Les canaux potassiques voltage-dépendants forment des tétramères dont chaque sous-unité comporte six segments transmembranaires (S1 à S6). Le pore, formé des segments S5-S6 de chaque sous-unité, est entouré de quatre domaines responsables de la sensibilité au potentiel membranaire, les senseurs de voltage (VS; S1-S4). Lors d’une dépolarisation membranaire, le mouvement des résidus chargés situés dans le VS entraine un mouvement de charges détectable en électrophysiologie, le courant de « gating ». L’activation du VS conduit à l'ouverture du pore, qui se traduit par un changement de conformation en C-terminal du segment S6. Pour élucider les principes qui sous-tendent le couplage électromécanique entre ces deux domaines, nous avons étudié deux régions présumées responsables du couplage chez les canaux de type Shaker K+, soit la région carboxy-terminale du segment S6 et le lien peptidique reliant les segments transmembranaire S4-S5 (S4-5L). Avec la technique du « cut-open voltage clamp fluorometry » (COVCF), nous avons pu déterminer que l’interaction inter-sous-unitaire RELY, formée par des acides aminés situés sur le lien S4-5L et S6 de deux sous-unités voisines, est impliquée dans le développement de la composante lente observée lors du retour des charges de « gating » vers leur état de repos, le « OFF-gating ». Nous avons observé que l’introduction de mutations dans la région RELY module la force de ces interactions moléculaires et élimine l’asymétrie observée dans les courants de « gating » de type sauvage. D’ailleurs, nous démontrons que ce couplage inter-sous-unitaire est responsable de la stabilisation du pore dans l’état ouvert. Nous avons également identifié une interaction intra-sous-unitaire entre les résidus I384 situé sur le lien S4-5L et F484 sur le segment S6 d’une même sous-unité. La déstabilisation de cette interaction hydrophobique découple complètement le mouvement des senseurs de voltage et l'ouverture du pore. Sans cette interaction, l’énergie nécessaire pour activer les VS est moindre en raison de l’absence du poids mécanique appliqué par le pore. De plus, l’abolition du couplage électromécanique élimine également le « mode shift », soit le déplacement de la dépendance au voltage des charges de transfert (QV) vers des potentiels hyperpolarisants. Ceci indique que le poids mécanique du pore imposé au VS entraine le « mode shift », en modulant la conformation intrinsèque du VS par un processus allostérique. / Voltage-gated potassium channels are tetramers and each subunit is formed of six transmembrane segments (S1 to S6). The pore, formed by the S5-S6 segments of each subunit, is surrounded by four modules responsible for sensitivity to the membrane potential, the voltage sensors (VS, S1-S4). During membrane depolarization, the movement of charged residues located in the VS causes a detectable charge movement called the gating current. The activation of the VS led to the opening of the pore, resulting in a conformational change in the C-terminal segment of S6. To elucidate the principles underlying the electromechanical coupling between these two domains, we examined two regions presumed responsible for the coupling among channels of the Shaker K + family: the carboxy-terminal region of S6 and the peptide bond linking the transmembrane segments S4-S5 (S4-5L). Using the cut-open voltage clamp fluorometry (COVCF), we have determined that the RELY inter-subunit interaction, formed by amino acids located on the S4-5L linker and S6 of two neighboring subunits, is involved in the development of the slow component observed during the return of the gating charges (OFF-gating) to their resting state. The introduction of mutations in the RELY region modulates the strength of these molecular interactions and eliminates the asymmetry observed in the wild type gating currents. Moreover, we demonstrate that this inter-subunit coupling is responsible for stabilizing the pore in the open state. We have also identified an intra-subunit interaction between residues I384 located on the S4-5L linker and F484 on the S6 segment of the same subunit. The destabilization of this hydrophobic interaction uncouples completely the movement of voltage sensors from pore opening. Without this interaction, the energy required to activate the VS is diminished due to the absence of mechanical weight applied by the pore. Furthermore, this uncoupling also eliminates the "mode shift", defined as an amplified shift of the voltage dependence of gating charge (QV) to hyperpolarizing potentials during prolonged depolarization, thus indicating that the mechanical load of the pore influences the entry of the VS into this shifted mode by modulating the conformation of the VS threw an intrinsic allosteric process.

Les canaux ioniques dépendants du voltage sont responsables de l'initiation et de la propagation des potentiels d'action dans les cellules excitables. De nombreuses maladies héréditaires (channelopathies) sont associées à un contrôle défectueux du voltage par ces canaux (arythmies, épilepsie, etc.). L’établissement de la relation structure-fonction exacte de ces canaux est donc crucial pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques spécifiques. Dans ce contexte, le canal procaryote dépendant du voltage et sélectif au potassium KvAP a servi de modèle d’étude afin d’approfondir i) le processus du couplage électromécanique, ii) l’influence des lipides sur l’activité voltage-dépendante et iii) l’inactivation de type closed-state. Afin de pallier à l’absence de données structurales dynamiques du côté cytosolique ainsi que de structure cristalline dans l’état fermé, nous avons mesuré le mouvement du linker S4-S5 durant le gating par spectroscopie de fluorescence (LRET). Pour ce faire, nous avons utilisé une technique novatrice du contrôle de l’état conformationnel du canal en utilisant les lipides (phospholipides et non phospholipides) au lieu du voltage. Un modèle dans l’état fermé a ainsi été produit et a démontré qu’un mouvement latéral modeste de 4 Å du linker S4-S5 est suffisant pour mener à la fermeture du pore de conduction. Les interactions lipides - canaux jouent un rôle déterminant dans la régulation de la fonction des canaux ioniques mais ne sont pas encore bien caractérisées. Nous avons donc également étudié l’influence de différents lipides sur l’activation voltage - dépendante de KvAP et mis en évidence deux sites distincts d’interactions menant à des effets différents : au niveau du senseur de voltage, menant au déplacement de la courbe conductance-voltage, et du côté intracellulaire, influençant le degré de la pente de cette même courbe. Nous avons également démontré que l’échange de lipides autour de KvAP est extrêmement limité et affiche une dépendance à l’état conformationnel du canal, ne se produisant que dans l’état ouvert. KvAP possède une inactivation lente particulière, accessible depuis l'état ouvert. Nous avons étudié les effets de la composition lipidique et de la température sur l'entrée dans l'état inactivé et le temps de récupération. Nous avons également utilisé la spectroscopie de fluorescence (quenching) en voltage imposé afin d'élucider les bases moléculaires de l’inactivation de type closed-state. Nous avons identifié une position à la base de l’hélice S4 qui semble impliquée à la fois dans le mécanisme responsable de ce type d'inactivation et dans la récupération particulièrement lente qui est typique du canal KvAP. / Voltage-gated ion channels are responsible for the initiation and propagation of action potentials in excitable cells. Several hereditary diseases (channelopathies) are associated with a defective voltage control by these channels, leading to arrhythmias, epilepsy, etc. Hence, establishing the exact structure/function relation for ion channels is crucial for the development of new specific therapeutic agents. Here, the bacterial voltage-gated potassium channel KvAP served as a model to study i) electromechanical coupling, ii) influence of lipids on the voltage dependent activity and iii) closed-state inactivation. To overcome the lack of structural information on the cytosolic side and of crystal structure in the closed state, we determined the S4-S5 linker movement during gating using fluorescence spectroscopy (LRET). We were able to control the conformational state of the channels by using lipids (phospholipids and non phospholipids) instead of voltage clamp. Based on these experimental constraints, a model in the closed state was produced, showing that a small 4Å radial displacement of the S4-S5 linker is sufficient to close the conduction pore. Interactions between lipids and membrane proteins play an important role in the regulation of ion channels activity but are not well characterized. We studied the influence of different lipids on KvAP voltage-dependent activation and showed two distinct effects related to different interactions sites: one bound to the voltage sensor, leading to a shift of the conductance-voltage curve, and another at the intracellular side near the pore region, affecting the steepness of this curve. We also showed that the exchange of lipids is very limited around KvAP and seems to be state dependent, occuring only when the channels are kept in the open state. KvAP has a slow inactivation atypical, accessible from the open state. We studied the effects of lipid composition and temperature on entry into inactivation and recovery. We also used voltage-clamp fluorometry in bilayers to investigate closed-state inactivation molecular basis. We identified a position at the bottom of the S4 helix that seems involved in the mechanism for slow inactivation and the extremely slow recovery from inactivation typically displayed by KvAP.

Cette thèse présente une nouvelle extension d’onduleur multiniveaux, appelé ‘Multi Neutral Point’ (MNP). Cet onduleur est déduit des topologies des structures multiniveaux ‘Neutral Point Clamped’ (NPC) et ‘Multi Point Clamped’ (MPC). Les intérêts de cette extension sont: l’absence de diodes de bouclage, la possibilité de disposer de tous les nombres de niveaux, pairs et impairs et possibilité de fonctionner en mode dégradé. Nous avons élaboré une commande rapprochée simple des transistors de puissance, d’abord pour un MNP à 3 niveaux, ensuite pour les nombres de niveaux supérieurs. Nous avons comparé les pertes de puissance d’un onduleur MNP et d’un onduleur NPC. Les pertes de l’onduleur MNP sont largement inférieures à celles de l’onduleur NPC. Dans l’optique de contrôler en courant l’onduleur MNP, une stratégie nouvelle par régulateur PID d’ordre fractionnaire est également développée. Ce contrôle permet de diminuer nettement les erreurs d’amplitude et de phase entre le courant de référence et le courant de charge. La méthode nécessite le réglage des différents paramètres de contrôle en utilisant le principe d'optimisation ‘’multi-objectif’’. Le fonctionnement de l’ensemble convertisseur-contrôle-commande est enfin largement validé par simulation et par expérimentation / This thesis presents a new extension of multilevel inverters, called 'Multi Neutral Point' (MNP). This topology is deduced from Neutral Point Clamped (NPC) and Multi Point Clamped (MPC) structures. The advantage of this extension is twofold: the absence of clamping diodes and the possibility of operating on all the numbers of levels (even and odd). We have developed a simple command; we first present the command strategy for a three levels MNP, then for a five level MNP. We have compared the power losses in the power switches of an MNP and an NPC. The power losses for an MNP are far below those of the NPC inverter. For this inverter model, we have chosen a robust current control by a fractional PID controller. This control strategy can sharply reduce the amplitude and the phase errors between the reference current and the load one. This method requires the setting of various control parameters thanks to the principle of ‘’multiobjective optimization.'' In the end the set of converter-control command is validated by simulation and experimentation; the simulated and experimental results match very well

Insulin resistance is an early marker of Type II diabetes. Excessive lipid accumulation in muscle and liver leads to insulin resistance, and lowering tissue lipids causes an enhancement of insulin action. The enzyme AMP-activated protein kinase (AMPK) is activated when cellular energy levels are compromised, such as during exercise; this enhances fuel oxidation and inhibits energy consuming processes. The hypothesis in this thesis was that activating AMPK in a lipid-induced insulin resistant state leads to tissue lipid reduction and improved insulin sensitivity. Insulin resistant high-fat fed (HF-) rats were administered 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-??-D-ribofuranoside (AICAR), a specific AMPK activator. During an euglycaemic hyperinsulinaemic clamp performed 24h later, HF-rats showed increased whole body, muscle and liver insulin action, independent of changes in PKB-phosphorylation. The liver had reduced triglycerides, malonyl-CoA and increased IkB-a content. A lowering of muscle malonyl-CoA was consistent with conditions favouring increased lipid utilisation. Normal, chow-fed rats also showed improved insulin action post-AICAR. Further studies showed that basal glucose uptake was not increased 24h after AICAR, suggesting that AMPK activation had caused an increase in insulin sensitivity. Diacylglycerols and triglycerides, but not ceramides, were reduced in the liver of AICAR treated HF-rats, suggesting lipid reduction as a likely mediator of enhanced liver insulin action. These lipid species were not reduced in muscle. AICAR administration to HF-rats lowered plasma glucose and fatty acids (FA) acutely, probably due to increased muscle glucose uptake and FA oxidation. Glycogen was reduced in liver and increased in muscle, suggesting glucose mobilisation from liver to muscle. Adrenergic blockade excluded the sympathetic nervous system in the acute AICAR effects. AMPK was activated in white muscle and liver of HF-rats immediately after AICAR, the same tissues that exhibited later improved insulin sensitivity. Tracer technologies used to investigate glucose and lipid fluxes showed that AMPK activation in white muscle simultaneously increased both glucose and FA uptake and their metabolism, with glucose also being stored as glycogen. The liver showed lower lipid synthesis, consistent with reduced liver lipid accumulation observed 24h post-AICAR. In conclusion, these results suggest that activation of AMPK leads to selective tissue lipid reduction and improved insulin action, and is a potential target for the treatment of insulin resistance and type II diabetes.

Le disulfure de diméthyle (DMDS), molécule volatile libérée par les Allium, est un fumigant prometteur en remplacement du bromure de méthyle. Par l'utilisation des techniques d'électrophysiologie (patch-clamp), de biologie moléculaire et d'imagerie calcique sur neurones d'insectes, nous avons identifié de nouvelles cibles altérées par le DMDS à une faible concentration (1 µM). Le DMDS modifie l'activité spontanée régulière des DUM neurones en des bouffées de potentiels d'action séparées par des phases de silence. Cette altération de fréquence est la conséquence d'effets sur plusieurs cibles. Nous avons montré que le DMDS décale la dépendance vis-à-vis du potentiel de l'activation et de l'inactivation du courant Na2 vers de potentiels plus négatifs, rendant la cellule plus excitable. Dans un deuxième temps nous avons mis en évidence que le DMDS induit une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire via l'activation des canaux TRPg et une sortie de calcium des stocks intracellulaires. Cette variation de calcium module, en cloche, les courants potassium dépendants du calcium (KCa). Grâce à l'étude du mode d'action du DMDS sur DUM neurones et au développement de nouvelles techniques associant la biologie moléculaire à l'électrophysiologie, nous avons apporté de nouveaux arguments en faveur de l'existence de deux courants KCa distincts. Parallèlement, grâce à une technique d'électroencéphalographie par télémétrie sur souris, nous avons révélé que le DMDS est susceptible d'engendrer des anomalies de l'activité électroencéphalographique.

Dans le néocortex murin, la division des cellules précurseurs a lieu dès le stade E11 et donne naissance aux premiers neurones pionniers dont les cellules de Cajal-Retzius. L'activité électrique spontanée, portée par les canaux ioniques, joue un rôle prépondérant dans le développement du système nerveux central. Comprendre la place des canaux ioniques et de la signalisation calcique dans les phases précoces de le neurogenèse était l'objectif principal de mon projet. Nous avons montré l'apparition précoce de canaux sodiques dépendants du voltage dans 55% des cellules neuronales à E13, dont les cellules de Cajal-Retzius. En parallèle, nous avons observé des activités calciques spontanées dans les cellules proliférantes et neuronales au même stade. La conception d'un logiciel d'imagerie nous a permis d'analyser statistiquement ces activités et d'identifier les canaux ioniques impliqués. Alors que les synapses ne sont pas encore formées, nous avons observé la mise en place d'activités synchrones au sein du néocortex et démontré l'existence de communications paracrines entre les cellules. De plus, nous avons identifié l'existence d'une cascade de signalisation où la dépolarisation des récepteurs glycinergiques active les canaux sodiques présents sur les neurones pionniers. Dans ces neurones, l'influx sodique entraîne une augmentation de calcium cytoplasmique via un échangeur Na+/Ca2+ puis une exocytose glutamatergique dont le libération paracrine induit l'activation d'autres cellules néocorticales. L'utilisation de la culture organotypique de cerveau nous a laissé entrevoir une implication physiologique majeure de cette cascade de signalisation dans la corticogenèse.

The transmission of sex pheromone-mediated signals is essential for goldfish reproduction. However, the neural pathways underlying this reproductive signalling pathway in the goldfish brain is not well described. Lesioning experiments have shown previously that two brain areas, the preoptic area (POA) and the ventral telencephali pars ventralis (Vv) in particular, are important for reproduction. We used patch clamp electrophysiology to study the electrical activities of POA and Vv neurons. Based on the intrinsic properties of these neurons, we suggest there are five different functional classes of POA neurons and a single class of Vv neurons. In addition, by electrically stimulating the olfactory bulb (OB), we were able to show that this primary sensory structure makes monosynaptic glutamatergic connections with both POA and Vv neurons. While electrophysiology measures signalling events occurring at short time scales on the order of milliseconds to minutes, we were also interested in studying sex pheromone signalling in the goldfish brain over a long time scale. Thus, we describe changes in gene expression in male goldfish exposed to waterborne sex pheromones (17alpha,20beta dihydroxy-4-pregene-3-one and Prostaglandin-F2alpha) over 6 hours. We perform cDNA microarrays on Prostaglandin-F2alpha-treated fish to study the rapid modulation of transcription and define the signalling pathways affected. Our microarrays showed that 71 genes were differentially regulated (67 up and 4 down). Through gene ontology enrichment analysis, we found that these genes were involved in various biological processes such as RNA processing, neurotransmission, neuronal development, apoptosis, cellular metabolism and sexual reproduction. RT-PCRs were performed to validate our microarrays and to facilitate direct comparisons of the effects of the two sex pheromones, 17alpha,20beta dihydroxy-4-pregene-3-one and Prostaglandin-F2alpha. By combining electrophysiology and gene expression analyses, we were able to study sex-pheromone signalling on two different time scales. One short, occurring on the order of milliseconds to minutes, that involves electrical activities in the brain through the glutamatergic amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate and N-methyl-D-aspartate receptors; and the other long occurring several hours later that involves changes in the gene expression levels of calmodulin and ependymin among other genes underlying neuroplasticity. Reproductive neuroplasticity in the goldfish may therefore require the activation of glutamatergic receptors which then activate downstream signals like calmodulin and ependymin to transform the sex pheromones-mediate signal into gene expression.

Switched mode power supplies (SMPS) have found wide spread acceptance in all power processing applications. The design demand is moving towards higher power densities. For reduction in size and weight, it is imperative to process the power at a higher switching frequency. High switching frequency requires soft switching techniques to reduce the switching losses. Several families of soft switching converters have emerged in the past two decades. Analysis and modelling methods have been proposed in relation with these topologies. Active clamp converters are the recently introduced soft switching topologies. Steady state analysis and model of these converters have been reported in literature. This thesis presents a unified equivalent circuit oriented model for the family of active clamp converters. Analytical expressions for DC conversion ratio in terms of pole current and throw voltage are derived for all the DC-DC converters with active clamp. The special feature is that, the conversion ratio exhibits a load dependent drop (IRd), where I is the pole current and Rd is the damping resistance. The damping resistance Rd is a mathematical artifact to represent the voltage loss on account of delay in the turn-on of the active switch. There is no energy loss associated with this load dependent drop. This is conveniently expressed as an appropriate lossless resistance in the equivalent circuit model. The proposed equivalent circuit models are valid for both steady-state and dynamic performance. A spread sheet based design is presented for the basic DC-DC converters with active clamp. A prototype design following the spreadsheet is made. The performance of the same is validated and verified by simulation and measurements. Steady state and dynamic results are presented. The stability criterion for the active clamp converters under current programming is investigated. The same is verified through simulation and validated on a current programmed active clamp converter prototype. The active clamp converters suffer from a few disadvantages: Higher VA ratings of switches, load dependent ZVS performance and increased component count. Several soft switching topologies have been reported in literature. Efficiency improvement and increase in switching frequency are obtained to different degrees. This thesis proposes a new family of soft switching converters. This family of converters switch at constant frequency and maintains the advantages of traditional PWM converters. The proposed topology employs an auxiliary circuit to achieve soft switching. The auxiliary circuit consists of a dependent voltage source, an auxiliary switch, a series diode and a set of resonant elements (Inductor and capacitor). The switching transitions of both the active switch and the auxiliary switch are lossless. The novelty in the proposed circuit is the method of generating the dependent source required to enable zero current switching of the auxiliary switch. The dependent source is realized by a coupled winding in the energy storage inductor or tapped from the energy transfer transformer of non-isolated and isolated converters respectively. The proposed topology is applicable to most of the isolated and non-isolated DC-DC converters. The circuit equations governing the sub-intervals of the converter are expressed in terms of pole current and throw voltage. With such a definition, performance results and the design equations are identical for all types of DC-DC converters. Equivalent circuit models are obtained for the whole family of DC-DC converters. The proposed model is valid for steady state and dynamic performance. Analytical expressions of DC conversion ratio for all topologies, in terms of pole current and throw voltage are derived. The special feature is that, the conversion ratio exhibits a load dependent drop (IRd), where I is the pole current and Rd is the damping resistance. The damping resistance Rd is a mathematical artifact to represent the voltage loss on account of delay in the turn-on of the active switch. There is no energy loss associated with this load dependent drop. This is conveniently expressed as an appropriate lossless resistance in the equivalent circuit model. Design guidelines are established for the whole family of proposed converters; the same are validated through prototype converters.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2009. / Härtill 5 uppsatser. Även tryckt utgåva.

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