Stimulating lymphocytes with Ifn-γ, anti-CD3, and interleukin-2 promotes the proliferation of a cell population coexpressing T-lymphocyte surface antigens such as CD3, CD8a, and CD25 as well as natural killer cell markers such as NK1.1, CD49, and CD69. These cells, referred to as cytokine-induced killer cells (CIKs), display cytotoxic activity against tumour cells, even without prior antigen presentation, and offer a new cell-based approach to the treatment of malignant diseases. Because CIKs are limited in vivo, strategies to optimize in vitro culture yield are required. In the last 10 years, mesenchymal stem cells (MSCs) have gathered considerable attention. Aside from their uses in tissue engineering and as support in haematopoietic stem cell transplantations, MSCs show notable immunomodulatory characteristics, providing further possibilities for therapeutic applications. In this study, we investigated the influence of murine MSCs on proliferation, phenotype, vitality, and cytotoxicity of murine CIKs in a coculture system. We found that CIKs in coculture proliferated within 7 days, with an average growth factor of 18.84, whereas controls grew with an average factor of 3.7 in the same period. Furthermore, higher vitality was noted in cocultured CIKs than in controls. Cell phenotype was unaffected by coculture with MSCs and, notably, coculture did not impact cytotoxicity against the tumour cells analysed. The findings suggest that cell–cell contact is primarily responsible for these effects. Humoral interactions play only a minor role. Furthermore, no phenotypical MSCs were detected after coculture for 4 h, suggesting the occurrence of immune reactions between CIKs and MSCs. Further investigations with DiD-labelled MSCs revealed that the observed disappearance of MSCs appears not to be due to differentiation processes.

Stimulating lymphocytes with Ifn-γ, anti-CD3, and interleukin-2 promotes the proliferation of a cell population coexpressing T-lymphocyte surface antigens such as CD3, CD8a, and CD25 as well as natural killer cell markers such as NK1.1, CD49, and CD69. These cells, referred to as cytokine-induced killer cells (CIKs), display cytotoxic activity against tumour cells, even without prior antigen presentation, and offer a new cell-based approach to the treatment of malignant diseases. Because CIKs are limited in vivo, strategies to optimize in vitro culture yield are required. In the last 10 years, mesenchymal stem cells (MSCs) have gathered considerable attention. Aside from their uses in tissue engineering and as support in haematopoietic stem cell transplantations, MSCs show notable immunomodulatory characteristics, providing further possibilities for therapeutic applications. In this study, we investigated the influence of murine MSCs on proliferation, phenotype, vitality, and cytotoxicity of murine CIKs in a coculture system. We found that CIKs in coculture proliferated within 7 days, with an average growth factor of 18.84, whereas controls grew with an average factor of 3.7 in the same period. Furthermore, higher vitality was noted in cocultured CIKs than in controls. Cell phenotype was unaffected by coculture with MSCs and, notably, coculture did not impact cytotoxicity against the tumour cells analysed. The findings suggest that cell–cell contact is primarily responsible for these effects. Humoral interactions play only a minor role. Furthermore, no phenotypical MSCs were detected after coculture for 4 h, suggesting the occurrence of immune reactions between CIKs and MSCs. Further investigations with DiD-labelled MSCs revealed that the observed disappearance of MSCs appears not to be due to differentiation processes.:Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis III Tabellenverzeichnis IV Bibliographische Beschreibung V Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 CIK-Zellen (CIK) 3 1.1.1 Merkmale von CIK-Zellen 3 1.1.2 Wirkungsmechanismen von CIK-Zellen 3 1.1.3 Studienlage 4 1.1.4 Bisherige Ansätze zur Verbesserung der Kultivierungsbedingungen 6 1.2 Mesenchymale Stammzellen (MSC) 7 1.2.1 Allgemein 7 1.2.2 Differenzierung von MSC 7 1.2.3 Heterogenität und Einflussfaktoren der MSC - Identitätsproblematik 8 1.2.4 Charakterisierung von MSC 9 1.2.5 Therapeutische Einsatzmöglichkeiten von MSC 11 2 Zielformulierung 15 3 Material und Methoden 16 3.1 Tiere 16 3.2 Materialien 17 3.2.1 Materialien für Zellkultur 17 3.2.2 Materialien für FACS-Analyse 18 3.2.3 Materialien für Zytotoxizitätsassay 19 3.2.4 Materialien für CFU-F-Assay 20 3.3 Methoden 21 3.3.1 Statistische Auswertung 21 3.3.2 Zellkultur 22 3.3.3 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) 26 3.3.4 Markierung der MSC mit DiD 28 3.3.5 Zytotoxizitätsassay (LDH-Freisetzungsassay) 29 3.3.6 CFU-F-Assay 32 4 Ergebnisse 34 4.1 Beeinflussung der Wachstumskurve 34 4.1.1 Der Wachstumskurvenverlauf von CIK-Zellen (Kontrollen) 34 4.1.2 Der Wachstumskurvenverlauf von CIK-Zellen in der Kokultur mit MSC 35 4.1.3 Der Wachstumskurvenverlauf in MSC-konditioniertem Medium 37 4.1.4 Der Wachstumskurvenverlauf bei Restimulierung an Tag 14 38 4.2 Beeinflussung des Oberflächenphänotyps 40 4.2.1 Der Oberflächenphänotyp von CIK-Zellen 40 4.2.2 Vergleich Oberflächenphänotyp Kontrollen mit kokultivierten CIK 43 4.3 Beeinflussung der Vitalität 46 4.4 Beeinflussung der Zytotoxizität 48 4.5 Identifizierung der MSC 49 4.5.1 Adhärenz an Plastikoberflächen 50 4.5.2 Fibroblastenähnliche Wachstumsmorphologie 50 4.5.3 Wachstum in Colony-Forming-Units 51 4.5.4 Der Oberflächenphänotyp von MSC 53 4.6 Schicksal der MSC in der Kokultur 54 4.6.1 Der Oberflächenphänotyp der adhärenten Zellen nach Kokultur 54 4.6.2 Kokultur mit DiD gelabelten MSC 57 5 Diskussion 59 5.1 Beeinflussung der Wachstumskurve 60 5.1.1 Mechanismen der Beeinflussung des Wachstumskurvenverlaufs 60 5.1.2 Fehlerbetrachtung 68 5.2 Identifizierung der CIK sowie Beeinflussung von Phänotyp und Vitalität 69 5.3 Beeinflussung der Zytotoxizität 70 5.3.1 Vergleich Zytotoxizität Kontrollen mit Kokulturen 70 5.3.2 Fehlerbetrachtung 71 5.4 Identifizierung der MSC 72 6 Schlussfolgerung 75 7 Ausblick 77 8 Zusammenfassung 79 Literaturverzeichnis 83 Danksagung I

Byggbranschen är en konservativ sektor där traditionella arbetssätt hindrar digitaliseringen från att nå sin fulla potential. BIM som står för building information modeling eller building information managment är det begreppet som står i fokus när digitaliseringen för byggprojekt diskuteras. Majoriteten av alla byggprojekt genomförs, trots fördelarna med BIM, fortfarande på ett mer eller mindre traditionellt sätt. I detta examensarbete undersöks CIK-projektet som står för Centrum för idrott och kultur i Knivsta. Projektet projekterades och framställdes med traditionella metoder. Utifrån personliga erfaranheter och flertalet personliga kommunikationer är det tydligt att kunskapsnivån kring den praktiska tillämpningen av BIM är väldigt låg i byggbranschen. Problematiken kring den låga kunskapsnivån för den praktiska tillämpningen leder till en underutvecklad digitalisering.  Syftet med detta examensarbete är att redogöra för hur CIK-projektet utfördes. Vidare undersöks det huruvida CIK-projektet hade kunnat projekteras med BIM som arbetssätt och vilka förändringar det skulle innebära för projektet. Metoden i arbetet har bestått av en litteraturstudie för att undersöka begreppet BIM och hur BIM tillämpas i byggprocessen. Därtill utfördes en litteraturstudie av Revit, BIMeye och StreamBIM som är BIM-verktygen som används i detta examensarbete. Vidare genomfördes en fallstudie av CIK-projektet där objektet beskrevs samt dokument och intervjuer analyserades. Slutligen utfördes ommodelleringar och observationer av CIK-projektet med BIM-verktygen som nämnts ovan. Resultatet påvisar inledningsvis hur de traditionella arbetsmetoderna genomfördes och därmed präglade CIK-projektet. Den uteblivna detaljerade kravställnigen från politikerna och beställarna resulterade i många oklarheter när den efterfrågade produkten skulle utformas. Arkitekterna använde sig av traditionella skissmetoder vid gestaltningen för att hitta lösningar på de efterfrågade behoven. Kalkyl och tidsplaneringen skapades samt justerades manuellt, vilket utfördes separerat från 3D-modellen. 3D-modellerna i CIK-projektet användes för visualiseringar och samordningar för kollisionskontroller. De kontrakterade handlingarna vid diverse leveranser var dock traditionella 2D-ritningar. Av dokumentanalysen kunde det konstateras att arkitekterna framställde över 300 ritningar och över 100 olika dörrar som presenterades på ett flertal olika ritningar. Revideringar under produktionen arbetades in i ritningarna och molnades därefter in för att markera ändringen. Därtill skapades det ett separat PM där revideringarna presenterades mer ingående. När byggnationen var färdigställd arbetades ytterligare korrigeringar in i handlingarna av konsulterna. Utvalda handlingar i samråd med beställarna stämplades sedan om till relationshandlingar och levererades som PDF-filer till förvaltarna. Vidare visar resultatet hur CIK-projektet med en BIM-tillämpning hade kunnat utföras. CIK med BIM innebär att det tillkommer minst två nya roller, en BIM-strateg och en BIM-samordnare. Vid projektstart skapar BIM-strategen tillsammans med beställarna en kravspecifikation i form av en BIM-manual för att beskriva standarder, leverensspecifikationer, kommunikationsmetoder med mera. Därtill ska det bland annat framgå hur den kommande modellen skall berikas med information samt vilka BIM-verktyg som skall användas. Den ansvariga BIM-samordnaren har sedan som arbetsuppgift att de ställda kraven för BIM-projektet efterföljs. Under gestaltningen ska beräkningskrafterna från parametrisk och generativ design användas för att hitta olika lösningar på krav. Därtill ska simulationer och analyser användas under projektets gång för att ta hänsyn till och säkerställa att kraven och behoven uppnås. Kalkylen och tidplanen ska vara kopplade till BIM-modellen för att ständigt få korrekta och uppdaterade kostnader och tidsåtgångar. Med hjälp av molntjänster som exempelvis BIMeye kan all data och information från BIM-modellen hanteras och diverse rapporter av informationen exporteras av samtliga i projektet. Via exempelvis StreamBIM hämtar sedan produktionen all nödvändig information från BIM-modellen för att kunna framställa CIK utan traditionella ritningar. Viktiga detaljritningar och kompletterande handlingar som exempelvis dörrkortet som skribenterna skapade ska kopplas till objekten i StreamBIM. Under hela produktionen ska sedan BIM-modellen ständigt uppdateras för att kunna skapa en digital tvilling av den verkliga byggnaden som sedan överlämnas till beställarna för förvaltning. BIM-modellen används och berikas sedan under hela byggnadens livstid. Vidare fördes det diskussioner i anknytning till resultatet, därtill diskuterades även metod och begränsningar för arbetet. CIK-projektet är ett bevis på att det går att arbeta på ett traditionellt sätt och ändå kunna framställa bra byggnader. Däremot hade ett BIM-tillämpat arbetssätt kunnat skapa ett mervärde för beställarna genom att kvalitetssäkra hela arbetet från idé till förvaltning. För att en tillämpning av BIM ska verkställas krävs det dock tydliga och specificerade krav från beställarna. Skribenterna anser därför att nationella krav skulle påskynda digitaliseringen i byggbranschen. BIM motiverar sig själv eftersom ändringar blir mer kostsamma i senare skeden jämfört med tidigt i projekteringen. Därför borde det läggas ner mer tid och kostnader på att analysera och hantera bygginformation tidigt för att inte riskera att större kostnader tillkommer senare i projektet. Eftersom begreppet BIM är brett och uppfattningarna kan variera mellan aktörer i branschen försvårades inhämtningen av vetenskaplig litteratur. Däremot underlättades säkerställandet av källkritiken genom författarnas erfarenheter av projektering på arkitektsidan. De slutsatser som kan dras från detta examensarbete är att bygginformationshanteringen är en viktig aspekt att beakta under byggprocessen. För komplexa projekt som CIK hade BIM inneburit ett helt nytt sätt att hantera och centralisera informationen genom att knyta data till objekten i modellen. Poängen med BIM-projekt är att ständigt vända sig till modellen eller molntjänstens databas som i sin tur är kopplad till modellen för att hämta nödvändig information. Resultatet blir därför ett frigörande från de informationsöarna och dubbelarbete som bildades i CIK-projektet med en traditionell projektering. / Purpose: The purpose of this study is to describe how the CIK project was executed. Furthermore, it is investigated how the CIK project could have been designed with BIM as a working method and what changes it would entail for the project. Method: This study has consisted of a literature study of BIM and a case study of the CIK project. The case study included an object description as well as documents and interviews were analyzed. In addition, remodeling and observations of the CIK project were performed with BIM tools. Results: The results initially show how the traditional working methods were implemented in the CIK project. The initial lack of requirements created ambiguities. The architects used traditional sketching methods for the design. Calculation and scheduling were handled separately from the 3D model. The 3D models in the CIK project were used for visualizations and coordination. However, the contracted documents for various deliveries were traditional 2D drawings. The architects produced over 300 drawings and over 100 different doors that were presented on different drawings. At the end of the production, selected PDF-documents were re-stamped in consultation with the customers for the administration. Furthermore, the results show how the CIK project with a BIM application could have been carried out. Initially, a BIM manual is created by a BIM strategist to specify the requirements. During design, parametric and generative design are used to find different solutions to meet the requirements. The calculation and schedule must be linked to the BIM model. All information management takes place in cloud services such as BIMeye. Through StreamBIM, the production then retrieves all the necessary information from the BIM model. Additional detailed drawings should be linked to the objects in StreamBIM. During production, the BIM model is updated before the delivery to the customers. Conclusions: The conclusions that can be drawn from this study are that the information management is an important aspect to implement during the construction process. For the CIK project, BIM would mean a completely new way of managing and centralizing the information by linking data to the objects in the model. The point of BIM projects is to constantly turn to the model or database, which is linked to the model to retrieve the necessary information. The result is therefore a release from the information islands and duplication of work that is formed in a traditional design.

La leucémie aigüe lymphoblastique de précurseurs des cellules B (pré-B LAL) est le cancer le plus fréquent chez l’enfant. La transplantation de cellules souches hématopoïétiques (TCSH) est nécessaire dans environ 20 à 30 % des enfants ayant une pré-B LAL. Les rechutes après TCSH sont habituellement réfractaires aux thérapies actuelles, et par conséquent, il est important de développer et d’optimiser de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux cellules « cytokine-induced killer » (CIK). En effet, ces cellules ont été montrées comme hautement cytotoxique contre beaucoup de types de cancers. Cependant, leur activité cytotoxique contre les pré-B LAL n’est pas vraiment efficace. Par conséquent, nous avons étudié la possibilité de combiner l’immunothérapie des cellules CIK avec l’interféron alpha (IFN-α) afin d’optimiser l’activité lytique de ces cellules contre les cellules pré-B LAL. De plus, vu qu’il a été démontré que l’activité cytotoxique des cellules CIK provient de la fraction CD56+, plus particulièrement les cellules CD3+CD56+, nous avons décidé d’utiliser la fraction CD56+ (cellules CD56+) dans l’ensemble de nos expériences. Nous avons observé in vitro que les cellules CD56+ lysent mieux les lignées cellulaires pré-B LAL comparativement aux cellules CIK non purifiées. Aussi, leur activité cytotoxique peut être augmentée par le traitement avec l’IFN-α. Par ailleurs, nous avons démontré l’efficacité des cellules CD56+ traitées par l’IFN-α contre les lignées cellulaires pré- B LAL in vivo, dans le modèle de souris NOD/SCID/gamma c- (NSG). La survie des souris est significativement prolongée lorsqu’elles reçoivent les cellules pré-B LAL avec les cellules CD56+ traitées par l’IFN-α. Nous avons par la suite étudié le mécanisme d’action des cellules CD56+ contre les lignées cellulaires pré-B LAL. Nous avons observé que les cellules CD56+ provenant de sang de cordon sont plus efficaces que les cellules CD56+ provenant de sang I périphérique pour tuer les lignées cellulaires pré-B LAL. Nous avons également montré que les cellules CD56+ utilisent seulement la voie NKG2D ou bien les voies NKG2D et TRAIL selon la lignée cellulaire pré-B LAL cible et selon la provenance de la source des cellules CD56+. Par ailleurs, nous avons remarqué que les cellules CIK sont sensibles à l’apoptose par Fas, et que cette sensibilité influence leur activité cytotoxique contre les cellules tumorales. En conclusion, les cellules CD56+ sont cytotoxiques contre les lignées cellulaires pré-B LAL, et leur effet lytique est augmenté par l’IFN-α aussi bien in vitro qu’in vivo dans le modèle de souris NSG. Ces données précliniques sont encourageantes pour tester cette nouvelle approche d’immunothérapie dans le traitement contre la pré-B LAL. / Precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is the most common form of leukemia in children. Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is required in around 20 to 30% of children with a B-ALL. The relapses occuring post-HSCT are usually insensitive to current therapy. Therefore, it is important to develop and optimize a new therapeutic strategy. In this study, we were interested to study « cytokine-induced killer » (CIK) cells. These cells have been shown to be very cytotoxic against many types of tumor. However, their cytotoxic activity against B-ALL cells is not very efficient. Consequently, we have studied the effect of combining adoptive immunotherapy of CIK cells with the interferon alpha (IFN-α) to increase their lytic activity against B-ALL cells. In addition, in the literature, the cytotoxic activity of CIK cells has been shown to come from the CD56+ fraction (CD56+ CIK), in particular CD3+CD56+ cells. Therefore, we used the CD56+ fraction in all the experiments. We have observed in vitro that CD56+ CIK cells killed more efficiently B-ALL cell lines than did non-purified CIK cells. Also, their cytotoxic activity could be enhanced with IFN-α. Moreover, we have demonstrated the efficacy of IFN-α-treated-CD56+ CIK cells against B-ALL cell lines in vivo in the model of NOD/SCID/gamma c- (NSG) mice by showing that the survival of mice injected with B-ALL cell lines was significantly increased when they were injected with IFN-α-treated-CD56+ CIK cells. Subsequently, we have studied the lytic mechanism of CD56+ CIK cells against B-ALL cell lines. We have observed that CD56+ CIK cells from cord blood were more efficient than CD56+ CIK cells from peripheral blood to kill B-ALL cell lines. CD56+ CIK cells used only the NKG2D pathway or the both NKG2D and TRAIL pathways depending on the B-ALL cell line and the source of CIK cells. In addition, we showed that CIK cells were sensitive to Fas apoptosis. This sensitivity III influenced the cytotoxic activity of CIK cells against tumor cells. In conclusion, CD56+ CIK cells are cytotoxic against B-ALL cell lines, and their effect can be increased with IFN-α in vitro and in vivo. Taken together, our pre-clinical data are very interesting for testing the potential clinical utility of purified CD56+ CIK cells as an immunotherapeutic strategy for B- ALL patients.