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Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich umfassend mit dem Krankheitsbild der Choanalatresie/-stenose und begleitend auftretenden Fehlbildungen. Schwerpunkt ist das CHARGE-Syndrom als häufig vorkommender Fehlbildungskomplex. 25 Patienten wurden mit der Diagnose Choanalatresie/-stenose am Kinderzentrum des Universitätsklinikums Leipzig AöR von 1997 bis 2007 behandelt. In sechs Fällen trat ein CHARGE-Syndrom auf. Zur retrospektiven Auswertung kamen allgemeine Patienteninformationen, Daten zu Schwangerschaft, Geburt und postnataler Anpassung sowie Therapiemaßnahmen, genetische Untersuchungen und der kindliche Wachstumsverlauf. In 16 Fällen konnten prospektive Angaben ermittelt werden. Es erfolgte eine klinische Untersuchung sowie die Durchführung von Entwicklungstests. Dabei wurden je nach Alter des Kindes die Denver Entwicklungsskalen bzw. der Five to Fifteen-Fragebogen eingesetzt. Ein Elternfragebogen diente der Erfassung soziodemographischer Daten, Informationen bezüglich der kindlichen Entwicklung, auftretender Erkrankungen und Inanspruchnahme ambulanter therapeutischer Maßnahmen sowie der Beurteilung der kindlichen Nasenatmung. Besonderes Interesse galt der Einschätzung der Lebensqualität betroffener Eltern. Zum Einsatz kam das Ulmer Lebensqualitäts-Inventar für Eltern chronisch kranker Kinder. Auf die große Bedeutung der kindlichen Frühförderung und die intensive Unterstützung dieser Familien wird hingewiesen.

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Le syndrome CHARGE (CS) est une maladie génétique rare caractérisée par de nombreuses anomalies congénitales, majoritairement causées par des altérations de novo du gène CHD7. Celui-ci code pour une protéine à chromodomaines, impliquée dans le remodelage ATP-dépendant de la chromatine. La grande majorité des altérations de CHD7 consiste en allèles nuls tels que des délétions, des substitutions non-sens ou des décalages du cadre de lecture. Nous avons réalisé le premier diagnostic moléculaire d’un patient Indonésien atteint du CS, en étudiant un panel de gènes (CHD7, EFTUD2, et HOXA1) par NGS (next-generation sequencing). Nous avons identifié une nouvelle mutation non-sens hétérozygote dans l’exon 34 du gène CHD7 (c.7234G>T ou p.Glu2412Ter). Par ailleurs, il n'existe pas d’analyse fonctionnelle qui permettrait de caractériser la pathogénicité des variants de la protéine CHD7 rencontrés chez des patients. C’est pourquoi l’objectif de ce travail est de mettre au point un test fonctionnel de la protéine CHD7, sous forme sauvage ou mutée. Pour cela, nous avons généré par mutagénèse dirigée des vecteurs codant pour trois variants faux-sens de CHD7 et le variant présentant une insertion de cinq acides aminés. Ensuite, les protéines CHD7, sous forme sauvage ou variante, ont été surexprimées dans la lignée HeLa. L’expression des protéines a été mise en évidence par western blot et par immunofluorescence. Pour étudier la fonctionnalité de CHD7, nous avons quantifié par RT-qPCR les transcrits de cinq gènes (l’ADNr 45S, SOX4, SOX10, MYRF, et ID2), dont la transcription est selon le littérature régulée par CHD7. Nous avons observé que l’expression de CHD7 sauvage entraînait une diminution significative et reproductible des quantités de transcrits correspondant à tous les gènes rapporteurs. Par contre, l’expression des quatre allèles variants de CHD7 n’avait aucun impact, ce qui suggère que ces variants ne sont pas fonctionnels. Par ailleurs, nous avons appliqué notre test biologique dans des cellules de la lignée SH-SY5Y, pour lesquelles nous avons introduit une mutation faux-sens dans le génome en utilisant la technique CRISPR/Cas9. Lorsque ce variant était exprimé, les niveaux de transcription des cinq gènes rapporteurs n’étaient pas significativement différents de ceux observés dans les cellules où les deux allèles de CHD7 avaient été invalidés. Par conséquent, les variants étudiés peuvent être répertoriés comme résultant de mutations causales du CS. / CHARGE syndrome (CS) is a rare genetic disease characterized by numerous congenital abnormalities, mainly caused by de novo alterations of the CHD7 gene. It encodes a chromodomain protein, involved in the ATP-dependent remodeling of chromatin. The vast majority of CHD7 alterations consists in null alleles like deletions, non-sense substitutions or frameshift-causing variations. We report the first molecular diagnosis of an Indonesian CS patient by a targeted NGS (next-generation sequencing) gene panel (CHD7, EFTUD2, and HOXA1). We identified a novel heterozygous nonsense mutation in exon 34 of CHD7 (c.7234G>T or p.Glu2412Ter). Functional analyses to confirm the pathogenicity of CHD7 variants are lacking and urgently needed. Therefore, the aim of this study was to establish a functional test for wild-type (WT) or variants of CHD7 protein found in CS patients. Using an expression vector encoding CHD7, three variants harboring an amino acid substitution and one variant with a five-amino acid insertion were generated via site-directed mutagenesis. Then CHD7 proteins, either wild-type (WT) or variants, were overexpressed in HeLa cell line. Protein expression was highlighted by western blot and immunofluorescence. We then used real-time RT-PCR to study CHD7 functionality by evaluating the transcript amounts of five genes whose expression is regulated by CHD7 according to the literature. These reporter genes are 45S rDNA, SOX4, SOX10, ID2, and MYRF. We observed that, upon WT-CHD7 expression, the reporter gene transcriptions were downregulated, whereas the four variant alleles of CHD7 had no impact. This suggests that these alleles are not polymorphisms because the variant proteins appeared non-functional. Furthermore, we applied our biological assay in SH-SY5Y cell line in which endogenous CHD7 gene was mutated using the CRISPR/Cas9 technique. Then, we observed that when a CHD7 missense variant was expressed, the transcription levels of the five reporter genes were non-significantly different, compared with the cells in which both CHD7 alleles were knocked-out. Therefore, the studied variants can be considered as disease-causing of CS.

Das CHARGE-Syndrom ist ein autosomal dominant vererbtes Dysmorphiesyndrom. Meistens handelt es sich um sporadische Fälle. Nur für ca. 2/3 der Betroffenen konnte als Ursache eine Mutation im CHD7-Gen nachgewiesen werden.  In dieser Arbeit wurde eine Familie untersucht, in der zwei Kinder gesunder Eltern von einem CHARGE-Syndrom betroffen sind und die Mutation c.7302dupA heterozygot aufweisen. Die  ursächliche Mutation c.7302dupA ließ sich in den väterlichen Spermien nachweisen. Ein Gonadenmosaik konnte somit beim Vater der betroffenen Kinder bestätigt werden.  Eine Methode zur DNA-Analyse an Einzelspermien wurde etabliert, mittels derer der Grad des Mosaiks näher bestimmt werden konnte. In einer Stichprobe des untersuchten Falles trugen 16 von 59 der untersuchten Einzelspermien die Mutation c.7302dupA. Aus diesem Ergebnis lässt sich ein deutlich erhöhtes Wiederholungsrisiko bei einem weiteren Kind ableiten. Eine Interaktion von CHD7 mit CHD8 konnte durch einen direkten Yeast-Two-Hybrid nachgewiesen werden. Bestätigt wurde dieses Ergebnis durch den Nachweis der Ko-Lokalisation der beiden Proteine sowie durch ein Signal in einem bimolekularen Fluoreszenzkomplement-Assay. Im direkten Yeast-Two-Hybrid ließ sich die Interaktionsstelle im CHD7 auf den AS Bereich 1950–2172 mit den Domänen SANT und CR3 mit distalen und proximalen Überhängen eingrenzen.  Durch das Einfügen einer bei einem CHARGE-Patienten identifizierten Missense-Mutation p.Trp2091Arg in den entsprechenden CHD7-Abschnitt ließ sich keine Interaktion mit CHD8 im direkten Yeast-Two-Hybrid mehr nachweisen. Die Bedeutung dieser Missense-Mutation beim Wegfall der Interaktion zwischen CHD7 und CHD8 als Ursache für das CHARGE-Syndrom ist in diesem Fall anzunehmen.

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Le syndrome CHARGE est une maladie génétique rare dont l’acronyme désigne les principales anomalies initialement identifiées pour décrire ce syndrome : colobome, problèmes cardiaques, atrésie des choanes, retard mental et de développement, anomalies génitales et défauts aux oreilles. Les patients présentent des combinaisons hautement variables d’anomalies et ce même entre individus d’une même famille. La principale cause de ce syndrome est une mutation du gène CHD7, mais de nouveaux gènes dont la mutation peut également engendrer ce syndrome, tel FAM172A , ont récemment été identifiés. Le modèle murin Toupee porte une mutation dans le gène Fam172a et présente les principales caractéristiques du syndrome CHARGE. Fait intéressant, si FVBToupee présente dans une forte proportion le colobome oculaire, 55% des individus B6ToupeeTg/Tg et 16% des individus B6ToupeeTg/+ présentent de la microphtalmie et de l’anophtalmie. Ces anomalies oculaires ont tout d’abord été caractérisées. Les études menées ont notamment permis d’identifier que chez B6Toupee la microphtalmie et l’anophtalmie sont beaucoup plus fréquentes dans l’œil droit et qu’elles se déclinent en plusieurs degrés variables d’atteinte au globe oculaire. Par la suite, l’étude comparative des modèles ToupeeTg/Tg et Chd7Gt/+a été réalisée dans les fonds génétiques FVB et C57Bl/6. Des différences significatives de pénétrance de même que des divergences phénotypiques ont permis de déterminer que l’identité du gène à l’origine du syndrome CHARGE et que le fond génétique modulent tous deux le développement phénotypique du syndrome CHARGE. Finalement, l’étude de doubles hétérozygotes FVBToupeeTg/+ ;Chd7Gt/+ a permis de confirmer une interaction génétique modérée entre Fam172a et Chd7 tandis que l’investigation de la mortalité néonatale chez Chd7Gt/+ a permis de suspecter des problèmes d’alimentation. / CHARGE syndrome is a rare genetic disease for which the acronym stands for the main characteristics initially identified to describe the syndrome: coloboma, heart problems, choanal atresia, retarded growth and development, genital anomalies and ear defects. Patients present highly variable combinations of anomalies, even between members of the same family. The main cause of this syndrome is a mutation in the CHD7 gene, but new genes whose mutation can also give rise to this syndrome, such as FAM172A, were recently identified. The Fam172a gene is mutated in the Toupee mouse model, which presents the main characteristics of CHARGE syndrome. Interestingly, while FVBToupee animals present coloboma in a strong proportion, 55% of B6ToupeeTg/Tg individuals and 16% of B6ToupeeTg/+ individuals present microphthalmia and anophthalmia. First, detailed characterization of these ocular anomalies revealed that microphthalmia and anophthalmia are much more frequent in the right eye of B6Toupee mice, with varying degrees of severity. Then, comparative analysis of ToupeeTg/Tg and Chd7Gt/+models in FVB and C57Bl/6 genetic backgrounds further revealed significant differences in penetrance and phenotypic presentation, suggesting that the identity of the causative gene and the genetic background both modulate phenotypic outcome of CHARGE syndrome. Finally, characterization of FVBToupeeTg/+;Chd7Gt/+ double heterozygotes confirmed a moderate genetic interaction between Fam172a and Chd7 while investigations of Chd7Gt/+ neonatal mortality allowed to suspect feeding problems.