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<p>The kidney regulates the excretion of water and electrolytes, which maintains homeostasis and enables control of arterial blood pressure. Hyaluronan, a large negatively charged interstitial glucosaminoglycan, is heterogeneously distributed within the kidney, primarily found in the medulla.</p><p>Medullary hyaluronan content changes depending on the state of body hydration and plays a part in fluid regulation through its water binding and viscoelastic properties. </p><p>The aim of this thesis was to provide new insight into the regulation of intrarenal hyaluronan during different states of body hydration, during completion of kidney development, and during diabetes mellitus.</p><p>Dehydration reduces medullary interstitial hyaluronan in parallel with reduced hyaluronan synthase 2 gene expression and increased urinary hyaluronidase activity. Acute hydration results in an increase in medullary hyaluronan, an increase that requires nitric oxide and prostaglandins. Urinary hyaluronidase activity decreases during hydration. The elevation of hyaluronan is important for reducing water permeability of the interstitium i.e. favoring diuresis.</p><p>Changes in hyaluronan concentration constitute a morphoregulatory pathway that plays a key role in nephrogenesis. The reduction in neonatal hyaluronan depended on an angiotensin II mediated process that does not appear dependent on lymph vessel formation. If angiotensin II is blocked with an ACE inhibitor, hyaluronan accumulates, which results in structural and functional abnormalities in the kidney. </p><p>Renomedullary hyaluronan is elevated during uncontrolled diabetes, which coincides with induction of hyaluronan synthase 2 mRNA, hyperglycemia, glucosuria, proteinuria and overt diuresis. The levels of hyaluronan are probably at a <i>terminus ad quem</i> as no further response was seen during hydration. The higher interstitial expression of hyaluronan during diabetes may be involved in the progression of diabetic nephropathy.</p><p>This thesis in physiology provides new mechanistic insights into the regulation of renal hyaluronan during various aspects of fluid handling.</p>

Understanding protein function highly benefits from the knowledge of its three-dimensional structure, especially in the case of protein-ligand complexes. Structural biology methods such as X-ray crystallography, SAXS and NMR are therefore widely used for structural studies of protein-ligand interaction. In this work, these methods were used to understand two biological processes involving protein interactions: X-ray structural analysis was used to study binding of effector molecule to a prokaryotic transcription factor. NMR and SAXS techniques were used to study interaction of a monoclonal antibody with its protein antigen. Transcriptional regulator DeoR negatively regulates the expression of catabolic genes for the utilization of deoxyribonucleosides and deoxyribose in Bacillus subtilis. DeoR comprises an N-terminal DNA-binding domain and a C-terminal effector-binding domain (C-DeoR), and its function is regulated by binding of a small-molecular effector deoxyribose-5-phosphate. We determined crystal structures of C-DeoR both in the free form and in complex with deoxyribose-5-phosphate. Structural analysis revealed unique covalent binding of effector molecule through a reversible Schiff-base double bond with an effector-binding-site lysine residue. The physiological nature of this binding mode was...

The kidney regulates the excretion of water and electrolytes, which maintains homeostasis and enables control of arterial blood pressure. Hyaluronan, a large negatively charged interstitial glucosaminoglycan, is heterogeneously distributed within the kidney, primarily found in the medulla. Medullary hyaluronan content changes depending on the state of body hydration and plays a part in fluid regulation through its water binding and viscoelastic properties. The aim of this thesis was to provide new insight into the regulation of intrarenal hyaluronan during different states of body hydration, during completion of kidney development, and during diabetes mellitus. Dehydration reduces medullary interstitial hyaluronan in parallel with reduced hyaluronan synthase 2 gene expression and increased urinary hyaluronidase activity. Acute hydration results in an increase in medullary hyaluronan, an increase that requires nitric oxide and prostaglandins. Urinary hyaluronidase activity decreases during hydration. The elevation of hyaluronan is important for reducing water permeability of the interstitium i.e. favoring diuresis. Changes in hyaluronan concentration constitute a morphoregulatory pathway that plays a key role in nephrogenesis. The reduction in neonatal hyaluronan depended on an angiotensin II mediated process that does not appear dependent on lymph vessel formation. If angiotensin II is blocked with an ACE inhibitor, hyaluronan accumulates, which results in structural and functional abnormalities in the kidney. Renomedullary hyaluronan is elevated during uncontrolled diabetes, which coincides with induction of hyaluronan synthase 2 mRNA, hyperglycemia, glucosuria, proteinuria and overt diuresis. The levels of hyaluronan are probably at a terminus ad quem as no further response was seen during hydration. The higher interstitial expression of hyaluronan during diabetes may be involved in the progression of diabetic nephropathy. This thesis in physiology provides new mechanistic insights into the regulation of renal hyaluronan during various aspects of fluid handling.

L'ostéoclaste est une cellule spécialisée dans la résorption de la matrice osseuse. Elle présente une organisation différente de l'actine selon les substrats sur lesquels elle est ensemencée. Sur verre ou plastique, l'actine est sous forme de "podosomes", alors que sur un substrat résorbable, elle se ré-organise en une ceinture conttinue, la zone de scellement (SZ). L'étude de cellules déficientes en WIP nous a permis de démontrer qu'un ostéoclaste sur verre forme 2 domaines d'actine distincts: les coeurs de podosomes et le nuage. Ces 2 domaines sont induits par différents récepteurs, CD44 et Beta3, polymérisés par des voies distinctes, et ont pour fonction l'adhérence et la contraction. Ils se ré-organisent en une unique structure, la SZ, quand l'ostéoclaste est transféré sur un substrat résorbable. Nous avons également démontré que le maintien de la ceinture de podosomes dépend d'un réseau de microtubules intact.

L'hématopoïèse est un processus finement régulé pour permettre sa pérennité et son adaptation aux contraintes physiologiques et pathologiques. Ce potentiel repose en grande partie sur les capacités de quiescence, auto-renouvellement, division asymétrique et multipotence des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Les CSH et progéniteurs hématopoïétiques (CSPH) sont principalement régulés de façon extrinsèque au sein des niches hématopoïétiques médullaires et cette régulation fait intervenir, des contacts intercellulaires et des facteurs diffusibles. Le phénotype " side-population " (SP), secondaire à l'efflux actif d'un colorant fluorescent (Hoechst 33342) par des pompes de type multidrugresistance, est une caractéristique des cellules souches de la plupart des tissus. Au sein de l'hématopoïèse, le phénotype SP est un excellent moyen pour identifier les CSH murines et est associé à leur quiescence et à leur adhésion à la niche endostéale, mais sa valeur comme marqueur des CSH est plus discutée chez l'homme. Les cellules SP, de par leur nature, sont également étudiées en oncologie, et sont associées aux cellules tumorales les plus résistantes et les plus tumorogènes. La compréhension des mécanismes régulant la fonctionnalité SP devrait permettre d'ouvrir des pistes en physiologie quand à la compréhension de la régulation des CSPH par les niches mésenchymateuses et en pathologie pour cibler les mécanismes de chimiorésistance.Dans ce travail nous montrons pour la première fois chez l'homme que l'acquisition du phénotype SP est un phénomène dynamique et versatile sous le contrôle du stroma médullaire. Le stroma médullaire est en effet capable de maintenir le phénotype SP de CSPH médullaires et d'induire le phénotype SP de CSPH circulants. L'acquisition du phénotype SP par les cellules circulantes nécessite à la fois un " nichage " au sein du stroma et des facteurs diffusibles. Les cellules circulantes capables d'acquérir le phénotype SP contiennent des CSPH au regard de (i) leur expression du CD34, (ii) leur richesse en cellules quiescentes, (iii) leur capacité clonogénique et proliférative en cultures secondaires, (iv) leur expression des gènes de " nichage " et de " souchitude ", (v) leur capacité de migration en réponse à un gradient de CXCL12, (vi) leur activité LT-SRC in vivo. De plus nous avons mis en évidence, au sein de ces CSPH SP+CD34+ révélés par le stroma médullaire, une sous-population CD44-/faible qui pourrait contenir les cellules plus immatures en raison de sa quiescence et de l'intensité de son efflux du Hoechst 33342. Les études mécanistiques montrent que l'acquisition du phénotype SP par les cellules circulantes est sous la dépendance de l'intégrine VLA-4 et du CD44. La transduction du signal implique des protéines G et la famille des Src-kinases. Nous montrons également que le stroma médullaire peut induire/maintenir/amplifier la fonctionnalité SP de blastes circulants de leucémie aigüe myéloblastique de façon ß1-intégrine dépendante et que cette fonctionnalité est associée à une capacité d'efflux de Mitoxantrone. Ce mécanisme de modulation de l'activité d'ABC-transporteurs par l'adhésion au stroma correspond à un mécanisme encore jamais décrit de CAM-DR.

La métastase et la chimiorésistance sont les principales causes de mortalité chez les patients atteints d’un cancer. La compréhension des mécanismes moléculaires régissant ces deux processus devient donc un domaine de recherche important pour la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ma thèse, je me concentre sur la compréhension du rôle du facteur d’initiation de la traduction chez les eucaryotes 4E (eIF4E) dans l’invasion du cancer, et je décris un nouveau mécanisme de résistance que nous avons découvert en étudiant le développement de la résistance à un inhibiteur connu d’eIF4E, la ribavirine. eIF4E est un puissant oncogène qui est connu pour être élevé dans une multitude de cancers comprenant entre autres les sous-types M4 / M5 de la leucémie myéloïde aiguë (AML). Il fonctionne dans la traduction et l'exportation nucléocytoplasmique d'ARNm en se liant à la coiffe m7G des ARNm possédant des codes USER spécifiques dans leur région UTR 5' et/ou 3'. En reconnaissant ces codes USER, le complexe dans lequel se trouve eIF4E régule de manière coordonnée l'expression de gènes essentiels à la croissance, à la prolifération et à la survie, et ainsi, eIF4E a été placée en tant que nœud central d'un régulon d'ARN régissant la prolifération. En analysant les voies dans lesquelles l’export est régulé de façon coordonnée par eIF4E et les effets physiologiques qui en découlent, j'ai trouvé un enrichissement de la voie biosynthétique de l'acide hyaluronique (HA) et de son principal récepteur CD44 qui sont des médiateurs clés connus des métastases cancéreuses. J’ai également démontré que l'élévation d’eIF4E modifie la surface des cellules cancéreuses en les recouvrant de protrusions riches en HA de type microvillus et enrichies d'armes de destruction métastatique. Heureusement, en dégradant le manteau HA ou en utilisant des inhibiteurs de CD44 en combinaison avec la ribavirine, nous pouvons alors nous défendre. Compte tenu de l'avantage prolifératif que confère la surexpression d’eIF4E, il est devenu un talon d'Achille attrayant pour le traitement de cancers ayant un niveau élevé d'eIF4E. En effet, lors d'un essai clinique de phase II parmi des patients atteints de leucémie myéloïde aiguë M4 / M5 réfractaire et récidivante, la ribavirine a conduit au ciblage d'eIF4E et a donné lieu à des réponses cliniques significatives, incluant des réponses complètes ou partielles. Cependant, tel qu’attendu lors d’un traitement monothérapique, les patients ayant répondu finissent par développer une résistance au médicament. Mon analyse a révélé que cette résistance est due à un mécanisme nouveau caractérisé par l'élévation du facteur de transcription Sonic Hedgehog GLI1 qui conduit à la glucuronidation du médicament et donc à la perte de l'interaction entre la drogue et sa cible. Heureusement, ce mécanisme peut être inversé en utilisant des inhibiteurs de la voie Hedgehog. En conclusion, ces découvertes fournissent de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des cellules cancéreuses agressives et résistantes. / Metastasis and chemoresistance are the leading cause of mortality among cancer patients. The discovery of molecular mechanisms governing these two processes is becoming an important area of research for the design of novel therapeutic strategies. In my thesis, I focus on understanding the role of the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) in cancer invasion and describe a novel mechanism of resistance that we discovered while studying the development of resistance to a known eIF4E inhibitor, ribavirin. eIF4E is a potent oncogene that is known to be elevated in a multitude of cancers including M4/M5 subtypes of acute myeloid leukemia (AML). It functions in mRNA translation and nucleocytoplasmic export by binding to the m7G cap of mRNAs possessing specific USER codes in their 5’ and/or 3’ UTRs. By recognizing these USER codes, eIF4E complex coordinately regulates the expression of genes essential for growth, proliferation and survival and as such has been placed as a central node of an RNA regulon governing proliferation. When analyzing which pathways have their export coordinately regulated by eIF4E and what physiological effects arise from it, I found an enrichment in the hyaluronic acid (HA) biosynthetic pathway as well as its major receptor CD44 which are known key mediators of cancer metastasis. I demonstrate that eIF4E elevation changes the surface of cancer cells sugar-coating them with HA-rich microvillus-like protrusions that are enriched with weapons of metastatic destruction. Luckily, through degrading the HA-coat or using inhibitors of CD44 in combination with ribavirin we can strike back. Given the proliferative advantage that eIF4E overexpression conveys, this rendered it as an attractive Achilles heel for the treatment of cancers where eIF4E levels are high. Indeed, in a phase II clinical trial in refractory and relapsed poor prognosis M4/M5 AML patients, ribavirin led to eIF4E targeting and resulted in significant clinical responses including complete and partial remissions. However, as it is expected for monotherapy treatment, all responding patients eventually developed resistance to the drug. My analysis revealed that resistance is due to a novel mechanism characterized by elevation of the Sonic Hedgehog transcription factor GLI1 which leads to drug glucuronidation and the subsequent loss of drug-to-target interaction. Fortunately, this mechanism can be reversed using Hedgehog pathway inhibitors. Taken together, these findings provide novel therapeutic venues for the treatment of aggressive and resistant cancer cells.

Hyaluronic acid (HA) is widely studied as a targeting moiety to CD44 overexpressing cancer cells. Various types of nanoparticles (NPs) were modified by HA. Virus-like particles (VLPs) derived from mouse polyomavirus are an interesting class of NPs that can be modified by various targeting agents to increase their potential as gene or drug delivery vehicles for e.g. theragnostic purposes. HA has not been tested as a targeting moiety on VLPs, hence this was the focus of the current study. HA (~14 kDa) was attached to the VLPs via a bispecific Bodipy-derived fluorescent probe. To test the targeting potential of HA on comparable non-viral NPs, nanodiamonds were prepared in a similar manner. NPs functionalized with HA, together with Bodipy-labeled control variants, were tested on interactions with MDA-MB-231 cells overexpressing CD44. The NP-cell interaction via CD44 was assessed by a competitive cell-binding assay, where non-labeled HA competed for HA-binding sites at CD44 with the NPs. CD44 specific cell interactions were detected in studies with HA functionalized nanodiamonds, whereas VLP-HA* associated with cells in a less specific manner. Control VLPs with polyethylene glycol (PEG) did not interact with the cells. Results indicate that the HA targeting strategy for the VLPs requires optimization to...

The Diploma Thesis deals with an implementation of the new method for an assessment of a cloning efficiency of the cancer stem cells separated by a high speed cell sorter. The cell-sowing on the microtitration plates was performed by the flow cytometry method in a combination with the high speed cell sorter. In the first part of the Diploma Thesis the new method was introduced and tested on the selected cell lines. The obtained results were compared with the results of the limiting dilution assay within four cell lines. As for the second part of my Diploma Thesis, the method was practically applied to analysis of the cloning capacity of two subpopulations of cE2 cells based on the expressions of characteristic markers of stem and cancer stem cells - CD44 and CD 133. Based on the findings, the new method can be introduced as an approved proceeding for the cloning capacity assessment of cancer stem cells in other workplaces that possess analogical device equipment.