Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da N-acetil-L-cisteína (NAC), adicionada ao diluente composto de leite em pó desnatado, sobre a viabilidade espermática e o estresse oxidativo do sêmen equino resfriado a 5°C. Ejaculados de 8 pôneis da raça Brasileira foram coletados em triplicata resultando em 24 ejaculados. O sêmen foi distribuído em 4 grupos: Equidil® + 0,00 mM (controle), 0,5 mM, 1,0 mM ou 2,5 mM de NAC. As amostras foram armazenadas em tubos de 15mL e mantidas em caixas de transporte de sêmen BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP, Brasil). Parâmetros como motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), vigor, pH, resposta ao teste hiposmótico (HOST) e atividade mitocondrial (MTT) foram avaliados nas 24 e 48 h, bem como no sêmen fresco, após a diluição. O vigor, MT e MP foram também avaliados após teste de termorresistência (TTR), na ausência e presença de peróxido. A MT, a MP, o vigor espermático e a MTT foram similares (P > 0.05) entre as concentrações de NAC, nas 24 e 48 h. A resposta ao HOST foi semelhante entre as concentrações de NAC (P > 0,05) nas 24 h de resfriamento, porém nas 48 h ocorreu diminuição da funcionalidade da membrana no grupo NAC 2,5 mM em comparação ao grupo EQUIDIL, sem adição de NAC. A MT, a MP e vigor, das amostras resfriadas por 24 h e submetidas ao TTR, diferiu entre sem e com peróxido (P < 0,05) nos grupos Equidil, 0,5 mM e 1,0 mM, mas foi similar na concentração de 2,5 mM de NAC. Quando o sêmen foi resfriado por 48 h, houve diferença no vigor e MT entre amostras com e sem peróxido (P < 0,05), em todos os grupos testados, mas a MP foi similar entre amostras com e sem peróxido, na concentração 2,5 mM. O pH do diluente Equidil® foi o maior e os grupos Equidil + 0,5 mM e 1,0 mM tiveram valores intermediários, enquanto a concentração de 2,5 mM de NAC gerou valores mais baixos, nos três momentos avaliados (P < 0,05). Não houve variação significativa de pH entre os momentos 0 e 24 h (P= 0,7075) e entre 0 e 48 h (P= 0,4617), em todos os grupos testados. As concentrações de NAC testadas não melhoraram a motilidade, integridade da membrana plasmática, atividade mitocondrial e resposta ao HOST de espermatozoides equinos resfriados a 5°C e armazenados por 48 h. Após TTR, as concentrações de NAC testadas não evitaram a diminuição da motilidade e vigor espermático, na presença de peróxido. / The aim of this study was to evaluate the effect of N-acetyl-L-cysteine (NAC) based on skim milk powder extender on sperm viability and oxidative stress of equine semen cooled to 5°C. Ejaculate of 8 ponies of the Brazilian breed were collected in triplicate, resulting in 24 ejaculates, distributed in 4 groups: Equidil® extender + 0.00mm (control), 0.5mM, 1.0mM and 2.5mM of NAC with the semen samples were The samples were stored in 15mL tubes and kept in BotuFLEX® semen transport boxes (Botupharm, Botucatu/SP/Brazil). Parameters, such as motility, vigor, pH, osmolarity, HOST, and MTT were evaluated at 24 and 48 h of cooling also in fresh semen. Vigor, total (TM) and progressive motility (PM) were also evaluated after thermoresistance test (TTR), in the absence and presence of peroxide. TM, PM, sperm vigor and MTT were similar (P > 0.05) between NAC concentrations at 24 and 48 h. The response to HOST was similar between NAC concentrations (P > 0.05) at 24 h cooling, but at 48 h there was a decreased in membrane functionality in 2.5mM NAC group compared to the EQUIDIL group. TM, PM, and vigor of the samples cooled by 24 h and submitted to TTR differed between without and with peroxide (P< 0.05) in the EQUIDIL, 0.5mM and 1.0mM groups, but was similar in 2.5mM NAC. After cooling for 48 h, there was difference in vigor and TM between samples with and without peroxide (P < 0.05) in all groups tested, but the PM was similar between samples with and without peroxide at concentration 2.5mM of NAC. The pH of the EQUIDIL extender was higher and the EQUIDIL + 0.5mM and 1.0mM groups had intermediate values, while the 2.5mM NAC concentration generated lower values in the three evaluated periods (P < 0.05). There was no significant variation of pH between 0 and 24 h (P=0.7075) and between 0 and 48 h (P=0.4617) in all groups tested. The concentrations of NAC tested did not improve motility, plasma membrane integrity, mitochondrial activity and response to HOST equine spermatozoa cooled to 5°C and stored for 48 h. After TTR, the concentrations of NAC tested did not prevent the decrease of motility and sperm vigor in the presence of peroxide.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / O arbovírus Mayaro (MAYV), encontrado nas regiões próximas a florestas e áreas rurais da América do Sul, é membro da família Togaviridae, gênero Alphavirus. Este gênero é distribuído amplamente, tendo dois grupos principais: Alphavirus do Velho Mundo (Chikungunya, Sindbis, O¿nyong-nyong, Ross River, Semliki Forest) e do Novo Mundo (Encefalite Equina Venezuelana, Encefalite Equina Ocidental), de acordo com a região na qual foram isolados originalmente. O mosquito Haemagogus spp. é o principal vetor do MAYV que também já foi isolado de mosquitos do gênero Aedes spp. Considerando a semelhança do MAYV com o vírus Chikungunya, recentemente inserido no Brasil, e transmitido por Ae. aegypti, há risco de que o MAYV possa ser transmitido em áreas urbanas. Cabe ressaltar que no Brasil já foram registrados casos de co-circulação de MAYV durante surtos epidêmicos de dengue. A infecção por MAYV causa sintomas semelhantes a outras doenças febris, como a febre da dengue, a febre do Chikungunya, e a malária, dificultando o diagnóstico preciso dos casos. O genoma de MAYV, com cerca de 11,7 kb, é organizado em duas principais regiões: domínio não estrutural (extremidade 5¿ do RNA), contendo os genes que codificam as proteínas não estruturais (nsP1-4); e domínio estrutural, contendo os genes que codificam as proteínas estruturais. As proteínas não estruturais dos Alphavirus são necessárias para o processamento da poliproteína e para síntese do RNA viral. Dentre as proteínas não estruturais, as proteases virais podem ser imunogênicas além de se constituírem em excelentes alvos terapêuticos. O estudo comparativo do genoma dos Alphavirus indica que a proteína nsP2 de MAYV possui diversas atividades enzimáticas, incluindo a atividade de cisteíno protease em sua região C-terminal. Portanto, com o intuito de obter um método de diagnóstico sorológico específico para MAYV, utilizando sistema de expressão recombinante em células de insetos, foi realizada a construção de três baculovírus recombinantes para a nsP2 de MAYV, para obtenção da proteína completa (nsP2FL), do domínio de cisteíno protease da porção C-terminal (Pro38), e do domínio N-terminal (NT51) como controle negativo da atividade proteolítica. A expressão de cada uma das formas recombinantes da nsP2 foi realizada em célula de inseto High Five¿. Os resultados foram analisados por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) e Western blotting. Apenas a construção NT51 da nsP2 de MAYV foi detectada na fração celular da cultura de High Five¿ por Western blotting. A análise de RNA das células High Five¿ e Sf-9 infectadas com os baculovírus recombinantes para nsP2FL e Pro38, revelou a presença de transcritos das proteínas recombinantes, indicando que a ausência dos produtos proteicos poderia ser devido a perda da cauda de histidina presente nas construções por atividade de proteólise na extremidade Cterminal. Esta hipótese foi confirmada após expressão das proteínas nsP2FL e Pro38, em célula High Five¿ infectada com baculovírus recombinantes para os genes que codificam as respectivas proteínas, com cauda de histidina na porção N-terminal. / The arbovirus Mayaro (MAYV), found in regions close to forests and rural areas of South America, is a member of the family Togaviridae, genus Alphavirus. This genus is distributed widely, in two main groups, according to the region in which they were originally isolated: the Old World (Chikungunya, Sindbis, O'nyong-Nyong, Ross River, Semliki Forest) and the New World Alphavirus (Venezuelan Equine Encephalitis, Western Equine Encephalitis). The mosquito Haemagogus spp. is the main vector of MAYV which has also been isolated from mosquitoes of the genus Aedes spp. Considering the similarity of MAYV with Chikungunya virus, recently introduced in Brazil, and transmitted by Ae. aegypti, there is risk of MAYV urban transmission. Indeed, in Brazil, co-circulation of MAYV during dengue outbreaks have been related. Symptoms of MAYV fever are similar to other febrile diseases, such as dengue fever, Chikungunya fever, and malaria, making an accurate diagnosis, difficult. MAYV 11.7 kb genome is divided in two regions: non-structural domain (5'- RNA) containing the genes encoding the nonstructural proteins (nsP1-4); and structural domain containing genes encoding structural proteins. The Alphavirus nonstructural proteins are required for processing of the polyprotein and for viral RNA synthesis. Among the non-structural proteins, viral proteases may be immunogenic besides being excellent therapeutic targets. Genome comparative studies of Alphavirus indicates that the MAYV nsP2 protein has diverse enzymatic activities including a cysteine protease activity in its C-terminal region. Thus, with the objective to obtain a specific diagnostic method for MAYV, using a recombinant expression system in insect cells, a construction of three MAYV nsP2 recombinant baculoviruses to obtain the complete protein (nsP2FL), the C-terminal cysteine protease domain (Pro38), and the N-terminal (NT51) domain as a proteolysis activity negative control. The expression of each nsP2 construction was performed on Sf-9 and High Five¿ insect cells and the results were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis with SDS (SDS-PAGE) and Western blotting. Only the nsP2 NT51 construction was detected in the cellular fraction of Sf-9 and High Five¿ cultures by Western blotting. RNA analysis of Sf-9 cells infected with nsP2FL and Pro38 recombinant baculoviruses revealed the presence of transcripts, suggesting that the absence of the corresponding protein products occurred due the proteolysis of the C-terminal portion of the protein, resulting in histidine tail elimination. This hypothesis was confirmed by expression of nsP2FL e Pro38, proteins in Sf-9 and High Five¿ cells infected with recombinant baculoviruses for the genes encoding the respective proteins with histidine tail at the N-terminal portion.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6407.pdf: 1899401 bytes, checksum: d7929c149990e2a77bfc5e204bc566f5 (MD5) Previous issue date: 2014-09-04 / Universidade Federal de Minas Gerais / Cysteine proteases (CPs) are proteolytic enzymes which have a cysteine residue at its active site. Plant legumains are CPs known as vacuolar processing enzymes and they play key roles in seed maturation, germination, senescence, stress response, programmed cell death during development and defense against pathogens. Although there are many studies about plant legumains, most of them is related to legumain functions in seeds of dicotyledonous. To date, only one legumain from sugarcane has been described. In this study, it was performed the characterization of a new sugarcane legumain, named CaneLEG2. The recombinant CaneLEG2 was produced in the heterologous expression system Pichia pastoris and its kinetic characterization showed that it exhibits self-activation and activity under acidic pH, which are common features of plant legumains. This study also demonstrated that the sugarcane cystatin CaneCPI-3 has a strong inhibition over the CaneLEG2 activity, suggesting that this cystatin may participate of the regulation of endogenous cysteine proteases. The results obtained in this work will support the understanding of the functions of CaneLEG2 and CaneCPI-3 in sugarcane. / As cisteino-peptidases (CPs) são enzimas proteoliticas que possuem um resíduo de cisteina em seu sitio ativo. As legumainas de plantas são CPs conhecidas como enzimas de processamento vacuolar (VPE) e participam nos processos de maturação de sementes, germinação, senescência, resposta a estresses, morte celular programada no desenvolvimento da planta ou em resposta ao ataque de patógenos. Embora existam diversos estudos com legumainas de plantas, a maioria deles esta relacionada as funções das legumainas em sementes de dicotiledoneas. Ate o momento, apenas uma legumaina de cana-de-açúcar havia sido descrita. Neste presente trabalho, foi realizada a caracterização de uma nova legumaina de cana-de-açúcar, denominada CaneLEG2. A CaneLEG2 recombinante foi produzida em sistema de expressão heterologa Pichia pastoris e sua caracterização cinetica mostrou que ela apresenta auto-ativação e atividade em pH ácido, caracteristicas comuns em legumainas de plantas. Esse estudo ainda demonstrou que a cistatina de cana-de-açúcar CaneCPI-3 exerce uma forte inibição sobre a atividade da CaneLEG2, sugerindo que essa cistatina pode atuar na regulação de cisteino-peptidases endógenas. Os resultados obtidos neste trabalho ajudam no entendimento das funções exercidas pela CaneLEG2 e CaneCPI-3 na cana-de-açúcar.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6416.pdf: 7607633 bytes, checksum: e01f0f58b2ee5032346c3d9eae67f4ac (MD5) Previous issue date: 2014-09-05 / Financiadora de Estudos e Projetos / Cystatins are reversible inhibitors of cysteine peptidases. The cystatins found in plants are called phytocystatins, and represent an independent subfamily of the cystatins superfamily. Some studies have reported significant pleiotropic effects for recombinant cystatins expressed in transgenic plants, notably including tolerance phenotypes against attack of herbivorous arthropods and pathogens, and against abiotic and biotic stresses. Besides, the recombinant sugarcane cystatin, CaneCPI-4, showed potential to inhibit development of melanoma cells. Thus, the study and knowledge about phytocystatins, become interesting from agricultural and medicinal point of view. The sugarcane genome project (SUCEST) allowed the identification of about 25 putative cystatins in this plant, which were gathered in 4 groups, by phylogenetic analysis. In this study, we propose a new classification for the putative cystatins found in the SUCEST database. Furthermore, we describe the heterologous expression, purification and characterization of two novel sugarcane cystatins, CaneCPI-5 and CaneCPI-6, which showed different inhibitory activities against human cathepsin B. While protein CaneCPI-6 was not able to inhibit this enzyme efficiently (Ki = 1,83 &#956;M), the protein CaneCPI-5 showed a good inhibitory capacity against the same enzyme (Ki = 6,87 nM). The CaneCPI-5 cystatin was also analyzed against recombinant cathepsin L from the beetle Sphenophorus levis (rSl-CathL), and showed a good inhibitory capacity against this enzyme (Ki = 0,059 nM). Finally, both of proteins, CaneCPI-5 and CaneCPI-6, proved to be thermostable when kept at 100°C for 30 minutes. / Cistatinas são inibidores reversíveis de cisteíno-peptidases. As cistatinas encontradas em plantas são denominadas fitocistatinas, e constituem uma subfamília independente da superfamília das cistatinas. Alguns estudos têm relatado importantes efeitos pleiotrópicos para cistatinas recombinantes expressas em plantas transgênicas, incluindo principalmente, fenótipos com tolerância ao ataque de artrópodes herbívoros e patógenos, e contra estresses bióticos e abióticos. Ademais, a cistatina recombinante de cana-de-açúcar, CaneCPI-4, apresentou potencial para inibir o desenvolvimento de células de melanoma. Dessa maneira, o estudo e conhecimento sobre as fitocistatinas, tornam-se interessantes do ponto de vista agrícola e na saúde. O projeto genoma da cana-de-açúcar (SUCEST) possibilitou a identificação de 25 possíveis cistatinas nesta planta, que foram reunidas em 4 grupos, por meio de análises filogenéticas. Nesse trabalho propomos uma reanálise das prováveis cistatinas encontradas no banco de dados do SUCEST. Além disso, descrevemos a expressão heteróloga, purificação e caracterização de duas novas cistatinas de cana-de-açúcar, CaneCPI-5 e CaneCPI-6, as quais apresentaram diferenças na ação inibitória contra a catepsina B humana. Enquanto a proteína CaneCPI-6 não foi capaz de inibir esta enzima de forma eficiente (Ki = 1,83 &#956;M), a proteína CaneCPI-5 apresentou um bom poder inibitório contra a mesma enzima (Ki = 6,87 nM). A cistatina CaneCPI-5 foi analisada também contra a catepsina L recombinante do inseto Sphenophorus levis (rSl-CathL), e apresentou alto poder inibitório contra essa enzima (Ki = 0,059 nM). Por fim, ambas as proteínas, CaneCPI-5 e CaneCPI-6, mostraram-se termoestáveis quando mantidas à 100°C durante 30 minutos.

O processo de criopreservação promove danos celulares que podem comprometer a qualidade espermática em termos de motilidade e dos índices de fertilidade, principalmente, devido ao estresse oxidativo. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de cisteína e glutamina na motilidade, morfologia, integridade da membrana, danos no DNA e índices de estresse oxidativo no sêmen de jundiá (Rhamdia quelen) pós-descongelamento. O sêmen de 5 machos (369,6 ± 71,75 g), com motilidade espermática superior a 80%, foi criopreservado em solução crioprotetora (frutose 50 g / L, leite em pó 50 g / L e metanol 100 mL / L) contendo diferentes concentrações de cisteína (0, 2,5, 5, 10 e 20 mM) e/ou glutamina (2,5 e 5,0 mM). O pool de sêmen foi diluído na proporção de 1:3, armazenado em palhetas de 0,25 mL, congelado em vapor de nitrogênio e mergulhado em nitrogênio líquido. Após o descongelamento (25°C por 10s) foram avaliados: motilidade (motilidade total, 0-100%), morfologia (Rosa de Bengala), fertilização, integridade da membrana (Eosina-Nigrosina), dano ao DNA (teste cometa), peroxidação lipídica (TBARS), atividade das enzimas SOD, CAT, GST e GPx, e a concentração de grupos carbonilas e sulfidrilas. Em relação aos parâmetros de motilidade, fertilização e morfologia espermática, nenhum tratamento apresentou diferença significativa em relação ao controle Na avaliação da integridade de membrana não foi observada diferença entre os tratamentos (P=0,7323). No ensaio do cometa e peroxidação lipídica os tratamentos que apresentaram os piores resultados foram os com maiores concentrações de cisteína e glutamina combinadas (P<0,0001) em relação ao controle. Observou-se uma maior atividade da SOD nos tratamentos 20C, 2,5G e 5G menor atividade no controle (P<0,0001). A atividade da CAT, GST e GPx foi maior no tratamento com as maiores concentrações dos antioxidantes (20C+5G; P<0,0001) e menor no controle. A concentração de grupos carbonilas foi maior no tratamento 20C+5G e menor controle (P<0,0001). Já a concentração de grupos sulfidrilas foi maior no controle e no tratamento 5C+5G (P<0,0001). Os achados deste estudo mostram que cisteína e glutamina, nas concentrações testadas, não apresentaram resultados satisfatórios e sim efeitos prejudiciais à qualidade espermática nos parâmetros de motilidade, morfologia, fertilização, peroxidação lipídica, índice de danos ao DNA e oxidação de proteínas. Portanto, as concentrações testadas não são recomendadas para a suplementação da solução crioprotetora para congelamento de sêmen de Rhamdia quelen. / The cryopreservation process promotes cellular damage that could compromise sperm quality in terms of motility and fertility rates, mainly due to oxidative stress. Thus, aim of this study was to assess the effects of different concentrations of cysteine and glutamine on post-thaw sperm motility, morphology, membrane integrity, fertility, DNA damage and indices of oxidative stress in the South American silver catfish (Rhamdia quelen). Sperm collected from five males (369.6 ± 71.75g), with sperm motility higher than 80%, was cryopreserved in cryoprotectant solution (fructose 50 g/L, powdered milk 50 g/L and methanol 100mL/L) containing different cysteine concentrations (0, 2.5, 5, 10 and 20 mM) and/or glutamine (2.5 and 5.0 mM). The semen pool was diluted 1:3, filled in 0.25 mL straws, frozen in nitrogen vapor, and plunged into liquid nitrogen. After thawing (25°C for 10 s) were measured: motility (total motile, 0-100%), morphology (Bengal Rose Staining), fertilization, membrane integrity (Eosin-Nigrosine), DNA damage (cometa assay), lipid peroxidation (TBARS), the activity of SOD, CAT, GST and GPx enzymes, and the concentration of Carbonyl and Sulfhydril groups. In relation to parameters of motility, fertilization and sperm morphology, no treatment presented a significant difference in relation to the control In the evaluation of membrane integrity, no difference was observed between treatments (P = 0.7323). In the comet and lipid peroxidation assay the treatments with the worst results were those with the highest concentrations of cysteine and glutamine combined (P <0.0001) in relation to the control. A higher activity of SOD was observed in treatments 20C, 2.5G and 5G lower activity in the control (P <0.0001). The activity of CAT, GST and GPx was higher in the treatment with the highest concentrations of antioxidants (20C + 5G; P <0.0001) and lower in the control. The concentration of carbonyl groups was higher in the 20C + 5G treatment and lower control (P <0.0001). The concentration of sulfhydryl groups was higher in control and 5C + 5G treatment (P <0.0001).The findings of this study show that cysteine and glutamine, at the concentrations tested, did not present satisfactory results, but rather, damaging effects on sperm quality in the parameters of motility, morphology, fertilization, lipid peroxidation, DNA damage and protein oxidation. Therefore, the concentrations tested are not recommended for the supplementation of the cryoprotectant solution for freezing semen of Rhamdia quelen.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo L. O. R. Cunha. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2017. / Nos últimos anos o rol de propriedades biológicas de compostos de selênio e de telúrio tem aumentado e outras atividades, além das bem descritas propriedades antioxidantes, também vêm sendo demonstradas. Neste contexto, a inibição enzimática promovida por espécies hipervalentes de selênio e telúrio (organocalcogenanas) foi relatada para cisteína proteases, tirosina fosfatases e o proteasoma, por exemplo. Esta inibição é resultado da particular reatividade que compostos hipervalentes de telúrio e selênio apresentam com tióis. Como a quantidade de biotióis reativos em sistemas celulares é vasta e nem todos estão disponíveis para ensaios in vitro com as organocalcogenanas, é possível vislumbrar a aplicação desses compostos como ligantes em cromatografia de afinidade para a identificação de proteínas reativas a esses compostos. Para atingir este objetivo foram utilizados organocalcogenetos derivados de benzaldeído. A estrutura dos ligantes é constituída por um grupo fenilcalcogenila ligado a um derivado de poliéter funcionalizado com um grupo amina que é ancorado à uma matriz de agarose. Foram preparadas duas classes de ligantes para a modificação de agarose que diferem na estrutura do espaçador, a primeira contém uma unidade de ácido succínico entre o organocalcogeneto e o derivado de poliéter (ligantes de Classe I) e a outra, isenta dessa unidade de ácido succínico, possui um grupo amino ionizável (ligantes catiônicos de Classe II). A rota de preparação dos ligantes de classe I envolveu uma sequencia sintética de seis etapas com rendimentos globais de 26% e 19% e os ligantes de Classe II foram preparados em uma sequencia de duas etapas com rendimentos globais de 43% e 22%, para os selenetos e teluretos, respectivamente. A oxido-redução do ligante de telúrio da classe II se mostrou rápido e satisfatório nos estudos preliminares, dando bons indícios para aplicação como ligante na cromatografia de afinidade. Por fim, os ligantes foram imobilizados na agarose funcionalizada com brometo de cianogênio e avaliados com papaína, utilizada como modelo de biotiol nesse trabalho. Notadamente os ligantes de telúrio apresentaram um comportamento distinto do que os de selênio quanto à eluição da papaína da matriz sólida, requerendo maior volume de solução com agente redutor para a eluição da proteína. Coletivamente os resultados apresentados nesse trabalho demonstram que matrizes sólidas funcionalizadas com organocalcogenetos são funcionais para a retenção e liberação de biomoléculas tioladas (funcionalidade "catch & release"), abrindo perspectivas para o estudo mais aprofundado da interação entre calcogenetos com tióis e, ainda para produção, caracterização e estudo de aplicações de diversas matrizes funcionalizadas com organocalcogenetos. / In recent years the role of biological properties of selenium compounds and tellurium compounds has increased, and other activities besides the well-described antioxidant properties have also been demonstrated. In this context, enzymatic inhibition promoted by hypervalent species of selenium and tellurium have been reported for cysteine proteases and tyrosine phosphatases. This activity is due to the particular reactivity of thiols with the chalcogenides atom in their hypervalent state. Apart from these enzymes, one can envisage a plenty of other potential reactive thiols in cellular systems that are prone to react with organocalcogenuranes which are still unknown. As the identification of these unknown targets would be helpful to understand therapeutical and toxicological aspects of these compounds, efforts in this direction are required. One strategy for this purpose consists in using the affinity purification technique using organochalcogenides as ligands, this is proposed in the present work. To achieve this goal, the use of organochalcogenides derived from benzylamines as ligands in affinity chromatography. The structure of this ligands contains a phenylchalcogenide moiety, a polyether spacer group functionalized with an amino group to attach it to an agarose substrate. Two different spacer classes were prepared, the first has a succinic acid spacer between the organochalcogenide and the polyether (Class I ligand); the second class has the polyether moiety directly linked to the phenylchalcogenide group and has an ionizable secondary amine (Class II cationic ligand). The preparation route of the class I ligands involved a six-step synthetic sequence in overall yields of 26% and 19%, and the Class II ligands were prepared in a two-step sequence in global yields of 43% and 22% of the selenides and tellurides, respectively. The studied oxidation and reduction reactions of Class II tellurium ligands revealed fast processes, suitable for a practical application of these novel organochalcogenides in affinity chromatography. Finally, ligands were immobilized in cyanogen bromide activated agarose and the modified matrices evaluated with papain as a model biothiol. Noteworthy, the selenide ligands released papain promptly by washing the matrix with dithiothreitol solution whereas telluride ligands showed the opposite behavior. Collectively, the results presented in this work demonstrate that organochalcogenide-modified agarose is a new class of functional materials for the retention and release of biothiols presenting a "catch & release" functionality. This work brings new perspectives for a more detailed study of the interaction between chalcogenides with thiols and also to the production, characterization and the study of novel applications of organochalcogenide-modified solid matrices.

Submitted by Gabriela Lopes (gmachadolopesufpel@gmail.com) on 2016-10-10T17:31:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese - Cláudia Militz da Costa.pdf.pdf: 2514954 bytes, checksum: 6ff53df6aea30c61f0946c80d9ddf869 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2016-10-11T20:51:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Cláudia Militz da Costa.pdf.pdf: 2514954 bytes, checksum: 6ff53df6aea30c61f0946c80d9ddf869 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-11T20:51:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Cláudia Militz da Costa.pdf.pdf: 2514954 bytes, checksum: 6ff53df6aea30c61f0946c80d9ddf869 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-12-18 / Sem bolsa / Em grãos de arroz de duas cultivares híbridas e duas variedades, beneficiadas logo após a colheita e após 6 meses de armazenamento dos grãos em casca na temperatura de 20ºC, foram analisados teores de 18 aminoácidos, proteínas totais, amilose, umidade, temperatura de gelatinização (estimativa), mais os parâmetros de qualidade industrial, de cocção, de textura, de viscosidade e sensorial, preferência e aceitação. Os resultados permitiram concluir que: (a) o aumento do tempo de armazenamento provoca reduções no conteúdo e alterações no perfil de aminoácidos, não havendo diferenças de comportamento entre variedades e híbridos; (b) o conteúdo de proteínas totais do endosperma não define o grau soltabilidade (ou de empapamento) dos grãos e nem está relacionado com a preferência do consumidor pelo arroz após a cocção; (c) a elevação do conteúdo de cisteína provoca aumento na soltabilidade do arroz cozido ao longo do armazenamento; (d) os parâmetros de avaliações texturométricas e reológicas refletem os resultados da análise sensorial e da aceitação do arroz após a cocção; e, (e) o aumento do tempo de armazenamento provoca aumento inicial no rendimento industrial e reduções na brancura e no grau de polimento, mas não altera a transparência do arroz. / In rice grains from two hybrids cultivars and two varieties, milled immediately after harvest and after 6 months of storage of grains with husk at the temperature of 20°C, were analyzed levels of 18 amino acids, total protein, amylose, moisture, gelatinization temperature (estimation), plus the parameters of industrial quality, cooking, texture, viscosity and sensory attributes, also preference and acceptance. The results allowed to conclude that: (a) the increase of storage time causes reductions in the amino acid content and changes in amino acid profile, with no significant differences among varieties and hybrids; (b) total protein content from endosperm does not define the degree of loose cooked grains (or of grain stickiness) and it is not associated with the consumer preference for the rice after cooking, (c) elevation in cysteine content causes an increase in loose cooked grain (reduction of stickiness) during storage; (d) parameters of texturometric and rheological evaluations reflect the results from sensory analysis and acceptance of the rice after cooking; and (e) the increase of storage time causes an initial increasing in industrial yield and leads to reductions in whiteness and polishing degree (milling degree), but does not change the transparency of rice .

La vacuole de la levure joue un rôle dans le stockage de nutriments, la dégradation des macromolécules et le recyclage de métabolites. En accord avec ces fonctions, des protéines se trouvant à la membrane vacuolaire catalysent le transport de divers composés à travers la membrane. Ceci permet par exemple à la vacuole d’accumuler un grand stock d’arginine et d’autres acides aminés cationiques ainsi que de mobiliser des acides aminés durant une carence en azote. Par ailleurs, les scientifiques soupçonnent l’existence d’un transporteur de cystéine, essentiel au contrôle redox de la vacuole et à la protéolyse. Afin d’étudier plus en détail le transport d’acides aminés dans la vacuole, nous avons mis au point un protocole d’isolement de vacuoles intactes suivi de tests d’entrée d’acides aminés. Dans un premier temps, cela nous a permis de caractériser pour la première fois un transport de cystéine dans les vacuoles intactes. En combinant des analyses bioinformatiques avec un screening d’une collection de souches mutantes pour une sensibilité à la cystéine ou la cystine (un dimère de cystéine), nous avons pu proposer une liste de gènes candidats codant pour un transporteur de cystéine à la membrane vacuolaire. Dans un deuxième temps, nous avons caractérisé la protéine Ypq2 comme un facilitateur de haute affinité catalysant l’export d’arginine hors de la vacuole en condition de carence en azote. En outre, nous avons identifié un nouveau transporteur, Vat1, nécessaire à l’établissement du stock d’arginine vacuolaire. Nos résultats sont conciliables avec l’existence d’un couplage fonctionnel entre les voies de sortie et d’import d’arginine dans la vacuole. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Alzheimer’s disease (AD), the most common form of dementia is associated with fibril formation of amyloid-ß peptides (Aß). Aß, proteolytically derived from Aß precursor protein (AßPP), is the major component of amyloid plaques in AD brains. Familial British and Danish dementias (FBD and FDD) share pathological and clinical characteristics with AD, and the underlying mechanisms are associated with amyloid formation of mutant peptides released from the Bri2 protein. Bri2 interacts with AßPP and its BRICHOS domain has been shown to delay Aß40 and Aß42 fibril formation and toxicity in vitro and in vivo. This makes Bri2 BRICHOS a promising anti-amyloid chaperone and a potential treatment strategy for AD. Furthermore, Bri2 BRICHOS possesses a general chaperone activity as it suppresses non-fibrillar aggregation of destabilized citrate synthase (CS). Recent findings show that Bri2 BRICHOS produced in E.coli can form different molecular weight assemblies, ranging from monomers to dimers and poly-disperse oligomers. The oligomers inhibit CS aggregation, whereas the monomers and dimers are more efficient against Aß42 fibrillation and neurotoxicity, respectively. The work in this thesis shows that similar Bri2 BRICHOS quaternary structures are formed in eukaryotic cells as in E.coli. Larger BRICHOS oligomers were found in cell media, derived from proteolytically processed endogenous Bri2 in SH-SY5Y cells, as well as in human embryonic kidney (HEK293) cells transfected with a Bri2 BRICHOS construct. Recombinant human Bri2 BRICHOS mutants with one or none of the two strictly conserved cysteine residues were studied. All mutant monomers become proteolytically degraded during purification, but form stable oligomers. Single Cys to Ser mutants form stable disulfide-dependent dimers that differ in ability to prevent Aß42 fibrillation, the most stable mutant (C164S) being even more efficient than the wildtype Bri2 BRICHOS dimer. This result suggests that intra or intermolecular disulfide(s) and oligomerization affect Bri2 BRICHOS stability and activity towards Aß42 fibril formation.

En agriculture, les ravages causés par les champignons pathogènes sont les plus répandus et les plus dommageables. Au cours du développement parasite, ils présentent un besoin en méthionine et cystéine. Notre étude vise à mieux comprendre le rôle clé de la méthionine dans la physiologie du champignon phytopathogène Magnaporthe grisea. Nous sous sommes focalisés sur deux mutants de délétion obtenus par remplacement de gène : le mutant du gène codant pour la méthionine synthase (mutant ΔMS) et celui du facteur de transcription MgMetR (mutant ΔMgMetR). Une étude globale a été entreprise pour chacun des mutants en utilisant les techniques de transcriptome et de métabolome. Les signatures métaboliques des mutants ont été déterminées par HPLC. Le mutant ΔMS est caractérisé par une accumulation d’homocystéine et de SAM et le mutant ΔMgMetR présente une réduction drastique de son taux de glutathion. L’analyse en transcriptome du mutant ΔMS montre un nombre important de gènes différentiellement exprimés. Plusieurs voies métaboliques se sont vues affectées dans le mutant ΔMS : le métabolisme des folates, la biosynthèse des acides aminés et l’homéostasie du fer ont fait l’objet d’une étude particulière. Les premières analyses bioinformatiques du transcriptome du mutant ΔMgMetR ont confirmé le rôle de MgMetR dans le contrôle de l’expression des gènes de la voie d’assimilation du sulfate. L’ensemble de ces résultats a permis de mettre en évidence de nouvelles connections métaboliques et ainsi, facilite la compréhension du métabolisme du champignon phytopathogène M. grisea afin de trouver de nouvelles voies d’étude pour la protection des cultures. / Filamentous fungi cause devastating diseases in agricultural crops. Recent studies highlighted a need for methionine and cysteine during the infectious process. Our goal is to understand the role of methionine biosynthesis in the plant pathogenic model Magnaporthe grisea. To this end, we focused our study on two null mutants for the genes encoding methionine synthase which catalyzes the last step for methionine biosynthesis (ΔMS), and the sulphur regulator MgMetR which controls sulphate assimilation pathway (ΔMgMetR). A global analysis was carried out for each mutant by using transcriptomic and targeted metabolomic approaches. Metabolic signatures were determined by HPLC. ΔMS mutant was characterized by an increase in homocysteine and S-adenosylmethionine levels whereas ΔMgMetR mutant displayed a drastic reduction in glutathione content. Microarray analyses of ΔMS mutant highlighted an important molecular perturbation since 507 to 1565 genes were differentially expressed in ΔMS mutant compared to the wild type strain depending on our experimental conditions (from starvation to excess of methionine). Our analyses focused on different metabolic pathways: folate metabolism, amino acid biosynthesis and iron homeostasis which were subject to molecular and biochemical validations. Microarray analyses of ΔMgMetR mutant confirmed the transcriptional control of the expression of the genes involved in sulphate acquisition and assimilation. The set of results obtained during this work gets insight into new metabolic interplays between methionine biosynthesis and M. grisea general metabolism and reveals new research areas for antifungal molecules with the aim of crop protection.