16:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adriano Silvio dos Santos.pdf: 1418434 bytes, checksum: 4ac5ef78eb225e6693c107993f6ee978 (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / Snakes venom of the Bothrops species induces a local inflammatory reaction, characterized by pain, edema, leukocyte migration and can be accompanied by tissue necrosis. The use of antivenom performs the function of neutralizing the greatest possible amount of circulating venom, thus minimizing its systemic effects, but its action does not extend to local manifestations, and thus require the use of another therapeutic option to control this reaction. The low level laser therapy (LLLT) is used as an alternative treatment in cases of muscle injury due to its biological effects, such as analgesics, anitinflamatory and healing. In a previous study of our lab it was found that LBP can enhance the viability of C2C12 muscle cells after the addition of B. jararacussu venom in the medium and that this effect of LBP is related to protection of the cell membrane. In the present study we analyzed the effect of LBP in the cell monolayer integrity, viability of muscle cells, exposed to injury by myotoxins BthTX - I - and BthTX - II isolated from Bothrops jararacussu venom. Cells received BthTX – I (75 μg / mL) and were immediately irradiated with LLLT Aluminum Indium Gallium Phosphate and Aluminium Gallium Arsenide, the wavelengths (λ) 685nm and 830 nm, power density 4 J/cm2, 100mW of power, total energy 1,3 J, application time of 13 and 35 seconds per point and the cells were incubated for 15, 30 and 60 minutes. The results demonstrated that BthTX – I affect cell viability in a dose dependent manner, but did not change cell integrity. The concentration of 75 μg/mL was chosen for the experiments with LBP. LLLT caused an significant increase in cell viability in all the analyzed period of time and in the λ 685 nm and 830 nm against Bothrops I toxin, however in the LBP λ 685 nm against Bothrops toxin II was effective only at 15 min, while the LBP at λ 830 was effective at 15 and 60 min. The LLLT was not able to change the LDH release at all times and wavelength used. Thus, LBP was able to protect C2C12 muscle cells against the miotoxic effect of isolated myotoxins isolated from B. jararacussu venom. Therefore, the results suggest that LLLT can be considered an effective therapeutic tool in patients bitten by snakes. / O veneno das serpentes do gênero Bothrops induz uma reação inflamatória local intensa, caracterizada por dor, formação de edema, migração leucocitária, podendo ser acompanhada por necrose tecidual. A utilização do soro antibotrópico desempenha a função de neutralizar a maior quantidade possível do veneno circulante, minimizando assim seus efeitos sistêmicos, porém sua ação não se estende às manifestações locais, sendo assim necessário o uso de outro recurso terapêutico para o controle dessa manifestação. A laserterapia de baixa potência (LBP) é uma alternativa de tratamento em situações de lesão muscular, devido a seus efeitos biológicos, tais como analgésicos, antinflamatórios e cicatrizantes. Em trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório, verificou-se que o LBP foi capaz de aumentar a viabilidade de células musculares C2C12, após a adição do veneno de B. jararacussu e que esse efeito do LBP é relacionado a uma proteção da membrana celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do LBP em células musculares C2C12 submetidas à lesão por miotoxinas (BthTX - I e BthTX - II) isoladas do veneno da serpente Bothrops jararacussu quanto a: viabilidade, descolamento celular e liberação da enzima LDH. As células receberam a BthTX – I e BthTX – II na dose 75 μg/mL e foram imediatamente irradiadas com LBP Índio Gálio Alumínio Fósforo e Arseneto de Gálio Alumínio, nos comprimentos de onda (λ) 685 nm vermelho e 830 nm infra-vermelho, de forma pontual, tempo de aplicação de 13 s e 35 s respectivamente e as células foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. Os resultados demonstraram que a BthTX - I e BthTX - II afetou a viabilidade celular de forma dose-dependente, sendo escolhida a dose 75 μg/mL para a realização dos experimentos com o LBP, porém não foi capaz de causar alterações na integridade. O LBP causou aumento significativo na viabilidade celular, em todos os tempos analisados no λ 685 nm e 830 nm frente à BthTX - I, entretanto o LBP no λ 685 nm e λ 830 frente a BthTX - II foi efetivo somente no tempo de 15 e 60. O LBP não foi capaz de diminuir a liberação de LDH em todos os tempos analisados e com os dois λ utilizados. Desta forma, verificou-se que o LBP foi capaz de proteger as células musculares C2C12 contra o efeito miotóxico das miotoxinas isoladas do veneno B. jararacussu e que esta proteção está relacionada ao efeito protetor a nível mitocondrial. Ainda, os resultados obtidos sugerem que o LBP pode ser considerado uma ferramenta terapêutica eficaz em pacientes picados por serpentes.

Processos celulares que governam as NADPH oxidases vasculares em condições patológicas não estão claros ainda. Como os processos redox são parte intrínseca da resposta da célula ao estresse, temos investigado se o estresse oxidativo pode convergir com outros tipos de estresse via Nox(es). No presente estudo, focamos na inibição do proteasoma como uma condição relevante de estresse. A incubação de células musculares lisas com concentrações não apoptóticas de inibidores do proteasoma, MG132 e lactacistina, promoveu aumento na produção basal de superóxido e na atividade da NADPH oxidase, diminuição da atividade da SOD e da razão GSH/GSSG. Por outro lado, a inibição do proteasoma diminui a atividade da Nox após estímulo com Angiotensina II ou Tunicamicina, conhecido estressor do retículo endoplasmático. Em condições basais, MG132 induz a expressão de mRNA da Nox1, entretanto o aumento de Nox1 induzido por Angiotensina II foi diminuído na presença de MG132. O mesmo efeito ocorre com a indução de Nox4 pela Tunicamicina, que nesse caso foi drasticamente reduzida na presença de MG132. Além disso, tanto Angiotensina II quanto Tunicamicina induziram a atividade lítica do proteasoma 20S. A seguir, investigamos as conseqüências fisiológicas do MG132 na sinalização do estresse do RE, uma conhecida resposta mediada por Nox4. Células vasculares incubadas com MG132 induzem a expressão de marcadores do estresse do RE, GRP78 e XBP1, e também os marcadores mais tardios ATF4 e o próapoptótico CHOP/GADD153. Resultados similares ocorrem também com a Tunicamicina. Entretanto, a co-incubação de Tunicamicina e MG132 diminui e a sinalização do estresse do RE. AKT e p38 MAPK foram ativados por MG132, possivelmente como resposta ao estresse induzido pela inibição do proteasoma. Assim, a inibição do proteasoma bloqueia a NADPH oxidase, com aumento da atividade basal e expressão da Nox1 versus forte inibição da ativação e expressão da Nox4 frente ao estímulo. A inibição da Nox4 associa-se e pode contribuir para a inibição pelo MG132 da sinalização do estresse do RE. Portanto, o proteasoma parece exercer papel na integração de estresses celulares envolvendo a NADPH oxidase. A inibição do proteasoma pode ter papel na terapia de doenças associadas a estresse do RE. / Cellular processes governing vascular Nox family NADPH oxidases in disease conditions are unclear. Since redox processes are intrinsic to cell stress response, we asked whether oxidative stress merges with other types of stress via Nox(es). We focused on proteasome inhibition as a relevant stress condition. Vascular smooth muscle cells (VSMC) incubation with non-apoptotic concentrations of proteasome inhibitors MG132 or lactacystin promoted increased baseline superoxide generation (HPLC/DHE products) and NADPH oxidase activity, decreased SOD activity and GSH/GSSG ratio. Conversely, proteasome inhibitors decreased by Nox response to Angiotensin II (AngII) and abrogated Nox response to endoplasmic reticulum (ER) stressor tunicamycin. With MG132, basal Nox1 mRNA levels were increased, while Nox1 response to AngII was blunted. Moreover, MG132 abolished Nox4 mRNA levels TN-induced. Both AngII and TN (at 2 and 4 hs) promoted increased 20S proteasome lytic activity. We next assessed physiological consequences of MG132 in ER stress signaling, a known Nox4- mediated response. VSMC incubation with MG132 alone enhanced expression of the ER stress markers Grp78 and XBP1 and late markers such as ATF4 and proapoptotic CHOP/GADD153. Similar results occurred with the known ER stressor TN. However, co-incubation of TN and MG132 decreased Grp78, Grp94 and CHOP/GADD153, indicating that proteasome inhibition interrupts ER stress. AKT and p38 are activated by MG132 as response to stress and recover to survival. Thus, proteasome inhibition disrupts NADPH oxidase, with increased baseline activity and Nox1 expression vs. strong inhibition of stimulated Nox1 and Nox4 activation/expression. The later effect may underlie MG132-mediated inhibition of ER stress signaling. (Support: FAPESP, CNPq Milênio Redoxoma)

A proteína dissulfeto isomerase (PDI) tem ganhado destaque em processos de sinalização celular. O objetivo deste trabalho foi investigar o papel da PDI na sinalização redox induzida por TNF-a em células endoteliais e por Angiotensina II (Ang II) em células musculares lisas vasculares (CMLV). Em cultura de células endoteliais isoladas da veia umbilical humana (HUVECs) os dados demonstraram que a PDI e a ERp46 regulam especificamente a fosforilação da ERK 1/2 induzida por TNF-a, possivelmente via alterações redox sobre a GTPase Ras e participa da angiogenese induzida por TNF-a. Em CMLV de artérias de resistência, os dados sugerem a participação da PDI na contração induzida por Ang II, bem como na disfunção vascular associada à hipertensão arterial, através da regulação da expressão e atividade da Nox1. Desta forma, podemos concluir que a PDI apresenta um papel na regulação da sinalização redox induzida por TNF-a e Ang II em células endoteliais e CMLV, respectivamente. Tais resultados apontam para um novo papel da PDI na fisiopatologia do sistema cardiovascular. / Protein disulfide isomerase (PDI), an oxidoreductase of endoplasmic reticulum, has emerged as a key player in cell signaling. The aim of the present study was to investigate the role of PDI in redox signaling induced by TNF-a in endothelial cells and by Angiotensin II (Ang II) in vascular smooth muscle cells (VSMCs). In human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) ERp46 or PDI inhibition reduced specifically TNF-a-induced ERK1/2 phosphorylation, possibly via redox modifications in Ras GTPase and TNF-a-induced angiogenesis. In VSMCs from resistance arteries, our results suggest that PDI positively regulates Nox1 dependent signaling and expression in VSMCs from resistance arteries and could be a new player in the oxidative stress and vascular dysfunction observed in hypertension. Altogether, the results provide evidence for a role for PDI in cardiovascular pathophysiology.