Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015 / Made available in DSpace on 2015-06-02T04:08:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 333914.pdf: 1463583 bytes, checksum: 4b55a96be627a5ad68a55463453ece36 (MD5) Previous issue date: 2015 / A incidência de doenças virais tem implicado em significativas perdas econômicas para a carcinicultura. Nesse contexto, a busca por estratégias que aumentem a capacidade dos camarões de sobreviver a surtos virais é de grande interesse para a aquicultura, como ativar as defesas antivirais utilizando a tecnologia de RNA de interferência (RNAi). O presente trabalho avaliou o efeito do silenciamento gênico do vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) na sobrevivência de camarões Litopenaeus vannamei e no perfil transcricional de genes associados ao seu sistema imune. Animais previamente tratados com dsRNA específico para o genoma do IMNV (dsRNA-IMNV) foram desafiados com uma dose letal desse mesmo vírus (1,02×106 cópias virais), enquanto camarões do grupo controle foram tratados com dsRNA vírus-inespecífico (gene IGSF4D de Danio rerio). O tratamento com dsRNA-IMNV conferiu uma proteção específica contra o IMNV, levando a uma sobrevivência de 90 % (30 dias), enquanto todos os animais tratados com dsRNA inespecífico morreram em 17 dias. A expressão de 46 genes, de diferentes categorias funcionais, foi quantificada por PCR quantitativa em tempo real nos diferentes grupos experimentais nos tempos 0 h, 24 h e 48 h pós-infecção. Dos genes analisados, 39 (85 %) apresentaram a expressão inalterada em todas as condições analisadas. Por outro lado, seis genes (13 %) pertencentes às categorias funcionais defesa antiviral (Lv-Ago2 e LvDcr2), defesa antimicrobiana (Litvan ALF-D e LvCrustin), reconhecimento (LvGal) e apoptose (LvIAP) foram diferencialmente expressos entre os animais que sobreviveram ou não sobreviveram à infecção por IMNV. Em conjunto, a expressão desses genes constitui uma assinatura transcricional associada a uma resposta imune eficaz contra o IMNV. De maneira interessante, o gene de coagulação (LvClot) apresentou expressão diferenciada apenas em função do tratamento com o dsRNA inespecífico (24h e 48 h pós-desafio), apresentando maiores níveis de transcritos nos animais que sucumbiram à infecção. A expressão de LvClot pode representar assim um indicativo precoce de estado mionecrótico em camarões. Com base nos resultados obtidos no presente estudo, foi possível identificar uma assinatura transcricional em hemócitos de L. vannamei associada à indução de proteção antiviral específica nos camarões, utilizando a técnica de RNAi. Assim, este é o primeiro relato da identificação de efetores do sistema imune potencialmente envolvidos na proteção e sobrevivência de camarões frente à infecção pelo IMNV.<br> / Abstract: The incidence of viral diseases has been implied in significant economic losses to the shrimp farming industry. In this context, strategies to improve the ability of shrimp to survive viral outbreaks are a major goal for aquaculture, such as the activation of shrimp antiviral defenses by using the RNA interference (RNAi) technology. The present study evaluated the effect of the RNAi-mediated gene silencing of the Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) on the survival of Litopenaeus vannamei shrimp and on the expression profile of genes associated to its immune system. Animals previously treated with dsRNA specific to the IMNV genome (dsRNA-IMNV) were challenged with a lethal dose of the virus (1.02×106 viral copies), while shrimp from the control group were treated with a nonspecific dsRNA (dsRNA-IGSF4D from Danio rerio). The dsRNA-IMNV treatment provided a specific protection against the IMNV, reaching a survival rate of 90 % (up to 30 days), whereas all animals treated with the nonspecific dsRNA died within 17 days. The expression of 46 genes, from different functional categories, was assessed in all experimental groups at 0 h, 24 h and 48 h post-infection. From those, 36 genes (85 %) did not change their expression pattern in all analyzed conditions. On the other hand, six genes (13 %) from the functional categories antiviral defense (Lv-Ago2and LvDcr2), antimicrobial defense (Litvan ALF-D and LvCrustin), microbial recognition (LvGal) and apoptosis (LvIAP) were differentially expressed between shrimp that survived and not survived to IMNV infection. Taken together, the expression of these genes can be considered as a transcriptional signature associated with an efficient immune response against IMNV. Interestingly, the coagulation gene (LvClot) was differently expressed only in the treatment with nonspecific dsRNA (24 h and 48 h post-infection), showing higher levels of transcripts in animals that succumbed to the infection. The expression of LvClot could be an indicative of an initial state of myonecrosis in shrimps. Based on these results, it was identified a hemocyte transcriptional signature in L. vannamei associated with the induction of a specific antiviral protection in shrimp, using the RNAi approach. Therefore, this is the first report on the identification of immune effectors potentially involved in shrimp protection and survival to IMNV infection.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T00:21:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289632.pdf: 1916144 bytes, checksum: 67af3bb6cca1c4c3c30dc049f92d0a4b (MD5) / O vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) causa uma doença progressiva em camarões de cultivo com substanciais perdas econômicas no Brasil e na Indonésia. Métodos imunológicos simples e rápidos para a detecção do IMNV ainda não são disponíveis devido à falta de anticorpos monoclonais (AcMo) contra o vírus. Neste trabalho, dois fragmentos do gene da proteína do capsídeo do IMNV, abrangendo os aminoácidos 105-297 (IMNV105-297) e 300-527 (IMNV300-527), foram clonados e expressos em Escherichia coli. Ambas sequências nucleotídicas e aminoacídicas deduzidas de IMNV105-297 e IMNV300-527 apresentaram elevada identidade com sequências de IMNV isolados no Brasil (99%) e na Indonésia (98%). Dentre os hibridomas que foram obtidos, seis AcMo anti-rIMNV105-297 (1.1D, 1.3H, 3.3G, 3.9G, 4.6C, 5.4H) e dez AcMo anti-rIMNV300-527 (1.3G, 1.3H, 1.8C, 2.9C, 2.9E, 3.3A, 9.7F, 9.8D, 9.8H, 11.2D) foram selecionados para se avaliar suas reatividades contra a proteína do capsídeo viral presente em lisado de camarões infectados por IMNV. Nos ensaios de imunodot-blot, cinco AcMo anti-rIMNV105-297 e oito AcMo anti-rIMNV300-527 apresentaram distintas sensibilidades contra lisados de tecido muscular infectado por IMNV, bem como contra rMNV105-297 ou rIMNV300-527. Dentre esses, três AcMo anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C, 5.4H) e cinco AcMo anti-rIMNV300-527 (1.3H, 1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) demonstraram alta especificidade contra a proteína nativa do IMNV nos ensaios de Western-blot, visto que reconheceram somente uma proteína de 100 kDa - massa esperada para a proteína do capsídeo do IMNV. Nas imunohistoquímicas, dois AcMo anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C) e quatro AcMo anti-rIMNV300-527 (1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) ligaram-se a inclusões virais presentes em fibrose muscular e em áreas de necrose coagulativa. Concluindo, esses seis AcMo foram sensíveis e específicos em todos os imunoensaios realizados e poderão ser utilizados em testes de imunodiagnóstico de rotina para prevenção e controle da disseminação do IMNV. / Infectious myonecrosis virus (IMNV) has been causing a progressive disease in farm-reared shrimp with substantial economical loses in northeastern Brazil and Indonesia. Simple and rapid immunological methods for IMNV detection are not yet available due to the lack of monoclonal antibodies (MAbs) against the virus. In this report, two fragments of the IMNV major capsid protein gene, comprising amino acids 105-297 (IMNV105-297) and 300-527 (IMNV300-527), were cloned and expressed in Escherichia coli. Both nucleotide and deduced amino acid sequences of IMNV105-297 and IMNV300-527 displayed high identity to IMNV isolated from Brazil (99%) and Indonesia (98%). Among several clones secreting antibodies against the IMNV recombinant proteins, six MAbs anti-rIMNV105-297 (1.1D, 1.3H, 3.3G, 3.9G, 4.6C, 5.4H) and ten MAbs anti-rIMNV300-527 (1.3G, 1.3H, 1.8C, 2.9C, 2.9E, 3.3A, 9.7F, 9.8D, 9.8H, 11.2D) were selected to evaluate their reactivity against the native IMNV capsid protein from IMNV-infected shrimp. In immunodot-blot, five MAbs anti-rIMNV105-297 and eight MAbs anti-rIMNV300-527 presented distinct levels of sensitivities against IMNV-infected muscle tissue homogenate and against rIMNV105-297 or rIMNV300-527. From those, three MAbs anti-IMNV105-297 (1.3H, 4.6C, 5.4H) and five MAbs anti-IMNV300-527 (1.3H, 1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) demonstrated high specificity against the native IMNV protein in Western-blot, since they only recognized a 100 kDa protein - the predicted mass of IMNV capsid protein. In immunohistochemistry, two MAbs anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C) and four MAbs anti-rIMNV300-527 (1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) bound to viral inclusions present in muscle fibrosis and coagulative necrosis areas. In conclusion, these six MAbs were sensitive and specific in all immunoassays performed herein, and can be used in routine immunodiagnostic tests to prevent and control IMNV dissemination.

Orientadores: Vitor Baranauskas, Maria Alice da Cruz-Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-25T18:03:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_WilliansFernando_M.pdf: 6828315 bytes, checksum: caab660e36c10bd15dfb824c4b1a18fe (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O tecido muscular é o principal afetado nos acidentes com veneno botrópico. O estudo do uso da luz, por meio da irradiação laser de baixa intensidade, busca possibilitar um recurso alternativo ao antiveneno. Camundongos Swiss (Mus musculus) machos, adultos jovens (6-8 semanas), massa corporal média de 22-25 ± 3g, receberam injeção intramuscular (m. gastrocnêmio direito) (20-25?l) do veneno liofilizado (diluído em NaCl 0,9%) de serpente do gênero Bothrops jararacussu (Bjssu) na concentração de 0,83mg/kg [grupos "veneno" (V), "veneno + laser" (VL) e "veneno + laser desligado"(VLP)]. Paralelamente, foi administrada injeção de NaCl 0,9% em animais dos grupos "salina" ["salina" (S), "salina + laser" (SL) e "salina + laser desligado" (SLP)]. A primeira irradiação laser (GaAs-904nm; área de tratamento: 1,0cm²; densidade de potência: 20 W/cm²; densidade de energia: 4 J/cm²; 4J/sessão de tratamento; modo contínuo; ponto único em contato direto; 1min 32s) foi realizada 3h pós-lesão/injeção de Bjssu/NaCl 0,9%, respectivamente nos grupos VL e SL. O tratamento foi repetido após 24, 48 e 72h. Desde o momento pré-lesão, os animais passaram por análise da função motora dinâmica por meio do sistema CatWalk. Terminado o período de 72h, foram sacrificados em câmara de CO2 e o m. gastrocnêmio coletado para análise. As amostras foram processadas e submetidas a técnicas de análise histológica, PCR quantitativa, espectroscopia Raman e FT-IR. Os animais dos grupos V e VLP não realizaram apoio do membro posterior direito (mantiveram postura flexora reflexa) no período de 3h pós-lesão, diferentemente (p<0,05) dos grupos VL, S e SL. A função motora foi reestabelecida em 24h. Na análise histológica foi observada extensa presença de infiltrado inflamatório na região da injeção de Bjssu, principalmente no período de 48h, tanto para os grupos V quanto para os grupos VL. Nos grupos S e SL as características morfológicas do tecido muscular permaneceram similares ao músculo intacto. A área de lesão mionecrótica foi significativamente menor (p<0,05) nos grupos tratados. Foi observada expressão relativa do gene miogenina significativamente maior (p<0,05) no período de 72h, para o grupo VL quando comparado ao grupo V. Por meio das técnicas de espectroscopia Raman e FT-IR foi possível caracterizar o tecido muscular normal e mionecrótico, bem como a influência do laser GaAs nestes tecidos. De maneira geral, podemos considerar que o laser GaAs promoveu melhora da função motora dinâmica, reduziu a área de lesão mionecrótica e influenciou a expressão gênica no modelo de mionecrose induzida por veneno de Bothrops jararacussu / Abstract: Muscle tissue is primarily affected in accidents with Bothrops venom. The study of the use of light through the low-level laser therapy seeks to enable an alternative tool to antivenom. Males Swiss mice (6-8 weeks old), mean body mass of 22-25 ± 3g, received intramuscular injection (right gastrocnemius) (20-25?l) of lyophilized Bothrops jararacussu venom (Bjssu) at a concentration of 0.83mg/kg ["venom" (V), "venom + laser" (VL) and "venom + laser off" (VPL) groups]. Similarly, was administered 0.9% NaCl injection into "saline" groups ["saline" (S), "saline + laser" (SL) and "saline + laser off" (SLP)]. The first laser irradiation (GaAs-904nm; 1.0cm² area of treatment; 20 W/cm² power density; 4 J/cm² energy density; 4J/treatment session; continuous mode; single point; direct contact; 1min 32s) was performed 3h post-injury/injection in VL and SL groups. Laser treatment was repeated after 24, 48 and 72h. From the moment pre-injury, animals underwent for dynamic motor function analysis through the CatWalk system. After the 72h period, animals were sacrificed in a CO2 chamber and gastrocnemius muscle collected for analysis. Samples were processed and subjected to histological analysis techniques, quantitative PCR, Raman and FTIR spectroscopy. The animals in V and VPL groups did not perform support of the right hindlimb (kept flexed in a reflex posture) 3h post-injury, unlike (p<0.05) VL, S and SL groups. Motor function was reestablished in 24h. Extensive inflammatory infiltrate in the Bjssu injection region was observed, mainly in the 48h period for both V and VL groups. Morphological characteristics of muscle tissue in S and SL groups remained similar to the muscle intact. The myonecrosis area was significantly lower (p <0.05) in treated groups. Relative expression of myogenin gene was significantly higher (p <0.05) at 72h period to VL group when compared to V group. Raman and FTIR spectroscopy techniques allowed the characterization of normal and injured muscle tissue as well the influence of GaAs laser on these tissues. In general we can consider that the GaAs laser improved the dynamic motor function, reduced the injury area and influenced gene expression in myonecrosis induced by Bothrops jararacussu venom / Mestrado / Eletrônica, Microeletrônica e Optoeletrônica / Mestre em Engenharia Elétrica

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2017-02-22T16:21:30Z No. of bitstreams: 1 Veronica Arns da Silva.pdf: 500226 bytes, checksum: 2a21789fca9964130708e123521a1f6c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-22T16:21:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Veronica Arns da Silva.pdf: 500226 bytes, checksum: 2a21789fca9964130708e123521a1f6c (MD5) Previous issue date: 2007-02-22 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The Infectious Myonecrosis Viral (IMNV), restricted action to the Brazilian northeast up to 2006, is disease of bigger negative impact in the shrimp cultured of the region. Having the objective to verify occurrence and evolution of the IMNV in Litopenaeus vannamei cultured on the coast of Pernambuco, Brazil, histopathological examination in 60 samples of shrimps from four farms in two cycles of aquaculture was proceeded. The histopatological findings had been correlated the data of the wet mount and the inquiry. Suggestive injuries of IMNV (coagulation necrosis, muscular hemocitic infiltration, spheroid of the ectopic lynphoid organ) were found in samples of the four studied farms with bigger occurrences in the first cycle. However, in the rainy period it had reduction of the occurrence, being associated the handling change. The raise time and the density were variables which influenced significantly (P<0,05) in the manifestation of the IMNV. / A Mionecrose Infecciosa Viral (IMNV), de ação restrita ao nordeste brasileiro até 2006, é a doença de maior impacto negativo na carcinicultura da região. Com objetivo de verificar ocorrência e evolução da IMNV em Litopenaeus vannamei, cultivado no litoral de Pernambuco, Brasil, procedeu-se ao exame histopatológico em 60 amostras, provenientes de quatro fazendas, em dois períodos (estio e chuvoso). Os resultados histopatológicos foram relacionados com os do exame a fresco e do inquérito. Em amostras das quatro fazendas foram identificadas lesões sugestivas de IMNV (necrose de coagulação, infiltração hemocítica na musculatura, esferóides ectópicos do órgão linfóide), havendo maior ocorrência de lesões no período de estio. Entretanto, no período chuvoso houve redução da ocorrência, sendo associada a mudança de manejo. O tempo de cultivo e a densidade de estocagem, foram variáveis que influenciaram significativamente (P<0,05) na manifestação da IMNV.

Orientador: Maria Alice da Cruz Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T14:48:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rocha_Thalita_D.pdf: 12491560 bytes, checksum: ab548083ce9ee87e876b9cd018db9d32 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Venenos e toxinas de animais peçonhentos são importantes ferramentas farmacológicas para o estudo de fenômenos biológicos. Os venenos produzidos por insetos sociais da ordem Hymenoptera têm chamado a atenção de bioquímicos, imunologistas, farmacologistas e neurologistas, tanto do ponto de vista clínico como biotecnológico. Neste trabalho o mastoparano (MP) Polybia-MPII (INWLKLGKMVIDAL-NH2), do veneno da vespa Polybia paulista, serviu de ferramenta para avaliar se o peptídeo tem ação miotóxica e neurotóxica, bem como determinar a natureza dessa ação em biomembranas. A ação miotóxica foi avaliada pela análise morfológica ao microscópio de luz e eletrônico e morfometria durante as fases degenerativa (3 e 24 horas) e regenerativa (3, 7 e 21 dias) após a injeção intramuscular de 0,25 mg/ml do peptídeo. Com o objetivo de identificar os eventos celulares e moleculares que acompanham essas alterações nos diferentes períodos analisados, foi avaliada a expressão das citocinas pró-inflamatórias, o fator de necrose tumoral (TNF-a) e o interferon gama (IFN-g). Em geral, na avaliação da ação local de venenos e toxinas, tem sido dado ênfase à capacidade de induzir mionecrose e tem-se negligenciado a capacidade de induzir apoptose por parte dessas substâncias. No presente trabalho, através da técnica de TUNEL e da imunomarcação de caspases 3 e 9, foi analisado a capacidade do Polybia-MPII em promover morte celular programada por apoptose no músculo tibial anterior. A ação neurotóxica do Polybia-MPII foi avaliada por microscopia confocal e microscopia eletrônica de transmissão e consistiu em investigar a organização da inervação dos terminais em secções longitudinais através da marcação com alfa-bungarotoxina conjugada com tetrametilrodamina (TRITC-aBTX) ou com isotiocianato de fluoresceína (FITC-aBTX), e contra-imunomarcados com sinaptofisina (marcador específico para vesículas sinápticas) e neurofilamentos, e pela contagem de vesículas sinápticas nos terminais colinérgicos. Os resultados mostraram pela primeira vez que o mastoparano de P. paulista é um potente indutor de mionecrose e apoptose. A atividade miotóxica do peptídeo mostrou iniciar-se pela lise do sarcolema seguida por diferentes estados patológicos comprometendo a organização miofibrilar, seguida pela lise das miofibras e das miofibrilas, com preservação da lâmina basal. A indução de apoptose pelo peptídeo foi demonstrada morfologicamente pela técnica de TUNEL, presença de caspase 3 e 9 e pela severa alteração mitocondrial e alteração da cromatina dos núcleos observadas por microscopia eletrônica, as quais coincidiram com expressão aumentada de IFN-g e TNF-a, esta uma citocina que medeia a ativação de uma das via das caspases que leva à morte celular programada por apoptose. Com relação à atividade neurotóxica, os resultados mostraram que o Polybia-MPII possui ação pré-sináptica, devido à significativa diminuição no conteúdo de vesículas sinápticas nos terminais pré-sinápticos, corroborando com dados do nosso grupo que evidenciaram através de estudos eletrofisiológicos a mesma ação neurotóxica pré-sináptica causada pelo veneno bruto de P. paulista. Esses efeitos foram variáveis ao longo dos diferentes períodos analisados, mostrando que as alterações eram transitórias e que os fenômenos regenerativos permitiam o restabelecimento da morfologia original. Os estudos biofísicos feitos em membranas artificiais mostraram que o Polybia-MPII interage com a bicamada lipídica da membrana, provavelmente utilizando o triptofano como ancoragem através de um mecanismo conhecido como ¿carpet¿, desestabilizando o equilíbrio iônico e promovendo a ruptura da membrana. Os estudos biofísicos mostraram-se consistentes com as observações morfológicas ao microscópio de luz e eletrônico. Os dados permitem concluir que o mastoparano Polybia-MPII é um potente indutor de mionecrose em músculo esquelético e sua atividade neurotóxica periférica pode ser qualificada como moderada e pré-sináptica; além de induzir apoptose em fibra muscular, cujo significado precisa ser investigado. A reversibilidade dos efeitos causados pelo mastoparano está de acordo com os dados clínicos observados em acidentes com ferroadas de P. paulista em indivíduos não alérgicos, os quais se caracterizam na maioria por serem de pouca gravidade, curta duração e auto-limitantes / Abstract: Venoms and toxins of poisonous animals are important pharmacological tools to study biological phenomena. The venom of social insects as those produced by Hymenoptera get attention from biochemistries, immunologists, biologists, pharmacologists and neurologists, as in a clinic view as biotechnologically. In this study the mastoparan (MP) Polybia-MPII, (INWLKLGKMVIDAL-NH2) from Polybia paulista wasp venom, was used as a tool to analyze if the peptide has myotoxic and neurotoxic effects, as well to determine its action on biomembranes. The myotoxicity of the mastoparan was evaluated during the degenerative phase (3 and 24 hours) and regenerative phase (3, 7 and 21 days) after the intramuscular injection of 0.25 mg/ml of the peptide using light microscopy, transmission electron microscopy and morphometry. With the purpose of determining the cellular and molecular events accompanying the alterations caused by P. paulista wasp mastoparan in these time-points the expression of proinflammatory cytokines, such as the tumor necrosis factor alpha (TNF-a) and interferon gamma (IFN-g) were evaluated. In general, studies on the local effects of venom and toxins have focused on their myotoxic potential, whereas the potential to induce apoptosis has been neglected. In this work, the ability of Polybia-MPII in inducing cell death by apoptosis on the tibial anterior muscle was assessed by TUNEL technique and immunohistochemistry for caspase 3 and caspase 9. The neurotoxic action of Polybia-MPII was evaluated by examining the organization of terminals innervation in longitudinal sections labelled with tetramethylrhodamineconjugated- or isothiocyanate fluorescein-conjugated-alpha-bungarotoxin (TRITC or FITC a-BTX receptor, respectively) and counter labelled with a combination of antisynaptophysin (a specific marker to synaptic vesicles) and anti-neurofilament protein using confocal microscopy and transmission electron microscopy, and by counting the synaptic vesicle within the cholinergic terminals. The results showed for the first time that the Polybia-MPII is a potent inducer of myonecrosis and apoptosis. The myotoxic action of the peptide initiated with the lyses of the sarcolemma followed by the development of different pathologic stages affecting myofibrillar organization, and eventually myofibrils and myofibre lyses, but maintaining unaffected the basal lamina. The ability of the peptide to induce apoptosis was demonstrated by TUNEL technique, immunolabelling of caspase 3 and 9, severe mitochondrial damage and alteration of the structure of nuclei chromatin seen by electron microscopy. Such effects were positively correlated with increased IFN-g and TNF-a expression, being the last one a cytokine which mediates the caspase pathway leading to programmed cell death by apoptosis. Concerning Polybia-MPII neurotoxicity, the results showed a pre-synaptic action of the peptide which was inferred by a decrease in synaptic vesicles content of pre-synaptic terminals, in agreement with electrophysiological studies done by our group with the P. paulista crude venom. These alterations varied along the time intervals analyzed, evidencing that the alterations were transitory and the regenerative phenomena allow to morphological reestablishment. The biophysical studies performed on artificial membranes, showed that the peptide interacted with the lipid bilayer probably anchored by tryptophan and by a mechanism known as carpet. As a result, the ionic balance is impaired inducing membrane leakage. The biophysical data were consistent with the morphological observations by light and electron microscopy. Data allow concluding that Polybia-MPII mastoparan is a mighty inducer of myonecrosis whereas the peripheral neurotoxicity could be considered as moderate and pres-synaptic. Besides, the peptide has an apoptotic-inducing potential on skeletal muscle fibre, the meaning of which deserves further investigation. The reversibility of the mastoparan effects is in accordance with clinical data in non-allergic patients stung by P. paulista, whose outcome is considered of mild, short-lived and self-limiting in severity / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2017-02-22T13:02:10Z No. of bitstreams: 1 Suzianny Maria Bezerra Cabral Silva.pdf: 1259614 bytes, checksum: e36cf9293552877b5a90863a34eee04d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-22T13:02:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Suzianny Maria Bezerra Cabral Silva.pdf: 1259614 bytes, checksum: e36cf9293552877b5a90863a34eee04d (MD5) Previous issue date: 2010-02-01 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei is the most important shrimp species in volume in world aquaculture. However, in recent decades, outbreaks of several diseases, especially viral diseases, were responsible for significant economic losses, threatening the sustainability of shrimp farming worldwide. In 2004, Brazilian shrimp farming was seriously affected by a new disease, caused by the Infectious myonecrosis virus (IMNV). Thus, disease control based on rapid and sensitive pathogen detection methods has become a priority worldwide. In this study, specific quantification method for IMNV was developed using real-time PCR with SYBR Green dye and viral load of the principal target tissues was quantified. A recombinant plasmid that contains the target IMNV sequence was constructed and a linear relationship between plasmid DNA and Ct values (R² = 0.992) was obtained for a range from 108 to 10² copies of IMNV. Viral load of IMNV was different for various tissues, being higher in haemolymph and muscle, followed by pleopods and gill. / O camarão marinho (Litopenaeus vannamei) é a mais importante espécie de camarão em volume na aqüicultura mundial. Entretanto, nas últimas décadas, surtos de diversas doenças especialmente as de etiologia viral foram responsáveis por perdas econômicas significativas,ameaçando a sustentabilidade da carcinicultura mundial. Em 2004, a carcinicultura brasileira foi seriamente afetada por uma nova doença, causada pelo vírus da Mionecrose infecciosa (IMNV). Assim, o controle de doenças baseado em métodos de detecção rápida e sensível de patógenos tornouse uma prioridade em nível mundial. No presente estudo, um método específico de quantificação para IMNV foi desenvolvido usando PCR em tempo real com o corante SYBR Green e a carga viral dos principais tecidos-alvo usados para o diagnóstico de IMNV foi determinada. Um plasmídeo recombinante contendo uma seqüência do vírus foi construído e uma relação linear de 0,992 foi obtida entre a quantidade de DNA plasmidial e os valores de Ct para uma faixa de 108 a 10² cópias de IMNV. A carga viral detectada nos tecidos mostrou que há diferença entre eles e os maiores valores estiveram presentes na hemolinfa e músculo, seguida de pleópodo e brânquia.

Orientadores: Maria Julia Marques, Elaine Minatel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T06:25:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_RafaelVentura_M.pdf: 800859 bytes, checksum: 1bb3eb2604bb7183c771d752b2478081 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Neste trabalho foi verificado se o cromoglicato de sódio protege os músculos distróficos de camundongos mdx da necrose. Camundongos mdx (n=8) com 14 dias de vida pós-natal, antes do início dos ciclos de degeneração e regeneração, foram tratados com cromoglicato de sódio (50mg/Kg/dia; intraperitoneal) por 16 dias. Camundongos mdx (n=8) com a mesma idade foram utilizados como grupo controle, recebendo salina pela mesma via e período. A necrose muscular foi quantificada através do marcador azul de Evans (AE), que penetra na fibra muscular somente quando há lesão do sarcolema. Secções do terço médio dos músculos esternomatóideo e tibial anterior foram obtidas para análise em HE e AE. Foram avaliados o número de fibras musculares positivas ao AE, de fibras musculares com núcleo periférico e de fibras com núcleo central. Foram quantificadas as áreas com infiltrado inflamatório exuberante com células no estágio inicial de regeneração muscular (Área Infl/Reg) e áreas com infiltrado inflamatório escasso com células em estágio avançado de regeneração. O cromoglicato de sódio promoveu diminuição significativa da mionecrose (p<0,05; teste t de Student) em ambos músculos e aumento da porcentagem de fibras com núcleo periférico. No músculo tibial anterior, a diminuição da mionecrose foi de 26% e o aumento de fibras com núcleo periférico, 30%. A área de Infl/Reg aumentou em ambos os músculos (p<0,05; teste t de Student). Os resultados mostram que o cromoglicato de sódio, ministrado antes do início dos ciclos de degeneração/regeneração, protege os músculos distróficos da mionecrose e interfere nos estágios iniciais da regeneração / Abstract: In the present study, we verified whether disodium cromoglycate (cromolyn), an anti-allergic drug, could protect dystrophic mdx muscIe fibers ITom degeneration. Treated mdx mice (n=8; 14 days of age) received daily intraperitoneal iDJections of cromolyn at a dose of 50mglkg body weight in saline, during 15 days. Cromolyn treatment started before the cycIes of muscIe degeneration-regeneration had started. Control non-treated mice (n=8 mdx) were injected with na equivalent amount of saline. For visualization of muscle fiber damage, treated (n=5) and non­ treated mdx (n=5) mice were injected with Evans blue dye (EBD), a marker of sarcolemmal lesion. Cryostat cross-sections of t.he stemomastoid (STN) and tibialis anterior (TA) muscles were stained with HE. The whole cross-sectional area of the muscIes was divided into a regenerated area, a.Tl area of inflammatory celI infiltration/regeneration a.Tld an area of regeneration. The number of regenerated muscle fibers (central nucIeated fibers), fibers with peripheral c.ell nuclei and degenerated fibers (positive to EBD) was counted in the regenerated area. The areas of inflammatory cell infiltrationlregeneration and of regeneration were expressed as a percentage of the total transverse graft area. Cromolyn lead to a significant decrease in myonecrosis and in t.he percentage of central nucleated fibers (p<O.O5; Student's t test). The number of fibers with peripheral nuclei increased in about 30% in t.he TA muscle. The area of inflammation-regeneration increased (p<O.O5; Student's t test) in the cromolyn treated group. These results show that cromolyn treatment before the cycles of muscle fiber degeneration­ regeneration started protects dystrophic muscIe fiber ITom myonecrosis and promotes the earlier stages ofmuscle fiber regeneration / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:41:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bifaroni_RenataManoScatamburlo_M.pdf: 12304500 bytes, checksum: a5c3c67724b7ea654b79231b9f69925a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A heme oxigenase (HO) é uma enzima envolvida na degradação de grupos heme, levando à formação de biliverdina IX, ferro e monóxido de carbono. Em baixas concentrações, esses produtos exercem diversos efeitos protetores, inclusive antiapoptóticos, antiinflamatórios, antiproliferativos e antitrombóticos, enquanto, em concentrações elevadas, podem resultar em hipóxia, comprometimento neurológico, disfunções mitocondriais e hiperbilirrubinemia. Neste estudo, investigamos o envolvimento da HO no aumento da permeabilidade vascular, na hemorragia e na mionecrose causadas pela peçonha de Bothrops jararacussu. A peçonha de B. jararacussu (0,3-3 µg/sítio) aumentou a permeabilidade vascular no dorso de pele de camundongos. Este aumento foi inibido pelo zinco deuteroporfirina 2,4-bis-glicol (ZnDPBG), um inibidor não seletivo da HO, quando administrado i.p. (45 e 90 µmol/kg), mas não quando i.d. (25-200 nmol/sítio). O co-tratamento com o inibidor do óxido nítrico sintase, N?-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, 100 nmol/sítio), não potencializou a inibição por ZnDPBG. ZnDPBG (45 ou 90 µmol/kg, i.p.) não reduziu a hemorragia na pele (3 e 10 µg de peçonha/sítio), mas aumentou esta resposta na dose maior. A peçonha (25 µg e 75 µg) aumentou a atividade da HO em músculo gastrocnêmio de camundongos em dois momentos - um precoce (nas primeiras horas após o envenenamento - fase de lesão aguda) e um tardio (alguns dias após a injeção de peçonha, fase de regeneração muscular). Na dose de 75 µg da peçonha, ocorreu aumento da expressão gênica da HO-1, entre 3 e 12 horas após o envenenamento, com pouca alteração na expressão da HO-2. As alterações histológicas causadas pela peçonha (25 µg e 75 µg) consistiram de três fases: fase 1 (até 6 h ou 12 h pós-peçonha - p.p.), caracterizada por hemorragia e mionecrose, fase 2 (de 12 h a 72 h p.p.), caracterizada por um extenso infiltrado inflamatório e fase 3 (7-28 dias p.p.), caracterizada por células regenerativas e maior deposição de colágeno ao redor destas células. O tratamento com ZnDPBG (90 µmol/kg, i.p.), 15 minutos após a injeção da peçonha (75 µg), inibiu parcialmente a mionecrose, diminuindo também os níveis de CK nas primeiras horas (1-3 h) pós-peçonha. Estes resultados indicam um envolvimento da HO no edema e na mionecrose causadas pela peçonha de B. jararacussu, e mostram que a inibição desta atividade com ZnDPBG pode proporcionar alguma proteção contra esses efeitos locais / Abstract: Heme-oxygenase (HO) is an enzyme involved in the degradation of heme groups that results in the formation of biliverdin IX, iron and carbon monoxide. At low concentrations, these reaction products have anti-apoptotic, anti-inflammatory, anti-proliferative, and anti-thrombotic activities, whereas at high concentrations they can cause hypoxia, neurological damage, mitochondrial dysfunction and hiperbilirrubinemia. In this study, we investigated the involvement of HO in the increase in vascular permeability, hemorrhage and myonecrosis caused by Bothrops jararacussu snake venom. Bothrops jararacussu venom (0.3-3 µg/site) increased the vascular permeability in mouse dorsal skin. This increase was inhibited by zinc deuteroporphyrin 2,4-bis-glycol (ZnDPBG), a non-selective HO inhibitor, when administered i.p. (45 and 90 µmol/kg). In contrast, ZnDPBG given i.d. (25-200 µmol/site) did not affect the increase in vascular permeability. Co-treatment with the nitric oxide synthase inhibitor N?-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 100 nmol/site) did not potentiate the inhibition by ZnDPBG. ZnDPBG (45 or 90 µmol/kg, i.p.) did not reduce the dorsal skin hemorrhage (3 and 10 µg of venom/site), but rather, increased this response at the highest dose. Venom (25 and 75µg) increased the HO activity of mouse gastrocnemius muscle. The increase in activity was biphasic and included early (first few hours after envenoming, corresponding to acute damage) and late (7-18 days after envenoming - muscle regeneration) phases. Enhanced gene expression of HO-1 was seen 3-12 h after envenomation (75 µg), with little change in HO-2 expression. Histological analysis showed that the muscle damage consisted of three phases: phase 1 (up to 6-12 h post-venom), characterized mostly by hemorrhage and myonecrosis, phase 2 (12-72 h post-venom), characterized by an extensive inflammatory infiltrate, and phase 3 (7-28 days post-venom), characterized mainly by regenerative cells and an increase in collagen deposition around these cells. Treatment with ZnDPBG (90 µmol/kg, i.p.) 15 min after venom (75 µg) injection partially attenuated the myonecrosis and also decreased the creatine kinase (CK) levels after 1 and 3 h. Together, these results indicate that HO activity is involved in the edema and myonecrosis caused by B. jararacussu venom, and that the inhibition of this activity with ZnDPBG provides some protection against these local effects / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2016-05-17T20:16:41Z No. of bitstreams: 1 Adriano Silvio dos Santos.pdf: 1418434 bytes, checksum: 4ac5ef78eb225e6693c107993f6ee978 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T20:16:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adriano Silvio dos Santos.pdf: 1418434 bytes, checksum: 4ac5ef78eb225e6693c107993f6ee978 (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / Snakes venom of the Bothrops species induces a local inflammatory reaction, characterized by pain, edema, leukocyte migration and can be accompanied by tissue necrosis. The use of antivenom performs the function of neutralizing the greatest possible amount of circulating venom, thus minimizing its systemic effects, but its action does not extend to local manifestations, and thus require the use of another therapeutic option to control this reaction. The low level laser therapy (LLLT) is used as an alternative treatment in cases of muscle injury due to its biological effects, such as analgesics, anitinflamatory and healing. In a previous study of our lab it was found that LBP can enhance the viability of C2C12 muscle cells after the addition of B. jararacussu venom in the medium and that this effect of LBP is related to protection of the cell membrane. In the present study we analyzed the effect of LBP in the cell monolayer integrity, viability of muscle cells, exposed to injury by myotoxins BthTX - I - and BthTX - II isolated from Bothrops jararacussu venom. Cells received BthTX – I (75 μg / mL) and were immediately irradiated with LLLT Aluminum Indium Gallium Phosphate and Aluminium Gallium Arsenide, the wavelengths (λ) 685nm and 830 nm, power density 4 J/cm2, 100mW of power, total energy 1,3 J, application time of 13 and 35 seconds per point and the cells were incubated for 15, 30 and 60 minutes. The results demonstrated that BthTX – I affect cell viability in a dose dependent manner, but did not change cell integrity. The concentration of 75 μg/mL was chosen for the experiments with LBP. LLLT caused an significant increase in cell viability in all the analyzed period of time and in the λ 685 nm and 830 nm against Bothrops I toxin, however in the LBP λ 685 nm against Bothrops toxin II was effective only at 15 min, while the LBP at λ 830 was effective at 15 and 60 min. The LLLT was not able to change the LDH release at all times and wavelength used. Thus, LBP was able to protect C2C12 muscle cells against the miotoxic effect of isolated myotoxins isolated from B. jararacussu venom. Therefore, the results suggest that LLLT can be considered an effective therapeutic tool in patients bitten by snakes. / O veneno das serpentes do gênero Bothrops induz uma reação inflamatória local intensa, caracterizada por dor, formação de edema, migração leucocitária, podendo ser acompanhada por necrose tecidual. A utilização do soro antibotrópico desempenha a função de neutralizar a maior quantidade possível do veneno circulante, minimizando assim seus efeitos sistêmicos, porém sua ação não se estende às manifestações locais, sendo assim necessário o uso de outro recurso terapêutico para o controle dessa manifestação. A laserterapia de baixa potência (LBP) é uma alternativa de tratamento em situações de lesão muscular, devido a seus efeitos biológicos, tais como analgésicos, antinflamatórios e cicatrizantes. Em trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório, verificou-se que o LBP foi capaz de aumentar a viabilidade de células musculares C2C12, após a adição do veneno de B. jararacussu e que esse efeito do LBP é relacionado a uma proteção da membrana celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do LBP em células musculares C2C12 submetidas à lesão por miotoxinas (BthTX - I e BthTX - II) isoladas do veneno da serpente Bothrops jararacussu quanto a: viabilidade, descolamento celular e liberação da enzima LDH. As células receberam a BthTX – I e BthTX – II na dose 75 μg/mL e foram imediatamente irradiadas com LBP Índio Gálio Alumínio Fósforo e Arseneto de Gálio Alumínio, nos comprimentos de onda (λ) 685 nm vermelho e 830 nm infra-vermelho, de forma pontual, tempo de aplicação de 13 s e 35 s respectivamente e as células foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. Os resultados demonstraram que a BthTX - I e BthTX - II afetou a viabilidade celular de forma dose-dependente, sendo escolhida a dose 75 μg/mL para a realização dos experimentos com o LBP, porém não foi capaz de causar alterações na integridade. O LBP causou aumento significativo na viabilidade celular, em todos os tempos analisados no λ 685 nm e 830 nm frente à BthTX - I, entretanto o LBP no λ 685 nm e λ 830 frente a BthTX - II foi efetivo somente no tempo de 15 e 60. O LBP não foi capaz de diminuir a liberação de LDH em todos os tempos analisados e com os dois λ utilizados. Desta forma, verificou-se que o LBP foi capaz de proteger as células musculares C2C12 contra o efeito miotóxico das miotoxinas isoladas do veneno B. jararacussu e que esta proteção está relacionada ao efeito protetor a nível mitocondrial. Ainda, os resultados obtidos sugerem que o LBP pode ser considerado uma ferramenta terapêutica eficaz em pacientes picados por serpentes.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CHAPTER II: Bothrops snake venoms contain proteins that contribute to the local and systemic effects seen after envenoming, such as edema, myonecrosis, coagulation disorders and hemorrhage. These effects can be triggered by the toxic action of metalloproteinases present in the bothropic venom. This study aimed to perform the purification, biochemical and functional characterization of a metalloproteinase called Moozincin, from Bothrops moojeni snake venom. Moozincin has approximate molecular mass of 28 kDa, displays relevant fibrinogenolytic activity and can be classified as a non-hemorrhagic fibrinogenolytic metalloprotease, in the class P-I. Moozincin was also able to induce edema, myonecrosis and hyperalgesia in experimental animals. Morphological analysis of the evolution of muscle injury revealed the occurrence of degenerative events and leukocyte infiltration already at three hours after application of Moozincin. These effects dominate until 48 hours after administration of the metalloprotease, when hemorrhagic effect was also demonstrated later in skeletal muscle, probably triggered by the action characteristic of metalloproteinases on vascular components and / or indirect action resulting from muscle injury. / CAPÍTULO II: As peçonhas de serpentes do gênero Bothrops contêm toxinas que contribuem com efeitos locais e sistêmicos vistos no envenenamento, como edema, mionecrose, distúrbios de coagulação e hemorragia. Grande parte desses efeitos pode ser desencadeada pela ação tóxica de metaloproteases presentes na peçonha botrópica. Este trabalho teve o objetivo de realizar a purificação e caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease, denominada Moozincina, presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni. A Moozincina tem massa molecular aproximada de 28 kDa e apresenta atividade fibrinogenolítica relevante, podendo ser classificada como uma metaloprotease fibrinogenolítica não-hemorrágica, pertencente à classe P-I. A Moozincina também foi capaz de induzir edema, hiperalgesia e mionecrose em animais experimentais. A análise morfológica da evolução da lesão muscular evidenciou a ocorrência de eventos degenerativos e infiltrado leucocitário já na terceira hora após a aplicação da toxina (Moozincina). Esses efeitos predominam até 48 horas após a administração da metaloprotease, quando também foi evidenciado efeito hemorrágico tardio no músculo esquelético, provavelmente desencadeado pela ação característica de metaloproteases sobre componentes vasculares e/ou por ação indireta decorrente da lesão muscular. CAPÍTULO III: Moozincina é uma metaloprotease recentemente isolada da peçonha da serpente Bothrops moojeni. No presente trabalho foi realizada a caracterização farmacológica de efeitos inflamatórios induzidos pela Moozincina. A aplicação intraplantar da Moozincina (5, 25 and 50 &#956;g/pata) induziu edema e hiperalgesia na pata de ratos. Os efeitos edematogênico e hiperalgésico máximos foram observados 3 e 4 horas após a injeção da toxina, respectivamente. Alguns fármacos como dexametasona (2,5 mg/kg) e indometacina (8,0 mg/kg) reduziram significantemente o edema e a hiperalgesia, já a prometazina (15 mg/kg) e o ácido nordiidroguaiarético (100 mg/kg) reduziram apenas o efeito edematogênico, enquanto HOE-140 (10 &#956;g/pata) e NG-monometil-I-arginina (100 &#956;g/pata) reduziu apenas a hiperalgesia. Esses resultados demonstram a participação de metabólitos de ácido araquidônico em ambos os efeitos inflamatórios induzidos pela Moozincina. Além disso, a ativação de receptores H1 de histamina está especificamente relacionada ao edema e a ação de bradicinina e de óxido nítrico à hiperalgesia. / Mestre em Genética e Bioquímica