Le répertoire T CD8 préimmun correspond aux lymphocytes T spécifiques d'antigène circulant en périphérie, et n'ayant pas encore été activés. Ces cellules sont très rares, et de ce fait, n'ont jusqu'ici pas pu être étudiées de façon approfondie. Nous avons dans un premier temps développé un protocole d'enrichissement basé sur la technologie des tétramères. Nous avons pu détecter et énumérer des lymphocytes T CD8 naïfs spécifiques d'antigènes dans le sang de sujets sains. Nous avons ensuite utilisé cet outil pour évaluer le répertoire T préimmun de patients chroniquement infectés par le virus de l'hépatite C (cHCV). Nous avons démontré que celui-ci est significativement perturbé, avec des cellules hypersensibles à l'activation TCR et une proportion importante de lymphocytes T de phénotype mémoire alors qu'ils n'ont pourtant pas rencontré leur antigène cible. Ces anomalies disparaissent après résolution de l'infection, soulignant l'intérêt d'instaurer précocément un traitement antiviral chez ces patients. Enfin, nous avons observé dans un modèle de souris transgéniques (OTI) une proportion importante de T inexpérimentés de phénotype mémoire chez les animaux non-immunisés déficients en cxcr3. Nos travaux démontrent que les lymphocytes T inexpérimentés peuvent perdre leur naïveté dans différentes situations pathologiques. Ces résultats devraient être pris en considération pour l'optimisation de futures stratégies d'immunothérapie, notamment lorsque des patients dits "inflammatoires" sont la cible de vaccinations. Enfin, nos résultats soulignent la difficulté d'interpréter les données d'immunophénotypage en l'absence d'information sur la spécificité antigénique. / The CD8 preimmune repertoire is defined as the set of circulating antigen-specific T CD8 lymphocytes that have not been activated yet by their cognate antigen. Because those cells are very rare, they have not been evaluated in humans. We developed a tetramer-based enrichment protocol that allowed for the first time direct detection and enumeration of those rare naive antigen-specific CD8 T cells in healthys. We then used this tool to characterize the CD8 preimmune repertoire in patients with chronic hepatitis C viral infection. We found that their naive CD8 T cells are dysregulated, being hypersensitive to TCR signals, and with increased proportions of memory-phenotype (MP) cells in inexperienced populations. These perturbations are reversible after viral clearance, highlighting the added benefit of early antiviral treatment. Finally, using a transgenic model (OTI), we observed high proportions of MP inexperienced T cells in the blood of cxcr3-deficient unimmunized mice. This suggests that CXCR3-dependent lymphocyte trafficking could account for some preimmune repertoire alterations. Altogether, our work demonstrates that inexperienced T cells can lose their naiveté in several pathological situations. The impact of these findings will need to be considered when designing future immunotherapeutic strategies - especially when « inflammatory » patients are being targeted. Additionally, we highlight the challenge of interpreting T-cell immunophenotyping studies without getting knowledge into antigen-specific populations.

A doença de Chagas, moléstia causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, resulta freqüentemente em um quadro de miocardite crônica que pode levar à morte do paciente. As causas que determinam a afetação cardíaca não estão totalmente esclarecidas. A nossa hipótese de trabalho é que o desafio poderia aumentar a ação efetora do sistema imune frente ao T. cruzi, resultando em redução da carga parasitária sistêmica e local, e, em longo prazo, em diminuição da patologia. A análise histopatológica mostrou que a manutenção prolongada do desafio foi capaz de reduzir moderadamente mas significantemente a patologia no coração. Estas experiências podem auxiliar a esclarecer a etiopatogenia do processo patológico cardíaco, confirmando que esta seja devida à reação frente aos parasitas remanescentes. Mais importante, os nossos resultados podem abrir uma esperançosa perspectiva de tratamento aos indivíduos de fase crônica. / Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi frequently results in chronic myocarditis that may result in death. The mechanisms underlying cardiac pathology are not totally clear. Our working hypothesis was that challenge could increase the immune systems effector activity against T. cruzi, leading to reduction in systemic and local parasite loads, which in turn could result, at the long run, in pathology diminution. The hystopathological analysis revealed that sustained challenge led to a small, but significant, decrease in heart pathology. These results could help to elucidate the etiopathogeny of chagasic heart lesions, inasmuch as they support the hypothesis of reactivity towards locally-persisting parasites. More important, our results open a hopeful perspective for the treatment of patients at the chronic phase.

Submitted by ACACIO DUARTE PACHECO (acacio@fmva.unesp.br) on 2016-09-01T16:16:58Z No. of bitstreams: 1 Acácio Impressão Tese Final.pdf: 1381975 bytes, checksum: 5982f80f260a714c02111156f309cccb (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-09-02T18:54:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pacheco_ad_dr_araca.pdf: 1381975 bytes, checksum: 5982f80f260a714c02111156f309cccb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T18:54:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pacheco_ad_dr_araca.pdf: 1381975 bytes, checksum: 5982f80f260a714c02111156f309cccb (MD5) Previous issue date: 2016-07-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A ocorrência de miocardite em cães naturalmente acometidos por Leishmania infantum chagasi tem sido demonstrada em estudos recentes, contudo o tipo de resposta imune incitada no tecido cardíaco de cães com leishmaniose visceral (LV) ainda não foi determinada. Sendo assim, foram avaliados fragmentos da: parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), parede livre de ventrículo esquerdo (VE) e septo interventricular (SIV) de 20 cães naturalmente acometidos por LV para determinação das alterações histopatológicas e da resposta imune no tecido cardíaco. A presença de miocardite foi observada em 75% dos animais avaliados, sendo o infiltrado inflamatório do tipo linfoplasmocitário a alteração mais comum nesses fragmentos. A imunomarcação de Leishmania spp. foi observada em 60% dos animais. Não houve correlação entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a presença de Leishmania sp. no miocárdio (p=0,0682). A imunomarcação do parasito apresentou correlação com a presença de linfócitos T CD4+ (p<0,0001) e T CD8+ (p=0,0002), linfócitos B CD79+ (p=0,046) e IgG (p=0,040). Os níveis de IL-4 (p=0,030), IL-12 (p=0,002), IFN- (p<0,0001) foram menores em cães infectados em relação ao grupo controle, independente da presença ou não do parasito no miocárdio (p>0,05). No presente estudo, a presença de alterações miocárdicas, associadas a resposta imunológica mista foram comuns em cães com LV. Novos estudos avaliando paralelamente, a presença de inflamação miocárdica e o perfil de citocinas no tecido cardíaco, à resposta imunológica sistêmica são indicados para confirmação da resposta imunológica presente no miocárdio de cães acometidos por LV. / Recent studies have demonstrated the occurrence of myocarditis in dogs naturally infected with Leishmania infantum chagasi, however the type of immune response in cardiac tissue of dogs with visceral leishmaniasis (VL) has not been determined. For this purpose, fragments from right atrial free wall (AD), right ventricular free wall (RV), left ventricular free wall (LV) and interventricular septum (IVS) of 20 dogs naturally affected by VL were evaluated to determine the histopathological changes and the immune response in heart tissue. The presence of myocarditis has been reported in 75% of the evaluated animals, and an lymphoplasmocytic inflammatory infiltrate was the most common change in these fragments. The immunostaining of Leishmania sp. was observed in 60% of the evaluated animals. There was no correlation between the intensity of the inflammatory infiltrate and the presence of Leishmania sp. (p = 0.0682). The immunostaining of the parasite correlated with the presence of CD4 + (p <0.0001) and CD8 + T lymphocytes (p = 0.0002), CD79 + B lymphocytes (p = 0.046) and IgG (p = 0.040). IL-4 (p = 0.030), IL-12 (p = 0.002) and IFN- levels (p <0.0001) were lower in the infected dogs when compared to control group, regardless of the presence or absence parasite in the myocardium (p> 0.05). The results obtained in this study suggest that the presence of myocardial changes is common in dogs with VL, associated with a mixed immune response in heart tissue. However, the local inflammatory process seems not enough to trigger the production of cytokines normally involved in VL, possibly due to a low parasite load in dogs myocardium, especially when compared to other organs such as spleen, liver and bone marrow. Further studies evaluating at the same time the presence of myocardial inflammation and the behavior of these circulating cytokines in target organs with immune activity are indicated to confirm the immune response present in the myocardium of dogs affected by VL. / FAPESP: 2013/12129-8 / CNPq: 141536/2013-6

Orientador: Mary Marcondes / Banca: Wagner Luis Ferreira / Banca: Katia denise Saraiva Bresciani / Banca: Heitor Flavio ferrari / Banca:fernanda Muller de Oliveira Ravai / Resumo: A ocorrência de miocardite em cães naturalmente acometidos por Leishmania infantum chagasi tem sido demonstrada em estudos recentes, contudo o tipo de resposta imune incitada no tecido cardíaco de cães com leishmaniose visceral (LV) ainda não foi determinada. Sendo assim, foram avaliados fragmentos da: parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), parede livre de ventrículo esquerdo (VE) e septo interventricular (SIV) de 20 cães naturalmente acometidos por LV para determinação das alterações histopatológicas e da resposta imune no tecido cardíaco. A presença de miocardite foi observada em 75% dos animais avaliados, sendo o infiltrado inflamatório do tipo linfoplasmocitário a alteração mais comum nesses fragmentos. A imunomarcação de Leishmania spp. foi observada em 60% dos animais. Não houve correlação entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a presença de Leishmania sp. no miocárdio (p=0,0682). A imunomarcação do parasito apresentou correlação com a presença de linfócitos T CD4+ (p<0,0001) e T CD8+ (p=0,0002), linfócitos B CD79+ (p=0,046) e IgG (p=0,040). Os níveis de IL-4 (p=0,030), IL-12 (p=0,002), IFN- (p<0,0001) foram menores em cães infectados em relação ao grupo controle, independente da presença ou não do parasito no miocárdio (p>0,05). No presente estudo, a presença de alterações miocárdicas, associadas a resposta imunológica mista foram comuns em cães com LV. Novos estudos avaliando paralelamente, a presença de inflamação miocá... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Recent studies have demonstrated the occurrence of myocarditis in dogs naturally infected with Leishmania infantum chagasi, however the type of immune response in cardiac tissue of dogs with visceral leishmaniasis (VL) has not been determined. For this purpose, fragments from right atrial free wall (AD), right ventricular free wall (RV), left ventricular free wall (LV) and interventricular septum (IVS) of 20 dogs naturally affected by VL were evaluated to determine the histopathological changes and the immune response in heart tissue. The presence of myocarditis has been reported in 75% of the evaluated animals, and an lymphoplasmocytic inflammatory infiltrate was the most common change in these fragments. The immunostaining of Leishmania sp. was observed in 60% of the evaluated animals. There was no correlation between the intensity of the inflammatory infiltrate and the presence of Leishmania sp. (p = 0.0682). The immunostaining of the parasite correlated with the presence of CD4 + (p <0.0001) and CD8 + T lymphocytes (p = 0.0002), CD79 + B lymphocytes (p = 0.046) and IgG (p = 0.040). IL-4 (p = 0.030), IL-12 (p = 0.002) and IFN- levels (p <0.0001) were lower in the infected dogs when compared to control group, regardless of the presence or absence parasite in the myocardium (p> 0.05). The results obtained in this study suggest that the presence of myocardial changes is common in dogs with VL, associated with a mixed immune response in heart tissue. However, the local inflam... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A doença de Chagas, moléstia causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, resulta freqüentemente em um quadro de miocardite crônica que pode levar à morte do paciente. As causas que determinam a afetação cardíaca não estão totalmente esclarecidas. A nossa hipótese de trabalho é que o desafio poderia aumentar a ação efetora do sistema imune frente ao T. cruzi, resultando em redução da carga parasitária sistêmica e local, e, em longo prazo, em diminuição da patologia. A análise histopatológica mostrou que a manutenção prolongada do desafio foi capaz de reduzir moderadamente mas significantemente a patologia no coração. Estas experiências podem auxiliar a esclarecer a etiopatogenia do processo patológico cardíaco, confirmando que esta seja devida à reação frente aos parasitas remanescentes. Mais importante, os nossos resultados podem abrir uma esperançosa perspectiva de tratamento aos indivíduos de fase crônica. / Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi frequently results in chronic myocarditis that may result in death. The mechanisms underlying cardiac pathology are not totally clear. Our working hypothesis was that challenge could increase the immune systems effector activity against T. cruzi, leading to reduction in systemic and local parasite loads, which in turn could result, at the long run, in pathology diminution. The hystopathological analysis revealed that sustained challenge led to a small, but significant, decrease in heart pathology. These results could help to elucidate the etiopathogeny of chagasic heart lesions, inasmuch as they support the hypothesis of reactivity towards locally-persisting parasites. More important, our results open a hopeful perspective for the treatment of patients at the chronic phase.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O efeito antibacteriano de Ãleos essenciais extraÃdos de folhas das espÃcies de Lippia aff. gracilis e Lippia gracilis frente a cepa de Staphylococcus aureus isolada de Ãlcera de paciente com pà diabÃtico foi avaliado mediante experimentaÃÃo in vitro e in vivo, utilizando-se o modelo experimental de ratos diabÃticos aloxano induzidos. Cento e doze ratos machos Wistar diabÃticos com peso mÃdio de 180g foram distribuÃdos ao acaso em dois experimentos. Cada experimento foi dividido em dois procedimentos que avaliaram a atividade antibacteriana de soluÃÃes dos Ãleos essenciais a 5%, em dois diferentes procedimentos: um no ato da administraÃÃo do inÃculo bacteriano e outro apÃs vinte e quatro horas de administraÃÃo. A administraÃÃo tanto do inÃculo 108ufc/ml quanto da suspensÃo dos Ãleos foi por via subcutÃnea no membro pÃlvico dos ratos diabÃticos. CinqÃenta e seis ratos Wistar foram utilizados para cada experimento, no qual os mesmos foram distribuÃdos ao acaso em 8 (oito) diferentes grupos: 4 grupos por experimento, apresentando 7 ratos por grupo (G1-Branco; G2-Controle negativo; G3-Controle positivo; G4-Teste). Foi verificado que no procedimento 1(S.aureus sem Lippia aff gracilis 108  698 versus S.aureus com Lippia aff gracilis 293,1  79,07; S.aureus sem Lippia gracilis 108  873 versus S.aureus com Lippia gracilis 302  57,2) e no procedimento 2 (S.aureus sem Lippia aff gracilis 108  313 versus S.aureus com Lippia aff gracilis 13,28  4,03; S.aureus sem Lippia gracilis 108  818 versus S.aureus com Lippia gracilis 13,14  4,27); houve reduÃÃo na contagem bacteriana tanto para Lippia aff. gracilis quanto para Lippia gracilis. Quando comparados os grupos G4 com G3, observou-se que esta suspensÃo a 5% nÃo apresentou efeito prÃ-inflamatÃrio. Para a validaÃÃo destes resultados, foram utilizados os testes Mann-Whitney e Bartletts &Newman-Keuls (MÃdia  - E.P.M) com nÃvel de significÃncia de (p<0,05). Ainda neste estudo foi avaliado a aÃÃo antioxidante e imunomoduladora da L-glutamina em modelos de ratos Wistar diabÃticos quando administrada por gavagem a uma concentraÃÃo de 0,7g/kg em um perÃodo de 30 dias. Quarenta ratos Wistar machos foram distribuÃdos ao acaso em 5 grupos (GI-nÃo diabÃtico; GII-diabÃtico; GIII-diabÃtico com salina; GIV-diabÃtico com L-glutamina; GV-diabÃtico com ProteÃna do Soro do Leite). Passado este perÃodo, foram determinadas as concentraÃÃes de substÃncias reativas ao Ãcido tiobarbitÃrico (TBARS) e glutationa reduzida (GSH) no soro e nos tecidos hepÃticos, pancreÃticos, mÃsculo esquelÃtico, rins e tecido adiposo. Para as comparaÃÃes entre o grupo tratado com L-glutamina com os demais, utilizou-se a anÃlise de variÃncia (ANOVA-teste Tukey). As comparaÃÃes entre grupos foram feitas utilizando-se o teste t de Student. Valores de p<0,05 foram considerados significantes. A suplementaÃÃo com L-glutamina induziu ao aumento nas concentraÃÃes de GSH (MÃdia  E.P.M) e reduÃÃo significante nas concentraÃÃes de TBARS (MÃdia  E.P.M), quando comparadas com o grupo controle, nos espÃcimes analisados. A aÃÃo imunomoduladora foi avaliada atravÃs da quantificaÃÃo de linfÃcitos CD4+ e CD8+ em sangue total. Vinte e quatro ratos Wistar machos diabÃticos foram distribuÃdos igualmente em 3 grupos (G1-diabÃtico com salina; G2-diabÃtico com L-glutamina; G3- diabÃtico com ProteÃna do Soro do Leite). Observou-se um aumento significante nas populaÃÃes de linfÃcitos CD4+ (MÃdia  E.P.M) com reduÃÃo nas populaÃÃes de linfÃcitos CD8+ (MÃdia  -E.P.M) do grupo G2 quando comparado com o grupo controle, ressaltando a importÃncia da L-glutamina como imunonutriente / The antibacterial effect of essential oils extracted from leaves of the species of Lippia aff. gracilis and Lippia gracilis against strains of Staphylococcus aureus isolated from patients with diabetic foot ulcers were evaluated in vitro and in vivo experimetation utilizing an experimental model of alloxan-induced diabetic rats. One hundred and twelve male diabetic Wistar rats with mean weight of 180g were distributed by chance into two experiments. Each experiment was divided in two procedures with evaluation of antibacterial activity of essential oils at 5% solutions; one procedure in the act of administration of bacterial inoculums and the other one 24 hours later. 108 CFU (Colony Forming Unit) /mL, as well as oils suspension inoculated in the subcutaneous tissue of the pelvic member of diabetic rats. Lower than 5% concentration of administered solution presented antibacterial effect in the in vitro experiment. Fifty-six Wistar rats were utilized in each experiment, randomly distributed in 08 different groups: 04 groups per experiment, each group with 07 rats (G1-White; G2-Negative Control; G3- Positive control; G4-Test). There was decrease in CFU/mL in procedure 1 (S.aureus without Lippia aff gracilis 108  698 versus S.aureus with Lippia aff gracilis 293,1  9,07; S.aureus without Lippia gracilis 108  873 versus S.aureus with Lippia gracilis 302Â57,2), which evaluated antibacterial effect of oils concomitantly with the administration of inocula as well as in procedure 2 (S.aureus without Lippia aff gracilis 108  313 versus S.aureus with Lippia aff gracilis 13,28  4,03; S.aureus without Lippia gracilis 108  818 versus S.aureus with Lippia gracilis 13,14  4,27) , which evaluated antibacterial effect of oils 24 hours after the administration of the inoculum . When comparing group G4 with G3, it was observed that 5% solution presented no pro-inflammatory effect, for analysis of these results, the tests of Mann-Whitney and Bartletts & Newman-Keuls (X  S.E.M) with level of significance (p<0,05) were used. Part of this study evaluated the antioxidant and immunomodulating effect of L-glutamine in models of Wistar diabetic rats when administered by gavages at a 0,7g/kg during 30 days. Fourty Wistar male rats were randomly distributed in 5 groups (GI- non diabetic; GII-diabetic; GIII-diabetic with saline; GIV- diabetic with L-glutamine; GV- diabetic with Whey Protein). After 30 days concentrations of TBARS and GSH in serum and in hepatic, pancreatic, skeletal muscles, kidneys and fat tissues were determined. For comparisons between the group treated with L-glutamine with the others, the ANOVA â Tukey test was utilized and the comparisons between groups were done using Studentâs t test. Values of p<0.05 were considered significant. The supplementation with L-glutamine induced an increase in the concentrations of GSH (Mean&#61617;S.E.M) and significant reduction in the TBARS (mean  S.E.M) concentrations, when compared to the control group, in the analyzed specimens. The immunomodulating effect was evaluated by quantification of CD4+ and CD8+ lymphocytes in total blood. Twenty-four Wistar male diabetic rats were distributed equally in 3 groups (G1-diabetic with saline; G2-diabetic with L-glutamine; G3- diabetic with Whey Protein). It was seen a significant increase of CD4+ (mean  S.E.M) lymphocytes with reduction of CD8+ (mean  S.E.M) lymphocytes in group G2 when compared to the control group, showing the importance of L-glutamine as an immunonutrient