Os genes Hox padronizam o corpo dos vertebrados durante o desenvolvimento embrionário, e a compreensão de sua evolução pode elucidar mecanismos genéticos subjacentes à evolução morfológica. A evolução molecular dos genes Hox imprime assinaturas em regiões regulatórias, as quais potencialmente afetam sua expressão gênica, como os elementos cis-regulatórios (CREs) que ladeiam o cluster D de Hox e seus RNAs não-codificantes (ncRNAs). Essa Tese de Doutorado enfoca a evolução regulatória de genes HoxD envolvidos no estabelecimento dos eixos corpóreos axial ântero-posterior (AP) e apendiculares em linhagens de aminiotas que exibem características morfológicas homoplásticas peculiares: os squamatas serpentiformes (Capítulos I e II) e os marsupiais Diprotodontia (Capítulo III). No Capítulo I investigou-se, em serpentes e anfisbênias, se assinaturas regulatórias envolvidas no estabelecimento das morfologias serpentiformes foram impressas na Sequência Conservada B (Conserved Sequence B, CsB), um CRE centromérico de Hoxd10-13. Usando lagartos e outros tetrápodes como referência para a morfologia serpentiforme, regiões conservadas de CsB foram sequenciadas em 38 espécies de Squamata, cujos TFBS foram preditos e comparados. Ambas linhagens serpentiformes exibem assinaturas regulatórias divergentes e convergentes ausentes em lagartos; a convergência localizou-se em um segmento de CsB que concentra perda nas linhagens serpentiformes de diversos TFBS com funções no desenvolvimento de membros e a aquisição de um sítio de ligação para PBX1. Essa assinatura convergente impressa durante evoluções independentes da morfologia serpentiforme pode estar relacionada à elongação corpórea e à perda dos membros, evidenciando um papel do CsB no desenvolvimento do eixo AP. No Capítulo II, foi investigado se um CRE telomérico (CNS65) e um centromérico (Island I) de Hoxd, os quais regulam respectivamente regiões proximais e distais dos membros tetrápodes em desenvolvimento, retêm suas capacidades regulatórias em Serpentes. Expressões de gene repórter desses CREs de serpentes foram realizadas em camundongo transgênico, revelando deficiência de suas atividades regulatórias nos brotos de membro. A comparação dos TFBS preditos nesses elementos entre serpentes e outros tetrápodes revelou que TFBS relacionados ao desenvolvimento dos membros foram perdidos nas sequências das serpentes. Ainda, essa comparação indicou um elemento em CNS65 potencialmente envolvido especificamente na regulação da formação de estilopódio/zeugopódio, e três elementos na Island I exclusivamente reguladores do desenvolvimento autopodial. A perda de membros em x serpentes aparentemente imprimiu assinaturas nesses CREs de Hoxd que possivelmente contribuíram para sua degeneração funcional, putativamente indicando módulos específicos de regulação nos membros. No Capítulo III, ncRNAs do cluster D de Hox foram estudados no contexto da evolução morfológica do autopódio posterior e heterocronia entre o desenvolvimento de membros anteriores e posteriores em Macropus eugenii. Os ncRNAs mapeados sobre o cluster D de Hox foram selecionados a partir de transcritoma de membros de embriões de M. eugenii nos dias 23 (d23) e 25 (d25) de gravidez, e sua conservação, perfis transcricionais e padrões de expressão foram explorados. A comparação com sequências ortólogas de outros mamíferos revelou cinco ncRNAs conservados em mamíferos, e três aparentemente exclusivos dos marsupiais. Os perfis transcricionais de genes HOXD10-13 e dos ncRNAs do cluster D de Hox foram predominantemente equivalentes. Os padrões de expressão de XLOC46 foi similar aos dos genes HOXD terminais de camundongo e M. eugenii, enquanto que XLOC52 e XLOC53 apresentaram expressão idêntica à desses genes em M. eugenii, exceto pela baixa expressão de XLOC53 no d25. Os ncRNAs intergênicos/intrônicos aos genes HOXD9-12 possivelmente regulam a expressão de genes HOXD terminais em mamíferos, enquanto que XLOC52 e XLOC53 constituem bons candidatos para investigação relacionada à evolução dos membros de marsupiais. Esta Tese demonstra como estudos de assinaturas regulatórias na evolução de genes do desenvolvimento contribuem para o entendimento das histórias evolutivas de divergência entre linhagens e d / Hox genes pattern the vertebrate body during embryonic development, and understanding their evolution may unravel genetic mechanisms subjacent to morphological evolution. Molecular evolution of Hox genes entails signatures in regulatory regions that potentially affect gene expression, such as the cis-regulatory elements (CREs) that surround the HoxD cluster and its noncoding RNAs (ncRNAs). In this PhD Thesis, I have explored regulatory evolution of HoxD genes engaged in the development of appendicular and anterior-posterior body (AP) axes in amniotic lineages that exhibit homoplastic morphological peculiarities: snakelike squamates (Chapters I and II) and diprotodontid marsupials (Chapter III). In Chapter I, I investigated in snakes and amphisbaenians, whether equivalent regulatory signatures were registered in the Conserved Sequence B (CsB), a centromeric Hoxd10-13 CRE, during evolution of snakelike morphologies. Using lizards and other tetrapods to represent the lacertiform morphology, conserved regions within CsB were sequenced from 38 squamate species, and transcription factor binding sites (TFBS) were predicted and compared among groups. Both snakelike lineages carry divergent and convergent regulatory signatures not identified in lizards; the convergence located in one CsB segment comprised loss of limb-related TFBS and gain of a binding site for PBX1. This convergent regulatory signature registered along two independent processes of snakelike evolution may relate to body elongation and limb loss, and evidences a role of CsB for AP axis development. In Chapter II, I investigated whether a telomeric (CNS65) and a centromeric (Island I) Hoxd enhancer that regulate gene expression respectively at proximal and distal regions of developing limbs retain their regulatory capacities in Serpentes. Gene reporter expression of these CREs from snakes were performed in transgenic mice and revealed that their regulatory activities were abrogated in limb buds. Comparison of predicted TFBS in these elements between snakes and limbed tetrapods revealed limb-related TFBS apparently lost in snakes, and pointed to one potential stilopodium/zeugopodium-specific element in CNS65 and three likely autopodium-specific elements in Island I. Limb loss in snakes registered signatures in Hoxd CREs that possibly contributed for their functional impairment, putatively indicating limb-specific modules. Finally, in the chapter III, I studied ncRNAs from HoxD cluster in the context of hindlimb morphological evolution and heterochrony between fore and hindlimb development in the tammar wallaby Macropus eugenii. The ncRNAs mapped to HoxD cluster were selected from transcriptome performed using tammar embryo limbs at days 23 (d23) and 25 (d25) of viii pregnancy, and their conservation, transcriptional profiles and expression patterns were explored. Comparison with orthologous sequences in other mammals revealed five ncRNAs conserved among mammals, and three transcripts apparently exclusive to marsupials. Transcriptional profiles of HOXD10-13 and HoxD ncRNAs were mostly equivalent. XLOC46 expression patterns resembled those of mouse and tammar terminal HOXD genes, whereas XLOC52 and XLOC53 showed identical expression patterns to those genes of tammar, except for XLOC53 low expression at d25. The ncRNAs intergenic/intronic to HOXD9-12 may regulate expression of terminal HOXD genes in mammals, and XLOC52 and XLOC53 are suitable for investigation regarding limb evolution in marsupial. This PhD Thesis demonstrates how studies of evolutionary footprints in regulatory elements of developmental genes contribute for elucidating specific processes during lineages divergence as well as functional aspects of these genes during development.

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Al?m disso, fatores do NER j? tiveram fun??es descritas em outros processos biol?gicos, sendo importante que se busque novas fun??es biol?gicas que possam ser associadas aos fen?tipos das s?ndromes causadas por muta??es nos genes da via NER, dentre elas a Xeroderma pigmentoso grupo de complementa??o A, associada a muta??es em XPA, al?m da s?ndrome de Cockayne, ocasionada por muta??es no gene CSB. Nesse contexto, c?lulas deficientes em XPA (XP12RO) ou CSB (CS1AN) foram submetidas ao estresse oxidativo com per?xido de hidrog?nio (H2O2) e apresentaram um perfil de sensibilidade ao agente, indicando que a aus?ncia dessas prote?nas sensibilizou as linhagens a essa condi??o. A an?lise do transcriptoma de c?lulas XP12RO indicou a diminui??o na express?o de genes com papel na resposta ao dano no DNA e que promovem a sobreviv?ncia celular em resposta ao estresse oxidativo. Nesse cen?rio, os resultados indicaram que XPA pode atuar na regula??o da express?o de genes essenciais ? resposta ao dano no DNA e na sobreviv?ncia ao estresse oxidativo (EGR1, GADD45A, GADD45B e XPC). Por outro lado, a an?lise do transcriptoma de c?lulas CS1AN indicaram a diminui??o na express?o de genes-chave nos processos biol?gicos como transcri??o, processamento de mRNA, prote?lise via ubiquitina-proteassoma ou respira??o celular, indicando um poss?vel papel central da prote?na CSB na regula??o desses processos, em resposta ao estresse oxidativo. Al?m disso, dado o fen?tipo de neurodegenera??o associada a s?ndrome de Cockayne, c?lulas progenitoras neurais (NPCs) e neur?nios derivados de c?lulas-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) deficientes em CSB foram utilizados como modelos de estudo de altera??es neuronais in vitro, de modo que os resultados indicaram que assim como observado nos fibroblastos, c?lulas NPCs deficientes em CSB tamb?m apresentaram sensibilidade a agentes oxidantes. Ainda, os resultados mostraram que assim como observado no transcriptoma de fibroblastos CS1AN, dada a diminui??o na express?o de genes com papel na respira??o celular, as an?lises do consumo de oxig?nio em neur?nios deficientes em CSB indicaram uma poss?vel disfun??o mitocondrial, caracterizada pelo decr?scimo na taxa de consumo de oxig?nio basal e pela diminui??o das capacidades respirat?rias m?xima ou de reserva dessas c?lulas, sugerindo o papel de CSB no metabolismo mitocondrial em ambos os modelos celulares utilizados neste estudo. / In oxidative stress response, the base excision repair (BER) is considered the major pathway for repair of oxidative lesions. However, an increasing number of studies have indicated the role of nucleotide excision (NER) in the repair of these lesions. In addition, some NER factors had functions beyond the role in repair already described and it is important to search for new molecular functions that can be associated to the classical phenotypes of the syndromes caused by mutations in NER genes: Xeroderma pigmentosum complementation group A, caused by mutations in XPA and Cockayne syndrome, caused by mutations in CSB. In this context, XPA (XP12RO) or CSB (CS1AN) deficient cells were submitted to oxidative stress induced by Hydrogen peroxide (H2O2) and the results indicated that both cell lines showed sensitivity to this agent. Furthermore, the transcriptome of XP12RO cells revealed the downregulation of genes that play a role in DNA damage response and promote cell survival in response to oxidative stress. In this scenario, the results indicated that XPA regulates the expression of genes that play a key role in DNA damage response and promote survival in response to stress (EGR1, GADD45A, GADD45B and XPC). On the other hand, the transcriptome analysis of CS1AN cells showed the downregulation of genes that play a key role in biological processes such as transcription, mRNA processing, protein degradation by the ubiquitin?proteasome pathway proteolysis or cellular respiration, indicating a possible role for CSB protein in the regulation of these processes, in response to oxidative stress. In adittion, given the neurodegeneration phenotype associated to Cockayne syndrome, neural progenitor cells (NPCs) and neurons derived from CSB deficient induced pluripotent stem cells (iPSCs) were used as cellular models to analyse neuronal changes in vitro. The results showed that, as observed in fibroblasts CS1AN, NPCs also presented sensitivity to oxidizing agents. Furthermore, as indicated in the transcriptome data from CS1AN fibroblasts, given the downregulation of genes that play a pivotal role in cellular respiration, the analysis of oxygen consumption rates in CSB deficient neurons also indicated a mitochondrial dysfunction characterized by the decrease in oxygen consumption basal rate and a lower maximum respiratory and reserve capacities, suggesting that the lack of functional CSB leads to a mitochondrial dysfunction in both cellular models used in this study. / 2017-12-09

La comprensión de los mecanismos moleculares que controlan la resistencia de la planta frente a patógenos biotrofos es un campo de investigación complejo y en expansión donde se impone la identificación de nuevos reguladores. Previamente se había descrito en nuestro laboratorio el gen P69C que codifica una proteasa con homología a subtilisinas y cuya expresión se induce en el transcurso de la interacción planta-patógeno. Con el fin de estudiar nuevos componentes de la planta implicados en la señalización de la respuesta defensiva, se procedió al escrutinio de mutantes de Arabidopsis thaliana que de forma constitutiva y sin la existencia de ningún estímulo externo se encontrara activada la expresión del gen GUS dirigida por el promotor P69C. En la presente memoria de tesis se describe ampliamente la identificación y caracterización del mutante, csb3 (constitutive subtilisin3). Las plantas csb3 poseen elevados niveles de ácido salicílico (SA) y además expresan genes dependientes de la ruta de SA tales como PR-1, PR-2 y GST6. Por otra parte, el mutante csb3 exhibe una elevada resistencia al oomiceto patógeno Hyaloperonospora parasitica de naturaleza biotrofa y a la bacteria patógena también biotrofa Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000 (Pst) DC3000. Sin embargo, la resistencia a patógenos necrotrofos tales como Botrytis cinerea y Plectosphaerella cucumerina permanece inalterada en las plantas csb3. Para analizar la participación de los distintos componentes de la ruta de señalización dependiente de SA en la manifestación del fenotipo de resistencia de csb3, se procedió al análisis epistático entre csb3 y pad4, sid2, eds5, nahG, npr1, dth9 y cpr1. Estos estudios indican que la elevada resistencia frente a patógenos biotrofos de las plantas csb3 requiere de todos y cada uno de los componentes de la ruta de señalización dependiente del SA estudiados. El gen CSB3 identificado por clonaje posicional codifica la 1-hidroxi-2-metil-2-butenil 4-difosfato (HDS) sin / Gil Morrió, MJ. (2005). Disección genética del mecanismo de resistencia frente a patógenos biotrofos mediado por el gen CSB3 en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1870 / Palancia

Das Messverfahren der optischen Spektrophotometrie wird zur kontinuierlichen Messung der Abwasserqualität auf ihre Einsatztauglichkeit überprüft. Der chemische Sauerstoffbedarf (CSB) wird als zentraler Kennwert für die stoffliche Verschmutzung von Abwasser und für dessen Nachweis in Oberflächengewässern eingesetzt, welche es zu bestimmen galt. Dabei wird der Informationsgehalt über eine organische, summarische Kohlenstoffbelastung mittels einer zusätzlichen Fraktionierung erhöht. In einer Labormesskampagne werden auf der Grundlage von Respirationsversuchen Daten aus Extinktionswerten des UV/Vis-Spektrums und Referenzwerten (Standardanalyseparameter und simulierte Stoffkonzentrationen mithilfe des Activated Sludge Modell No. 1) generiert. Darauf aufbauend werden Kalibrationsmodelle für den CSB und einzelne Fraktionen entwickelt. Die Modelle werden mithilfe des Regressionsansatzes der Partial-Least-Squares entwickelt und im Rahmen eines Anwendungsbeispiels auf ihre Praxistauglichkeit überprüft. Als Ergebnis dieser Arbeit stehen Kalibrationsmodelle für den Einsatz im kommunalem Abwasser unter Trockenwetterbedingungen zur Verfügung. Die Vorhersagequalität nimmt mit zunehmender Differenzierung ab. Von einer Weiterverwendung der berechneten Äquivalentkonzentrationen für die CSB-Fraktionen (SS, XS, SI und XI), z. B. als Kalibriergröße für Stofftransportmodelle oder als Steuer- und Regelgröße, wird allerdings abgeraten. Als Ursache für die hohen Messungenauigkeiten wurde eine unzureichende Anpassung an die Veränderungen in der Abwasserzusammensetzung während eines Trockenwettertagesganges identifiziert. Mit einer erweiterten Datengrundlage, unter der Verwendung von Standardanalyseparametern (CSB, CSBmf und BSB) in einer Abwasserprobe, welche für den Ausschluss von Stoffverbindungen vor und nach einer respirativen Vorbehandlung bestimmt werden, wird eine höhere Modellgüte in Aussicht gestellt. Darüber hinaus wird ein Umdenken hinsichtlich statischer - hin zu dynamischen - Kalibrationsfunktionen für UV/Vis-Sensoren vorgeschlagen. Eine Generalisierbarkeit der entwickelten Kalibrationsmodelle auf weitere Wetterbedingungen, Messstandorte oder Sensoren wird nicht empfohlen.:Abbildungen VI Tabellen XIII Abkürzungen XV 1 Einleitung 1 1.1 Motivation 1 1.2 Zielstellung 2 2 Stand der Forschung 5 2.1 Kohlenstoffe 6 2.1.1 Zusammensetzung und Herkunft im häuslichen Abwasser 7 2.1.1.1 Fette 8 2.1.1.2 Proteine 8 2.1.1.3 Tenside 9 2.1.1.4 Phenole 10 2.1.1.5 Kohlenwasserstoffe 10 2.1.2 Fraktionierung von Kohlenstoffverbindungen 11 2.1.2.1 Chemischer Sauerstoffbedarf 12 2.1.2.2 Ansätze zur CSB-Fraktionierung 12 2.1.2.3 Stoffzusammensetzung einzelner CSB-Fraktionen 15 2.1.2.4 Messmethoden zur Bestimmung des CSB 18 2.2 Optische Spektroskopie 20 2.2.1 Grundlagen 20 2.2.1.1 Elektromagnetische Strahlung 20 2.2.1.2 Einordnung der optischen Spektroskopie 21 2.2.1.3 Lichtabsorption 21 2.2.1.4 Chemisch-physikalische Grundlagen 22 2.2.1.5 Mathematische Grundlagen 24 2.2.1.6 Extinktionsmessung 25 2.2.2 Online-Messtechnik 26 2.2.2.1 Sensoren /-hersteller 26 2.2.2.2 Kalibrierung 26 2.2.2.2.1 Kalibrierung der S::CAN MESSTECHNIK GmbH 27 2.2.2.2.2 Unabhängige Analyseverfahren zur Auswertung spektrophotometrischer Messreihen 28 2.2.2.3 Messung 29 2.2.2.3.1 Einstellungen und Voraussetzungen 29 2.2.2.3.2 Qualitative Einflussnahme von Störgrößen auf die spektroskopische Datenerfassung 30 2.2.3 Einsatz in der Siedlungswasserwirtschaft und Hydrologie 31 3 Versuchsdurchführung und Analytik 33 3.1 Messkampagnen 33 3.1.1 Labormessversuche 33 3.1.1.1 Respirationsversuch 34 3.1.1.1.1 Versuchsaufbau zum Respirationsversuch 35 3.1.1.1.2 Betriebshinweise Respirationsversuch 38 3.1.1.2 Verdünnungsversuch 41 3.1.1.2.1 Versuchsaufbau zum Verdünnungsversuch 42 3.1.1.2.2 Betriebshinweise Verdünnungsversuch 43 3.1.2 Feldmessversuch 43 3.1.2.1 Versuchsaufbau zum Feldmessversuch 44 3.1.2.2 Betriebshinweise Feldmessversuch 46 3.2 Abwasserproben: Aufbewahrung und Analytik 47 3.2.1 Konservierung und Probenvorbehandlung 48 3.2.2 Standardisierte Laboranalyseverfahren 49 3.2.2.1 CSB 49 3.2.2.2 Biologischer Sauerstoffbedarf BSBn 50 3.3 Mess- und Regelinstrumente 51 3.3.1 Optischer Multiparameter-Sensor 51 3.3.2 Luminescent Dissolved Oxygen-Sensor (LDO) 53 3.3.3 Peristaltik-Pumpe 54 3.3.4 Dispergierer 54 4 Untersuchungen zur Entwicklung und Anwendung von UV/Vis-Kalibrierungen 55 4.1 Statistische Verfahren zur Kalibrierung 55 4.1.1 Datengrundlage und Methoden 56 4.1.1.1 Datengrundlage 56 4.1.1.2 Multivariate Datenanalyse 57 4.1.1.2.1 Regressionsanalyse 58 4.1.1.2.1.1 Schätzung der Regressionsfunktion 59 4.1.1.2.2 Qualitätsprüfung 61 4.1.1.2.3 Prüfung der Modellprämissen 63 4.1.1.2.4 Multivariate Regressionsanalyse 66 4.1.1.3 Vergleich der Kalibrierverfahren 70 4.1.2 Ergebnisse 70 4.1.2.1 Regressionsansätze für UV/Vis-Kalibrierung 70 4.1.2.1.1 Partial-Least-Squares Regression (PLS-R) 70 4.1.2.1.2 Lasso-Regression 73 4.1.2.1.3 Herstellerkalibrierung (SCAN GmbH) 73 4.1.2.1.3.1 Anwendung der globalen Herstellerkalibrierung 73 4.1.2.1.3.2 Lokal angepasste Herstellerkalibrierung 74 4.1.3 Auswertungen 75 4.1.3.1 Tauglichkeit angewandter Regressionsansätze zur Entwicklung von UV/Vis-Kalibrierfunktionen 75 4.1.3.1.1 Vergleich der Vorhersagequalitäten zwischen Regressionsansätzen und Herstellerkali¬- brierung 75 4.1.3.1.2 Aussagekraft angewandter Regressionsmodelle 77 4.1.3.1.2.1 Regressionsfunktion und -koeffizienten 77 4.1.3.1.2.2 Modellprämissen 78 4.1.3.2 Identifizierung signifikanter WL oder -Bereiche 80 4.2 Fraktionierung von CSB-Verbindungen 81 4.2.1 Datengrundlage und Methoden 82 4.2.1.1 Laborwertmethode 83 4.2.1.2 Modellwertmethode 85 4.2.1.2.1 Respirometrische Messung 86 4.2.1.2.2 Sauerstoffverbrauchsrate 87 4.2.1.2.3 Modellberechnung 89 4.2.1.2.4 Simulationsmethode mit modifiziertem Activated Sludge Modell No. 1 92 4.2.1.2.5 Modellkalibrierung 95 4.2.1.2.6 Datenauswahl 96 4.2.1.3 Lichtabsorptionsmethode 96 4.2.2 Ergebnisse 97 4.2.2.1 Modellwertmethode mit ASM No. 1 97 4.2.2.2 Auswahl von Modelldaten 100 4.2.2.3 UV/Vis-Kalibrierfunktionen 101 4.2.2.3.1 CSB-Fraktionen 101 4.2.2.3.2 Vergleich MW- und LW-Modell 103 4.2.3 Auswertungen 104 4.2.3.1 Tauglichkeit von Simulationsergebnissen aus Modellwertmethode zur Entwicklung von Kalibrierfunktionen 104 4.2.3.2 Abweichende Vorhersagequalitäten zwischen den UV/Vis-Kalibrierfunktionen 106 4.2.3.3 Messunsicherheiten und Modellqualität 107 4.2.3.4 Signifikante Wellenlängen oder -bereiche für einzelne CSB-Fraktionen 109 4.3 Anwendungsbeispiel: Kohlenstoffumsatz entlang einer Fließstrecke 111 4.3.1 Datengrundlage und Methoden 112 4.3.1.1 Einsatz von UV/Vis-Messtechnik 115 4.3.1.1.1 Vergleichbarkeit bei Parallelbetrieb baugleicher Sensoren 115 4.3.1.1.1.1 Versuchsdurchführung 116 4.3.1.1.1.2 Berechnungsansätze 116 4.3.1.1.2 Lokale Kalibrierung 117 4.3.1.1.2.1 Univariat 118 4.3.1.1.2.2 Multivariat 118 4.3.1.2 Kohlenstoffumwandlung und -umsatz innerhalb des Durchflussreaktors 118 4.3.1.2.1 Vorverarbeitung von UV/Vis-Daten 120 4.3.1.2.2 Zeitsynchronisation mithilfe der Fließzeit 120 4.3.1.2.3 Bestimmung von stofflichen Veränderungen in einem Wasserpaket 121 4.3.2 Ergebnisse 122 4.3.2.1 Praxiseinsatz von UV/Vis-Messtechnik 122 4.3.2.1.1 Stabilität und Vergleichbarkeit von Messsignalen bei unterschiedlichen Sensoren 122 4.3.2.1.1.1 Messgüte 122 4.3.2.1.1.2 Sensoranpassung 124 4.3.2.1.2 UV/Vis-Kalibrationsfunktionen 125 4.3.2.1.2.1 Validierung LK-PLS-R 126 4.3.2.1.2.2 Lokale Nachkalibrierung LK-PLS-R 128 4.3.2.1.3 Anwendung entwickelter Kalibrationsmodelle auf Zeitreihen 130 4.3.2.2 Kohlenstoffumsatz 131 4.3.3 Auswertungen 135 4.3.3.1 Tauglichkeit von UV/Vis-Messtechnik für den Einsatz in der Kanalisation 135 4.3.3.1.1 Vorhersagegenauigkeit von Kalibrationsfunktionen 135 4.3.3.1.2 Abweichende Messergebnisse der Extinktion von einzelnen Sensoren 135 4.3.3.2 Veränderungen in den Konzentrationen einzelner Kohlenstofffraktionen entlang der Fließstrecke 136 5 Diskussion 139 6 Ausblick 151 7 Zusammenfassung 153 8 Literaturverzeichnis 157 A Anhang 171 A.1 Respirationsversuche CSB-Fraktionen 171 A.1.1 Quellcode - CSB-Fraktionierung 171 A.1.2 Respirationsversuche CSB-Fraktionen 175 A.1.3 Quellcode - PLS-Regression 178 A.1.4 UV/Vis-Kalibrierung - CSB-Fraktionen 180 A.1.5 Modellgüte 183 A.1.6 Modellprämissen 184 A.2 Feldmesskampagne 188 A.2.1 Sensorkompensation 188 A.2.2 Korrelationsplots 189 A.2.2.1 Validierung der Kalibrationsmodelle 189 A.2.2.2 Nachkalibrierung der Kalibrationsmodelle 192 A.2.2.2.1 univariat 192 A.2.3 Stoffliche Veränderungen in Wasserpaketen 198 A.2.4 Laboranalysen Stoffliche Veränderungen in Wasserpaketen 201 / Optical spectrophotometry is checked as measuring method for continuous monitoring of waste water quality. The chemical oxygen demand (COD) is used as a central parame-ter for the material assessment of waste water and for its detection in surface waters. The information value about an organic load is increased using an additional fractiona-tion. In a laboratory measurement campaign, data from extinction values of the UV/Vis spectrum and reference values are created (standard analysis parameters and simulated concentrations by using the Activated Sludge Model No. 1). Based on this calibration models for the COD and individual fractions are developed using the regression ap-proach of the partial least squares and their practical suitability is checked in the context of an application example. As a result of this work, calibration models for use in munici-pal wastewater under dry weather conditions, are available. The prediction quality de-creases with increasing differentiation. We advise against further use of the calculated equivalent concentrations for the COD fractions (SS, XS, SI und XI), e.g. as a calibration var-iable for mass transfer models or as a control and regulation variable. The reason for higher measurement uncertainties is identified as insufficient adaptation to the changing wastewater composition during a dry weather day. With an extended data basis, a higher model quality is promised: Standard analysis parameters (COD, CODmf and BOD) are de-termined in wastewater samples before and after respiratory pretreatment in order to be able to rule out substances. In addition, rethinking of static calibration functions for UV/Vis sensors is proposed towards dynamic methods. A generalization of calibration models to other weather conditions, measurement locations or sensors is not recom-mended.:Abbildungen VI Tabellen XIII Abkürzungen XV 1 Einleitung 1 1.1 Motivation 1 1.2 Zielstellung 2 2 Stand der Forschung 5 2.1 Kohlenstoffe 6 2.1.1 Zusammensetzung und Herkunft im häuslichen Abwasser 7 2.1.1.1 Fette 8 2.1.1.2 Proteine 8 2.1.1.3 Tenside 9 2.1.1.4 Phenole 10 2.1.1.5 Kohlenwasserstoffe 10 2.1.2 Fraktionierung von Kohlenstoffverbindungen 11 2.1.2.1 Chemischer Sauerstoffbedarf 12 2.1.2.2 Ansätze zur CSB-Fraktionierung 12 2.1.2.3 Stoffzusammensetzung einzelner CSB-Fraktionen 15 2.1.2.4 Messmethoden zur Bestimmung des CSB 18 2.2 Optische Spektroskopie 20 2.2.1 Grundlagen 20 2.2.1.1 Elektromagnetische Strahlung 20 2.2.1.2 Einordnung der optischen Spektroskopie 21 2.2.1.3 Lichtabsorption 21 2.2.1.4 Chemisch-physikalische Grundlagen 22 2.2.1.5 Mathematische Grundlagen 24 2.2.1.6 Extinktionsmessung 25 2.2.2 Online-Messtechnik 26 2.2.2.1 Sensoren /-hersteller 26 2.2.2.2 Kalibrierung 26 2.2.2.2.1 Kalibrierung der S::CAN MESSTECHNIK GmbH 27 2.2.2.2.2 Unabhängige Analyseverfahren zur Auswertung spektrophotometrischer Messreihen 28 2.2.2.3 Messung 29 2.2.2.3.1 Einstellungen und Voraussetzungen 29 2.2.2.3.2 Qualitative Einflussnahme von Störgrößen auf die spektroskopische Datenerfassung 30 2.2.3 Einsatz in der Siedlungswasserwirtschaft und Hydrologie 31 3 Versuchsdurchführung und Analytik 33 3.1 Messkampagnen 33 3.1.1 Labormessversuche 33 3.1.1.1 Respirationsversuch 34 3.1.1.1.1 Versuchsaufbau zum Respirationsversuch 35 3.1.1.1.2 Betriebshinweise Respirationsversuch 38 3.1.1.2 Verdünnungsversuch 41 3.1.1.2.1 Versuchsaufbau zum Verdünnungsversuch 42 3.1.1.2.2 Betriebshinweise Verdünnungsversuch 43 3.1.2 Feldmessversuch 43 3.1.2.1 Versuchsaufbau zum Feldmessversuch 44 3.1.2.2 Betriebshinweise Feldmessversuch 46 3.2 Abwasserproben: Aufbewahrung und Analytik 47 3.2.1 Konservierung und Probenvorbehandlung 48 3.2.2 Standardisierte Laboranalyseverfahren 49 3.2.2.1 CSB 49 3.2.2.2 Biologischer Sauerstoffbedarf BSBn 50 3.3 Mess- und Regelinstrumente 51 3.3.1 Optischer Multiparameter-Sensor 51 3.3.2 Luminescent Dissolved Oxygen-Sensor (LDO) 53 3.3.3 Peristaltik-Pumpe 54 3.3.4 Dispergierer 54 4 Untersuchungen zur Entwicklung und Anwendung von UV/Vis-Kalibrierungen 55 4.1 Statistische Verfahren zur Kalibrierung 55 4.1.1 Datengrundlage und Methoden 56 4.1.1.1 Datengrundlage 56 4.1.1.2 Multivariate Datenanalyse 57 4.1.1.2.1 Regressionsanalyse 58 4.1.1.2.1.1 Schätzung der Regressionsfunktion 59 4.1.1.2.2 Qualitätsprüfung 61 4.1.1.2.3 Prüfung der Modellprämissen 63 4.1.1.2.4 Multivariate Regressionsanalyse 66 4.1.1.3 Vergleich der Kalibrierverfahren 70 4.1.2 Ergebnisse 70 4.1.2.1 Regressionsansätze für UV/Vis-Kalibrierung 70 4.1.2.1.1 Partial-Least-Squares Regression (PLS-R) 70 4.1.2.1.2 Lasso-Regression 73 4.1.2.1.3 Herstellerkalibrierung (SCAN GmbH) 73 4.1.2.1.3.1 Anwendung der globalen Herstellerkalibrierung 73 4.1.2.1.3.2 Lokal angepasste Herstellerkalibrierung 74 4.1.3 Auswertungen 75 4.1.3.1 Tauglichkeit angewandter Regressionsansätze zur Entwicklung von UV/Vis-Kalibrierfunktionen 75 4.1.3.1.1 Vergleich der Vorhersagequalitäten zwischen Regressionsansätzen und Herstellerkali¬- brierung 75 4.1.3.1.2 Aussagekraft angewandter Regressionsmodelle 77 4.1.3.1.2.1 Regressionsfunktion und -koeffizienten 77 4.1.3.1.2.2 Modellprämissen 78 4.1.3.2 Identifizierung signifikanter WL oder -Bereiche 80 4.2 Fraktionierung von CSB-Verbindungen 81 4.2.1 Datengrundlage und Methoden 82 4.2.1.1 Laborwertmethode 83 4.2.1.2 Modellwertmethode 85 4.2.1.2.1 Respirometrische Messung 86 4.2.1.2.2 Sauerstoffverbrauchsrate 87 4.2.1.2.3 Modellberechnung 89 4.2.1.2.4 Simulationsmethode mit modifiziertem Activated Sludge Modell No. 1 92 4.2.1.2.5 Modellkalibrierung 95 4.2.1.2.6 Datenauswahl 96 4.2.1.3 Lichtabsorptionsmethode 96 4.2.2 Ergebnisse 97 4.2.2.1 Modellwertmethode mit ASM No. 1 97 4.2.2.2 Auswahl von Modelldaten 100 4.2.2.3 UV/Vis-Kalibrierfunktionen 101 4.2.2.3.1 CSB-Fraktionen 101 4.2.2.3.2 Vergleich MW- und LW-Modell 103 4.2.3 Auswertungen 104 4.2.3.1 Tauglichkeit von Simulationsergebnissen aus Modellwertmethode zur Entwicklung von Kalibrierfunktionen 104 4.2.3.2 Abweichende Vorhersagequalitäten zwischen den UV/Vis-Kalibrierfunktionen 106 4.2.3.3 Messunsicherheiten und Modellqualität 107 4.2.3.4 Signifikante Wellenlängen oder -bereiche für einzelne CSB-Fraktionen 109 4.3 Anwendungsbeispiel: Kohlenstoffumsatz entlang einer Fließstrecke 111 4.3.1 Datengrundlage und Methoden 112 4.3.1.1 Einsatz von UV/Vis-Messtechnik 115 4.3.1.1.1 Vergleichbarkeit bei Parallelbetrieb baugleicher Sensoren 115 4.3.1.1.1.1 Versuchsdurchführung 116 4.3.1.1.1.2 Berechnungsansätze 116 4.3.1.1.2 Lokale Kalibrierung 117 4.3.1.1.2.1 Univariat 118 4.3.1.1.2.2 Multivariat 118 4.3.1.2 Kohlenstoffumwandlung und -umsatz innerhalb des Durchflussreaktors 118 4.3.1.2.1 Vorverarbeitung von UV/Vis-Daten 120 4.3.1.2.2 Zeitsynchronisation mithilfe der Fließzeit 120 4.3.1.2.3 Bestimmung von stofflichen Veränderungen in einem Wasserpaket 121 4.3.2 Ergebnisse 122 4.3.2.1 Praxiseinsatz von UV/Vis-Messtechnik 122 4.3.2.1.1 Stabilität und Vergleichbarkeit von Messsignalen bei unterschiedlichen Sensoren 122 4.3.2.1.1.1 Messgüte 122 4.3.2.1.1.2 Sensoranpassung 124 4.3.2.1.2 UV/Vis-Kalibrationsfunktionen 125 4.3.2.1.2.1 Validierung LK-PLS-R 126 4.3.2.1.2.2 Lokale Nachkalibrierung LK-PLS-R 128 4.3.2.1.3 Anwendung entwickelter Kalibrationsmodelle auf Zeitreihen 130 4.3.2.2 Kohlenstoffumsatz 131 4.3.3 Auswertungen 135 4.3.3.1 Tauglichkeit von UV/Vis-Messtechnik für den Einsatz in der Kanalisation 135 4.3.3.1.1 Vorhersagegenauigkeit von Kalibrationsfunktionen 135 4.3.3.1.2 Abweichende Messergebnisse der Extinktion von einzelnen Sensoren 135 4.3.3.2 Veränderungen in den Konzentrationen einzelner Kohlenstofffraktionen entlang der Fließstrecke 136 5 Diskussion 139 6 Ausblick 151 7 Zusammenfassung 153 8 Literaturverzeichnis 157 A Anhang 171 A.1 Respirationsversuche CSB-Fraktionen 171 A.1.1 Quellcode - CSB-Fraktionierung 171 A.1.2 Respirationsversuche CSB-Fraktionen 175 A.1.3 Quellcode - PLS-Regression 178 A.1.4 UV/Vis-Kalibrierung - CSB-Fraktionen 180 A.1.5 Modellgüte 183 A.1.6 Modellprämissen 184 A.2 Feldmesskampagne 188 A.2.1 Sensorkompensation 188 A.2.2 Korrelationsplots 189 A.2.2.1 Validierung der Kalibrationsmodelle 189 A.2.2.2 Nachkalibrierung der Kalibrationsmodelle 192 A.2.2.2.1 univariat 192 A.2.3 Stoffliche Veränderungen in Wasserpaketen 198 A.2.4 Laboranalysen Stoffliche Veränderungen in Wasserpaketen 201