La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif lié à l’acquisition d’une anomalie chromosomique t(9;22) conduisant à l’expression d’une protéine de fusion p210 Bcr-Abl dont l’activité tyrosine kinase dérégulée est nécessaire et suffisante pour engendrer la maladie.Cette pathologie bénéficie depuis 2002 d’une avancée thérapeutique : les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK). Cette thérapeutique dite ciblée, dont le chef de file est l’imatinib, est très efficace puisque 80% des patients entre en rémission. Malheureusement, 20% des patients traités développent des résistances primaires ou secondaires, dépendantes ou non de l’oncogène Bcr-Abl dont certaines ont été caractérisées. A ce titre, la LMC est devenue un modèle d’étude à la fois des mécanismes oncogéniques mais aussi des résistances.La résistance aux ITK dans la LMC peut être considérée sur deux plans. D’une part la résistance qui permet à la cellule leucémique d’échapper à la pression thérapeutique des ITK et d’autre part la résistance « intrinsèque » de la cellule souche leucémique par des mécanismes certainement multiples. Ce second niveau de résistance est à l’origine de la récurrence de la LMC lors de l’arrêt du traitement.Cette thèse a consisté à déterminer comment pouvait mourir les cellules de LMC en réponse aux ITK pour mettre en évidence les morts induites et les régulations qui existent entre-elles. De plus, cela a permis d’utiliser les morts non-apoptotiques pour contourner les mécanismes de résistance aux ITK.Nous avons montré pour la première fois en utilisant différents modèles cellulaires de LMC (cellules K562, Lama-84 et AR-230), que l’imatinib (ainsi que les autres ITK nilotinib et dasatinib) induit de la sénescence en plus d’une réponse apoptotique. En absence d’apoptose, par inhibition de cette dernière, la réponse sénescente devient une réponse majeure des cellules de LMC suggérant que l’apoptose a un rôle de « frein » sur la sénescence. L’autophagie activée par les ITK régule négativement la réponse apoptotique alors qu’elle est nécessaire pour une réponse sénescente majeure. Nous avons pu mettre en évidence deux types de sénescences induites par l’imatinib : une sénescence dépendante et une indépendante de l’autophagie. L’autophagie semble donc au cœur de la régulation des morts cellulaires. Puisque les cellules de LMC peuvent mourir par des morts non-apoptotiques, nous avons cherché à éliminer les cellules résistantes par des morts non-apoptotiques. Pour cela différentes molécules ont été utilisées telles que l’acide mycophénolique (MPA), un immunosuppresseur déjà utilisé en clinique. Le MPA en inhibant la synthèse de GTP permet d’induire des dommages à l’ADN et une réponse apoptotique et/ou sénescente. Dans ce contexte, l’autophagie protège la cellule de la réponse apoptotique mais ne protège pas la cellule de la sénescence. Le MPA est au contraire un puissant inducteur d’apoptose sur les cellules primaires. En effet, il induit une apoptose massive des cellules primaires résistantes aux ITK quelque soit le mécanisme impliqué (surexpression de tyrosine kinase, mutation de Bcr-Abl). Le MPA est l’exemple parfait des molécules qu’il nous faut rechercher pour éliminer les cellules résistantes de LMC notamment dans le cas où les patients sont en crise blastique et donc résistants aux thérapeutiques.Ces résultats suggèrent que la sénescence est une des morts qui peut être induite pour dépasser la résistance des cellules cancéreuses. / Chronic Myeloid Leukemia is a myeloproliferative syndrome connected to the acquisition of a chromosomal abnormality t(9;22) leading to the expression of a fusion protein p210 Bcr-Abl of whom the tyrosine kinase activity deregulated is necessary and sufficient to engender the disease.This pathology benefits since 2002 of a therapeutic advance: the tyrosine kinase inhibitors (TKI). This targeted therapeutics, from which imatinib is the front-line, is very effective because 80 % of patients enters in remission. However, 20 % of the treated patients develop primary or secondary resistances which can be dependent or not to the Bcr-Abl oncogene among which some have been characterized. Indeed, CML is now a model to study both oncogenic and resistances mechanisms.Resistance to TKI in CML can be considered on two sides. On one hand the resistance allowing the leukemic cell to escape the therapeutic pressure of TKI and on a second hand the “intrinsic” resistance of Leukemic stem cells by multiple mechanisms. This second level of resistance is at the origin of the CML recurrence.This thesis consisted in determining how could die the CML cells in response to TKI to bring to light cell deaths induced and the regulations existing between them. Furthermore, it allowed exploring the use of non-apoptotic cell deaths to overcome resistance to TKI.We showed for the first time by using CML cell lines (K562, Lama-84 and AR-230), that imatinib (as well as nilotinib and dasatinib) induced senescence besides an apoptotic response. In absence of apoptosis, by its inhibition, senescence becomes a major response of CML cells suggesting that apoptosis is limiting senescence. Autophagy activated by TKI negatively regulates apoptosis while it is necessary for a major senescent response. We were able to bring to light two types of senescence in response to TKI : a senescence dependent and a senescence independent of autophagy suggesting it plays a critical role in cell death regulation.Because CML cells can die by non-apoptotic cell deaths, we used them to eliminate TKI resistant cells. Mycophenolic acid (MPA), an immonusuppressor already used in therapeutic as an immunosuppressive agent has been extensively used. MPA by inhibiting the synthesis of GTP induces DNA damage and apoptotic and\or senescent response. In this context, autophagy protects the cells from apoptotic response but do not from senescence. Conversely, MPA is a powerful inductor of apoptosis on hematopoietic primary cells. Indeed, it induces apoptosis of TKI resistant primary cells whatever the mechanism involved (overexpression of tyrosine kinases or mutation of Bcr-Abl). MPA illustrates the need to look for new molecules to eliminate TKI resistant CML cells, particularly when patients are in the evolved blastic phase of the disease.These results suggest that senescence is one of the deaths which can be used to overcome resistance of cancer cells.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21259号 / 医博第4377号 / 新制||医||1029(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 河本 宏, 教授 濵﨑 洋子, 教授 髙折 晃史 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Die Maillard-Reaktion und ihre Produkte (MRPs) sind aus der Lebensmittelchemie bekannt. Der Nachweis der Derivate in physiologischen Medien und die Beobachtung erhöhter Gehalte im Zusammenhang mit Alterungsgeschehen und Stoffwechselerkrankungen führte zur Diskussion möglicher pathophysiologischer Konsequenzen in vivo. Auf diesem Hintergrund stellt sich die Frage nach der Relevanz der täglichen Nahrung als MRP-Quelle. Grundlage zur Beurteilung sind quantitative Daten zum Vorkommen der Verbindungen in Lebensmitteln. Heterogenität und Vielzahl der Produkte machen die Betrachtung individueller und die Berücksichtigung noch unbekannter Derivate notwendig. Durch Bestimmung von Lysin, dem Amadori-Produkt (AP) Ne-Desoxylactulosyl-1-lysin, Pyrralin, Ne-Carboxymethyllysin (CML), Glyoxal- und Methylglyoxal-Lysin-Dimer (GOLD, MOLD) und 2-Amino-6-(3-hydroxy-2-methyl-4-oxo-4H-pyridin-1-yl)-hexansäure (Maltosin) in verschiedenen Milchprodukten konnte gezeigt werden, dass AP das Hauptprodukt der Lysinderivatisierung in diesen Proben darstellt. CML und Pyrralin gewannen mit zunehmender Erhitzung an Bedeutung, wobei Pyrralin auch in den stark thermisch behandelten Proben nur in relativ geringen Mengen gebildet wird. GOLD und MOLD waren nicht nachweisbar. Mit den erfassten Derivaten konnte nur ein Teil, 40-50 % in flüssigen Proben, der Lysinmodifizierung erklärt werden. Es kommt demnach in erheblichem Maße zur Bildung weiterer in Nahrungsmitteln noch nicht erfasster Derivate. Das hier erstmals in Lebensmitteln quantifizierte Maltosin leistet keinen relevanten Beitrag zur weiteren Aufklärung der Lysinmodifizierung, da es erst in sehr stark erhitzten Produkten und in deutlich geringeren Mengen als Pyrralin entsteht. Zur Beurteilung der ernährungsphysiologischen Relevanz alimentärer MRPs sind neben der zugeführten Menge deren Resorbierbarkeit und Elimination aus dem Körper von Interesse. Anhand der renalen Exkretion definierter Lysinderivate in Abhängigkeit von der nahrungsbedingten Zufuhr sollten Aussagen zu deren metabolischem Transit getroffen werden. Es wurde eine Ernährungsstudie durchgeführt, in der die Probanden zunächst auf MRP-haltige Lebensmittel verzichteten, dann, bis auf eine Kontrollgruppe, Mahlzeiten mit bekannten Gehalten verzehrten und im Anschluss wieder MRPfrei lebten. Die 24h-Urinproben der Teilnehmer wurden hinsichtlich der Gehalte an freiem AP, Pyrralin, CML und Pentosidin untersucht. Die Gehalte lagen für AP, Pyrralin und CML in der Größenordnung weniger mg pro Tag, für Pentosidin dagegen nur bei wenigen µg pro Tag. Der Verzicht auf MRP-haltige Nahrung führte innerhalb von 48 bis 72 h zum Absinken der Gehalte auf ein Basislevel. Es zeigte sich, dass mehr als 85 % des AP, ca. 90 % des Pyrralins aber nur 30 bis 40 % des Pentosidins im Urin aus alimentären Quellen stammen. AP, Pyrralin und Pentosidin werden demnach grundsätzlich aus der Nahrung resorbiert und über die Nieren eliminiert. Im Gegensatz zu Literaturberichten waren die im Urin messbaren CML-Gehalte durch die MRP-freie Diät nicht beeinflussbar, was auf eine geringe oder fehlende proteolytische Freisetzung und/oder schlechtere Resorbierbarkeit der Verbindung hindeutet. Nach Verzehr definierter MRP-Mengen zeigten sich stark unterschiedliche Wiederfindungen. Während freies Pentosidin und proteingebundenes Pyrralin nahezu vollständig bzw. zum überwiegenden Teil (50 bis 60 %) über den Urin eliminiert werden, trifft dies nur auf einen geringen Prozentsatz des proteingebundenen Pentosidins (2 %) und des AP (<3 %) zu. Eine ernährungsphysiologische Beurteilung kann demnach nur nach Kenntnis der im Lebensmittel enthaltenen Derivate und deren individuellen metabolischen Transits erfolgen. Ausgehend von der vorliegenden Arbeit und der Literatur ist das von der Nahrung ausgehende Gefährdungspotential als gering anzusehen. Zu berücksichtigen bleibt, dass ein großer Teil der MRPs noch immer unbekannt ist, ernährungsphysiologische Konsequenzen damit nicht abschließend einzuschätzen sind.

Hintergrund Die chronische myeloische Leukämie (CML) ist eine myeloproliferative Er- krankung, die aufgrund ihres Modellcharakters unter der Behandlung mit Tyrosin-Kinase- Inhibitoren (TKI) gut für eine Beschreibung mittels computerbasierter Modelle geeignet ist. Grundlage für die Entstehung einer CML ist die Bildung eines Philadelphia-Chromosoms durch eine Translokation der Chromosomen 9 und 22. Es resultiert das Onkogen BCR- ABL1, welches für eine konstitutiv aktive Tyrosinkinase codiert. Diese führt zu ungeregelter Proliferation der betroffen Zellen und zur Verdrängung der gesunden Blutbildung. Das überaktivierte Protein kann durch TKIs gezielt gehemmt werden. Damit ist es möglich, die Tumorlast erheblich zu senken und das Fortschreiten der Erkrankung aufzuhalten. Aktuell werden in der klinischen Anwendung außerhalb von Studien TKIs für die gesamte Lebensdauer der Patienten eingesetzt. Absetzstudien zeigten, dass circa 50% der Patienten nach einer über zwei Jahren nicht nachweisbaren BCR-ABL1-Last nach Behandlungsstopp kein erneutes Anwachsen der Tumorlast aufwiesen. Die Anwendung von computergestützten Modellsimulationen hilft, Zugriff auf die klinisch nur schwer zu messenden leukämischen Stammzellen zu bekommen und darüber Vorhersagen über den weiteren Therapieverlauf zu treffen. Aufgabenstellung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollen Möglichkeiten der Übertragung von Patientendaten auf das etablierte Modell nach Roeder und Loeffler (2002) verbessert werden. Die vom Modell vorhergesagten Stammzellkinetiken sollen abschließend auf Praxistauglichkeit geprüft werden. Material und Methoden Aufgrund der Vergleichbarkeit zu früheren Untersuchungen erfolgte die Auswahl von 51 Patienten des deutsches Armes der IRIS-Studie. Deren Therapieverläufe wurden analysiert und können über eine biphasische exponentielle (biexponentielle) bzw. über eine stückweise lineare Funktion beschreiben werden. Als Erweiterung der Arbeiten von Horn et al. (2013) wurden alle Parameter der biexponentiellen Funktion in die Entwicklung neuer Methoden einbezogen. Zusätzlich wurde untersucht, ob die Einbeziehung von zensierten Messpunkte die Form der biexponentiellen Funktion verändert. Basierend auf den Therapiedaten der IRIS-Patienten erfolgte die Ermittlung eines Para meterraumes für Eingangsparameter der Modellsimulation (Modellparameter), welcher in 270.400 individuelle Paramterkombinationen unterteilt wurde. Es erfolgten anschließend die Simulation und Auswertung nach der biexponentiellen Beschreibung. Auf Basis dieser erheblich größeren Datengrundlage konnten zwei neue Verfahren der Modellparameteridentifikation für individuelle Patienten entwickelt werden. Einerseits wurde in Anlehnung an die Arbeit von Horn et al. (2013) ein Verfahren unter Nutzung der Regression vorgestellt. Andererseits konnte über den Vergleich der Abstände zwischen simulierten und realen Therapieverläufen eine Suche (lookup-table) etabliert werden. Die Berechnung des Abstandes zwischen Therapieverläufen ermöglicht gleichzeitig den Vergleich der verschiedenen Verfahren und damit eine Aussage über deren Anpassungsgüte. Zum Schluss wurde beispielhaft für einen Patienten das Verfahren der lookup-table angewendet und die resultierende Stammzellkinetik weiter analysiert. Ergebnisse Einführend erfolgte die Analyse der resultierenden biexponentiellen Funktion mit und ohne Einbeziehung von Messunsicherheiten. Es zeigte sich, dass der Verlauf dieser Funktion besonders in Bereichen, die von einbezogenen Messunsicherheiten betroffen sind, abweichend ist. Die Beschreibung des Langzeitverlaufs erfolgt jedoch annähernd gleich. Anschließend erfolgte die Validierung der Größe des vorsimulierten Datenpool anhand eines Vergleichs der statistischen Parameter von Patienten und Simulationen. Dieser zeigte sich dabei für die weiteren Untersuchungen geeignet. Die Nutzung der lookup-table zur Identifikation der am besten zu einem Patienten passenden Therapiesimulation ist überlegen sowohl gegenüber von der Horn et al. (2013) beschriebenen als auch in dieser Arbeit neu entwickelten Regressionsverfahren. Diese ergeben deutliche Abweichungen zwischen Patientendaten und Simulation. Eine Analyse des vorhergesagten Therapieverlaufes im Stammzellkompartiment ergibt jedoch, dass ähnliche Therapieverläufe im peripheren Blut durch stark unterschiedliche Stammzellkonfigurationen beschrieben werden können. Es resultiert eine starke Streuung der vorhergesagten Zeitpunkte eines möglichen Therapieendes. Schlussfolgerungen Die Nutzung der lookup-table zu Identifikation einer passenden Therapiesimulation ist hoch effektiv und anderen Verfahren, die auf Regression basieren, überlegen. Die etablierte Computersimulation nach Roeder und Loeffler (2002) bietet Zugriff auf die Therapie in der Ebene der Stammzellen. Die in weiteren Analysen gezeigten Streuungen der vorhergesagten Therapieverläufe im Stammzellkompartiment lassen den Schluss zu, dass Methoden zur Eingrenzung der Stammzellverläufe entwickelt werden müssen, um die Vorhersagen klinisch nutzbar zu machen. Weiterhin muss anhand von Messungen an Knochenmarkproben von realen Patienten geprüft werden, ob die von der Simulation postulierten Verläufe der Tumorlast im Stammzellkompartiment der realen Behandlung entsprechen. Ausblick Die in aktuellen Arbeiten beschriebene Rolle des Immunsystems im Therapieverlauf der CML (Saussele et al. 2016; Clapp et al. 2016) sollte in eine Verbesserung des Stammzellmodells nach Roeder und Loeffler (2002) einfließen. Weiterhin kann die Validierung der im Rahmen der Individualmedizin zu treffenden Absetzvorhersagen letztendlich nur über klinische Absetzuntersuchungen ermöglicht werden. / Background Chronic myeloic leukaemia (CML) is a myeloproliferative disease, which is well suited for modelling approaches. It is characterized by the oncogenic BCR-ABL1 fusion gene originating from an inverse translocation of the chromosomes 9 and 22 leading to the Philadelphia chromosome. The result is a constitutively activated tyrosine-kinase. This is followed by an extensive proliferation of leukaemic stem cells leading to a displacement of normal haematopoesis. The molecular specificity of CML forms the basis of a highly efficient, targeted therapy by tyrosine kinase inhibitors (TKIs). TKIs can decrease the tumour burden and slow down or eventually stop progressing of the disease. Currently, in clinical applications drugs are administered for the remaining life span. Interestingly, in recent treatment cessation trials patients were stopped after two years of non-detectable tumour burden and about 50% remained without relapse. The application of computer-based modelling helps to gain access to stem cell counts being difficult to measure clinically. This forms the basis for predictions of long-term therapy outcomes. Aim of this work This work aims on identifying a suitable algorithm to efficiently identify model simulations that optimally decribe individual patient kinetics. Furthermore, the clinical usability of the new methods was investigated. Material and methods The analysed group of patients was chosen out of the German cohort of the IRIS trial to ensure comparability to former investigations. It consists of 51 individuals. The course of leukaemic burden , i. e. leukaemic vs. non-leukaemic cells on a single patient level can be described as a biphasic exponential (bi-exponential) or a piecewise linear function. As an extension to former methods described by Horn et al. (2013) all parameters are included into further method development. Additionally, an investigation was conducted whether censored data points change the functional behaviour of a bi-exponential fit based on patients’ data. According to therapy data of all patients an input parameter space for the model simulation was delimited, such that all observed patient kinetics can be mimicked by the model. This parameter space was uniformly divided into 270.400 discrete parameter combinations. The therapy simulation of each combination was conducted and described by a bi-exponential function likewise to the patients’ fit. With the help of these huge variety of in silico therapies two new methods of model parameter identification for individual patients were developed. The first one is an advanced approach based on a regression model proposed by Horn et al. (2013). The second one by comparing distances between the patients’ and the models’ bi-exponential functions (lookup table). The comparison of the distances between different therapy courses (either simulated or patients’ data) was also used to compare the quality of different methods. As an example, for one patient the stem cell kinetics from the model were analysed in more detail and checked for robustness. Such a strategy, which might build the basis for clinical applications. Results A comparison between the different bi-exponential functions with and without censored data points revealed differences especially in the area in which censoring was performed. However, for the long-term tumour burden censored data had no influence. Secondly, an investigation was performed showing the sufficiency of the pre-simulated therapy courses for the new methods, i. e. lookup-table and regression models. The lookup- table turns out to be superior to identify a therapy simulation for a unique patient, since the complexity of linear regression models lead to increased deviations between patients’ therapy courses and the simulations. Unfortunately, distinct stem cell configurations lead to similar therapy descriptions in peripheral blood, assuming the correctness of the model. As a result, the prediction of a safe treatment cessation is often widely spread. Conclusions The new developed lookup-table to identify model simulations suitable for an individual patient is highly effective and superior to other methods using regression models. The simulation of the TKI treatment using the agent-based model of Roeder und Loeffler (2002) gives easy access to therapy courses on the level of leukaemic stem cells. Unfortunately, the finding of a well fitting simulation within the peripheral blood is not enough to provide a point of safe treatment cessation, since different stem cell configurations can lead to similar therapy courses. Additionally, it is necessary to check which of the assumed therapy courses on the stem cell level is appropriate. This could be done by gathering more information from bone-marrow punctures during the course of treatment. Outlook Investigations of new data showed the important role of the immune system in CML treatment (Saussele et al. 2016; Clapp et al. 2016). This should be taken into account by improving the model of Roeder und Loeffler (2002). Additionally, data from cessation trials can be used to validate the model assumptions.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-02-06T16:52:19Z No. of bitstreams: 1 Caio Bruno Quinta de Souza Leal.pdf: 116273125 bytes, checksum: 5e247a988672d255dad21fa0aedcc5da (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-06T16:52:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caio Bruno Quinta de Souza Leal.pdf: 116273125 bytes, checksum: 5e247a988672d255dad21fa0aedcc5da (MD5) Previous issue date: 2014-01-31 / Monitoring of minimal residual disease (MRD) in patients with Chronic Myeloid Leukemia (CML) who receive treatment with Imatib mesylate (IM) is extremely important, because it enables the evaluation of the response to the treatment and the early diagnosis of possible recurrences. The objective of this study was to standardize molecular methods used in order to monitor MRD in patients with CML, on therapy with IM. Peripheral blood samples were collected from 11 patients diagnosed with CML in October 2012 to September 2013, in the Department of Hematology of Hospital Araújo Jorge of the Association to Combat Cancer in Goiás. Three months after starting treatment, patients underwent a new peripheral blood collection for evaluation of MRD. Detecting bcr-abl transcripts and endogenous controls (abl and β2m) employed reverse transcription methods associated with polymerase chain reaction (RT-PCR), while quantification of bcr-abl transcripts was achieved by using reverse transcription associated with real-time PCR (RQ-PCR) and Taqman probes. Specific oligonucleotides and probes recognizing e13a2 and e14a2 junctions of bcr-abl transcripts and to the abl endogenous control were used in this study. By the time of diagnosis, three patients (27.3%) expressed the b2a2 transcript, five patients (45.5%) expressed the b3a2 transcript, two patients (18.2%) expressed both transcripts and one patient (9%) did not express any of the transcripts. The endogenous controls analysis resulted in better amplification for the abl transcript, which was used in the RQ-PCR reactions. The assessment of DRM was possible in only eight patients, due to the loss of follow-up. Three months after starting treatment with IM, all patients presented complete hematologic response. However, only one patient (12.5%) presented the undetectable transcript, reaching the full molecular response, while the other seven patients (87.95%) presented MRD. One (12.5%) of the seven patients who presented MRD, reached complete molecular response, while six patients (75%) presented a reduction of two logs, achieving minor molecular response, and one patient (12.5%) presented only partial molecular response. By using molecular biology methods, our results have enabled the standardization and the establishment of a laboratory routine, according to the international guidelines, for monitoring MRD in patients with CML. / O monitoramento de doença residual mínima (DRM) em pacientes com leucemia meilóide crônica (LMC) que recebem tratamento com mesilato de imatibe (MI) é extremamente relevante, pois possibilita o acompanhamento da resposta e o diagnóstico precoce de eventuais recidivas da doença. O objetivo deste estudo foi padronizar métodos moleculares utilizados na avaliação de DRM em pacientes com LMC, em tratamento com MI. Amostras de sangue periférico foram coletadas de 11 pacientes diagnosticados com LMC, no período de outubro de 2012 a setembro de 2013, no Setor de Hematologia do Hospital Araújo Jorge da Associação de Combate ao Câncer em Goiás. Três meses após o início do tratamento, os pacientes foram submetidos a uma nova coleta de sangue periférico para avaliação de DRM. A detecção dos transcritos bcr-abl e controles endógenos (abl e β2m) empregaram os métodos de transcrição reversa associados à reação em cadeia da polimerase (RT-PCR), enquanto a quantificação dos transcritos bcr-abl foi feita por meio de transcrição reversa associada à PCR em tempo real (RQ-PCR), utilizando a metodologia de sondas de hidrólise (TaqMan). Oligonucleotídeos e sondas Taqman específicos para as junções e13a2 e e14a2 dos transcritos bcr-abl e para o controle endógeno (abl) foram usados neste estudo. Ao diagnóstico, três pacientes (27,3%) expressaram o transcrito b2a2, cinco pacientes (45,5%) o transcrito b3a2, dois pacientes (18,2%) expressaram ambos os transcritos e um paciente (9%) não expressou nenhum dos transcritos. A amplificação dos controles endógenos resultou em melhor amplificação para o transcrito abl, que foi usado nas reações de RQ-PCR. A avaliação de DRM foi possível em oito pacientes, devido à perda de seguimento dos demais. Três meses após o início do tratamento com MI, todos os pacientes apresentaram resposta hematológica completa. No entanto, apenas um paciente (12,5%) apresentou o transcrito bcr-abl indetectável, alcançando a reposta molecular completa, enquanto os outros sete pacientes (87,95%) apresentaram DRM. Dentre os sete pacientes que apresentaram DRM, seis (75%) apresentaram redução de um a dois logs, alcançando resposta molecular menor, enquanto um (12,5%) apresentou resposta molecular parcial. Nossos resultados possibilitaram a padronização e o estabelecimento de uma rotina segundo as diretrizes internacionais, para monitoramento da DRM em pacientes com LMC, utilizando métodos de biologia molecular.

In der vorliegenden Arbeit wird der Beschaffungsprozess der MAN Nutzfahrzeuge AG analysiert. Zu diesem Zweck werden drei verschiedene Methoden angewendet. Das Ziel besteht darin herauszufinden, inwieweit die Berücksichtigung ökologischer Aspekte den Entscheidungsprozess beeinflusst, sodass nachhaltige Beschaffung eine sinnvolle Option bieten kann. Dazu werden verschiedene Beschaffungsalternativen unter Verwendung der Ansätze zur Lebenszykluskostenrechnung, Ökobilanzierung und Hemmnisanalyse verglichen. Ziel ist es, Empfehlungen für zukünftige Investitionsentscheidungen abzuleiten. Die vorliegende Ausarbeitung zeigt, dass die Ausweitung der Investitionsbetrachtung auf den gesamten Lebenszyklus weit über konventionelle Ansätze hinaus gehen.

As the volume of data processed by computers and telecommunication devices rapidly increases, high speed serial link has been challenged to maximize its I/O bandwidth with limited resources of channels and semiconductor devices. This trend requires designers’ relentless effort for innovations. The innovations are required not only at system level but also at sub-system and circuit level. This dissertation discusses two important topics regarding high speed serial links: Clock and Data Recovery (CDR) and Current Mode Logic (CML). This dissertation proposes a mixed-mode adaptive loop gain Bang-Bang CDR. The proposed CDR enhances jitter performances even if jitter spectrum information is limited a priori. By exploiting the inherent hard-nonlinearity of the Bang-Bang Phase Detector (BBPD), the CDR loop gain is adaptively adjusted based on a posteriori jitter spectrum estimation. Maximizing advantages of analog and digital implementations, the proposed mixed-mode technique achieves PVT insensitive and power efficient loop gain adaptation for high speed applications even in limited ft technologies. A modified CML D-latch improves CDR input sensitivity and BBPD performance. A folded-cascode-based Charge Pump (CP) is proposed to minimize CP latency. The effectiveness of the proposed techniques was experimentally demonstrated by various jitter performance tests. This dissertation also presents a process-variation-resilient CML. A typical CML requires over-design to meet the specification over the wide range of process parameter variations. To address this issue, the proposed CML employs a time-reference-based adaptive biasing chain with replica load. It adjusts a variable load resistor to simultaneously regulate time-constant, voltage swing, level-shifting and DC gain. The performance of the high speed building blocks such as Bang-Bang Phase Detectors, frequency dividers and PRBS generators can be more accurately regulated with the proposed CML approach. The prototype is fabricated to experimentally compare the process-variation-induced performance degradation between the conventional and the proposed CML. Compared to the conventional CML, the proposed architecture significantly reduces the performance degradation on divider self-oscillation frequency, PRBS generator speed and PRBS output jitters over the process-variation with only <3% additional power dissipation.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CAIO BRUNO QUINTA DE SOUZA LEAL - PARTE 1.pdf: 34304765 bytes, checksum: 476dda15021939ae8be633403ae9dabe (MD5) Previous issue date: 2014-01-31 / Monitoring of minimal residual disease (MRD) in patients with Chronic Myeloid Leukemia (CML) who receive treatment with Imatib mesylate (IM) is extremely important, because it enables the evaluation of the response to the treatment and the early diagnosis of possible recurrences. The objective of this study was to standardize molecular methods used in order to monitor MRD in patients with CML, on therapy with IM. Peripheral blood samples were collected from 11 patients diagnosed with CML in October 2012 to September 2013, in the Department of Hematology of Hospital Araújo Jorge of the Association to Combat Cancer in Goiás. Three months after starting treatment, patients underwent a new peripheral blood collection for evaluation of MRD. Detecting bcr-abl transcripts and endogenous controls (abl and &#946;2m) employed reverse transcription methods associated with polymerase chain reaction (RT-PCR), while quantification of bcr-abl transcripts was achieved by using reverse transcription associated with real-time PCR (RQ-PCR) and Taqman probes. Specific oligonucleotides and probes recognizing e13a2 and e14a2 junctions of bcr-abl transcripts and to the abl endogenous control were used in this study. By the time of diagnosis, three patients (27.3%) expressed the b2a2 transcript, five patients (45.5%) expressed the b3a2 transcript, two patients (18.2%) expressed both transcripts and one patient (9%) did not express any of the transcripts. The endogenous controls analysis resulted in better amplification for the abl transcript, which was used in the RQ-PCR reactions. The assessment of DRM was possible in only eight patients, due to the loss of follow-up. Three months after starting treatment with IM, all patients presented complete hematologic response. However, only one patient (12.5%) presented the undetectable transcript, reaching the full molecular response, while the other seven patients (87.95%) presented MRD. One (12.5%) of the seven patients who presented MRD, reached complete molecular response, while six patients (75%) presented a reduction of two logs, achieving minor molecular response, and one patient (12.5%) presented only partial molecular response. By using molecular biology methods, our results have enabled the standardization and the establishment of a laboratory routine, according to the international guidelines, for monitoring MRD in patients with CML. / O monitoramento de doença residual mínima (DRM) em pacientes com leucemia meilóide crônica (LMC) que recebem tratamento com mesilato de imatibe (MI) é extremamente relevante, pois possibilita o acompanhamento da resposta e o diagnóstico precoce de eventuais recidivas da doença. O objetivo deste estudo foi padronizar métodos moleculares utilizados na avaliação de DRM em pacientes com LMC, em tratamento com MI. Amostras de sangue periférico foram coletadas de 11 pacientes diagnosticados com LMC, no período de outubro de 2012 a setembro de 2013, no Setor de Hematologia do Hospital Araújo Jorge da Associação de Combate ao Câncer em Goiás. Três meses após o início do tratamento, os pacientes foram submetidos a uma nova coleta de sangue periférico para avaliação de DRM. A detecção dos transcritos bcr-abl e controles endógenos (abl e &#946;2m) empregaram os métodos de transcrição reversa associados à reação em cadeia da polimerase (RT-PCR), enquanto a quantificação dos transcritos bcr-abl foi feita por meio de transcrição reversa associada à PCR em tempo real (RQ-PCR), utilizando a metodologia de sondas de hidrólise (TaqMan). Oligonucleotídeos e sondas Taqman específicos para as junções e13a2 e e14a2 dos transcritos bcr-abl e para o controle endógeno (abl) foram usados neste estudo. Ao diagnóstico, três pacientes (27,3%) expressaram o transcrito b2a2, cinco pacientes (45,5%) o transcrito b3a2, dois pacientes (18,2%) expressaram ambos os transcritos e um paciente (9%) não expressou nenhum dos transcritos. A amplificação dos controles endógenos resultou em melhor amplificação para o transcrito abl, que foi usado nas reações de RQ-PCR. A avaliação de DRM foi possível em oito pacientes, devido à perda de seguimento dos demais. Três meses após o início do tratamento com MI, todos os pacientes apresentaram resposta hematológica completa. No entanto, apenas um paciente (12,5%) apresentou o transcrito bcr-abl indetectável, alcançando a reposta molecular completa, enquanto os outros sete pacientes (87,95%) apresentaram DRM. Dentre os sete pacientes que apresentaram DRM, seis (75%) apresentaram redução de um a dois logs, alcançando resposta molecular menor, enquanto um (12,5%) apresentou resposta molecular parcial. Nossos resultados possibilitaram a padronização e o estabelecimento de uma rotina segundo as diretrizes internacionais, para monitoramento da DRM em pacientes com LMC, utilizando métodos de biologia molecular

Laurová, T. Application of model CAPM on European stock market. Diploma thesis. Brno: Mendel University, 2015. The fundamental of this thesis is application of CAPM model on European stock market. Diploma thesis consists of two parts. The first one is the theoretical part, which is describing the basics of CAPM model, which serves for better understanding of the model and portfolio management. In the second, practical part, there will be solved the basic characteristics of model. There will be also created portfolios in Microsoft Excel. Finally there will be evaluated the veracity of the specified hypothesis and comparison of incurred portfolios.