A new method for enhancing rates of enzymatic hydrolysis for cellulosic fiber is presented. By adding a cationic polyelectrolyte to a cellulase/cellulose hydrolytic system, the polyelectrolyte binds to the cellulase and fiber forming flocs. The cellulase is bound by a patching mechanism. By using this technique, the rate of enzymatic hydrolysis can be enhanced. This thesis covered observations made about the cellulase/cationic polyelectrolyte/fiber interactions. A mechanism was proposed based on the experimental results.

The enzymatic hydrolysis of cellulose to glucose by cellulases is one of the major steps in the conversion of lignocellulosic biomass to biofuel. This hydrolysis by cellulases, a heterogeneous reaction, currently suffers from some major limitations, most importantly a dramatic rate slowdown at high degrees of conversion in the case of crystalline cellulose. Various rate-limiting factors were investigated employing experimental as well as computational studies. Cellulose accessibility and the hydrolysable fraction of accessible substrate (a previously undefined and unreported quantity) were shown to decrease steadily with conversion, while cellulose reactivity, defined in terms of hydrolytic activity per amount of actively adsorbed cellulase, remained constant. Faster restart rates were observed on partially converted cellulose as compared to uninterrupted hydrolysis rates, supporting the presence of an enzyme clogging phenomenon. Cellulose crystallinity is a major substrate property affecting the rates, but its quantification has suffered from lack of consistency and accuracy. Using multivariate statistical analysis of X-ray data from cellulose, a new method to determine the degree of crystallinity was developed. Cel7A CBD is a promising target for protein engineering as cellulose pretreated with Cel7A CBDs exhibits enhanced hydrolysis rates resulting from a reduction in crystallinity. However, for Cel7A CBD, a high throughput assay is unlikely to be developed. In the absence of a high throughput assay (required for directed evolution) and extensive knowledge of the role of specific protein residues (required for rational protein design), the mutations need to be picked wisely, to avoid the generation of inactive variants. To tackle this issue, a method utilizing the underlying patterns in the sequences of a protein family has been developed.

In recent years, fungal and bacterial cellulases have gained popularity for the conversion of lignocellulosic material to biofuels and biochemicals. This study investigated properties of fungal (Trichoderma. reesei) and bacterial (Clostridium thermocellum) cellulases. Enzymatic hydrolysis was carried out with T. reesei using nine enzyme concentration and substrate combinations. Initial rates and extents of hydrolysis were determined from the progress curve of each combination. Inhibition occurred at the higher enzyme concentrations and higher solids concentrations. Mechanisms to explain the observed inhibition are discussed. Samples of C. thermocellum purified free cellulase after 98% hydrolysis were assayed to determine the total protein content (0.15 ± 0.08 mg/mL), the enzymatic activity (0.306 ± 0.173 IU/mL) and the cellulosome mass using the Peterson method for protein determination, the cellulase activity assay with phenol-sulfuric acid assay, and the indirect ELISA adapted for C. thermocellum cellulosomes, respectively. Issues regarding reproducibility and validity of these assays are discussed.

In this study, 11 bacterial isolates from Salt Lake,Turkey were identified by using fatty acid methyl ester (FAME) analysis. They were screened for production of industrially important enzymes xylanase, cellulase, &amp / #945 / -amylase and protease. These enzymes were characterized in terms of enzyme activity, stability, optimum temperature and optimum pH. One of the isolates was identified as Bacillus pumilus, and two of them were identified as Bacillus subtilis. Other isolates were determined to be Bacillus licheniformis. All the isolates were determined to produce xylanase. Optimum temperatures and optimum pH values of xylanases were 50-55 &deg / C and pH 7.0-8.0. Xylanases were quite stable up to pH 8.0 and 70 &deg / C. Isolates were not significant cellulase producers. Four of the isolates did not produce any cellulase enzyme and the rest produced negligible amounts of cellulase. Therefore, xylanases from the isolates were promising for pulp and paper industry, which requires cellulase free and stable xylanases. All the isolates produced appreciable quantities of &amp / #945 / -amylase. Optimum temperatures and optimum pH values of &amp / #945 / -amylases 60-80 &deg / C and pH 7.0-8.0. &amp / #945 / -Amylases were quite stable up to pH 9.0 and 80 &deg / C. &amp / #945 / -Amylases from the isolates were promising for starch processing industry, which requires &amp / #945 / -amylases stable at high temperatures and for detergent industry, which requires &amp / #945 / -amylases stable at alkaline pH values. Considerable protease productions were achieved by all the isolates. TTG 2 was the best protease producer with 271 U/ml. Optimum temperatures and optimum pH values of proteases were 50-60 &deg / C and pH 7.0-7.4. Proteases were quite stable up to pH 9.0 and 80 &deg / C. Proteases from the isolates were promising for detergent and leather industry, in which proteases must be stable at alkaline pH values.

My work concentrates on feeding behavior of overwintering diapausing and post {--} diapausing bark beetles and developmental treshold. This is done either biochemically by measuring the enzymatic activity in the midgut and by assessing the feeding status from the size and consistence of the food bolus in the gut. Detailed knowledge of feeding behaviour and development treshold may help to predict the overwintering success of local populations with all the consequencies for spring dispersal and reproduction.

O processamento da uva para produção de suco e vinho engloba diferentes processos tecnológicos, como por exemplo, o tratamento enzimático, onde usualmente são utilizadas preparações de enzimas comerciais, buscando-se aprimorar processos como clarificação e extração. Entretanto, esse é um tratamento que demanda elevado tempo de processamento, sendo relevante a busca por novas tecnologias a fim de apurar o processo. O ultrassom pode ser utilizado como uma alternativa para reduzir o tempo de processamento e acrescer qualidade ao produto, pois além de ser uma técnica sustentável, pode proporcionar benefícios no uso combinado com enzimas, favorecendo as reações em decorrência de seus efeitos. Neste trabalho, o uso em conjunto de tratamento enzimático (ET), ultrassom (US), e agitação mecânica (MS) foi avaliado na extração do mosto da uva Cabernet Sauvignon, a fim de compreender os efeitos das técnicas combinadas. Inicialmente, nove preparados enzimáticos comerciais foram caracterizados segundo suas atividades enzimáticas e aplicados para extração do mosto, avaliando a variação de temperatura (40, 50 e 60 °C), tempo (15 e 30 min), e concentração de enzima (0,01 a 2,0 U.g-1). Os melhores resultados foram obtidos com o preparado Zimopec PX5® nas condições de 1,0 U.g-1 de pectinase a 50 °C por 30 min. A extração do mosto apresentou aumento significativo nos parâmetros de qualidade avaliados (cor, sólidos solúveis totais, rendimento de extração, capacidade antioxidante, antocianinas totais) quando os três métodos de extração (US, MS e ET) foram combinados, principalmente na presença do ultrassom. Tendo em vista o efeito sinérgico obtido entre a aplicação enzimática e o ultrassom na extração do mosto, um novo estudo foi conduzido buscando investigar a influência da sonicação na eficiência catalítica das enzimas pectinase (PE), xilanase (XLN) e celulase (CE). Para isso, as atividades enzimáticas foram avaliadas em diferentes pHs e em amostras de enzima e substratos submetidas a um tratamento prévio de sonicação por tempos determinados (0 – 30 min). Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos foram estimados, apresentando um efeito positivo do US na atividade das enzimas. A sonicação prévia do substrato contribuiu significativamente para o aumento da atividade de XLN, enquanto a sonicação prévia da enzima melhorou a atividade da CE e PE. Os resultados apresentaram um aumento na velocidade de hidrólise das enzimas com o uso do US, assim como um aumento da eficiência catalítica (Vmax/Km), mostrando o potencial da aplicação do US para ativação das enzimas. De acordo com os resultados obtidos, pode-se afirmar que o ultrassom proporcionou melhorias na extração do mosto, podendo ser utilizado como uma técnica alternativa de processo, bem como apresentou efeitos benéficos sobre as atividades enzimáticas. / Grape processing for juice and wine production encompasses different technological processes, such as enzymatic treatment, that usually uses commercial enzyme preparations to improve clarification and extraction processes. However, this is a treatment that demands high processing time, being relevant the search for new technologies in order to improve the whole process. Ultrasound (US) can be used as an alternative to reduce the processing time and improve the quality of the product, moreover, it can provide benefits in the combined use with enzymes, favoring the enzymatic reactions. In this work, the combined use of enzymatic treatment (ET), ultrasound (US), and mechanical agitation (MS) was studied in order to understand the effects of the techniques on Cabernet Sauvignon must extraction. Initially, nine commercial enzyme preparations were characterized according to their enzymatic activities and applied to must extraction, evaluating temperature (40, 50 and 60 °C), time (15 and 30 min), and enzyme concentration (0.01 to 2.0 Ug-1). The best results were obtained for the preparation Zimopec PX5® under conditions of 1.0 U.g-1 of pectinase at 50 °C for 30 min. A significant increase on quality parameters (color, °Brix, yield, antioxidant capacity, total anthocyanins) was obtained to extraction combining the three methods (US, MS and ET), mainly when US were applied. Based on these previous results, a new study was conducted to investigate the influence of sonication on the catalytic efficiency of the enzymes pectinase (PE), xylanase (XLN) and cellulase (CE). The enzymatic activities were evaluated at different pH and in samples of enzyme and substrates submitted to a previous treatment of sonication by determined times (0 - 30 min). The kinetic and thermodynamic parameters were estimated, showing a positive effect of the ultrasonic treatment on the enzymatic activity. Previous sonication of the substrate contributed significantly to the increase in XLN activity, whereas the previous sonication of the enzyme improved the activity of CE and PE. This research showed the potential benefits of ultrasound treatment on reaction rate and catalytic efficiency (Vmax/Km) improvement of enzymes, attesting that US can be used to increase the catalytic efficiency of pectinase, xylanase and cellulase enzymes. According to the obtained results, it can be affirmed that ultrasound improved the extraction process, and can be applied as an alternative technique, as well as provided beneficial effects on the enzymatic activity.

Orientador: Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / CelE1 é uma endoglucanase, pertencente à família GH5, altamente ativa em ampla faixa de temperaturas e em condições alcalinas de pH. Foram examinamos os efeitos do pH sobre as estruturas secundárias e terciárias, carga líquida, e a atividade de CelE1. Embora a variação do pH tenha mostrado um pequeno efeito na estrutura da enzima, a atividade foi influenciada em condições ácidas, enquanto que atingiu a atividade ótima em pH 8. A fim de verificar a possibilidade de aplicação industrial como aditivo de detergentes, a atividade da enzimática da CelE1 foi avaliada na presença de agentes tensoativos. Surfactantes iônicos e não iônicos não foram capazes de reduzir significativamente a atividade CelE1. Portanto, notou-se que CelE1 pode ser uma candidata promissora para utilização como aditivos de detergentes. Foi relatada uma análise termodinâmica com base na estabilidade estrutural e química dos processos de desnaturação e renaturação da enzima. Os resultados indicaram que A enzima CelE1 apresenta atividade em temperaturas baixas e ambientes, em condições alcalinas e na presença de surfactantes, além de ter a capacidade de se desnaturar e renaturar, em diferentes concentrações de ureia. O processo de desnaturação e renaturação da CelE1 mostrou-se ser um processo reversível de dois estados. Estes dados podem ser úteis para aplicações biotecnológicas. / CelE1 is a cold-active endo-acting glucanase with high activity at a broad temperature range and under alkaline conditions. Here, we examined the effects of pH on the secondary and tertiary structures, net charge, and activity of CelE1. Although variation in pH showed a small effect in the enzyme structure, the activity was highly influenced at acidic conditions, while reached the optimum activity at pH 8. Furthermore, to estimate whether CelE1 could be used as detergent additives, CelE1 activity was evaluated in the presence of surfactants. Ionic and nonionic surfactants were not able to reduce CelE1 activity significantly. Therefore, CelE1 was found to be promising candidate for use as detergente additives. Finally, we reported a thermodynamic analysis based on the structural stability and the chemical unfolding/refolding process of CelE1. The results indicated that the chemical unfolding proceeds as a reversible two-state process. These data can be useful for biotechnological applications.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6150.pdf: 1801179 bytes, checksum: d2366a6c320c54df184a270c81c7c653 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / The present situation of energy and environmental setting in the world has favored the development of alternative energy sources, and has emerged as an option the use of biofuels, such as bioethanol. Besides ethanol produced from sugarcane, there is the alternative of to use plant biomass to get called second-generation ethanol. In Brazil, the major lignocellulosic material used to produce bioethanol is sugarcane bagasse, and this ethanol is obtained by fermentation of the hydrolyzate of the plant cell wall polysaccharides, this hydrolysis is performed normally by enzymes cellulolytic. Microorganisms, such as fungi of the genus Trichoderma, which are filamentous fungi present in the soil, have a variety of these enzymes that convert cellulose into glucose. In this context, the aim of this study was the recombinant production of Trichoderma harzianum IOC-3844 endoglucanase IV and its biochemical characterization. This Endo IV, which presents high similarity with Endo IV of other Thichoderma species, was expressed using the heterologous expression system of the yeast Pichia pastoris, and after be purified, assays were performed to test their activity. The recombinant enzyme hasn t show sign of degradation in any of the substrates used and can t be confirmed its hydrolytic action. However, the literature has been showed that these enzymes have capacity to increase the breaking of lignocellulose by cellulases (or a mix of them). Based on these data, a test was performed to evaluate the ability of endo IV supplemental activity in the cocktail Acellerase 1500 (Genencor) in the hydrolysis of biomass. In the experiment, copper was added as an electron donor and despite the increase in the hydrolysis of sugarcane bagasse the results showed that copper alone improves the cocktail performance. A circular dichroism analysis was performed and showed that the recombinant Endo IV is correctly coiled. The study showed that the enzyme produced at the laboratory has a high level of expression, but its activity couldn t be detected. The intention now is to perform tests with cocktails that don t contain expansins and isolated enzymes in order to verify that the Endo IV has effect upon them. / A atual situação do cenário energético e ambiental do mundo tem favorecido o desenvolvimento de fontes alternativas de energia, e como opção tem surgido a utilização de biocombustíveis, como o bioetanol. Além do etanol produzido a partir do caldo de cana, há a alternativa de utilizar a biomassa vegetal para obter o chamado etanol de segunda geração. No Brasil o principal material lignocelulósico utilizado para produção de bioetanol é o bagaço de cana-de-açúcar, e este etanol é obtido por meio da fermentação do hidrolisado dos polissacarídeos da parede celular dos vegetais, sendo esta hidrólise, realizada, normalmente, por enzimas celulolíticas. Microrganismos, como os fungos do gênero Trichoderma, que são fungos filamentosos presentes no solo, possuem uma variedade dessas enzimas capazes de converter a celulose em glicose. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi a produção recombinante da enzima endoglucanase IV de Trichoderma harzianum IOC-3844 e sua caracterização bioquímica. Esta Endo IV, que apresenta alta similaridade com as Endo IV de outras espécies de Thichoderma, foi expressa utilizando-se o sistema de expressão heteróloga da levedura Pichia pastoris e, após ser purificada, foram realizados ensaios para testar sua atividade. A enzima recombinante não demonstrou sinal de degradação em nenhum dos substratos utilizados, não podendo ser comprovada sua ação hidrolítica. Porém, na literatura consta que essas enzimas têm a capacidade de aumentar a quebra de lignocelulose por celulases (ou uma mistura delas). Com base nesses dados, um teste foi realizado para avaliar a capacidade da endo IV de suplementar a atividade do coquetel Acellerase 1500 (Genencor) na hidrólise de biomassa. No experimento, foi adicionado cobre como doador de elétrons e apesar do aumento na hidrólise do bagaço-de-cana os resultados mostraram que o cobre sozinho melhora a performance do coquetel. Uma análise de dicroísmo circular foi realizada e revelou que a Endo IV recombinante se encontra corretamente enovelada. O estudo mostrou que a enzima produzida em laboratório possui alto nível de expressão, porém sua atividade não pôde ser constatada. Pretende-se agora realizar testes com coquetéis que não contêm expansinas e com enzimas isoladas, a fim de verificar se a Endo IV possui efeito sobre elas.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-08Bitstream added on 2014-06-13T19:35:23Z : No. of bitstreams: 1 rodrigues_gr_me_jabo.pdf: 533286 bytes, checksum: dff723ba2dc7ffcab8ade10e5ed0fee4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas, uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares que ajudam na mineralização da matéria orgânica, liberação de carbono e nutrientes na forma de serem assimilados. Devido a esses importantes fatores é que cada vez mais aumenta a busca por enzimas que possam ser utilizadas nos diversos setores industriais com maior aproveitamento e baixo custo. A celulase pertence a essa classe de enzimas, ela é formada por um complexo multienzimático capaz de hidrolisar celulose através da quebra da ligação ~,1-4. A partir disso foi realizada uma busca de gene r~lacionado com a hidrolise da celulose em biblioteca metagenômica de DNA extraído de solo de arboreto de eucalipto. Foram realizado testes bioquímicos e moleculares, partindo de um par de oligonucleotídeo iniciadores degenerado que foi construído para identificar gene da glucanase que está ligado na hidrolise da celulose. Com o teste bioquímico foi possível selecionar clones que estão relacionados com hidrolise da celulose, a confirmação dos clones positivos foi feita através de reações de PCR. Após a escolha do clone foi feita uma sub-biblioteca, os clones da sub-biblioteca foram sequenciados e através do sequenciamento foi possível encontrar gene relacionado à hidrólise da celulose. / The microorganisms show a abundant genetic diversity and perform unique and crucial ecosystems maintence, one of this function is the produce of extracellular enzymes that mineralize organic matte and release carbon and nutrients in forms that can be assimilated. Due this important factors its increasing the search of enzymes who can be use on the manufacturing with better utilization and low cust. The cellulase belongs to this class of enzymes and its formed by a complex multienzimatic who its able to hydrolisar a cellulose trough the broke of the linked (3- 1-4. The cellulose, o homopolissacarideo wich we see in big amount on the biosphere. So, was made a screening to genes related with cellulase in metagenômic library of aboreto of eucalyptus cloning larg fragmenets in vector cosmídeo, with size who was between 30 and 45kb. There was made tests biochemists and molecular starting of a couple degenerate primes wich vvas made to identify the gene of glucanase that its connected in hydrolise da cellulose.With this tests we could detect the dones related with hydrolose of cellulose.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6365.pdf: 6803351 bytes, checksum: 3798ce23bc2e32bb3a3571c470c599b6 (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / The production of second-generation ethanol by enzymatic hydrolysis of biomass is considered a viable and promising alternative to face the global energy crisis and to decrease our dependence on fossil fuels. Therefore, it is necessary to degrade the constituent molecules of the plant cell wall such as lignin, cellulose and hemicellulose to fermentable sugars. However, the use of enzymes for this purpose is still expensive, leading to the increase on studies seeking to make them more feasible economically and technically. The present study aimed the molecular, structural and functional characterization of the endoglucanase Cel12A from the fungus Gloeophyllum trabeum by different techniques. Biochemical data revealed the substrate specificity for the enzyme and showed that β-glucan is the best substrate for its activity (239.2 ± 9.1 U mg-1). Optimal conditions for activity were pH 4.5 and temperature of 50 oC. Thermal stability assay indicated a half-life of 84.6 ± 3.6 hours at 50 oC. The kinetic parameters Km (3.2 ± 0.5 mg mL-1) and Vmax (0,40 ± 0,02 μmol min-1) were determined using β-glucan as substrate. Analysis of scanning electron microscopy of oat spelts and filter paper samples submitted to the hydrolysis by GtCel12A evidenced the degradation effects of these substrates compared to control samples. Moreover, the low-resolution envelope and the crystallographic structure for GtCel12A were determined. The structure revealed a β-sandwich fold with two β-sheets (A and B) and three α-helices, while sheet A showed five strands and sheet B nine strands. The comparative analysis of the amino acid sequence and homologous structures prompted us to identify the catalytic residues, Glu142 and Glu227 in the active site of the enzyme. These results are important for understanding and elucidating the enzyme molecular mechanism of action and other glycoside hydrolase family 12 endoglucanases. / A produção de etanol de segunda geração, a partir da hidrólise enzimática da biomassa vegetal é considerada uma alternativa viável e promissora para enfrentarmos a crise energética mundial e diminuirmos a dependência das fontes fósseis de energia. Para isso, é necessário que ocorra a degradação das moléculas constituintes da parede celular como a lignina, a celulose e a hemicelulose a açúcares fermentescíveis. No entanto, a utilização de enzimas para esse fim ainda apresenta um custo elevado, o que tem desencadeado, cada vez mais, estudos que busquem torná-las mais viáveis econômica e tecnicamente. O presente estudo visou à caracterização molecular, estrutural e funcional da endoglucanase Cel12A do fungo Gloeophyllum trabeum por diferentes técnicas. Os dados bioquímicos revelaram a especificidade por substratos da enzima, sendo que o melhor substrato para a atividade foi o β-glucano (239,2 ± 9,1 U mg-1). As condições ótimas para a atividade foram pH 4,5 e temperatura de 50 oC. Os ensaios de estabilidade térmica indicaram uma meia-vida de 84,6 ± 3,6 horas a 50 oC. Os parâmetros cinéticos Km (3,2 ± 0,5 mg mL-1)) e Vmax (0,40 ± 0,02 μmol min-1) foram determinados utilizando-se β-glucano como substrato. Análises de microscopia eletrônica de varredura de amostras de papel de filtro e aveia submetidos à hidrólise pela GtCel12A evidenciaram os efeitos de degradação dos substratos em relação às amostras controle. Adicionalmente, o envelope de baixa resolução e a estrutura cristalográfica da GtCel12A foram obtidos. O modelo de alta resolução revelou um enovelamento do tipo sanduíche β, com duas folhas β (A e B) e três hélices α, sendo que a folha A apresentou cinco fitas e a B, nove fitas. Por meio de análises comparativas da sequência de aminoácidos e de estruturas homólogas identificamos os resíduos catalíticos Glu142 e Glu227 no sítio ativo da enzima. Tais resultados são importantes para a elucidação e compreensão do mecanismo molecular de atuação dessa enzima e de outras endoglucanases da família GH12.