Sabe-se que a hemoglobina é uma rica fonte de peptídeos antimicrobianos (hemocidinas). A primeira hemocidina derivada da hemoglobina bovina caracterizada em carrapatos foi o peptídeo Hb33-61, que é ativo contra bactérias gram-positivas e fungos. Acredita-se que tais hemocidinas sejam geradas proteoliticamente no intestino do carrapato. Neste trabalho nós caracterizamos bioquimicamente uma catepsina D, designada BmAP. A análise da expressão gênica por qPCR mostrou que ela é expressa predominantemente no intestino. Através de LC-MS/MS, determinamos a especificidade de clivagem da BmAP utilizando Hb bovina, e verificamos que resíduos hidrofóbicos foram preferencialmente clivados nos subsítios P1 e P1. Também investigamos a especificidade de clivagem da catepsina L intestinal BmCL1, utilizando uma biblioteca combinatória de tetrapeptídeos e através de hemoglobinólise in vitro. A BmCL1 preferiu resíduos alifáticos no P2 e polares no P1 e P1. Além disso, hidrolisou a cadeia da Hb bovina entre A63/A64, gerando peptídeos com estrutura primária similar ao Hb 33-61. A hemoglobinólise com a BmAP e/ou BmCL1 resultou na formação de algumas hemocidinas, corroborando a hipótese do seu envolvimento na geração endógena de peptídeos antimicrobianos. / It is known that hemoglobin is a rich source of antimicrobial peptides (hemocidins). The first hemoglobin-derived hemocidin characterized in ticks was the peptide Hb33-61, which is active against Gram-positive bacteria and fungi. It is believed that hemocidins are endogenously generated in the tick gut. In this work we biochemically characterized a cathepsin D, designated BmAP. Expression analysis by qRT-PCR showed that it is expressed predominantly in the gut. Through LC-MS/MS, we determined the cleavage specificity of BmAP using bovine hemoglobin, and we verified that hydrophobic residues were preferentially cleaved at the subsites P1 and P1. We also investigated the cleavage specificity of the intestinal cathepsin L BmCL1, using a positional scanning synthetic combinatorial library and through in vitro hemoglobinolysis. BmCL1 preferred aliphatic residues at P2 and polar residues at P1 and P1. Also, it hydrolysed the subunit of bovine hemoglobin at A63/A64, generating peptides with a primary structure similar to Hb 33-61. Hemoglobinolysis with BmAP and/or BmCL1 resulted in the formation of some hemocidins, corroborating the hypothesis that these proteinases are involved in the endogenous generation of antimicrobial peptides

Doenças causadas por agentes infecciosos e parasitários são chamadas negligenciadas por não despertarem interesse das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. Essas doenças são responsáveis por levar milhões de pessoas à morte todos os anos e afetam principalmente os países pobres e em desenvolvimento. Dentre estas, a doença de Chagas e as leishmanioses, parasitoses causadas por parasitas flagelados pertencentes à família Trypanosomatidae, T. cruzi e Leishmaina sp., respectivamente, se apresentam como um sério problema de saúde pública mundial. Endêmicas em vários países e causando milhões de mortes anualmente, ainda hoje não existem fármacos eficientes e seguros para o tratamento dessas doenças. Este panorama torna eminente a necessidade de pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos para essas parasitoses. A busca por agentes quimioterápicos envolve a seleção de vias metabólicas essenciais à sobrevivência dos parasitas. Dentre estas, destacamse cisteíno-proteases presentes nesses tripanossomatídeos, deste modo a cruzaína no T. cruzi, e a CPB2.8 na Leishmania mexicana, se mostram como alvos bioquímicos promissores. A disponibilidade de estruturas cristalográficas da cruzaína e do sequenciamento genômico da CPB2.8, nos permite utilizar estratégias de planejamento de fármacos baseado no receptor (SBDD) na identificação de candidatos a fármacos para essas doenças. Entre as técnicas modernas de SBDD utilizadas, a triagem virtual possibilita identificar promissores candidatos a novos fármacos. Assim neste trabalho, obteve-se por meio da técnica de modelagem comparativa o modelo da enzima CPB2.8 de L. mexicana, visto a indisponibilidade da estrutura cristalográfica no Protein Data Bank (PDB). De modo a refinar o modelo construído realizou-se a simulação por dinâmica molecular de 100ns, apresentando estabilização a partir de 80ns. A simulação por dinâmica molecular foi validada por meio do gráfico de Ramachandran, gráfico de raio de giro, RMSD, gráfico de superfície hidrofóbica. Foram calculados os mapas de interação molecular no programa GRID das seguintes proteínas: cruzaína, CPB2.8, catepsina B e catepsina L, e, posteriormente, foi construído um modelo farmacofórico baseado no sítio ativo das enzimas cruzaína e CPB2.8. O modelo farmacofórico da cruzaína foi validado por curva ROC apresentando valor de AUC 61%. A triagem virtual foi realizada para ambas as proteínas e foram obtidos 369 compostos para a cuzaína e 225 compostos para a CPB2.8. Foi realizado o ancoramento molecular desses compostos obtidos pela triagem virtual a fim de diminuir a quantidade de compostos a serem avaliados experimentalmente. / Neglected diseases are caused by parasites and infectious agents and affect mainly people in poor areas being prevalent in 149 countries and causing 534,000 deaths per year. Among neglected diseases we can highlight Chagas Disease and Leishmaniasis, both have a high rate of morbidity and mortality and both are addressed in this project in the search of new drugs against a NTD. Nowadays, the search for new drugs involves the selection of biological pathways essential for parasite survival, in this class of parasites we can suggest the cysteine proteases, a proteases family present in Trypanosoma cruzi and and Leishmania ssp. In order to obtain a new agent against Neglected Disease in this work was obtained the model of the enzyme CPB2.8 of L. mexicana using the comparative modeling technique, due to the unavailability of the crystallographic structure in the Protein Data Bank (PDB). In order to refine the constructed model was performed the molecular dynamics simulation of 100ns, stabilization was achieved from 80ns. Molecular dynamics simulation was validated using the Ramachandran graph, radius of rotation graph, RMSD, hydrophobic surface area graph. The molecular interaction fields were calculated in the GRID program to cruzain, CPB2.8, cathepsin B and cathepsin L. Based on molecular interaction fields generated pharmacophoric models were constructed using information about the active site of the enzymes cruzain and CPB2.8. The pharmacophoric model of cruzain was validated by ROC curve presenting AUC value of 61%. Virtual screening was performed for both proteins and 369 compounds were obtained for cuzain and 225 compounds for CPB2.8. Docking studies of these compounds was performed in order to decrease the amount of compounds to be evaluated experimentally.

O presente trabalho dedica-se à síntese de compostos hipervalentes de telúrio e sua aplicação como sondas fluorescentes, assim como sua atividade biológica como agentes neuroprotetores. Para tanto, utilizamos derivados do núcleo cumarínico, alquinos e reagentes hipervalentes de telúrio nos processos sintéticos, os quais foram estrategicamente modificados para interagir de forma seletiva à analitos de interesse. Devido aos diferentes estudos e aplicações, essa tese foi dividida em 4 capítulos. No primeiro capítulo iremos abordar a síntese dos compostos hipervalentes de telúrio através de metodologias convencionais e também por processos ambientalmente amigáveis, como processos sintéticos assistidos por microondas. No capítulo seguinte, trataremos da síntese de uma nova sonda fluorescente baseada em organoteluranas a qual é capaz de detectar cisteína dentre uma mistura complexa de aminoácidos. Além disso, por meio de estudo in sílico, em conjunto com os estudos experimentais, proporemos um novo mecanismo para a reação entre organoteluranas e tióis. Além do mais, iremos abordar a Selenoe Teluro-funcionalização de núcleos cumarínicos, que foram aplicados como sondas fluorescentes frente a espécies oxidantes endógenas. No terceiro capítulo iremos apresentar os resultados obtidos no estudo de estabilidade dos compostos de telúrio (IV) em sistemas aquosos, os quais foram monitorados por espectrometria de massas e por ressonância magnética nuclear. No último capítulo, iremos discutir sobre os estudos in vitro e in vivo envolvendo organoteluranas como agentes terapêuticos em casos de epilepsia induzida por pilocarpina. De maneira geral, o trabalho apresentado nesta tese consiste em um conjunto de estudos integrando as áreas sintética, analítica, biológica, fotofísica e computacional, que levaram à compreensão de mecanismos ainda obscuros, como as reações entre organoteluranas e tióis, bem como o entendimento da atividade desses compostos em sistemas neurológicos. / The present work is dedicated to the synthesis of hypervalent compounds of tellurium and their application as fluorescent probes, as well as their biological activity as neuroprotective agents. For this end, we used coumarin nucleus derivatives, alkynes and hypervalent tellurium reagents in the synthetic processes, which were strategically modified to selectively interact with analytes of interest. Due to different studies and applications, the thesis was divided into 4 chapters. In the first chapter we will present the synthesis of hypervalent tellurium compounds through conventional methodologies and also by environmentally friendly processes, such as microwave-assisted processes. The next chapter, will deal with the synthesis of a new fluorescence probe based on organotelluranes capable of detecting cysteine from a complex mixture of amino acids. Furthermore, by means of in silico studies and experimental results we propose a new mechanism for the reaction between organotelluranes and thiols. In addition, we will describe the seleno- and telluro-functionalization of coumarin nuclei, which were applied as fluorescent probes against endogenous oxidant species. In the third chapter, we will present the results obtained from the stability study of the Te (IV) compounds in aqueous systems monitored by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. In the last chapter, we will discuss the in vitro and in vivo studies involving organotelluranes as therapeutic agents in cases of pilocarpine-induced epilepsy. In general, the work presented in this thesis consists in a set of studies integrating the synthetic, analytical, biological, photophysical and computational areas that led to a better understanding of the still obscure mechanisms of organotellurane reactions, such as the ones involving thiols, as well as the study of the activity of these compounds in neurological systems.

Doenças causadas por agentes infecciosos e parasitários são chamadas negligenciadas por não despertarem interesse das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. Essas doenças são responsáveis por levar milhões de pessoas à morte todos os anos e afetam principalmente os países pobres e em desenvolvimento. Dentre estas, a doença de Chagas e as leishmanioses, parasitoses causadas por parasitas flagelados pertencentes à família Trypanosomatidae, T. cruzi e Leishmaina sp., respectivamente, se apresentam como um sério problema de saúde pública mundial. Endêmicas em vários países e causando milhões de mortes anualmente, ainda hoje não existem fármacos eficientes e seguros para o tratamento dessas doenças. Este panorama torna eminente a necessidade de pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos para essas parasitoses. A busca por agentes quimioterápicos envolve a seleção de vias metabólicas essenciais à sobrevivência dos parasitas. Dentre estas, destacamse cisteíno-proteases presentes nesses tripanossomatídeos, deste modo a cruzaína no T. cruzi, e a CPB2.8 na Leishmania mexicana, se mostram como alvos bioquímicos promissores. A disponibilidade de estruturas cristalográficas da cruzaína e do sequenciamento genômico da CPB2.8, nos permite utilizar estratégias de planejamento de fármacos baseado no receptor (SBDD) na identificação de candidatos a fármacos para essas doenças. Entre as técnicas modernas de SBDD utilizadas, a triagem virtual possibilita identificar promissores candidatos a novos fármacos. Assim neste trabalho, obteve-se por meio da técnica de modelagem comparativa o modelo da enzima CPB2.8 de L. mexicana, visto a indisponibilidade da estrutura cristalográfica no Protein Data Bank (PDB). De modo a refinar o modelo construído realizou-se a simulação por dinâmica molecular de 100ns, apresentando estabilização a partir de 80ns. A simulação por dinâmica molecular foi validada por meio do gráfico de Ramachandran, gráfico de raio de giro, RMSD, gráfico de superfície hidrofóbica. Foram calculados os mapas de interação molecular no programa GRID das seguintes proteínas: cruzaína, CPB2.8, catepsina B e catepsina L, e, posteriormente, foi construído um modelo farmacofórico baseado no sítio ativo das enzimas cruzaína e CPB2.8. O modelo farmacofórico da cruzaína foi validado por curva ROC apresentando valor de AUC 61%. A triagem virtual foi realizada para ambas as proteínas e foram obtidos 369 compostos para a cuzaína e 225 compostos para a CPB2.8. Foi realizado o ancoramento molecular desses compostos obtidos pela triagem virtual a fim de diminuir a quantidade de compostos a serem avaliados experimentalmente. / Neglected diseases are caused by parasites and infectious agents and affect mainly people in poor areas being prevalent in 149 countries and causing 534,000 deaths per year. Among neglected diseases we can highlight Chagas Disease and Leishmaniasis, both have a high rate of morbidity and mortality and both are addressed in this project in the search of new drugs against a NTD. Nowadays, the search for new drugs involves the selection of biological pathways essential for parasite survival, in this class of parasites we can suggest the cysteine proteases, a proteases family present in Trypanosoma cruzi and and Leishmania ssp. In order to obtain a new agent against Neglected Disease in this work was obtained the model of the enzyme CPB2.8 of L. mexicana using the comparative modeling technique, due to the unavailability of the crystallographic structure in the Protein Data Bank (PDB). In order to refine the constructed model was performed the molecular dynamics simulation of 100ns, stabilization was achieved from 80ns. Molecular dynamics simulation was validated using the Ramachandran graph, radius of rotation graph, RMSD, hydrophobic surface area graph. The molecular interaction fields were calculated in the GRID program to cruzain, CPB2.8, cathepsin B and cathepsin L. Based on molecular interaction fields generated pharmacophoric models were constructed using information about the active site of the enzymes cruzain and CPB2.8. The pharmacophoric model of cruzain was validated by ROC curve presenting AUC value of 61%. Virtual screening was performed for both proteins and 369 compounds were obtained for cuzain and 225 compounds for CPB2.8. Docking studies of these compounds was performed in order to decrease the amount of compounds to be evaluated experimentally.

Clostridium difficile est une bactérie pathogène responsable de diarrhées nosocomiales et de la plupart des colites pseudomembraneuses. Le principal facteur de risque est la prise d’antibiotiques qui altère la composition du microbiote intestinal, et favorise ainsi l’implantation de la bactérie au niveau colique. Après une étape de colonisation, la bactérie produit ses principaux facteurs de virulence, les toxines A et B. La colonisation est un processus multifactoriel, qui met en jeu différentes protéines de surface dont des adhésines et une cystéine protéase Cwp84.Dans une première partie, nous avons analysé le processus de maturation de la protéase Cwp84, ainsi que sa localisation dans la bactérie, afin de mieux comprendre son rôle dans la virulence de C. difficile. La protéase recombinante, purifiée sous forme de zymogène, présente un processus de maturation particulier comprenant des clivages successifs, qui aboutissent à la forme mature de 47 KDa. La protéase ainsi activée présente une activité protéolytique sur la fibronectine. Dans la bactérie, Cwp84 existe sous deux formes majoritaires, associées à la surface de la bactérie : une première forme, d’environ 80 KDa, associée aux protéines de la couche S, dont le rôle serait de cliver le précurseur des protéines de la couche S en deux protéines matures ; une deuxième forme, d’environ 50 KDa correspondant vraisemblablement à la forme mature de la protéase recombinante de 47 KDa, est retrouvée à la fois dans la fraction extracellulaire et associée à la surface de la bactérie. Nous avons montré que la protéase rélarguée est capable de se ré-associer sous sa forme mature de manière spécifique à la surface de C. difficile. Dans une deuxième partie, nous avons analysé l’impact de conditions environnementales mimant celles rencontrées par la bactérie au cours de son transit dans le tractus digestif de l’hôte, sur la modulation de facteurs de colonisation, dont la protéase. Nous avons montré qu’un pH acide favorise à la fois l’expression et le processus de maturation de la protéase vers sa forme mature de 47 KDa. Des analyses protéomiques et transcriptomiques ont montré que d’autres protéines impliquées dans colonisation sont surexprimées dans un milieu avec glucose, cette régulation étant vraisemblablement liée à la diminution du pH résultant de la fermentation du glucose plutôt qu’à un effet direct de ce sucre. Cette régulation des facteurs de virulence par le pH acide est probablement un élément favorable au processus de colonisation de l’hôte. Ces différentes analyses ont également permis l’identification de facteurs de virulence potentiels, qui devront être caractérisés par la suite. / Clostridium difficile, a gram-positive spore-forming, anaerobic bacterium, is the etiological agent of pseudomembranous colitis and of many cases of nosocomial diarrhea. The main risk factor is the use of antibiotics that alters the intestinal microbiota, predisposing to C. difficile intestinal colonization. C. difficile pathogenicity is mediated mainly by its A and B toxins, secreted after host colonization that involves various surface proteins, including different adhesins and proteolytic enzymes as the cysteine protease Cwp84.We sought to analyze the localization and the maturation process of the proteaseCwp84. We showed that the recombinant protein Cwp8430-803, purified as zymogen form, presents a particular maturation process including consecutive cleavages, leading to the mature form of 47 kDa. This protease has a proteolytic activity against the fibronectin. Two identifiable forms of the protease were found to be associated in the bacteria: a form of about 80 kDa and a cleaved one of 47 kDa, identified as the mature protease. They were found mainly in the bacterial cell surface fractions, and weakly in the extracellular fraction. The 80 kDa protein was non covalently associated to the S-layer proteins, while the 47 kDa form was found to be tightly associated with the underlying cell wall. Our data supported that the anchoring of the Cwp84 47 kDa form is presumably due to a re-association of the secreted protein.We also studied the regulation of virulence factors depending of environmental conditions that mimic those encountered by the bacterium in the digestive tract. We showed that an acidic pH affects the expression and the proteolytic process of Cwp84. The mature form was only recovered with an acidic pH. Proteomic and transcriptomic analysis of some surface proteins involved in colonization revealed that their expression was increased in media containing glucose. However, this regulation is probably related to the decrease in pH resulting from fermentation of glucose, rather than a direct effect of glucose. The acidic pH could lead in vivo to modulation of virulence factors expression and is probably a favorable feature in the colonisation process. We also identified new surface associated-proteins, that could represent potential virulence factors; they will be characterized later.

Arroz e feijão são alimentos comuns em uma refeição típica brasileira, oferecendo grande variedade de nutrientes. São fontes de minerais, como o ferro e zinco, que são essenciais ao bom funcionamento do organismo. O ferro participa de importantes processos metabólicos de transporte e é componente de muitas proteínas. O zinco, por sua vez, é constituinte essencial para a atividade de muitas enzimas. A deficiência destes minerais pode levar a uma série de doenças e ao impedimento do funcionamento normal do organismo. Sabe-se que o ferro não heme, oriundo dos vegetais, possui menor absorção do que o ferro heme, de origem animal, assim como o zinco vegetal, que acaba sofrendo interferência de inibidores, naturalmente presentes em vegetais. Os inibidores mais comuns em arroz e feijão são os polifenóis, com maior abrangência dos taninos, e o ácido fítico conhecido por seu efeito quelante. Promover estratégias que visem aumentar a absorção de nutrientes são interessantes, visto que eles podem ser reduzidos pelos inibidores. Neste estudo, foram elaborados quatro tratamentos, sendo que todos continham arroz e feijão e variaram entre si quanto à promotores adicionados à esta mistura. Ácido ascórbico e aminoácidos sulfurados, como a cisteína foram os escolhidos para este estudo para verificar a promoção de ferro e zinco. Para simular uma realidade nutricional, como fonte de ácido ascórbico foi escolhido o tomate, e, como fonte de aminoácidos sulfurados foram escolhidos o alho e a cebola. O objetivo foi avaliar a bioacessibilidade do ferro e zinco em arroz e feijão, bem como analisar a influência de promotores e inibidores na absorção destes micronutrientes. A bioacessibilidade foi determinada pela utilização de células caco-2, que é um método validado tanto para ferro como para zinco, e o teor de ferritina e zinco foram usados como indicadores de bioacessibilidade. Como resultado, observou-se que tanto a cisteína como o ácido ascórbico estiveram associados com o aumento na absorção de ferro, porém tal efeito só foi significativo quando permaneceram juntos no mesmo tratamento. Em relação aos inibidores, somente o ácido fítico influenciou a bioacessibilidade de ferro, enquanto que para taninos não foi observada influência. A ação dos promotores e inibidores não teve relação significativa para zinco. / Rice and beans are common foods in a typical Brazilian meal, offering great variety of nutrients. They are sources of minerals such as iron and zinc, which are essential to the proper functioning of the body. Iron participates in important metabolic processes of transport and is a component of many proteins. Zinc, in turn, is an essential constituent for the activity of many enzymes. The deficiency of these minerals can lead to several diseases and to the impediment of normal functioning of the body. It is known that non-heme iron, derived from vegetables has less absorption than heme iron, of animal origin, as well as plant zinc that ends up suffering interference from inhibitors, naturally present in vegetables. The most common inhibitors in rice and beans are polyphenols, with greater coverage of tannins and phytic acid, known for its chelating effect. Promoting strategies to increase nutrient uptake are interesting, as they can be reduced by inhibitors. In this study, four treatments were elaborated, all of which contained rice and beans and varied among them for the promoters added to this mixture. Ascorbic acid and sulfur amino acids such as cysteine were chosen for this study to verify the promotion of iron and zinc. For simulate a nutritional reality tomato was chosen as a source of ascorbic acid and garlic and onion was chosen as a source of sulfur amino acids. The objective was to evaluate the bioaccessibility of iron and zinc in rice and beans, as well as to analyze the influence of promoters and inhibitors on the absorption of these micronutrients. Bioaccessibility was determined using caco-2 cells, which is a validated method for both iron and zinc and the content of ferritin and zinc were used as indicators of bioaccessibility. As a result, both cysteine and ascorbic acid were found to be associated with increased iron absorption, but this effect was only significant when they were in the same treatment. In relation to the inhibitors, only phytic acid influenced the bioaccessibility of iron, while for tannins no influence was observed. The action of promoters and inhibitors was not significantly related to zinc.

O processo de criopreservação promove danos celulares que podem comprometer a qualidade espermática em termos de motilidade e dos índices de fertilidade, principalmente, devido ao estresse oxidativo. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de cisteína e glutamina na motilidade, morfologia, integridade da membrana, danos no DNA e índices de estresse oxidativo no sêmen de jundiá (Rhamdia quelen) pós-descongelamento. O sêmen de 5 machos (369,6 ± 71,75 g), com motilidade espermática superior a 80%, foi criopreservado em solução crioprotetora (frutose 50 g / L, leite em pó 50 g / L e metanol 100 mL / L) contendo diferentes concentrações de cisteína (0, 2,5, 5, 10 e 20 mM) e/ou glutamina (2,5 e 5,0 mM). O pool de sêmen foi diluído na proporção de 1:3, armazenado em palhetas de 0,25 mL, congelado em vapor de nitrogênio e mergulhado em nitrogênio líquido. Após o descongelamento (25°C por 10s) foram avaliados: motilidade (motilidade total, 0-100%), morfologia (Rosa de Bengala), fertilização, integridade da membrana (Eosina-Nigrosina), dano ao DNA (teste cometa), peroxidação lipídica (TBARS), atividade das enzimas SOD, CAT, GST e GPx, e a concentração de grupos carbonilas e sulfidrilas. Em relação aos parâmetros de motilidade, fertilização e morfologia espermática, nenhum tratamento apresentou diferença significativa em relação ao controle Na avaliação da integridade de membrana não foi observada diferença entre os tratamentos (P=0,7323). No ensaio do cometa e peroxidação lipídica os tratamentos que apresentaram os piores resultados foram os com maiores concentrações de cisteína e glutamina combinadas (P<0,0001) em relação ao controle. Observou-se uma maior atividade da SOD nos tratamentos 20C, 2,5G e 5G menor atividade no controle (P<0,0001). A atividade da CAT, GST e GPx foi maior no tratamento com as maiores concentrações dos antioxidantes (20C+5G; P<0,0001) e menor no controle. A concentração de grupos carbonilas foi maior no tratamento 20C+5G e menor controle (P<0,0001). Já a concentração de grupos sulfidrilas foi maior no controle e no tratamento 5C+5G (P<0,0001). Os achados deste estudo mostram que cisteína e glutamina, nas concentrações testadas, não apresentaram resultados satisfatórios e sim efeitos prejudiciais à qualidade espermática nos parâmetros de motilidade, morfologia, fertilização, peroxidação lipídica, índice de danos ao DNA e oxidação de proteínas. Portanto, as concentrações testadas não são recomendadas para a suplementação da solução crioprotetora para congelamento de sêmen de Rhamdia quelen. / The cryopreservation process promotes cellular damage that could compromise sperm quality in terms of motility and fertility rates, mainly due to oxidative stress. Thus, aim of this study was to assess the effects of different concentrations of cysteine and glutamine on post-thaw sperm motility, morphology, membrane integrity, fertility, DNA damage and indices of oxidative stress in the South American silver catfish (Rhamdia quelen). Sperm collected from five males (369.6 ± 71.75g), with sperm motility higher than 80%, was cryopreserved in cryoprotectant solution (fructose 50 g/L, powdered milk 50 g/L and methanol 100mL/L) containing different cysteine concentrations (0, 2.5, 5, 10 and 20 mM) and/or glutamine (2.5 and 5.0 mM). The semen pool was diluted 1:3, filled in 0.25 mL straws, frozen in nitrogen vapor, and plunged into liquid nitrogen. After thawing (25°C for 10 s) were measured: motility (total motile, 0-100%), morphology (Bengal Rose Staining), fertilization, membrane integrity (Eosin-Nigrosine), DNA damage (cometa assay), lipid peroxidation (TBARS), the activity of SOD, CAT, GST and GPx enzymes, and the concentration of Carbonyl and Sulfhydril groups. In relation to parameters of motility, fertilization and sperm morphology, no treatment presented a significant difference in relation to the control In the evaluation of membrane integrity, no difference was observed between treatments (P = 0.7323). In the comet and lipid peroxidation assay the treatments with the worst results were those with the highest concentrations of cysteine and glutamine combined (P <0.0001) in relation to the control. A higher activity of SOD was observed in treatments 20C, 2.5G and 5G lower activity in the control (P <0.0001). The activity of CAT, GST and GPx was higher in the treatment with the highest concentrations of antioxidants (20C + 5G; P <0.0001) and lower in the control. The concentration of carbonyl groups was higher in the 20C + 5G treatment and lower control (P <0.0001). The concentration of sulfhydryl groups was higher in control and 5C + 5G treatment (P <0.0001).The findings of this study show that cysteine and glutamine, at the concentrations tested, did not present satisfactory results, but rather, damaging effects on sperm quality in the parameters of motility, morphology, fertilization, lipid peroxidation, DNA damage and protein oxidation. Therefore, the concentrations tested are not recommended for the supplementation of the cryoprotectant solution for freezing semen of Rhamdia quelen.

Arroz e feijão são alimentos comuns em uma refeição típica brasileira, oferecendo grande variedade de nutrientes. São fontes de minerais, como o ferro e zinco, que são essenciais ao bom funcionamento do organismo. O ferro participa de importantes processos metabólicos de transporte e é componente de muitas proteínas. O zinco, por sua vez, é constituinte essencial para a atividade de muitas enzimas. A deficiência destes minerais pode levar a uma série de doenças e ao impedimento do funcionamento normal do organismo. Sabe-se que o ferro não heme, oriundo dos vegetais, possui menor absorção do que o ferro heme, de origem animal, assim como o zinco vegetal, que acaba sofrendo interferência de inibidores, naturalmente presentes em vegetais. Os inibidores mais comuns em arroz e feijão são os polifenóis, com maior abrangência dos taninos, e o ácido fítico conhecido por seu efeito quelante. Promover estratégias que visem aumentar a absorção de nutrientes são interessantes, visto que eles podem ser reduzidos pelos inibidores. Neste estudo, foram elaborados quatro tratamentos, sendo que todos continham arroz e feijão e variaram entre si quanto à promotores adicionados à esta mistura. Ácido ascórbico e aminoácidos sulfurados, como a cisteína foram os escolhidos para este estudo para verificar a promoção de ferro e zinco. Para simular uma realidade nutricional, como fonte de ácido ascórbico foi escolhido o tomate, e, como fonte de aminoácidos sulfurados foram escolhidos o alho e a cebola. O objetivo foi avaliar a bioacessibilidade do ferro e zinco em arroz e feijão, bem como analisar a influência de promotores e inibidores na absorção destes micronutrientes. A bioacessibilidade foi determinada pela utilização de células caco-2, que é um método validado tanto para ferro como para zinco, e o teor de ferritina e zinco foram usados como indicadores de bioacessibilidade. Como resultado, observou-se que tanto a cisteína como o ácido ascórbico estiveram associados com o aumento na absorção de ferro, porém tal efeito só foi significativo quando permaneceram juntos no mesmo tratamento. Em relação aos inibidores, somente o ácido fítico influenciou a bioacessibilidade de ferro, enquanto que para taninos não foi observada influência. A ação dos promotores e inibidores não teve relação significativa para zinco. / Rice and beans are common foods in a typical Brazilian meal, offering great variety of nutrients. They are sources of minerals such as iron and zinc, which are essential to the proper functioning of the body. Iron participates in important metabolic processes of transport and is a component of many proteins. Zinc, in turn, is an essential constituent for the activity of many enzymes. The deficiency of these minerals can lead to several diseases and to the impediment of normal functioning of the body. It is known that non-heme iron, derived from vegetables has less absorption than heme iron, of animal origin, as well as plant zinc that ends up suffering interference from inhibitors, naturally present in vegetables. The most common inhibitors in rice and beans are polyphenols, with greater coverage of tannins and phytic acid, known for its chelating effect. Promoting strategies to increase nutrient uptake are interesting, as they can be reduced by inhibitors. In this study, four treatments were elaborated, all of which contained rice and beans and varied among them for the promoters added to this mixture. Ascorbic acid and sulfur amino acids such as cysteine were chosen for this study to verify the promotion of iron and zinc. For simulate a nutritional reality tomato was chosen as a source of ascorbic acid and garlic and onion was chosen as a source of sulfur amino acids. The objective was to evaluate the bioaccessibility of iron and zinc in rice and beans, as well as to analyze the influence of promoters and inhibitors on the absorption of these micronutrients. Bioaccessibility was determined using caco-2 cells, which is a validated method for both iron and zinc and the content of ferritin and zinc were used as indicators of bioaccessibility. As a result, both cysteine and ascorbic acid were found to be associated with increased iron absorption, but this effect was only significant when they were in the same treatment. In relation to the inhibitors, only phytic acid influenced the bioaccessibility of iron, while for tannins no influence was observed. The action of promoters and inhibitors was not significantly related to zinc.

Guanine is generally accepted as the most easily oxidized DNA base when cells are subjected to ionizing radiation, photoionization or photosensitization. At pH 7, the midpoint reduction potential is on the order of 0.2 – 0.3 V higher than those of the radicals of e.g. tyrosine, tryptophan cysteine and histidine, so that the radical “repair” (or at least, a thermodynamically favorable reaction) involving these amino acids is feasible. Computational quantum studies have been done on tyrosine, tryptophan, cysteine and histidine side chains as they appear in histones. Density functional theory was employed using B3LYP/6-31G+ (d, p) basis set to study spin densities on these amino acids side chains as they pair with the guanine radical cation. The amino acid side chains are positioned so as not to disrupt the Watson-Crick base pairing. Our results indicate that, these side chains of amino acid with reducing properties can repair guanine radical cation through electron transfer coupled with proton transfer.

Fasciola cause considerable monetary loss in the agriculture industry, while parasitism of humans is an emerging disease. Fasciola cathepsin L-like proteases are believed to aid parasite invasion and survival through a range of functions including feeding, immune evasion and modulation, tissue migration, egg production and excystment. As such these proteases are considered good targets for chemotherapies and vaccine development. Fasciola cathepsins are evolutionarily divided into clades that reflect function and life stage of expression. Analysis of F. gigantica genomic DNA and mRNA identified novel cathepsin L-like sequences which are incorporated into a phylogenetic analysis of the complete Fasciola cathepsin L-like protease family. Analysis of mRNA transcripts isolated in this study also points to trans-splicing occurring amongst cathepsin transcripts, the first time this has been identified in Fasciola species. S2 subsite specificity is important in determining substrate interactions with cathepsin L-like proteases. Previous work has shown that amino acid substitutions at this site can dramatically influence substrate specificity. A number of substitutions, specifically those that have been observed, or predicted to occur during the evolution of Fasciola cathepsins L-like proteases, were introduced into the S2 subsite of FhCatL5 at aa69 to determine their influence. The introduction of L69C and L69S substitutions resulted in low overall activity indicating their expression provides no functional advantage, thus explaining the absence of such variants amongst fluke. The L69F variant showed an increase in the ability to cleave substrates with P2 proline, indicating F69 variants expressed by fluke are also likely to have this ability, similar to that shown with L69Y and FhCatL2. The introduction of a L69W substitution leads to increased cleavage of substrates with P2 proline, along with a decrease in cleavage of substrates with P2 phenylalanine. FgCatL1G transcripts were isolated from F. gigantica metacercariae. This contrasts with FhCatL5 and FhCatL2 which have been isolated in adult F. hepatica. These cathepsins differ at aa69, possessing tryptophan, leucine and tyrosine respectively. The processing and substrate specificities of each recombinant enzyme was analysed and compared. While FhCatL5 and FhCatL2 process in vitro in a manner similar to that reported for FhCatL1, FgCatL1G requires different processing conditions, including neutral pH. Combined with FgCatL1G possessing increased stability at acidic pH, this reflects the different environment into which FgCatL1G is expressed by immature compared to the adult flukes. The substrate specificity of FgCatL1G also differed from previously reported cathepsins, with a preference for P2 proline and low activity against substrates with P2 phenylalanine. This is the first time recombinant expression and purification of a cathepsin L-like protease specific to the immature life stages of Fasciola has been undertaken and had enzyme specificity analysed. This work has expanded knowledge of the repertoire of cathepsin proteases expressed at various life-stages of the liver fluke. Vaccination and/or drug inhibition studies may in the future be targeted towards cathepsins that are expressed in either the adult or immature stage, or perhaps both in a multi-targeted approach. The knowledge gained in this study may allow such targets to be chosen.