La distribution des sucres est un processus clé dans le développement de la plante et cours des interactions plantes/microorganismes.Une recherche des acteurs moléculaires impliqués dans la répartition des ressources carbonées au cours de l'interaction avec le champignon nécrotrophe B. cinerea a été réalisée. Plusieurs familles de transporteurs de sucres et d'invertases ont été ciblées, permettant d'établir une cartographie des gènes régulés transcriptionnellement lors de l'interaction. Le rôle de certains gènes candidats a été étudié par une approche de génomique fonctionnelle afin de mettre en évidence une fonction biologique de l'allocation du carbone dans la résistance de la plante aux champignons nécrotrophes. Un système d'interaction simplifié, basé sur un dialogue moléculaire sans contact physique entre une culture cellulaire d'A. thaliana et B. cinerea, a été développé. Il a permis de mesurer les flux de sucres ainsi que les activités enzymatiques et métaboliques pour chaque partenaire. Nos résultats montrent que B. cinerea entraine une forte augmentation de l'activité invertasique pariétale dans les tissus infectés, indiquant qu'une transition source/puits a lieu. Plusieurs transporteurs de sucres sont différentiellement exprimés, certains d'entre eux modulant le devenir de l'interaction. L'activité d'absorption d'hexoses et le métabolisme primaire des cellules hôtes sont fortement stimulés, démontrant l'importance de la compétition pour les sucres à l'interface plante/agent pathogène. En conclusion, l'absorption des sucres alimente le métabolisme énergétique des cellules hôtes et participe aux mécanismes de défense de la plante. / During plant development and upon pathogen infection, sugar allocation is a key process in plant physiology. Cell wall invertases and sugar transporters, involved in the sink strength, likely play a major role in the metabolic plant response. Molecular actors involved in carbohydrates allocation upon B. cinerea interaction have been identified using a transcriptional approach. Some gene families of sugar transporters and invertases have been targeted, allowing the establishment of a cartography of genes regulated during the interaction. To understand the biological role of carbon allocation during the interaction between plants and necrotrophic fungi, candidate genes have been studied using a functional genomics approach.A simplified interaction system has been developped, allowing a molecular dialogue between Arabidopsis and B. cinerea cells, without any physical contact. This system enables the monitoring of radiolabelled sugar uptake rates and some enzymatic and metabolomic activities for both the host cells and the pathogen, independently.Globally, our results demonstrate that B. cinerea infection leads to the transition from a source to a sink tissue, with a strong increase in cell wall invertase activity. The expression of some sugar transporter genes is also affected, while some of them (AtSTP1 and 13) are involved in the disease development. Besides the increase in hexose uptake activity, primary metabolism is deeply affected, highlighting the competition for apoplastic sugars that takes place at the plant/pathogen interface. Sugar retrieval appears to be a key process, fuelling host cells with energy and signal molecules, contributing to the plant defense mechanisms.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d’infections nosocomiales sévères associées à un taux élevé de mortalité. Le système de sécrétion de Type III (SST3) et les effecteurs qu’il injecte sont considérés comme des facteurs de virulence prépondérants de P. aeruginosa. Récemment nous avons caractérisé, un groupe de souches ne possédant pas les gènes du SST3, mais dont la virulence repose sur la sécrétion d’une nouvelle toxine de 172 kDa, nommée Exolysine (ExlA) qui provoque la perméabilisation de la membrane des cellules hôtes. ExlA est sécrétée dans le milieu par une porine de la membrane externe, nommée ExlB, formant ainsi un nouveau système de sécrétion à deux partenaires (TPS), ExlBA. Outre le domaine TPS du coté N-terminal de la protéine, impliqué dans sa sécrétion, ExlA possède différents domaines ; des répétitions hémagglutinines, cinq motifs Arginine-Glycine-Acide Aspartique (RGD) et un domaine C-Terminal faiblement conservé. Des tests de cytotoxicité sur des cellules eucaryotes ont montrés que la délétion du domaine C-terminal abolissait l’activité toxique d’ExlA. En utilisant un modèle de liposomes et différents types de cellules eucaryotes, comme les globules rouges, nous avons démontré qu’ExlA forme des pores membranaires de 1.6 nm. De plus, par un criblage cellulaire à haut-débit d’une banque de mutants obtenus par une mutagenèse de transposition, nous avons montré qu’un facteur bactérien additionnel était requis dans la toxicité d’ExlA. En effet, parmi les 7 400 mutants, nous avons identifiés 3 transposons insérés dans des gènes codant pour le pili de type IV, démontrant ainsi que cet appendice impliqué dans l’adhésion des bactéries participe à la toxicité d’ExlA, en permettant un contact rapproché entre la bactérie et les cellules hôtes. Un criblage de macrophages primaires de souris KO pour différentes protéines impliquées dans la voie de l’activation de l’inflammasome, nous a permis de démontrer que le pore formé par ExlA est responsable de l’activation de la Caspase-1 par l’inflammasome NLRP3 conduisant à la maturation de l’interleukine-1ß. Une étude bio-informatique a révélé la présence de gènes homologues à exlA chez d’autres espèces de Pseudomonas non pathogènes, comme P. putida, P. protegens, P. entomophila. Nous avons montré que ces bactéries environnementales sont aussi capables de provoquer une mort cellulaire dépendante de la Caspase-1. Finalement, un criblage d’une banque de macrophages dont les gènes ont été invalidés par la technologie CRISPR/cas9 a révélé que plusieurs protéines du système immunitaire, indirectement liées à l’activation de la Caspase-1 sont impliquées dans la mort cellulaire médiée par ExlA. De plus, nous avons montré que plusieurs sgRNAs ciblant un microARN, mir-741, était grandement enrichi dans les macrophages ayant résisté à une infection avec ExlA. Mir-741 régule l’expression d’enzymes (St8sIa1 et Agpat5) impliquées dans la voie de biosynthèse des sphingolipides et des glycérophospholipides, suggérant ainsi que l’activité d’ExlA requiert un environnement lipidique particulier. / Pseudomonas aeruginosa is a human opportunistic pathogen responsible for nosocomial infections associated with high mortality. The type III secretion system (T3SS) and T3SS-exported toxins have been considered as key infectivity virulence factors. Our team recently characterized a group of strains lacking T3SS, but employing a new pore-forming toxin of 172 kDa, named Exolysin (ExlA) that provokes cell membrane disruption. In this work we demonstrated that the ExlA secretion requires ExlB, a predicted outer membrane protein encoded in the same operon, showing that ExlA-ExlB define a new active Two-Partner Secretion (TPS) system. In addition to the TPS secretion signals, ExlA harbors several distinct domains, which comprise hemagglutinin domains, five Arginine-Glycine-Aspartic acid (RGD) motifs and a non-conserved C-terminal region lacking any identifiable sequence motifs. Cytotoxic assays showed that the deletion of the C-terminal region abolishes host-cell cytolysis. Using liposomes and eukaryotic cells, including red blood cells, we demonstrated that ExlA forms membrane pores of 1.6 nm. Based on a transposon mutagenesis strategy and a high throughput cellular live-dead screen, we identified additional bacterial factors required for ExlA-mediated cell lysis. Among 7 400 mutants, we identified three transposons inserted in genes encoding components of the Type IV pili, which are adhesive extracellular appendices. Type IV pili probably mediate close contact between bacteria and host cells and facilitate ExlA cytotoxic activity. These findings represent the first example of cooperation between a pore-forming toxin of the TPS family and surface appendages to achieve host cell intoxication. Using mice primary bone marrow macrophages we showed that ExlA pores provoke activation of Caspase-1 via the NLRP3-inflamasomme followed by the maturation of the pro-interleukin-1ß. Mining of microbial genomic databases revealed the presence of exlA-like genes in other Pseudomonas species rarely associated with human infections P. putida, P. protegens and P. entomophila. Interestingly, we showed that these environmental bacteria are also able to provoke Caspase-1 cleavage and pro-inflammatory cell death of macrophages. Finally, genome-wide loss-of-function CRISPR/cas9 RAW library screen revealed that several components of the immune system response, indirectly linked to Caspase-1 are involved in the ExlA-mediated cell lysis. Moreover, we found at least three sgRNAs targeting miRNA, mir-741 were highly enriched in resistant macrophages challenged by ExlA. This miRNA regulates enzymes (St8sIa1 and Agpat5) in the sphingolipids and glycerophololipids biosynthesis pathways, suggesting that ExlA activity may require proper lipid environment.

Background: Type I interferonopathies comprise a heterogenous and phenotypically diverse range of diseases, characterized by an elevated level of type I interferon (IFN) exhibited in patients accompanied by high interferon stimulated gene (ISG) scores. Type I interferonopathies are difficult to treat, especially in the acute phases of the disease, and typically chronic, requiring lifelong treatment and care. A patient, exhibiting symptoms of a type I interferonopathy was identified by whole exome sequencing to have a compound heterozygous mutation in the type III IFN receptor, IFNLR1. The compound mutation is comprised of two discrete truncating mutations, c.532_535dupCATG (p.G179AfsX37) and c.904dupG (p.V302GfsX30), termed mutant 1 or mutant 2 (M1, M2), respectively. The M1 and M2 IFNLR1 proteins were shown to be expressed, but were demonstrated to be non-functional. Hypothesis: Mutant isoforms of IFNLR1 interfere with the normal function of the closely related IL-10 family of cytokines and receptors through a shared β subunit receptor chain IL10RB. It is hypothesized that M1 and M2 IFNLR1 are able to impair correct IL-10 or IL-22 receptor formation by preventing coupling with IL10RB resulting in immune dysregulation. Materials and Methods: Multiple CRISPR-Cas9 tools were implemented to create several cell lines with genome edits up to a single base pair resolution to model deficiencies in each of the IFN receptors: IFNLR1, IFNGR1, and IFNAR1. The knock-out cell lines were used as models for the expression of M1 and M2 IFNLR1, IL10RA, and IL10RB, to study the relationship between the IFN-λ, IL-10 and IL-22 pathways. Stimulation of these model pathways and expression systems with IL-10, IL-22, and IFN-λ helped further our understanding between these proteins. The relationship between the IL-10 and IFN-λ pathways was further explored by stimulation of whole blood derived from the patient, parents, and controls which was conducted to further quantify the role IL-10 signalling played in the pathogenesis of the disease. Results: M1 was demonstrated to promote the spontaneous phosphorylation of STAT1, STAT2, and STAT3 independent of stimulation. This phosphorylation was independent of type I, type II, or type III IFN signalling, with phosphorylation persisting in knock-out lines of all IFN receptors singly or in combination. Consequently, the closely related IL-10 family of cytokines was examined for its role in the pathogenesis of the disease. M1 and M2 were demonstrated to interact with IL10RA and IL10RB on the protein level and were demonstrated to influence the phosphorylation of STAT3 by IL-10 or IL-22 stimulation. Further analysis of whole blood derived from the patient, parents and controls demonstrated a lack of IL-10-mediated regulation of IL-12 solely in the patient. Elevated basal and stimulatory levels of IL-18, CXCL10, and IFN-γ were also detected in the patient. Conclusions: The patient maintained IL-10 regulatory capacity in all but IL-12 signalling, which is a pathway known to be directly controlled by IL-10. IL-12 is mainly produced in cells like dendritic cells, which are one of the only cell types to naturally express IFNLR1, IL10RA and IL10RB. The loss of IL-12 regulation by IL-10 likely stems from interference by the M1 and M2 IFNLR1 present in patient dendritic cells, inhibiting proper formation of the IL-10 receptor and preventing its regulatory function. The elevated levels of IL-12 in conjunction with elevated IL-18 levels, which functions synergistically with IL-12 result in secretion of high levels of IFN-γ. IFN-γ likely participates in a positive feedback loop with CXCL10, resulting in prolonged and heightened immune response after immune challenge in the patient resulting in autoinflammation.:List of Tables v List of Figures vi List of Abbreviations ix 1 Introduction 1 1.1 CRISPR-Cas9-Mediated Editing 1 1.1.1 Guide Efficiency and Off-Target Prediction 11 1.2 Type I Interferonopathies 13 1.3 Pathogen Detection by the Innate Immune System 14 1.3.1 TLR Dependent Nucleic Acid Sensing 14 1.3.2 Non-TLR-Mediated Detection of Nucleic Acids 17 1.4 Interferon-Mediated Innate Immunity 19 2 Hypotheses and Goals 24 2.1 Hypotheses 24 2.2 Goals 24 3 Methods and Materials 26 3.1 Table of Materials and Software Used 26 3.2 Cell Culture 30 3.2.1 Adherent Cell Culture 31 3.2.2 Suspension Cell Culture 31 3.2.3 Cell Counting and Seeding 32 3.2.4 Cell Defrosting and Freezing 33 3.2.5 Cytokine Stimulation 34 3.2.6 Transfection 35 3.3 Target Prediction 37 3.4 CRISPR-Cas9 Cloning 39 3.4.1 Insert Generation, Plasmid Digestion and Ligation 40 3.4.2 Transformation and Clonal Selection 43 3.4.3 In-Fusion Cloning 44 3.4.4 DNA-Miniprep 44 3.4.5 DNA-Maxiprep 45 3.5 PCR 46 3.5.1 DNA Extraction 47 3.5.2 Amplification Reaction (Standard PCR) 48 3.5.3 PCR Clean 49 3.5.4 In Vitro sgRNA Synthesis 50 3.5.5 pegRNA Templates 52 3.6 Measurement of DNA and RNA Concentration 54 3.7 Agarose Gel Electrophoresis 54 3.7.1 Gel Preparation 54 3.7.2 Electrophoresis Parameters 55 3.7.3 Gel Extraction 55 3.8 Gene Editing 57 3.8.1 CRISPR-Cas9-Mediated Gene Editing 57 3.8.2 Cutting Assays 60 3.8.3 Isolation of Single Clones 62 3.9 Sanger Sequencing 64 3.10 Immunostaining 64 3.10.1 Protein Extraction and BCA Assay 64 3.10.2 Western Blotting 66 3.10.3 Co-Immunoprecipitation 69 3.11 Whole Blood Assays 71 3.11.1 Whole Blood Stimulation 71 3.11.2 Flow Cytometry 72 3.11.3 Statistical Analysis 73 4 Results 74 4.1 Implementation of CRISPR-Cas9 Techniques 74 4.2 In Vitro sgRNA Synthesis for CRISPR-Cas9 Editing 75 4.3 Validation of CRISPR-Cas9 Editing 75 4.4 Cas9 Editing 78 4.4.1 IFNLR1 Editing 78 4.4.2 IFNLR1 Rescue 80 4.4.3 IFNGR1 Knock-Outs 81 4.4.4 IFNAR1 Knock-Outs 82 4.4.5 Targeted Installation of Mutations 84 4.5 Investigation of a Type I Interferonopathy 88 4.5.1 Characterization of a Patient with Complete IFNLR1 Deficiency 88 4.5.2 Basal Level of pSTAT1 and pSTAT3 in Patient Cells 89 4.5.3 IFNLR1 Expression in Patient 91 4.5.4 Overexpression of IFNLR1 Isoforms 93 4.5.5 Spontaneous Induction of STAT1 Phosphorylation 94 4.5.6 Independence of Immune Activation from IFN Signalling Pathways 96 4.6 IL-10 and IL-22 Stimulations 98 4.6.1 IL-10 Stimulation 98 4.6.2 Interaction of IL10RA, IL10RB, and IFNLR1 Isoforms 102 4.6.3 IL-22 Stimulation 106 4.7 Whole Blood Assays 107 4.7.1 TNF-α 107 4.7.2 IFN-γ 108 4.7.3 IL-12 and IL-18 109 4.7.4 CXCL10 111 4.7.5 IL-10 112 5 Discussion 114 5.1 Cell Model Creation by CRISPR-Cas9 Techniques 114 5.1.1 Cutting Assays and CRISPR-Cas9 Validation 114 5.1.2 IFN Receptor Knock-outs 116 5.1.3 Base Editing and Prime Editing 117 5.2 Characterization of a Complete IFN-λ Receptor Deficiency 121 5.2.1 Establishing an IFNLR1 Overexpression System 121 5.2.2 IL-10 Family of Cytokines 124 5.3 Whole Blood Assays 129 6 Conclusions 133 7 Summary 135 8 Zusammenfassung 137 9 Scientific Output 139 10 Literature 140 11 Acknowledgements 155 12 Appendix 156 12.1.1 Supplementary Tables 156 12.1.2 Supplementary Figures 160 12.1.3 Declarations 161 / Hintergrund: Typ-I-Interferonopathien umfassen ein heterogenes und phänotypisch vielfältiges Spektrum von Krankheiten, die sich durch einen erhöhten Typ-I-Interferon (IFN)-Spiegel bei Patienten auszeichnen, der mit einer hohen Expression IFN-stimulierter Gene (ISG) einhergeht. Typ-I-Interferonopathien sind vor allem in den akuten Phasen der Krankheit oft schwer zu behandeln und verlaufen in der Regel chronisch, so dass eine lebenslange Behandlung erforderlich ist. Bei einer Patientin mit Symptomen einer Typ-I-Interferonopathie wurde durch eine Exom-Sequenzierung eine compound heterozygote Mutation im IFNLR1-Gen, das den Typ-III-IFN-Rezeptor bzw. INF-λ-Rezeptor kodiert, festgestellt. Dabei handelt es sich um zwei trunkierende Mutationen, c.532_535dupCATG (p.G179AfsX37) und c.904dupG (p.V302GfsX30), die als Mutante 1, beziehungsweise Mutante 2 (M1, M2) bezeichnet wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die M1- und M2-IFNLR1-Proteine zwar exprimiert wurden, allerdings nicht funktionell waren. Hypothese: Mutierte Isoformen von IFNLR1 beeinträchtigen die normale Funktion der eng verwandten Interleukin-10-Familie von Zytokinen und Rezeptoren durch die gemeinsame β Untereinheit, der Rezeptorkette IL10RB. Es wird angenommen, dass M1 und M2 die korrekte IL-10 oder IL-22-Rezeptorbildung beeinträchtigen, indem sie die Kopplung mit IL10RB verhindern, was zu einer Dysregulation des Immunsystems führt. Material und Methode: Mittels verschiedener CRISPR-Cas9-Methoden, teilweise mit einer Genauigkeit bis zu einem Basenpaar, wurden mehrere Zelllinien mit editierten Gensequenzen erzeugt, um Funktionsverluste der verschiedenen IFN-Rezeptoren, IFNLR1, IFNGR1 und IFNAR1, zu modellieren. Die Knock-out-Zelllinien wurden dann als Modelle für die Expression von M1 und M2 IFNLR1 sowie IL10RA und IL10RB verwendet, um die Beziehung zwischen den IFN-λ, IL-10 und IL 22-Signalwegen zu untersuchen. Die Untersuchung dieser modellierten Expressionssysteme mit IL-10, IL 22 und IFN-λ trug zu einem besseren Verständnis der Beziehungen zwischen diesen Proteinen bei. Die Beziehung zwischen den IL-10 und IFN λ Signalwegen wurde durch die Stimulierung von Blutproben der Patientin, deren Eltern, sowie von Kontrollpersonen weiter untersucht, um die Rolle der IL-10-Signalübertragung bei der Pathogenese der Autoinflammation weiter zu chrakterisieren. Ergebnisse: Es wurde gezeigt, dass M1 zu einer spontanen, stimulationsunabhängigen Phosphorylierung von STAT1, STAT2 und STAT3 führt. Diese Phosphorylierung zeigte sich unabhängig vom Typ-I-, Typ-II- oder Typ III IFN Signalweg, wobei die Phosphorylierung in Knock-out-Zelllinien aller IFN Rezeptoren, einzeln oder in Kombination, bestehen blieb. Daraufhin wurde die eng verwandte IL-10-Familie von Zytokinen auf ihre Rolle bei der Pathogenese der Krankheit untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass M1 und M2 mit IL10RA und IL10RB auf Proteinebene interagieren und die Phosphorylierung von STAT3 durch IL-10 oder IL-22 Stimulation beeinflussen. Weitere Analysen des Vollbluts der Patientin, der Eltern und von Kontrollpersonen zeigten, dass IL-10 die Regulation von IL-12 einzig bei der Patientin nicht beeinflusste. Ebenfalls wurden bei der Patientin erhöhte Basal- und Stimulationswerte von IL 18, CXCL10 und IFN-γ festgestellt. Schlussfolgerungen: Die Patientin behielt die regulierende Funktion von IL-10 in allen Bereichen bei, mit Ausnahme des IL-12-Signalwegs, von dem bekannt ist, dass er direkt durch IL-10 kontrolliert wird. IL-12 wird hauptsächlich in dendritischen Zellen produziert, die zu den einzigen Zelltypen gehören, die natürlicherweise IFNLR1, IL10RA und IL10RB exprimieren. Der Verlust der IL 12 Regulierung durch IL-10 ist wahrscheinlich auf eine Störung durch die in den dendritischen Zellen der Patientin vorhandenen M1- und M2-IFNLR1-Mutationen zurückzuführen, die die ordnungsgemäße Bildung des IL-10-Rezeptors hemmen und seine Regulierungsfunktion verhindern. Die erhöhten IL-12-Spiegel in Verbindung mit erhöhten IL-18-Spiegeln, die synergistisch mit IL-12 wirken, führen zu einer hohen Sekretion von IFN-γ. ermutlich ist IFN γ an einer positiven Rückkopplungsschleife mit CXCL10 beteiligt, die nach einer Stimulierung des Immunsystems zu einer verlängerten und verstärkten Immunantwort bei der Patientin führt, die wiederum in einer Autoinflammation resultiert.:List of Tables v List of Figures vi List of Abbreviations ix 1 Introduction 1 1.1 CRISPR-Cas9-Mediated Editing 1 1.1.1 Guide Efficiency and Off-Target Prediction 11 1.2 Type I Interferonopathies 13 1.3 Pathogen Detection by the Innate Immune System 14 1.3.1 TLR Dependent Nucleic Acid Sensing 14 1.3.2 Non-TLR-Mediated Detection of Nucleic Acids 17 1.4 Interferon-Mediated Innate Immunity 19 2 Hypotheses and Goals 24 2.1 Hypotheses 24 2.2 Goals 24 3 Methods and Materials 26 3.1 Table of Materials and Software Used 26 3.2 Cell Culture 30 3.2.1 Adherent Cell Culture 31 3.2.2 Suspension Cell Culture 31 3.2.3 Cell Counting and Seeding 32 3.2.4 Cell Defrosting and Freezing 33 3.2.5 Cytokine Stimulation 34 3.2.6 Transfection 35 3.3 Target Prediction 37 3.4 CRISPR-Cas9 Cloning 39 3.4.1 Insert Generation, Plasmid Digestion and Ligation 40 3.4.2 Transformation and Clonal Selection 43 3.4.3 In-Fusion Cloning 44 3.4.4 DNA-Miniprep 44 3.4.5 DNA-Maxiprep 45 3.5 PCR 46 3.5.1 DNA Extraction 47 3.5.2 Amplification Reaction (Standard PCR) 48 3.5.3 PCR Clean 49 3.5.4 In Vitro sgRNA Synthesis 50 3.5.5 pegRNA Templates 52 3.6 Measurement of DNA and RNA Concentration 54 3.7 Agarose Gel Electrophoresis 54 3.7.1 Gel Preparation 54 3.7.2 Electrophoresis Parameters 55 3.7.3 Gel Extraction 55 3.8 Gene Editing 57 3.8.1 CRISPR-Cas9-Mediated Gene Editing 57 3.8.2 Cutting Assays 60 3.8.3 Isolation of Single Clones 62 3.9 Sanger Sequencing 64 3.10 Immunostaining 64 3.10.1 Protein Extraction and BCA Assay 64 3.10.2 Western Blotting 66 3.10.3 Co-Immunoprecipitation 69 3.11 Whole Blood Assays 71 3.11.1 Whole Blood Stimulation 71 3.11.2 Flow Cytometry 72 3.11.3 Statistical Analysis 73 4 Results 74 4.1 Implementation of CRISPR-Cas9 Techniques 74 4.2 In Vitro sgRNA Synthesis for CRISPR-Cas9 Editing 75 4.3 Validation of CRISPR-Cas9 Editing 75 4.4 Cas9 Editing 78 4.4.1 IFNLR1 Editing 78 4.4.2 IFNLR1 Rescue 80 4.4.3 IFNGR1 Knock-Outs 81 4.4.4 IFNAR1 Knock-Outs 82 4.4.5 Targeted Installation of Mutations 84 4.5 Investigation of a Type I Interferonopathy 88 4.5.1 Characterization of a Patient with Complete IFNLR1 Deficiency 88 4.5.2 Basal Level of pSTAT1 and pSTAT3 in Patient Cells 89 4.5.3 IFNLR1 Expression in Patient 91 4.5.4 Overexpression of IFNLR1 Isoforms 93 4.5.5 Spontaneous Induction of STAT1 Phosphorylation 94 4.5.6 Independence of Immune Activation from IFN Signalling Pathways 96 4.6 IL-10 and IL-22 Stimulations 98 4.6.1 IL-10 Stimulation 98 4.6.2 Interaction of IL10RA, IL10RB, and IFNLR1 Isoforms 102 4.6.3 IL-22 Stimulation 106 4.7 Whole Blood Assays 107 4.7.1 TNF-α 107 4.7.2 IFN-γ 108 4.7.3 IL-12 and IL-18 109 4.7.4 CXCL10 111 4.7.5 IL-10 112 5 Discussion 114 5.1 Cell Model Creation by CRISPR-Cas9 Techniques 114 5.1.1 Cutting Assays and CRISPR-Cas9 Validation 114 5.1.2 IFN Receptor Knock-outs 116 5.1.3 Base Editing and Prime Editing 117 5.2 Characterization of a Complete IFN-λ Receptor Deficiency 121 5.2.1 Establishing an IFNLR1 Overexpression System 121 5.2.2 IL-10 Family of Cytokines 124 5.3 Whole Blood Assays 129 6 Conclusions 133 7 Summary 135 8 Zusammenfassung 137 9 Scientific Output 139 10 Literature 140 11 Acknowledgements 155 12 Appendix 156 12.1.1 Supplementary Tables 156 12.1.2 Supplementary Figures 160 12.1.3 Declarations 161

Ziel der Arbeit war es, die regulatorischen Mechanismen von Virulenz-assoziierten Genen in den Pathogenen Francisella novicida und Streptococcus pyogenes zu untersuchen. Kapitel eins befasst sich mit der Regulation des Virulenzfaktors Streptolysin S (SLS) von S. pyogenes. Wir untersuchten die Rolle der Ribonuklease (RNase) Y in der transkriptionellen und posttranstrikptionellen Regulation des Gens sagA. RNase Y begünstigte die Produktion einer kleinen RNA (sRNA) vom sagA Transkript, war jedoch nicht an der posttranskriptionellen Regulierung der sagA RNA beteiligt. Dennoch förderte RNase Y die Transkription von sagA indirekt. Wir konnten weiterhin zeigen, dass die 5′- untranslatierte Region (UTR) der sgaA RNA eine Sekundärstruktur besitzt, die möglicherweise einen Liganden bindet und damit die Zugänglichkeit der ribosomalen Bindungsstelle beeinflusst. Die Deletion einzelner Abschnitte der 5′ UTR hat einen negativen Effekt auf die sagA Expression. Wir haben eine Methode entwickelt um die Aktivität von Riboswitches, (u.a. die sagA 5‘ UTR) zu analysieren und konnten damit drei putative Riboswitches in S. pyogenes validieren. In Kapitel zwei charakterisierten wir den Mechanismus mit dem CRISPR-Cas9 aus F. novicida (FnoCas9) die Expression bakterieller Lipoproteine (BLPs) unterdrückt, um dem Immunsystem des Wirtes zu entgehen. Wir zeigen, dass FnoCas9 eine duale Funktion besitzt, die es dem Protein ermöglicht nicht nur DNA zu schneiden, sondern auch Transkription zu regulieren. In dieser erstmals beschriebenen Aktivität bindet FnoCas9 an den tracrRNA:scaRNA Duplex, wodurch der Protein-RNA Komplex an einen DNA Abschnitt hinter dem Promoter der blp Gene bindet und somit deren Transkription verhindert. Diese Bindungsstelle besitzt ein protospacer-adjacent motif (PAM) und eine scaRNA-komplementäre Sequenz, an die der FnoCas9-RNA Komplex bindet, allerdings nicht schneidet. Dieses System könnte in Zukunft das Repertoire an CRISPR-basierten Anwendungsmöglichkeiten erweitern. / The aim of this thesis was to study regulatory mechanisms of virulence-related genes in the bacterial pathogens Francicella novicida and Streptococcus pyogenes. Chapter one focuses on the regulation of the virulence factor streptolysin S (SLS) in S. pyogenes. First, we investigated the role of the ribonuclease (RNase) Y in the transcriptional and post-transcriptional regulation of SLS-coding gene, sagA. We found that RNase Y promotes the production of a small RNA (sRNA) from the sagA transcript but we observed no regulation at the post-transcriptional level. Yet, RNase Y promotes sagA transcription indirectly and affects hemolysis levels. We next showed that the sagA 5′ untranslated region (UTR) contains a secondary structure that is is possibly modulated by direct binding to a ligand and may affect the accessibility to the ribosomal binding site (RBS). Our results indicate that removing fragments of the 5′ UTR has a negative effect on sagA expression. We developed a method for testing the activity of putative riboswitches, including sagA 5′ UTR. Using this method, we validated three predicted riboswitches in S. pyogenes. In chapter two, we characterized the mechanism by which F. novicida CRISPR-Cas9 (FnoCas9) represses the expression of bacterial lipoproteins (BLPs), allowing evasion of the host immune system. We show that FnoCas9 is a dual-function protein that, in addition to its canonical DNA nuclease activity, evolved the ability to regulate transcription. In this newly-described mechanism, the non-canonical RNA duplex tracrRNA:scaRNA guides FnoCas9 to the DNA target located downstream of the promoter of the BLP-coding genes, causing transcriptional interference. The endogenous targets contain a protospacer-adjacent motif (PAM) and a sequence that is complementary to scaRNA, promoting FnoCas9 binding but not DNA cleavage. Engineering this system expands the toolbox of CRISPR applications by allowing repressing other genes of interest.

Das plastidäre Genexpressionssystem höherer Pflanzen ist hochkomplex und differiert beträchtlich von dem prokaryotischer Vorfahren. Jeder einzelne Schritt der RNA-Prozessierung und Translation ist abhängig von nukleär kodierten, posttranslational in den Chloroplasten importierten Proteinen, insbesondere RNA-Bindeproteinen, wie den chloroplastidären Ribonukleoproteinen (cpRNP). Ein wichtiger und im Fokus dieser Arbeit stehender Vertreter ist CP29A, welcher ein breites Bindespektrum aufweist und in vivo mit einer Vielzahl von Transkripten interagiert. Frühere Studien belegen dennoch, dass ein Knockout von CP29A unter Standardkultivierungsbedingungen nicht in einem makroskopisch vom Wildtyp differierenden Phänotyp resultiert. Unter Kältestress hingegen ist CP29A für die Entwicklung photosynthetisch aktiver Chloroplasten essenziell. Zur tiefergehenden Charakterisierung der molekularen Funktion von CP29A wurde in der vorliegenden Arbeit eine genomweite Transkriptomanalyse der cp29a-Mutante durchgeführt. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass CP29A bereits unter Standardkultivierungsbedingungen das Spleißen vieler plastidärer Introns unterstützt. Kälteinduziert weist das phänotypisch auffällige Gewebe der cp29a-Mutante eine globale Beeinträchtigung der Genexpression sowie massive Defekte der plastidären mRNA-Prozessierung auf. Da die Funktionalität von Proteinen substanziell von ihrer Lokalisation abhängig ist, wurden antikörperbasierte mikroskopische Lokalisationsstudien durchgeführt. Diese dokumentieren, dass CP29A kältestressinduziert zu dynamischen Granula lokalisiert, welche separiert von den plastidären Nukleoiden vorliegen und mit einem häufig in stressinduzierten Granula detektierten Protein kolokalisieren. / The plastid gene expression system in higher plants is highly complex and differs significantly from the gene expression system of the prokaryotic ancestors. Each individual step of RNA-processing and translation is dependent on nuclear-encoded RNA-binding proteins, such as chloroplast ribonucleoproteins (cpRNP), which are imported post-translationally into the chloroplast. An important representative is CP29A, which has a broad binding spectrum and interacts with a large number of transcripts in vivo. Earlier studies show that, while a knockout of CP29A under standard-cultivation-conditions does not result in a macroscopically different phenotype, under cold stress conditions CP29A is essential for the development of photosynthetically active chloroplasts. For a more detailed characterization of the molecular function of CP29A, a genome-wide transcriptome analysis of the cp29a mutant was carried out. It could be shown for the first time that CP29A already supports the splicing of many chloroplast introns under standard-cultivation-conditions. Cold-induced the phenotypically noticeable mutant tissue shows a global impairment of gene expression and massive defects in plastid mRNA processing. Since the functionality of proteins is substantially dependent on their localization, antibody-based microscopic localization studies were carried out. They reveal that cold stress-induced CP29A localizes to dynamic granules, which are separate from the plastid nucleoids and colocalize with a protein commonly detected in stress-induced granules.

Diabetes ist ein weltweites Problem, das durch den Verlust oder die Dysfunktion der Insulin-produzierenden β-Zellen des Pankreas verursacht wird. In seltenen Fällen entsteht Diabetes durch eine Mutation in einem einzigen Gen. Diese monogenetischen Formen des Diabetes können zur Identifizierung neuer Regulatoren der β-Zellen-Entwicklung und -Funktion beitragen. In der vorliegenden Arbeit habe ich neue putative Diabetes-assoziierte Gene untersucht, die zuvor durch „Next-Generation“ Sequenzierung in einer Gruppe von Kindern und Jugendlichen mit idiopathischem Diabetes festgestellt wurden. Insbesondere analysierte ich neuartige Mutationsvarianten in Genen kodierend für Histone deacetylase 4 (HDAC4), Glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) und Glioma-associated oncogene homolog 2 (GLI2). Basierend auf den folgenden Kriterien wurden diese Transkriptionsregulatoren zur weiteren funktionellen Analyse priorisiert: Genetische Information, Patientenphänotyp und Expressionsprofil der Kandidaten Gene in Mauspankreas-Vorläuferzellen. Um die Rolle der Varianten während der pankreatischen Zelltypspezifizierung zu untersuchen, nutzte ich die CRISPR-Cas9 Methode in Kombination mit Stammzellendifferenzierung. Im Detail generierte ich diverse Stammzellen mittels CRISPR-Cas9, die die Mutationsvarianten der Patienten trugen und differenzierte diese zu β-ähnlichen Zellen. Weitere in vitro und Transkriptionsanalysen zeigten, dass die Variante c.C4661T in GLI2 die Entwicklung der β-ähnlichen Zellen beeinträchtigte, was für eine genetische Prädisposition zur Entwicklung von Diabetes verantwortlich sein kann. Zusätzlich nutzte ich diese Plattform, um neue extrinsische Faktoren zu untersuchen und zeigte, dass die fördernde Rolle von HC toxin (HDAC Inhibitor) und SLIT3 (ROBO Ligand) konserviert ist. Zusammenfassend habe ich eine Differenzierungsplattform etabliert, um die Rolle von genetischen und extrinsischen Faktoren für die Entwicklung des Pankreas und/oder β-Zellen zu untersuchen. / Diabetes is a worldwide health problem caused by the loss or dysfunction of the insulin-secreting β-cells in the pancreas. Unelucidated forms of monogenic diabetes, arising from rare mutations in one single gene, represent invaluable models for identifying new targets of β-cell development and function. In this study, I focused on putative disease-associated genes for diabetes that have been previously identified by next-generation sequencing of a cohort of patients with puberty-onset diabetes. In particular, I investigated unique mutant variants in genes coding for Histone deacetylase 4 (HDAC4), Glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) and Glioma-associated oncogene homolog 2 (GLI2). These transcriptional regulators were prioritized for functional analysis based on patient phenotype, expression level in pancreas progenitor cells and available genetic information. To investigate the role of the genetic mutant variants in pancreatic cell fate decisions and cell function, I used the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9 genome editing technology in combination with human induced pluripotent stem cell (iPSC)-directed β-cell differentiation. Employing these approaches, I established several patient-like iPSC lines carrying the identified heterozygous missense variants. Specifically, functional experiments and whole transcriptome analysis showed that the variant c.C4661T in GLI2 impairs human β-cell differentiation and β-cell function, which might be responsible for a genetic predisposition to develop diabetes. In addition, I used the same iPSC-based differentiation model system to study novel extrinsic factors, namely the HDAC inhibitor HC toxin and the ROBO ligand SLIT3 and uncovered their conserved role in enhancing human β-cell development. Taking together, I established a human iPSC differentiation platform to study critical genes and extrinsic factors that are necessary for human pancreas development and/or β-cells.

Wie regulatorische Sequenzen die Genexpression steuern, ist von grundlegender Bedeutung für die Erklärung von Phänotypen in Gesundheit und Krankheit. Die Funktion regulatorischer Sequenzen muss letztlich in ihrer genomischen Umgebung und in entwicklungs- oder gewebespezifischen Zusammenhängen verstanden werden. Da dies eine technische Herausforderung ist, wurden bisher nur wenige regulatorische Elemente in vivo charakterisiert. Hier verwenden wir Induktion von Cas9 und multiplexed-sgRNAs, um hunderte von Mutationen in Enhancern/Promotoren und 3′ UTRs von 16 Genen in C. elegans zu erzeugen. Wir quantifizieren die Auswirkungen von Mutationen auf Genexpression und Physiologie durch gezielte RNA- und DNA-Sequenzierung. Bei der Anwendung unseres Ansatzes auf den 3′ UTR von lin-41, bei der wir hunderte von Mutanten erzeugen, stellen wir fest, dass die beiden benachbarten Bindungsstellen für die miRNA let-7 die lin-41-Expression größtenteils unabhängig voneinander regulieren können, mit Hinweisen auf eine mögliche kompensatorische Interaktion. Schließlich verbinden wir regulatorische Genotypen mit phänotypischen Merkmalen für mehrere Gene. Unser Ansatz ermöglicht die parallele Analyse von genregulatorischen Sequenzen direkt in Tieren. / How regulatory sequences control gene expression is fundamental for explaining phenotypes in health and disease. The function of regulatory sequences must ultimately be understood within their genomic environment and development- or tissue-specific contexts. Because this is technically challenging, few regulatory elements have been characterized in vivo. Here, we use inducible Cas9 and multiplexed guide RNAs to create hundreds of mutations in enhancers/promoters and 3′ UTRs of 16 genes in C. elegans. We quantify the impact of mutations on expression and physiology by targeted RNA sequencing and DNA sampling. When applying our approach to the lin-41 3′ UTR, generating hundreds of mutants, we find that the two adjacent binding sites for the miRNA let-7 can regulate lin-41 expression largely independently of each other, with indications of a compensatory interaction. Finally, we map regulatory genotypes to phenotypic traits for several genes. Our approach enables parallel analysis of gene regulatory sequences directly in animals.

Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ist ein vielseitiger Modellorganismus sowohl in der Grundlagenforschung als auch für biotechnologische Anwendung. Für die genetische Veränderung wurden verschiedene Methoden entwickelt, jedoch ist die gezielte Modifikation kerncodierter Gene immernoch sehr schwierig. In dieser Arbeit wird eine Strategie vorgestellt, die es ermöglicht, kerncodierte Gene in Chlamydomonas gezielt mit sequenzspezifischen Zinkfinger-Nukleasen zu verändern. Das COP3-Gen, welches den lichtaktivierbaren Ionenkanal Kanalrhodopsin-1 codiert, diente hierbei als Zielsequenz der für die Deletion hergestellten Zinkfinger-Nukleasen. Um eine Charakterisierung der ZFNs zu ermöglichen, wurde ein Modelstamm generiert, der ein inaktiviertes Markergen enthält. Die Inaktiverung erfolgte hierbei durch Insertion der COP3-ZFN Zielsequenz. Die Transformation dieses Modellstamms mit ZFN codierender Plasmid-DNA und einem Reparatur-Template ermöglichte die Wiederherstellung der Markeraktivität und eine Selektion Antibiotika-resistenter Kolonien. Wenn in diesen Experimenten zusätzlich ein COP3 veränderndes Template benutzt wurde, enthielt 1% der analysierten Klone ein mutiertes COP3-Gen. Der Chlamydomonas Augenfleck ist ein lichtsensitives Organell mit entscheidender Funktion für die phototaktische Orientierung der Alge. Eine Deletionsmutante des Blaulicht-Photorezeptors Phototropin zeigte in Experimenten eine veränderte Regulation der lichtabhängigen Augenfleckgröße. Durch Komplementierung der Phototropin-Dysfunktion konnte der lichtabhängige Regulationsprozess wiederhergestellt werden. Die Expression der Phototropin-Kinasedomäne führte zu einer lichtunabhängigen Reduktion der Augenfleckfläche. Interessanterweise führte auch die Expression der N-terminalen LOV-Domänen zu einer geänderten Regulation des Augenflecks und der Phototaxis. Dies deutet, zusätzlich zur Lichtregulation der Kinasedomäne, auf eine zelluläre Signalfunktion der LOV-Domänen hin. / The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii is a versatile model for fundamental and biotechnological research. A wide toolset for genetic manipulation has been developed for this alga, but specific modification of nuclear genes is still not routinely possible. Here we present a nuclear gene targeting strategy for Chlamydomonas that is based on the application of zinc-finger nucleases (ZFNs). Initially, we designed a set of ZFNs for targeting the COP3 gene that encodes the light-activated ion channel channelrhodopsin-1. To evaluate the designed ZFNs, we constructed a model strain by inserting a non-functional selection marker interspaced with a short COP3 target sequence into the nuclear genome. Upon co-transformation of this recipient strain with the engineered ZFNs and a DNA repair template, we were able to restore marker activity and select antibiotic resistant clones with active nucleases. In cases where cells were co-transformed with a modified COP3 template, 1% of these clones contained a modified COP3 locus as well. The eyespot of Chlamydomonas is a light-sensitive organelle important for phototactic orientation of the alga. Here we found that eyespot size is downregulated in light. In a strain in which the blue light photoreceptor phototropin was deleted, the light regulation of the eyespot size was affected. We restored this dysfunction in different phototropin complementation experiments. Complementation with the phototropin kinase fragment reduced the eyespot size, independent of light. Interestingly, overexpression of the N-terminal LOV-domains alone also affected eyespot size and phototaxis, suggesting that aside from activation of the kinase domain, they fulfill an independent signaling function in the cell. We propose that phototropin is a light regulator of phototaxis that desensitizes the eyespot when blue light intensities increase.

Lungenkrebs ist nicht nur eine der häufigsten Krebsarten, sondern auch für die Mehrzahl der krebsbedingten Todesfälle weltweit verantwortlich. Die erheblichen Auswirkungen solcher Tumore werden anhand einer Fünf-Jahres-Überlebensrate von nur 20% und 1,8 Millionen Todesfällen deutlich. Die Mehrzahl aller Fälle (85%) sind als nicht-kleinzellige Lungenkarzinome (non-small-cell lung cancer (NSCLC)) zu klassifizieren. Da solche Tumore häufig mit Rauchen in Zusammenhang stehen, gilt NSCLC als immunogener Krebstyp. Folglich werden charakteristische onkogene Treibermutationen in Genen wie z.B. epidermal growth factor receptor (EGFR) oder anaplastic lymphoma kinase (ALK) häufig beobachtet. In Übereinstimmung mit dieser hohen Mutationsrate hat die Therapie mit Immuncheckpoint-Inhibitoren (immune checkpoint inhibition (ICI)), bei der in erster Linie Antikörper gegen programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) zum Einsatz kommen, in den letzten Jahrzehnten die Therapieoptionen und die Prognose für NSCLC revolutioniert. Eine Ansprechrate von etwa 20% auf eine Monotherapie mit ICIs bedeutet jedoch gleichzeitig, dass die Mehrheit der Patienten, insbesondere solche mit EGFR- oder ALK-Mutationen, überhaupt nicht von ICI-Therapien profitieren. Neben dieser primären Resistenz kommt es ebenfalls vor, dass Tumore nach einem anfänglichen Ansprechen durch sekundäre Resistenzentwicklung weiter fortschreiten. Diese Grenzen der derzeitigen Behandlungsmethoden könnten in Zukunft durch bispezifische Antikörper (bispecific antibodies (biABs)), welche T Zellen mit Tumorzellen verbinden, in Kombination mit ICI erweitert werden. Um den Fortschritt von solchen T Zell-basierten Immuntherapien zu beschleunigen, ist es unerlässlich die molekularen Mechanismen von Resistenzen besser zu verstehen, wirksame Kombinationsansätze zu entwickeln und geeignete Richtlinien für die Patientenstratifizierung aufzustellen. Weitere Forschungsarbeiten dazu, wie Immunität gegenüber Tumorzellen auch in Subtypen mit Treibermutationen erhöht werden kann, sind dringend nötig um die Überlebensrate bei NSCLC zu verbessern. Die vorlegende Arbeit adressiert diese Herausforderungen und zielt darauf ab, biABvermittelte T Zell-Immunantworten in NSCLC zu verbessern. Zu diesem Zweck wurde ein CRISPR/Cas9 Screen in der NSCLC-Zelllinie NCI-H1975, welche EGFR mutiert ist, durchgeführt. Eine fokussierte sgRNA Bibliothek wurde in diese Zellen eingebracht bevor aktivierte CD8+ T Zellen sowie ein biAB zugegeben wurden. Diese Behandlung führte zur Abreicherung von sgRNAs, die Gene editieren, welche T Zell-vermittelten Zelltod hemmen. Durch diese Ausrichtung des CRISPR/Cas9 Screens konnten somit Resistenz vermittelnde Gene identifiziert werden. Nach erfolgreicher Durchführung folgte eine tiefergehende Validierung, welche schließlich die Gene ankyrin repeat and MYND domain containing 1 (ANKMY1) und chromosome 22 putative open reading frame 46 (C22orf46) als bisher unbekannte Regulatoren von Resistenz gegenüber T Zellen bestätigte. Aufbauend auf diesen Ergebnissen zielte der zweite Teil der Arbeit darauf ab, die Funktion sowie wichtige Eigenschaften von C22orf46 eingehender zu analysieren. Dazu wurden sowohl Experimente in weiteren NSCLC-Zelllinien als auch mit Chemotherapeutika durchgeführt, welche eine breitere Beteiligung von C22orf46 in verschieden NSCLC-Subtypen sowie an anti-apoptotischen Signalwegen nahelegten. Außerdem wurde ein eGFP-tagging Ansatz entwickelt um sowohl aufzuklären, ob es sich um ein protein-kodierendes Gen handelt als auch, welche subzelluläre Lokalisierung vorherrscht. Diese Experimente bestätigten zum ersten Mal, dass der offene Leserahmen FLJ2358 von C22orf46 für ein nukleolares Protein kodiert. Weiterhin ergab die RNA-Sequenzierung von C22orf46-Knockout-Zellen eine veränderte Expression mehrerer immunmodulatorischer Moleküle, darunter bekannte Faktoren, die für das Engagement von T-Zellen relevant sind, wie IL-10 oder CXCL11. Des Weiteren wurden Transkriptom-Veränderungen festgestellt, die mit einer schlechteren Prognose bei Lungenkrebs korrelieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das von C22orf46 kodierte und im Nukleolus exprimierte Protein eine entscheidende Rolle in anti-apoptotischen Signalwegen spielt und mit der Immunresistenz von NSCLC-Zellen in Verbindung steht. Diese Ergebnisse bilden eine wichtige Grundlage für künftige Studien, in welchen nachgeschaltete Signalwege und Interaktionspartner im Detail erforscht werden sollten. Da die funktionellen Daten zu C22orf46 aus in vitro Experimenten stammen, sind weitere Untersuchungen in einer komplexeren Immunumgebung, z. B. in einem Modellorganismus, erforderlich, um die Übertragbarkeit der Resultate zu prüfen. Die Ergebnisse dieser Arbeit erhöhen das Verständnis von Resistenzen gegenüber T Zell-basierten Therapien und sind geeignet die Patientenstratifizierung in Zukunft zu verbessern. / Lung cancer is not only a prevalent cancer type but also accounts for the majority of cancer-related deaths globally, emphasizing its substantial impact. The five-year survival rate stands at only 20%, with 1.8 million deaths recorded annually. Non-small-cell lung cancer (NSCLC) constitutes the most frequent subtype, representing 85% of all cases. As these tumors are often associated with smoking exposure, NSCLC is considered an immunogenic cancer type. Consequently, characteristic oncogenic driver mutations in genes such as epidermal growth factor receptor (EGFR) or anaplastic lymphoma kinase (ALK) are observed. In well accordance with this high mutational burden, immune checkpoint inhibition (ICI) primarily utilizing anti-programmed cell death protein 1 (PD-1) or anti-programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) antibodies, revolutionized the therapy options and prognosis for NSCLC in recent decades. However, an response rate around 20% to ICI monotherapy at the same time means that the majority of patients, especially EGFR- or ALK-mutant ones, are not benefiting at all from ICI (primary resistance) or tumors still progress after an initial response (secondary resistance) which clearly illustrates the limitations of the current treatment pathways. T cell engaging bispecific antibodies (biABs) in combination with ICI could enhance therapy efficiencies in the future. To expedite the progress of T cell based immunotherapies, research aims to better understand molecular mechanisms of resistance, to develop effective combination approaches and to establish suitable guidelines for patient stratification. To date, such strategies to enhance anti-tumor immunity even in subgroups with oncogenic driver mutations and to allow long-term survival remain urgent but unmet clinical needs. To address these challenges, this thesis aimed to provide mechanisms increasing the biAB mediated T cell killing in NSCLC. To this end, pooled loss-of-function CRISPR/Cas9 screening was established in the EGFR-mutant NCI-H1975 cell line with a focused single guide RNA (sgRNA) library. Direct challenging of knockout cells with isolated cytotoxic T cells (CTLs) by means of a biAB led to depletion of sgRNAs targeting genes inhibiting T cell mediated killing. Successful implementation of this functional screening, along with thorough hit gene validation, identified ankyrin repeat and MYND domain containing 1 (ANKMY1) and chromosome 22 putative open reading frame 46 (C22orf46) as previously unknown mediators of T cell resistance in NSCLC. Building on these results, the thesis further aimed to analyze the role and characteristics of C22orf46 in depth. Through experiments with anti-neoplastic drugs and validation in the A549 NSCLC cell line, a broader involvement of C22orf46 in anti-apoptotic signaling across different NSCLC subtypes is suggested. This observation aligns with two recent studies presenting C22orf46’s contribution to tumor progression. Additionally, an eGFP-tagging approach was developed to elucidate both the protein-coding ability and subcellular localization of C22orf46. This approach for the first time confirmed that the open reading frame (ORF) FLJ2358 of C22orf46 encodes a nucleolar protein. Finally, RNA sequencing of C22orf46 knockout cells revealed altered expression of several immunomodulatory molecules, including well established factors relevant to T cell engagement, such as interleukin (IL)-10 or C-X-C motif chemokine ligand 11 (CXCL11), as well as transcriptome alterations correlating with a worse prognosis in lung cancer. In conclusion, the nucleolar protein encoded by C22orf46 plays a crucial role in antiapoptotic signaling and is associated with immune suppression in NSCLC. These findings provide a solid foundation for future studies to elucidate downstream pathways and interaction partners in detail. While the functional data on C22orf46 originates from in vitro experiments, further research in a more complex immune environment, such as a model organism, is required to test the transferability of the findings. The results of this thesis are suited to enhance the understanding of immune resistance but also patient stratification and could thereby provide greatly needed improvements for NSCLC patients in the future.

Development and regeneration of the vertebrate eye are the result of complex interactions of regulatory networks and spatiotemporally controlled gene expression events. During embryonic retinal development, the coordination of cell signaling and transcriptional regulation allows for a relatively homogenous sheet of neuroepithelial cells to proliferate and differentiate in-to a multilayered, light sensitive retinal tissue. Following injury, the retinas of many cold-blooded vertebrates, such as the zebrafish, undergo a proliferative response that results not only in new retinal cells of the correct type in the correct location, but also functional integration of these cells and restoration of vision. In order for embryonic retinal neurogenesis to proceed correctly, systems must be in place that restrict subsets of progenitor cells from differentiation. Pools of actively proliferating retinal progenitor cells are maintained to fill the needs of developmental processes and normal growth of the retina. In addition, subsets of radial glia in the retina retain the ability to de-differentiate into proliferating progenitor cells to meet the demands of the regenerating retina. All of these processes rely on the tight coordination of extrinsic and intrinsic cues, as well as regulation of gene expression by transcription factors. Although a considerable amount of work has been conducted to identify key regulators of retinal development and regeneration, many gene regulatory networks which include both master signaling pathways as well as individual transcription factors remain poorly characterized. Some of these factors implicated in retinal development and regeneration are members of the Hairy/Enhancer of Split (Hes) superfamily of genes, including the Hairy-related (Her) factors Her4 and Her9. Her transcription factors are basic-helix-loop-helix-orange (bHLH-O) transcription factors that bind to palindromic E- and N-box canonical sequences in the promoters of target genes. Her factors have been previously shown to play roles in a diverse array of developmental and neurogenic processes, including neural tube closure, floor plate development, somitogenesis, and development of various components of the central nervous system as well as the cranial sensory placodes. The roles of her4 and her9 in retinogenesis, however, remain undefined. To determine the possible roles of her4 and her9 factors in the retina, I characterized the expression patterns of these factors during developmental retinal neurogenesis and/or regeneration, examined loss of function phenotypes, and identified signaling pathways that modulate expression of these factors. Chapter 1 of this dissertation provides an overview of vertebrate retina and retinal development, the known functions of her4 in other tissues, and the Notch-Delta signaling pathway. Chapter 2 provides evidence that her4 is a primary effector of the Notch pathway during retinal development, and examines the role of her4 expressing cells during regeneration of the mature zebrafish retina within the context of both chronic and acute photoreceptor damage paradigms. In addition, generation and validation of the transgenic her4:Kaede zebrafish which was used to identify the lineage of her4-expressing cells is described. Characterization of her9 during retinal development, identification of the retinoic acid signaling pathway as a regulator of her9 expression in the retina, and the role her9 plays during retinal vasculogenesis are discussed in Chapter 3. Chapter 4 discusses the generation of her9 knock-out zebrafish lines using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology and characterization of mutant phenotypes in mosaic her9 mutant F0 fish. In addition, in Chapter 4 I also discuss the screening processes used to identify and characterize genetic lesions in the her9 allele and establish various lines that stably transmit deleterious her9 alleles in the germline, and provide preliminary data of the her9 mutant phenotype. Finally, in Chapter 5 I discuss conclusions from the data generated from this dissertation, additional studies that would expand upon this work, and the implications of these results on the broader understanding of retinal development and regeneration. My dissertation incorporates reverse genetic analysis in zebrafish, biochemical analysis, transgenesis, and various molecular approaches to help better understand the roles of her4 and her9 during retinal neurogenesis. Moreover, these studies may also contribute to a better understanding of retinal development, and disease pathogenesis. It is my hope that this work could also ultimately contribute, even if in some small way, to the goal of enabling human patients who have suffered from vision loss a means by which a damaged retina could be regenerated and functional vision restored.