Os tumores astrocíticos são originados a partir dos astrócitos e classificados de acordo com a Organização Mundial de Saúde em astrocitoma pilocítico (grau I), astrocitoma subependimal de células gigantes (grau I), xantoastrocitoma pleomórfico (grau II), astrocitoma difuso (grau II), astrocitoma anaplásico (grau III) e glioblastoma (GBM) (grau IV). Este último é o tumor cerebral mais frequente em adultos, possuindo uns dos piores prognósticos, devido principalmente à radioresistência do tumor, com uma sobrevida média de 14 meses. Vários estudos têm procurado encontrar novos alvos terapêuticos e os genes da família BUB são candidatos promissores, devido ao seu papel no controle do ciclo celular. Estes genes participam do mecanismo do ponto de checagem do fuso mitótico, prevenindo a separação prematura das cromátides irmãs. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a expressão de BUB1, BUB3 e BUBR1 em amostras de pacientes portadores de gliomas de baixo grau (I e II) e glioblastoma, relacionar as expressões destes genes à sobrevida e estudar os efeitos da inibição dos genes BUB1 e BUBR1, por RNAi, na linhagem pediátrica SF188. Nossos resultados mostraram que tanto BUB1 quanto BUBR1 foram hiperexpressos nos glioblastomas e nos gliomas de baixo grau em relação à substância branca (p<0,05). A análise da expressão destes genes em amostras de glioblastomas em relação a amostras de grau I e II demonstrou uma hiperexpressão dos genes BUB1 e BUBR1 e uma hipoexpressão do BUB3 em glioblastoma (p<0,05). Em relação à sobrevida, os baixos níveis de expressão dos genes BUB1 e BUBR1 foram relacionados a uma melhor sobrevida quando analisado o total de todos os pacientes. Paralelamente, a inibição dos genes BUB1 e BUBR1 na linhagem SF188 resultou em uma diminuição da proliferação e também da capacidade clonogênica, além de um aumento na apoptose quando combinado com temozolomida (TMZ). Também foram realizados experimentos com inibições dos genes com ou sem a presença de irradiação. Esta combinação resultou em uma diminuição tanto da proliferação quanto da capacidade clonogênica. Estes resultados sugerem que o BUB1 e o BUBR1 podem ser considerados alvos interessantes para o tratamento de glioblastoma, porém estudos adicionais são necessários para confirmar tal potencial. / Astrocytic tumors are originated from astrocitytes and classified according to the World Health Organization into pilocytic astrocytoma (grade I), subependymal giant cell astrocytoma (grade I), pleomorphic xanthoastrocytoma (grade II), diffuse astrocytoma (grade II), anaplastic astrocytoma (grade III) and Glioblastoma (GBM) (grade IV). Glioblastoma is the most common brain tumor in adults with a very poor prognosis and a median survival of 14 months. Because their role in cell cycle control, several authors have previously ponited the BUB gene family as new therapeutic target candidates. These genes participate in the mitotic checkpoint by preventing the premature separation of sister chromatids. The aims of this study were to study the expression of BUB1, BUB3 e BUBR1 in samples of patients with low-grade gliomas (I and II) and glioblastoma, evaluate any association of gene expression with patient survival and analyze BUB1 e BUBR1 inhibition (by iRNA) effects, on SF188, a pediatric cell line. BUB1 and BUBR1 were found hyperexpressed in glioblastoma samples and in low-grade gliomas when compared with white matter samples (p<0.05). The analysis of the expression of these genes in glioblastoma samples compared with grade I and II samples showed a hyperexpression of BUB1 and BUBR1, while BUB3 was hipoexpressed in glioblastoma (p<0.05). In the survival analysis, the hipoexpression of BUB1 and BUBR1 genes were related with a better survival when all patients were considered. The BUB1 and BUBR1 inhibition resulted in decreased proliferation and colony formation, along with increased apoptosis when combined with temozolomide. Experiments with the inhibition of genes also were performed in association with irradiation. This combination demonstrated decreased proliferation and colony formation. Our results suggest that BUB1 and BUBR1 might be interesting targets for future treatment of glioblastoma, nonetheless further studies are necessary to confirm this potencial.

Wolbachia pipientis é uma alfa-protobactéria intracelular obrigatória, endossimbionte de artrópodes e nematódeos que é herdada por via materna ao longo das gerações. A presença desta bactéria nos tecidos germinativos pode provocar nos hospedeiros alterações fenotípicas reprodutivas, como partenogênese, feminização genética de machos, morte de machos, incompatibilidade citoplasmática (IC) e alterações de fitness. Alguns mecanismos moleculares dessas alterações baseiam-se na modulação da expressão gênica do hospedeiro, ou seja, a bactéria pode suprimir ou estimular genes de forma a produzir ambiência favorável à manutenção da endossimbiose. Devido a esse potencial manipulador, Wolbachia tem sido testada como \"ferramenta\" para controle populacional de insetos vetores de patógenos. O mosquito Culex quinquefasciatus, naturalmente infectado por Wolbachia na região Neotropical, é um importante vetor de diversos patógenos que atingem humanos e animais. A presença da bactéria causa IC e altera o fitness no mosquito, mediante alterações temporais na ovogênese, fecundidade e fertilidade reprodutivas. Sabe-se que a presença da Wolbachia altera a expressão do gene grauzone e há fortes indícios de que esta expressão diferencial induza à IC em Cx. quinquefasciatus. Sabe-se também que este gene possui duas cópias parálogas em Cx. quinquefasciatus, porém estudos observaram a relevância de apenas um parálogo como importante regulador dos ciclos celulares da ovogênese e espermatogênese. No entanto, as bases genéticas dos fenótipos IC e \"fitness alterado\" do modelo Wolbachia-Cx. quinquefasciatus Neotropical ainda permanecem desconhecidas. Objetivamos inicialmente neste modelo quantificar e silenciar a expressão do gene grauzone (ambos parálogos) para suportar a hipótese pré-existente de que a superexpressão deste gene em mosquitos infectados por Wolbachia causa as alterações fenotípicas reprodutivas. Durante o desenvolvimento do projeto houve intercorrências que alteraram o rumo do trabalho: a necessidade de substituição da colônia experimental de mosquitos devido a baixas demográficas e à alta variabilidade intraespecífica do gene grauzone. Frente às intercorrências, formulamos como neo-objetivo a comparação filogenética entre as variantes do gene grauzone. Detectamos também variabilidade em um dos parálogos e concluímos que as cópias parálogas do gene encerram proteínas estruturalmente distintas e talvez funcionalmente distintas no tocante à alteração reprodutiva (IC) causada pela presença da Wolbachia. Foi possível observar que fêmeas infectadas apresentam amplificações de grauzone mais intensas quando comparadas com fêmeas não-infectadas no 4° dia de emergência, corroborando dados da literatura. Em conjunto, esses achados indicam que é promissora a continuidade do estudo do papel de grauzone na IC, mas demonstra também que este gene é mais complexo do que se imaginava, o que demandará maior esforço investigativo. A expectativa de uso futuro de Wolbachia como controlador biológico de mosquitos-vetores poderá se beneficiar de estudos como aqui proposto. / Wolbachia pipientis is an obligate intracellular alpha-protobacterium, endosymbiont of arthropods and nematodes, which is inherited through maternal route over generations. The presence of this bacterium in germinative tissues can cause reproductive phenotypic alterations in the hosts, such as parthenogenesis, genetic feminization of males, death of males, cytoplasmic incompatibility (CI) and fitness changes. Some molecular mechanisms of these alterations are based on the modulation of gene expression of the host, that is, the bacterium can suppress or stimulate genes in order to produce favorable environment for the maintenance of the endosymbiosis. Due to this potential manipulator, Wolbachia has been tested as a \"tool\" for population control of pathogen vector insects. The mosquito Culex quinquefasciatus, naturally infected by Wolbachia in the Neotropical region, is an important vector of several pathogens that affect humans and animals. The presence of the bacteria causes CI and changes the fitness in the mosquito, through temporal changes in ovogenesis, reproductive fertility and fertility. The presence of Wolbachia is known to alter the expression of the grauzone gene and there are strong indications that this differential expression induces the CI in Cx. quinquefasciatus. It is known that this gene occurs with two paralogs copies in Cx. quinquefasciatus, but studies have observed the relevance of only one paralog as important regulator of oogenesis and spermatogenesis cell cycles. However, the genetic basis of the phenotypes \"changed fitness\" and CI of Wolbachia-Cx quinquefasciatus Neotropical model remain unknown. We initially aimed at quantifying and knockdown of grauzone gene (both paralogs) to support the preexisting hypothesis that overexpression of this gene in Wolbachia-infected mosquitoes causes reproductive phenotypic changes. During the development of the project there were intercurrences that altered the course of work: the need to replace mosquito populations due to demographic lows and the high intraspecific variability of grauzone gene. In view of the intercurrences we formulated the neo-objective phylogenetic comparison between the variants of the grauzone gene. We also detected variability in one of the paralogs and concluded that the paralogs copies of the gene contain structurally distinct and perhaps functionally distinct proteins with respect to the reproductive alteration (CI) caused by the presence of Wolbachia. It was possible to observe that infected females show more intense grauzone amplifications when compared to uninfected females on the 4th day of emergence, corroborating data from the literature. Taken together, these findings indicate that the continuity of the study of the role of grauzone in CI is promising, but also demonstrates that this gene is more complex than previously thought, which will require more investigative effort. The expectation of future use of Wolbachia as a biological control of mosquito-vectors may benefit from studies as proposed here.

O quelóide é um tumor fibroso benigno que ocorre durante a cicatrização da pele em indivíduos geneticamente predispostos. A cicatrização é um processo biológico complexo e depende da interação de diferentes estruturas teciduais e de um grande número de tipos celulares residentes e infiltrativos, que produzem citocinas. A interleucina 8 (IL-8), citocina pró-inflamatória, é super-expressa pelos fibroblastos durante o desenvolvimento do tecido de granulação, acelerando o processo de cicatrização. Como o quelóide resulta de uma reparação tecidual anormal após lesão da pele, o presente estudo teve por objetivo determinar a expressão dos receptores da IL-8, CXCR1 e CXCR2, e a capacidade proliferativa, pelo ciclo celular, dos fibroblastos queloideanos cultivados e extraídos ex vivo, por citometria de fluxo. Fibroblastos de cicatriz queloideana e de pele normal foram obtidos de 21 pacientes da raça negra, com idade variando entre 10 e 40 anos, de lesões com até 2 anos de evolução. Em nosso estudo constatamos expressão reduzida dos receptores para a IL-8, CXCR1(35,7%±11,2) e CXCR2 (27,8%±11,3), em fibroblastos de cicatriz queloideana cultivados, comparando com a pele normal (44,1±16,2 e 46,3±27,1 respectivamente). Entretanto, essa diferença só foi significante para o receptor CXCR2. A baixa expressão desses receptores poderia ser decorrente da atividade de metaloproteinases, que regulam a expressão de proteínas da superfície celular, através de clivagem enzimática, ou a capacidade reduzida de internalização e a reciclagem de receptores, mantida por filamentos de actina do citoesqueleto, que nos fibroblastos do quelóide estão diminuídos. Em relação ao ciclo celular de fibroblastos cultivados do quelóide e da pele normal, verificamos diferenças não significantes da capacidade de replicação (fase S do ciclo celular) e de apoptose. No quelóide observamos significante aumento de células na fase G2/M, indicando aumento da velocidade de divisão celular. Para confirmar esses achados estudamos o ciclo celular de fibroblastos extraídos ex vivo, da porção periférica e central do quelóide e da pele normal. Os fibroblastos da porção periférica apresentaram porcentagem significantemente maior de células com capacidade replicativa, fase S do ciclo (22,9% ± 11,6), em relação à porção central (4,7% ± 2,9) e à pele normal (6,8% ± 4,9), e maior velocidade de divisão celular, fase G2/M (18,6 ± 12,0), em relação à porção central (35,6 ± 7,0) e pele normal (32,3 ± 6,9). Verificamos que a porção central apresentou maior porcentagem de células em apoptose (7,0% ± 2,1), comparado à porção periférica (4,9% ± 1,9) e pele normal (2,0% ± 0,86). Esses dados indicam que as células da porção periférica do quelóide parecem ser responsáveis pela elevada taxa de proliferação, justificando o crescimento expansivo a partir das margens da cicatriz queloideana, com desenvolvimento de lesão semelhante a tumor, bem como a porção central ser responsável pela fibrose, contendo células quiescentes e apoptóticas. Esses resultados sugerem modulação diferencial das reações celulares através das vias de sinalização para proliferação ou morte celular programada. Neste sentido, a baixa expressão dos receptores da IL-8, CXCR1 e principalmente de CXCR2, nos fibroblastos do quelóide sugere capacidade reduzida da IL-8 em promover cicatrização acelerada. A baixa atividade da IL-8 sobre os fibroblastos queloideanos estaria promovendo desregulação da resposta inflamatória e com isso atraindo novas células inflamatórias para o local e produzindo sinais alterados, como grande produção da citocina TGF&#946;. Essa desregulação do processo de cicatrização, com alteração de citocinas e da matriz extracelular, poderia ser responsável pelas duas populações de fibroblastos, uma proliferativa na periferia e outra quiescente e apoptótica na porção central. Finalizando, podemos concluir que nossos resultados correspondem às alterações histológicas e clínicas do quelóide que se expande nos limites da lesão. / A keloid is a benign fibrous tumor that occurs during wound healing in genetically predisposed individuals. Healing is a complex biological process and depends on the interaction of different tissue structures and a great number of resident and infiltrative cell types. The interleukin-8 (IL-8), a proinflammatory chemokine, showed higher expression in fibroblasts during the development of the granulation tissue, promoting more rapid tissue maturation. Since keloids result from abnormal wound healing, the objective of the present study was to determine the expression of CXCR1 and CXCR2, IL-8 receptors, and the proliferation capacity, throughout the cell cycle, of the keloid fibroblasts extracted ex vivo and those submitted to in vitro cultivation. Normal skin and keloid scar fibroblasts were obtained from 21 African-Brazilian patients, aged from 10 to 40 years, whose lesions had evolved for no longer than 2 years. Expression of receptors and the cell cycle was assessed by flow cytometry. We showed lower expression of the CXCR1 (35,7% ± 11,2) and CXCR2 (27,8%±11,3) in keloid fibroblasts, when compared with normal skin (44,1 ± 16,2 e 46,3 ± 27,1 respectively), but the difference was not significant for the CXCR1 receptor. This lower expression of IL-8 receptors in keloid fibroblasts could be due to the action of metalloproteinases, which regulate the surface protein enzymatically, or fibroblastic cytoskeleton conditions, which influence receptor internalization and recycling. The distribution assessment of cell cycle phases of fibroblasts cultivated from keloid scars and normal skin did not show significant difference in replication capacity and apoptosis. The keloid fibroblasts presented a significantly higher proportion of cells in the G2/M phase, suggesting higher rate of cell division. To confirm these results we studied the cell cycle of fibroblasts extracted ex vivo, now separated by central and peripheral portions of keloid and normal skin. The peripheral fibroblasts showed significant high cell proportions in phase S (22,9% ± 11,6), compared with the central portion (4,7% ± 2,9) and normal skin (6,8% ± 4,9), and higher cells in division phase G2/M (18,6% ± 12,0), compared with the central portion (35,6% ± 7,0) and normal skin (32,3% ± 6,9). The central portion showed higher proportion of apoptosis (7,0% ± 2,1), compared with the peripheral portion (4,9% ± 1,9) and normal skin (2,0% ± 0,86). These results suggest that the keloid peripheral cells could be responsible for the proliferation rate, justifying the expansive keloid growth at the borders of the keloid scar, in a similar fashion to tumor development and the central portion being responsible for fibrosis, with quiescent and apoptotic cells. These results suggest a differentiated modulation of cell reactions by signal pathways for programmed cellular proliferation or death. In this sense, the low expression of the IL-8 receptors CXCR1 and CXCR2 in keloid fibroblasts suggests a diminished capacity of IL-8 to promote accelerated healing. This low expression of IL-8 receptors in keloid fibroblasts could promote the dysregulation of the inflammatory response and thus attract more inflammatory cells to the site, producing different signals, such as a high production of the TGF&#946; cytokine. This dysregulation of the healing process, with changed cytokine and extracellular matrix expression, could be responsible for two different cell populations of fibroblasts, one proliferation at the periphery and the other fibrotic at the center of the lesion, with apoptotic and quiescent cells. Finally, we conclude that our results correspond to the histological and clinical changes of keloids that grow beyond the wound boundaries.

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T00:22:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maso_Victor_D.pdf: 2835269 bytes, checksum: f3165794df6b39b4fa01215914687cc9 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Síndromes mielodisplásicas (SMD) abrangem um espectro de doenças hematológicas caracterizadas por hematopoese ineficaz e risco de evolução para leucemia mielóide aguda (LMA). As leucemias agudas apresentam altas taxas de mortalidade devido, principalmente, à sua capacidade de resistir a diversos tipos de quimioterápicos, sendo necessário buscar novos compostos capazes de interferirem no crescimento tumoral. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos da quercetina in vitro e in vivo, na linhagem celular P39/Tsugane, a qual foi estabelecida a partir de células leucêmicas do sangue periférico de paciente que possuía síndrome mielodisplásica, como modelo. O desenho experimental compreendeu o tratamento in vitro e in vivo com quercetina das células leucêmicas, verificando-se vias de apoptose, ciclo celular e autofagia. O modelo xenográfico de tumor de células leucêmicas subcutâneo foi utilzado para os ensaios in vivo. A quercetina induziu pronunciada apoptose das células leucêmicas P39, seguida por supressão da expressão de BcL-2, BclxL, Mcl-1, aumento da expressão de Bax e modulação do potencial de membrana mitocondrial com liberação de citocromo c e ativação de caspases. O tratamento com quercetina resultou em retenção das células na fase G1 do ciclo celular, com pronunciada diminuição das proteínas CDK2, CDK6, ciclina D, ciclina E e ciclina A, diminuição na fosforilação de Rb e aumento na expressão de p21 e p27. Quercetina induziu a formação do autofagossomo nas células P39, com ativação de PI3K classe III, Beclina 1, Atg5-Atg12, Atg7, conversão de LC3-I em LC3-II e desfosforilação de Akt e mTOR. A inibição da autofagia induzida por cloroquina juntamente com quercetina viii desencadeou aumento na apoptose, mas não alterou a modulação da fase G1 do ciclo celular induzida por quercetina. As células P39 tratadas com a combinação de quercetina e inibidores seletivos de ERK1/2 e/ou JNK (PD184352 e SP600125, respectivamente) apresentaram diminuição na retenção em fase G1 do ciclo, Este tratamento combinado, entretanto, não alterou a percentagem de células apoptóticas. Além disso, administração in vivo de quercetina reduziu significativamente o volume tumoral em camundongos inoculados com células P39 e confimar os resultados in vitro relacionados com apoptose, autofagia e ciclo celular. Assim, quercetina demonstra uma potente atividade antileucêmica através de sinalizações que causam parada do ciclo celular, apoptose e indução da autofagia. Esta última, por sua vez, parece proteger as células do alto grau de apoptose / Abstract: This study proposes to investigate quercetin antitumor efficacy in vitro and in vivo, using P39 cell line as a model. The experimental design comprised leukemic cells or xenografts of P39 cells, treated in vitro or in vivo, respectively, with quercetin; apoptosis, cell cycle and autophagy activation were then evaluated. Quercetin caused pronounced apoptosis in P39 leukemia cells, followed by Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 downregulation, Bax upregulation and mitochondrial translocation, triggering cytochrome c release and caspases activation. Quercetin also induced the expression of FasL protein. Furthermore, our results demonstrated an antioxidant activity of quercetin. Quercetin treatment resulted in an increased cell-arrest in G1 phase of the cell cycle, with pronounced decrease in CDK2, CDK6, cyclin D, cyclin E and cyclin A proteins, decreased Rb phosphorylation and increased p21 and p27 expression. Quercetin induced autophagosome formation in P39 cell line, with upregulation of PI3K class III proteins, Beclin-1, Atg5-Atg12, Atg7, conversion of LC3-I to LC3-II, and dephosphorylation of Akt and mTOR. Autophagy inhibition induced by quercetin with chloroquine triggered apoptosis but did not alter quercetin modulation in the G1 phase. P39 cell treatment with a combination of quercetin and selective inhibitors of ERK1/2 and/or JNK (PD184352 or SP600125 respectively), significantly decreased cells in G1 phase, this treatment however did not change the apoptotic cell number. Furthermore, in vivo administration of quercetin significantly reduced tumor volume in P39 xenografts and confirmed in vitro results regarding apoptosis, autophagy and cell cycle arrest / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Laura Sterian Ward / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T22:18:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_MarianaBonjiorno_M.pdf: 2775717 bytes, checksum: 1e2d998b43775fd0f5b926acafc0b649 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As lesões tiroidianas de padrão folicular constituem cerca de 30% das lesões de tiroide e são um grande problema clínico já que incluem condições benignas e malignas. Isso obriga aos pacientes que são candidatos potenciais a realizarem cirurgia, que se mostra desnecessária em 70% das citologias indeterminadas que, no exame histológico, revelam serem lesões benignas. Os antígenos de Câncer de Testículos possuem como membro MAGE A3, uma proteína especifica envolvida na regulação da apoptose e na progressão do ciclo celular. O gene TP53 é um supressor tumoral, sua proteína p53 possui uma participação fundamental no controle do ciclo celular, reparação do DNA e ativação da apoptose, e é responsável pela transcrição da MDM2, que inibe as funções transcritoras de p53 e produz retroalimentação negativa. A proteína KAP-1 pode atuar como uma co-repressora de p53 ao se ligar a MAGE A3 e a MDM2 e ele tem sido implicado em diversos processos celulares, tais como o desenvolvimento, diferenciação e transformação neoplásica. Objetivamos neste trabalho, analisar a expressão de MAGE A3, P53, MDM2 e KAP-1 como possíveis marcadores de diagnóstico e prognóstico para Câncer Diferenciado de Tiroide. Utilizamos imunoistoquímica para avaliar expressão das proteínas. Foram investigados 364 pacientes com nódulos de tiroide (tecidos malignos e benignos). A expressão de todas as proteínas identificou malignidade (p<0.0001) e também pode diferenciar algumas lesões de padrão folicular. A expressão proteica de MAGE A3, P53, MDM2 e KAP-1 se associaram com aspectos clínicos e patológicos de agressividade, porém somente KAP-1 se correlacionou com recidiva tumoral, mas não com a sobrevida dos pacientes. Nossos dados sugerem que a expressão de MAGE A3, P53, MDM2 não é boa marcadora de recidiva, mas todas as proteínas podem auxiliar no diagnóstico diferencial das lesões foliculares da tiroide e confirmar malignidade, podendo ser útil como parte de um painel de marcadores que auxiliam no diagnóstico para câncer diferenciado da tiroide / Abstract: The lesions of thyroid follicular constitute about 30% of thyroid lesions and are a major clinical problem since they include benign and malignant conditions. This requires patients who are potential candidates to perform surgery, which appears unnecessary in 70% of indeterminate cytology that the histological examination revealed to be benign. The antigens Cancer Testis have member as MAGE A3, a specific protein involved in regulation of apoptosis and cell cycle progression. The TP53 is a tumor suppressor, its protein p53 has a fundamental role in cell cycle control, DNA repair and activation of apoptosis, and is responsible for transcription of MDM2, which inhibits the functions of p53 transcribers and produces negative feedback. The KAP-1 protein can act as a co-repressor of p53 to bind to MDM2 and MAGE A3 and it has been implicated in diverse cellular processes such as development, differentiation and neoplasic transformation. This paper sets to analyze the expression of MAGE A3, P53, MDM2 and KAP-1 as potential markers for diagnosis and prognosis of Differentiated Thyroid Cancer. We used immunohistochemistry to evaluate protein expression. We investigated 364 patients with thyroid nodules (malignant and benign tissue). The expression of all proteins identified malignancy (p <0.0001) and also can differentiate between some follicular lesions. Protein expression of MAGE A3, P53, MDM2 and KAP-1 were associated with clinical and pathological aggression, but only KAP-1 correlated with tumor recurrence, but not with patient survival. Our data suggest that the expression of MAGE A3, P53, MDM2 is not a good marker of recurrence, but all proteins may help in the differential diagnosis of follicular thyroid lesions and to confirm malignancy and may be useful as part of a panel of markers that help diagnosis of differential thyroid cancer / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Ciências

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Somatic cell nuclear transfer (SCNT) has been used in recent years for various purposes; to produce copies of genetically superior animals or genetically modified animals. Mainly as a research tool, trying to understand aspects related to cell reprogramming. Despite past several years since birth first animal cloned from a somatic cell, the efficiency remains low. The causes are multifactorial and may involve species particularities, the cell used as nuclear donor or enucleated cytoplasts. Currently it is known that the main problem found in cloned embryos is related to an incomplete cellular reprogramming, which in turn compromises the expression of genes required for normal embryonic development. In the present work we studied different cell cycle associations between cytoplasts (oocytes) and donor cells and its relation with a histone deacetylase inhibitor on the reprogramming of pig embryos produced by SCNT. Oocytes were enucleated at MII or TII (pre-activated) and the associated with previously synchronized cells in G1/G0 and G2/M phase of the cell cycle using or not a histone deacetylase inhibitor Scriptaid in the first hours of embryo culture. The results showed cell cycle incompatibilities between TII cytoplasts and G1/G0 cells even as MII cytoplasts G2/M cells regarding cell reprogramming. Scriptaid treatment showed a cell cycle dependent effect, since the improvement in embryo development was observed when using MII cytoplasts, regardless of the cell used as the donor nucleus. Although widely used in order to improve cell reprogramming in cloned embryos, it was demonstrated the relationship between inhibition of deacetylation with cell cycle interactions between and cytoplasts donor cells on the development of pig embryos produced by SCNT. / A clonagem por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) têm sido utilizada nos últimos anos para diversos fins, tanto para a produção de cópias de animais geneticamente superiores quanto para a produção de animais geneticamente modificados. Principalmente como ferramenta de pesquisa básica, buscando compreender aspectos relacionados a reprogramação celular. Apesar de passados vários anos desde o nascimento do primeiro animal clonado a partir de uma célula somática, a eficiência da técnica ainda permanece baixa. As causas são multifatoriais, podem envolver características da especie com que se está trabalhando bem como o tipo de célula utilizada como doadora de núcleo e citoplasto utilizado com receptor. Atualmente sabe-se que um dos principais problemas encontrados em embriões provenientes de clonagem estão relacionados a uma incompleta reprogramação da célula utilizada como doadora de núcleo, o que acaba por comprometer a expressão de genes necessários ao desenvolvimento embrionário normal. No presente trabalho foram estudadas diferentes associaçoes de ciclo celular entre citoplastos (oócitos) receptores e células doadoras de núcleo e sua relação com inibidores de deacetilase sobre a reprogramação de embriões suínos produzidos por SCNT. Oócitos foram enucleados no estágio de MII ou TII (pré-ativados) e associados a células previamente sincronizadas nas fases G1/G0 ou G2/M do ciclo celular, para cada grupo ainda foi utilizado ou não o tratamento com o inibidor de deacetilase Scriptaid nas primeiras horas de cultivo embrionário. O resultados obtidos permitem afirmar que existem incompatibilidades de ciclo celular entre citoplastos em TII e células em G1/G0 assim como entre citoplastos em MII e células em G2/M quanto à reprogramação celular. O tratamento com Scriptaid mostrou ter um efeito ciclo celular dependente, uma vez que só foi observada melhora no desenvolvimento embrionário quando utilizado com citoplastos em MII, independente da célula utilizada como doadora de núcleo. Apesar de amplamente utilizados com a finalidade de melhorar a reprogramação celular em embriões clonados, foi demostrado pela primeira vez a relação da inibição da desacetilação com diferentes interações de ciclo celular entre citoplastos e células doadoras de núcleo sobre o desenvolvimento de embriões produzidos por SCNT.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2015-12-15T13:26:48Z No. of bitstreams: 1 erickestevesdeoliveira.pdf: 1235775 bytes, checksum: d5513847048574c1ada373c0b486b859 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2015-12-15T13:42:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 erickestevesdeoliveira.pdf: 1235775 bytes, checksum: d5513847048574c1ada373c0b486b859 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-15T13:42:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 erickestevesdeoliveira.pdf: 1235775 bytes, checksum: d5513847048574c1ada373c0b486b859 (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Ocimum. gratissimum L. e Mentha x villosa Huds. são duas plantas aromáticas que são amplamente utilizadas no Brasil e em outros países tanto para fins terapêuticos, como na culinária. Diversas atividades farmacológicas já foram descritas para essas duas plantas e para os componentes majoritários de seus óleos essenciais, Eugenol e Óxido de Piperitenona, respectivamente. Porém ainda há a carência de estudos sobre a atividade antiproliferativa desses óleos essenciais sobre linhagens tumorais e as implicações desses compostos sobre a produção de TGF-1, uma citocina que, em tumores já estabelecidos, apresenta efeito pró-tumoral. Esse estudo visa avaliar os efeitos dos tratamentos com os óleos essenciais de O. gratissimum e M. x villosa, sobre uma linhagem de adenocarcinoma humano de pulmão produtora de TGF-1. Métodos: A viabilidade celular foi avaliada através do ensaio de MTT em linhagens de células (A549 e J774 A.1) e em macrófagos intraperitoneais tratados com 5 a 200g/mL, por 48h. O efeito dos óleos essenciais sobre o ciclo celular foi avaliado através de marcação com iodeto de propídio e quantificação das fases de ciclo celular por citometria de fluxo. A quantificação de células em SubG1 foi utilizada como parâmetro para avaliação de apoptose, que foi confirmada através da marcação de TUNEL. A produção de TGF-1 foi avaliada por ELISA. Resultados: Os dois óleos essenciais reduziram a viabilidade da linhagem celular A549 (IC50: OG:160g/mL / MV:117g/mL), os tratamentos também induziram parada do ciclo celular em S com 24h de tratamento (controle: 12,31±0,89 / OEOG: 15,70±1,15 / OEMV: 23,35±0,75) efeito já registrado para eugenol. Também houve aumento do percentual de células em SubG1 (controle: 15,05±0,71 / OEOG: 91,94±1,71 / OEMV:24,62±1,06), indicando aumento da fragmentação de DNA, um dos sinais de apoptose, que foi confirmado pelo aumento da mediana de fluorescência na marcação de TUNEL (controle:59.1±3.4 / OEOG:68.6±3.7 / OEMV:75.3±15.7). Houve redução da produção de TGF-1 nas concentrações não letais dos óleos essenciais (10 e 50g/mL). Conclusões: Esses dados demonstram o potencial indutor de apoptose e de parada de ciclo celular, desses óleos essenciais para o tratamento de tumores, sobretudo aqueles caracterizados pela produção de TGF-1, citocina importante para a sobrevivência e proliferação de células tumorais. Contudo, essa citocina desempenha papéis importantes na homeostase do organismo, e por isso são necessários estudos que avaliem o efeito sistêmico desses óleos essenciais. / Ocimum. gratissimum L. and Mentha x villosa Huds are aromatic plants largely used, in Brazil and other countries, for therapeutic and culinary purposes. Several pharmacological properties have been described for their essential oil and their major compounds: Eugenol and piperitenone oxide respectively. However, the antiproliferative effect and the blockage of the TGF-1 production are poorly understood. This cytokine contributes for the development of late-phase tumors. This study aimed to evaluate the effects of the essential oils of Ocimum gratissimum and Mentha x villosa over a TGF-1 producer human lung adenocarcinoma cell line. Methodology: Viability was assessed through MTT assay, on cell lineages (A549 and J774 A.1) and intraperitoneal macrophages treated for 48h with essential oil concentrations ranging from 5 to 200g/mL. Cell cycle and SubG1 DNA amount was evaluated through propidium iodide staining followed by flow citometry analysis. TUNEL assay was used to quantify the DNA fragmentation. ELISA was performed to measure the TGF-1 production. Results: Both essential oils reduced A549 cell viability (IC50: EOOG:160g/mL / EOMV:117g/mL), there was also cell cycle arrest at S phase, after 24hours of treatment (control: 12,31±0,89 / EOOG: 15,70±1,15 / EOMV: 23,35±0,75). SubG1 DNA amount was also elevated after treatment (control: 15,05±0,71 / EOOG: 91,94±1,71 / EOMV:24,62±1,06), an indicative of DNA fragmentation, one of the apoptosis sign. This effect was confirmed by the elevated TUNEL labeling. The non-lethal concentrations of the essential oils (10 and 50g/mL) led to the reduction of TGF-1 production. Conclusion: These data indicates the apoptotic and cell cycle arrest effects of the essential oils, mainly over TGF-1 producing tumors. As this cytokine has a key role over the survival and proliferation of these cancer cells. The possible systemic effects of these treatments are yet to be evaluated, as the TGF-1 blockage may affect the maintenance of homeostasis.

Peptídeos intracelulares são constantemente produzidos pelo sistema ubiquitina proteassomo e muitos são provavelmente funcionais. Aqui, um nonapeptídio derivado da ciclina-D2, específica da transição G1/S, chamado \"pep5\" mostrou um aumento específico durante a fase S do ciclo celular em células HeLa. O pep5 (50-100 &mu;M) induziu a morte celular em células HeLa e em várias outras células tumorais, mas isso só ocorreu quando o pep5 foi sintetizado acoplado ao peptídeo penetrador de células (pep5-cpp). In vivo, o pep5-cpp reduziu o volume do glioblastoma C6 de ratos Wistar em cerca de 50%. A acetilação reduziu a potência do pep5-cpp, enquanto substituições Leu-Ala aboliram totalmente a atividade deste peptídeo. Os resultados de caracterização inicial do mecanismo de morte celular indizida pelo pep5 incluem ativação de caspases 3/7 e 9, inibição da fosforilação Akt2 e inibição da atividade do proteassomo. Esses dados colaboram com a hipótese da função de peptídeos intracelulares na sinalização. / Intracellular peptides are constantly produced by the ubiquitinproteasome system and many are probably functional. Here, a nonapeptide of G1/S-specific cyclin-D2 named pep5 showed a specific increase during the S phase of HeLa cell cycle. Pep5 (50-100 &mu;M) induced cell death in HeLa and in several other tumor cells, only when it was fused to a cell penetrating peptide (pep5-cpp). In vivo, the pep5-cpp reduced the volume of the rat C6 glioblastoma by almost 50%. Acetylation reduced the potency of the pep5-cpp while Leu-Ala substitutions totally abolished the pep5 activity. Findings from the initial characterization of the cell death mechanism of pep5 include caspase 3/7 and 9 activation, inhibition of Akt2 phosphorylation and inhibition of proteasome activity. These data further support the intracellular function of peptides.

A crotoxina é a toxina mais abundante e ativa do veneno da cascavel brasileira Crotalus durissus terrificus. É composta por duas sub-unidades ligadas não covalentemente. A sub-unidade ácida é enzimaticamente inativa e não possui toxicidade, é também conhecida como crotapotina e potencializa a ação da fosfolipase A2 (sub-unidade básica). Alguns autores atribuem à crotoxina um efeito citotóxico e sugerem seu uso como um agente terapêutico contra tumores. Neste trabalho, foi investigada a citotoxidade da crotoxina e suas subunidades em células de melanoma murino e fibroblastos. Os ensaios de indicam que a crotoxina é tóxica para as células de melanoma promovendo a morte até em concentrações mais baixas enquanto os fibroblastos foram afetados somente em concentrações mais altas. Ensaios com as subunidades mostraram que a fosfolipase A2 foi mais tóxica para as células de melanoma que para os fibroblastos. / Crotoxin is the most abundant and active toxin from the venom of the Brazilian rattlesnake Crotalus durissus terrificus. It is composed of two subunits non covalently linked. One acidic with no enzymatic or toxic activity, known as crotapotin, which enhances the phospholipase A2 (basic subunit) action. Some authors have also attributed to this toxin a direct cytotoxic effect, and have suggested its use as a therapeutical agent against tumoral cells. In the present work, we investigated the cytotoxic effect of crotoxin and its subunitis on murine melanoma cells and fibroblasts. Our results indicate that crotoxin is highly toxic to the melanoma cells inducing cell death even at the lowest concentration while the fibroblast were only affected with the higher concentrations. The subunits assays showed that the phospholipase A2 had a higher toxicity on melanoma cells than on fibroblasts.

Gastrópodes terrestres secretam muco pela superfície corporal, quando se locomovem, para proteção do corpo contra injúria mecânica, dessecação ou contato com substâncias nocivas. O muco de moluscos tem sido estudado como fonte de novos compostos naturais com diversas atividades biológicas, entre elas a capacidade de induzir proliferação celular. O presente trabalho propôs o estudo do muco produzido pelas lesmas terrestres Phyllocaulis boraceiensis como agente indutor de proliferação celular e síntese de colágeno em cultura de fibroblastos humanos normais, células endoteliais e no reparo de processos cicatriciais no modelo de ferida cirúrgica da derme de camundongos. Fibroblastos tratados com proteínas do muco de P. boraceiensis em concentrações menores que 0,012 <font face=\"Symbol\">mg/µl apresentaram aumento nas taxas de proliferação avaliadas pelo método colorimétrico do MTT e em citometria de fluxo CSFE, mostrando um efeito dose-dependente. Os resultados obtidos mostraram que fibroblastos humanos normais e células endoteliais tratados com 0,012 g/<font face=\"Symbol\">ml de proteínas do muco, aumentaram significativamente a produção e secreção de elementos da matriz extracelular, como as fibras de colágeno. Houve a redução da produção de radicais livres lipídicos poli-insaturados. O ensaio de cicatrização da derme lesionada de camundongos Balb-c tratados com proteínas do muco de P. boraceiensis na concentração de 0,012 <font face=\"Symbol\">mg/µl induziu o reparo da cicatrização com maior eficácia e em menor tempo quando comparado ao grupo controle e aos tratados com a concentração de 0,18 <font face=\"Symbol\">mg/µl. Esses resultados corroboram a premissa de que o muco de P. boraceiensis, assim como o de outros gastrópodes, apresenta propriedade proliferativa das células envolvidas nos processos de cicatrização. / Mucus of molluscs has been studied as a source of new natural compounds with diverse biological activities, as ability to induce cell proliferation. The aim of this study is the potential use of mucus produced by land slugs Phyllocaulis boraceiensis as a promoter of cell proliferation and collagen synthesis in human fibroblasts, endothelial cells and in repair processes of healing wound skin of mice. Fibroblasts treated with P. boraceiensis mucus at concentrations below 0.012 <font face=\"Symbol\">mg/µl have high rates of proliferation as evaluated by the MTT and CFSE flow cytometer assays, proliferative effect was dose-dependent. Fibroblasts and endothelial cells treated with 0.012 <font face=\"Symbol\">mlowg/µl mucus induced a significant increase in production and secretion of extracellular matrix such as collagen fibers. There was a reduction in polyunsaturated lipid production. Healing assay of lesions in mice treated with mucus at 0.012 <font face=\"Symbol\">mg/µl induce repair of the scar more effectively and in less time when compared to the control group and those treated 0.18 <font face=\"Symbol\">mg/µl. These findings support the premise that the P. boraceiensis mucus demonstrates proliferative properties in cells involved in the healing process.