Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The geraniol (C10H18O) is an acyclic monoterpene alcohol, present in the essential oil of some medicinal plants, herbs and citrus fruits, especially species of the genus Cymbopogon. Were described biochemical and pharmacological properties such as anticonvulsant action, analgesic, antinflammatory, antioxidant, anticancer and antimicrobial activities. In this study we sought to characterize the effects produced by geraniol on contractility, electrical activity and its possible antiarrhythmic potential in mammalian heart. For this, we used guinea-pig (Cavia porcellus) and mice (Mus musculus) of C57Bl/6J strain. The contractile studies were performed in the left atria drawn 1GF and stimulated with pulses of suprathreshold current, maintained in Cuba for isolated organ submerged in modified Tyrode solution (8 mL) and aerated with carbogenic mixture (95% O2 and 5% CO2). The force of atrial contraction was recorded by an isometric transducer. Electrocardiographic recordings were performed on isolated heart under constant aortic perfusion flow (8 mL/min) in a Langendorff system. To study the effects of geraniol on current membrane, experiments were performed using the technique of patch-clamp in rat ventricular cardiomyocytes setup whole-cell. In the atrium, geraniol reduced the force of contraction (~ 98%, EC50 = 1510 ± 160 M) whereas nifedipine, used as positive control, showed a EC50 of 0.90 ± 0.66 M. Geraniol, at 3 mM, decreased the positive inotropism of both CaCl2 and BAY K8644. In ventricular cardiomyocytes, the ICa,L was reduced by 50.7% (n = 5, p < 0.0001) after perfusion with 300 M of geraniol. Furthermore, geraniol prolonged the action potential duration (APD) measured at 50% of repolarization (49.7%, n = 5, p < 0.05), without changing the resting potential. The increase in APD can be attributed to blockade of K+ channel transient outward (Ito) (59.7%, n = 4, p < 0.001), the K+ current non-inactivated (Iss) (39.2 %, n = 4, p < 0.05) and K+ current to inward rectifier (Ik1) (33.7%, n = 4, p < 0.0001). In isolated heart, geraniol increased PRi and QTi without affecting the QRS (n = 6) complex, and reduced both left ventricular pressure (83%) and heart rate (16.5%). Furthermore, geraniol delayed time for the start of ouabain-induced arrhythmias in 128%, preventing in 30% the increase of diastolic tension, however, without affect the positive inotropic effect induced by ouabain (n = 6). Geraniol exerts negative inotropic and chronotropic responses in the mammalian heart by decreasing the L-type Ca2+ current and prolongs the duration of ventricular action potential by reducing potassium currents voltage-dependent. Such effects may be responsible for the antiarrhythmic effect of geraniol front the arrhythmias induced by ouabain in vitro. / O geraniol (C10H18O) é um monoterpeno alcoólico acíclico, presente no óleo essencial de algumas plantas medicinais, frutas cítricas e ervas aromáticas, principalmente espécies do gênero Cymbopogon. São descritas propriedades bioquímicas e farmacológicas, tais como ação anticonvulsivante, analgésica, anti-inflamatória, antioxidante, anticancerígena e antimicrobiana. Neste trabalho buscou-se caracterizar os efeitos produzidos pelo geraniol sobre a contratilidade, atividade elétrica e seu possível potencial antiarrítmico em coração de mamífero. Para tanto, foram utilizados cobaia (Cavia porcellus) e camundongos (Mus musculus) da linhagem C57Bl/6J. Os estudos contráteis foram realizados em átrio esquerdo estirado a 1gf e estimulados com pulsos de corrente supralimiares, mantido em cuba para órgão isolado, submerso em solução de Tyrode modificada (8 mL) e aerado com mistura carbogênica (95 % O2 e 5 % CO2). A força de contração atrial foi captada por um transdutor isométrico. Os registros eletrocardiográficos foram realizados em coração isolado, sob perfusão aórtica de fluxo constante (8 mL/min), em sistema de Langendorff. Para estudar os efeitos do geraniol sobre as correntes de membrana, foram executados experimentos através da técnica de patch-clamp , na configuração whole-cell , em cardiomiócitos ventriculares de camundongo. No átrio, o geraniol reduziu a força de contração (~ 98%, EC50 = 1510 ± 160 M) enquanto que a nifedipina, usada como controle positivo, apresentou uma EC50 de 0,90 ± 0,66 M. O geraniol, na concentração de 3 mM, diminuiu o inotropismo positivo de ambos CaCl2 e BAY K8644. Em cardiomiócito ventricular, a ICa,L foi reduzida em 50,7% (n = 5, p < 0,0001), após a perfusão com 300 μM de geraniol. Além disso, o geraniol prolongou a duração do potencial de ação (DPA), medida a 50 % da repolarização (49,7%, n = 5, p < 0,05), sem alterar o potencial de repouso. O aumento da DPA pode ser atribuído ao bloqueio dos canais para K+ transient-outward (Ito) (59,7 %, n = 4, p < 0,001), canal de K+ não-inativado (Iss) (39,2 %, n = 4, p < 0,05) e do canal para K+ inward rectifier (IK1) (33,7% , n = 4, p < 0,0001). Em coração isolado (n = 6), o geraniol aumentou o PRi e QTi sem afetar a duração do complexo QRS, reduzindo a pressão ventricular esquerda (83%) e a frequência cardíaca (16,5%). Além disso, o geraniol retardou o tempo para o início das arritmias induzidas por ouabaína em 128%, evitando em 30% o aumento da tensão diastólica sem, contudo, afetar o efeito inotrópico positivo da ouabaína (n = 6). O geraniol exerce respostas inotrópicas e cronotrópicas negativas no coração de mamífero, por meio da diminuição das correntes para Ca2+ tipo-L e, prolonga a duração do potencial de ação ventricular por reduzir as correntes para K+ dependentes de voltagem. Tais efeitos podem ser responsáveis pelo efeito antiarrítmico do geraniol frente às arritmias induzidas por ouabaína in vitro .

O escorpião amarelo Tityus serrulatus (Ts) é considerado a espécie mais perigosa do Brasil, e muitas das toxinas de sua peçonha já foram isoladas e caracterizadas. No entanto, as frações XIIA e XIIB, obtidas da cromatografia de troca iônica da peçonha de Ts, possuem várias toxinas de baixa massa molecular ainda não caracterizadas. Através da combinação de técnicas de RP-FPLC em colunas C8 e C18, espectrometria de massas e/ou sequenciamento amino-terminal, foi possível isolar e identificar os componentes destas frações, bem como realizar as caracterizações estrutural, por RMN, e eletrofisiológica, por Two Microelectrode Voltage Clamp, de algumas neurotoxinas isoladas. Foram escolhidas três toxinas de interesse: Ts11, Ts9 e Ts1-G. Nossos resultados mostram que a Ts11 foi capaz de bloquear canais para potássio dependentes de voltagem (Kv): Kv1.2, Kv1.3, Kv4.2, Kv10.1, hERG, e Shaker IR, bloqueando em 25%, 27%, 25%, 15%, 12%, e 10% as correntes de potássio, respectivamente. A Ts11 possui uma estrutura única (estrutura obtida por RMN): ICK scaffold sem os elementos de estrutura secundária (alfa-hélice ou fita-beta). Esta estrutura diferenciada, somada à atividade biológica caracterizada neste estudo, evidencia uma nova subfamília de KTxs, a qual foi denominada como ?-KTx, sendo a Ts11 o primeiro membro desta subfamília: ?-KTx1.1. A caracterização funcional da Ts9 mostra que a mesma não apresenta atividade bloqueadora sobre os canais Kv testados (Kv1.1; Kv1.2; Kv1.3; Kv1.4; Kv1.5; Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv7.2; Kv10.1 hERG e Shaker IR), na concentração de 100 nM. Apesar da Ts9 não ter bloqueado os canais testados, ela apresenta estrutura e resíduoschave que sugerem sua ação em Kvs e estudo anteriormente publicado mostra que ela é um potente ligante de canais para potássio ativados por cálcio de baixa condutância (SK). Também foi conduzido um estudo comparativo entre a Ts1e sua isoforma precursora Ts1-G nos canais para sódio dependentes de voltagem Nav1.1 - 1.8 e DmNav1, a fim de analisar a importância da amidação C-terminal. A Ts1 madura possui região C-terminal amidada, enquanto que sua isoforma Ts1-G não é amidada, pois apresenta uma Gly na região Cterminal (última etapa de transformação pós-traducional, anterior a ação da enzima ?- amidante). A Ts1-G não apresentou ação nos canais (Nav) na concentração testada (100 nM), enquanto que a Ts1 (100 nM) age como ?- toxina, reduzindo o limiar de excitação dos canais Nav e/ou reduzindo as correntes de sódio, evidenciando que a amidação C-terminal é importante para a atividade biológica da toxina madura. Adicionalmente, nas análises por MALDI/TOF das frações XIIA e XIIB, foram encontrados 45 componentes cujas massas moleculares não correspondem a de toxinas já isoladas, abrindo perspectivas para a identificação de moléculas com potencial uso biotecnológico, visto que toxinas com ação em canais iônicos podem ser ferramentas valiosas para a elucidação das características farmacológicas, fisiológicas e estruturais dos seus alvos. / The yellow scorpion Tityus serrulatus (Ts) is considered the most dangerous species of Brazil, and several toxins present in its venom have been already isolated and characterized. However, fractions XIIA and XIIB obtained from ion exchange chromatography of Ts crude venom, presented many low molecular weight toxins which have not been characterized yet. Through a combination of RP-FPLC technique using C8 and C18 columns, mass spectrometry and / or amino terminal sequencing, it was possible to isolate and identify the components of these fractions, as well as perform structural characterization thru NMR and electrophysiological characterization using Two Microelectrode Voltage Clamp, of some of the neurotoxins isolated. It was choosen three toxins of interest: Ts11, Ts9 and Ts1-G. Our results show that Ts11 was able to block voltage gated potassium channels (Kv): Kv1.2, Kv1.3, Kv4.2, Kv10.1, hERG, and Shaker IR, blocking 25%, 27%, 25% 15%, 12% and 10% of the potassium currents, respectively. Ts11 has an unique structure (structure obtained thru NRM technique): ICK scaffold without the elements of secondary structure (alpha helix or beta-sheet). Additionaly, the differentiated structure and functional characterization, Ts11 shows us an evidence of a new subfamily of toxins, which was named as ?-KTX, and therefore, Ts11 is the first member of this subfamily: ?-KTx1.1. The functional characterization of Ts9 shows that it has no blocking activity on the tested Kv channels (Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4, Kv1.5, Kv1.6, Kv2.1, Kv3.1 , Kv4.2, Kv7.2, Kv10.1, hERG and Shaker IR) at a concentration of 100 nM. Despite the Ts9 have not blocked the tested channels, it presents structure and key-amino acid residues that suggest its action on Kvs and previously published study shows that it is a potent ligant for slow conductance calciumactivated potassium channels (SK). It was also conducted a comparative electrophysiological study between the Ts1and its precursor isoform Ts1-G on voltage gated sodium channels, in order to evaluate the importance of the C-terminal amidation. The mature Ts1 has amidated C-terminal region, whereas Ts1-G isoform is not amidated, and therefore has a Gly at the Cterminal region (last step of post-translational modification, before the action of the enzyme ?-amidante). The Ts1-G showed no action on Nav channels at the concentration tested (100 nM), whereas Ts1 (100 nM) acts as ?-toxin, lowering the excitation threshold of Nav channels and/or reducing sodium currents, evidencing that the C-terminal amidation is important for the biological activity of the mature toxin. Additionally, the analyses by MALDI/TOF of the fractions XIIA and XIIB showed several molecules whose molar masses do not match the toxins already identified, opening prospects for the identification of new molecules with potential biotechnological use, considering that toxins that act on ion channels can be valuable tools for the elucidation of pharmacological, physiological and structural characteristics of their targets.

Orientador: Nailton Monteiro do Nascimento Júnior / Banca: Cintia Duarte de Freitas Milagre / Banca: Natanael Dante Segretti / Resumo: Os nAChRs (receptores nicotínicos de acetilcolina) são canais iônicos pentaméricos que respondem ao neurotransmissor endógeno acetilcolina, com os subtipos α4β2 e α7 sendo expressos em grandes quantidades no cérebro humano. Esses receptores estão envolvidos em desordens neurológicas como a doença de Alzheimer, esquizofrenia, dor crônica e autismo, bem como no vício em nicotina. Neste contexto, o SBDD (structure-based drug design) é uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento de novos candidatos à fármacos visando estes receptores. Neste trabalho, aplicou-se a metodologia dbCICA (docking-based comparative intermolecular contacts analysis) para a identificação das condições de ancoragem molecular ótimas para estes dois receptores. Em resumo, compostos bioativos atuando em cada um dos dois receptores foram coletados da literatura científica e ancorados nos receptores α4β2 e α7, explorando diferentes condições de ancoragem. Em seguida, os resultados foram pós-processados através da metodologia dbCICA, uma abordagem baseada em algoritmo genético, visando a identificação de contatos críticos para o reconhecimento molecular entre os ligantes ancorados e os resíduos do sítio ativo. Através dessa análise, foi possível determinar as condições ótimas de ancoragem para ambos os receptores trabalhados. Os contatos críticos identificados através do dbCICA estão em acordo com relatos da literatura sobre interações críticas dessa classe de receptores. As condições ideais de ancoragem para... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The nAChRs (nicotinic acetylcholine receptors) are pentameric ligand-gated ionic channels that respond to the endogenous neurotransmitter acetylcholine, with the α4β2 and α7 subtypes highly expressed in human brain. Those receptors are involved in many neurologic disorders such as Alzheimer's disease, Schizophrenia, chronic pain, autism, as well as in nicotine addiction. In this context, SBDD (structure-based drug design) is a powerful tool for designing novel drug candidates targeting those receptors. In this work, we applied dbCICA (docking-based comparative intermolecular contacts analysis) to identify optimal docking conditions for these two receptors. Briefly, bioactive compounds acting on each receptor were gathered from the scientific literature and docked into the binding sites of the α4β2 and α7, exploring different docking conditions. Then, the results were post-processed through dbCICA, a genetic algorithm based approach, aiming to identify critical contacts for molecular recognition involving the docked ligands and binding site residues. Through this analysis it was possible to determine the optimal docking conditions for both receptors. The critical contacts identified by dbCICA are in agreement with the literature about critical interactions from this class of receptors. The optimal docking conditions for receptor α4β2 were used to select 8 from 116 novel molecular fragments with potential biological activity towards this subtype, to be synthesized in future ste... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Fosfolipases A2 miotóxicas (Lys49, enzimaticamente inativa, e Asp49, com atividade) isoladas do veneno de Bothrops asper, induzem hipernocicepção. Assim, avaliamos os mecanismos estruturais, moleculares e mediadores centrais envolvidos neste efeito. A injeção intraplantar das FLA2s acarretou hiperalgesia, enquanto que apenas a FLA2-Asp49 induziu alodinia. A região C-terminal é a responsável pelo efeito da FLA2-Lys49, enquanto que a atividade catalítica da FLA2-Asp49 parece ser responsável pela indução de hipernocicepção. Canais de Ca2+ e Na+ participam deste efeito. Na medula espinhal, receptores NK1 e para CGRP, receptores ionotrópicos para glutamato, NO, IL-1, prostanóides e adenosina participam da hiperalgesia induzida pelas FLA2s. Adicionalmente, receptores metabotrópicos para glutamato e o TNF?, estão envolvidos na hiperalgesia induzida pela FLA2-Asp49. Receptores NK1 e NK2 e para CGRP, receptores para glutamato, TNF? e prostanóides medeiam a alodinia. A ativação de astrócitos e microglia, na medula espinhal, contribui para a gênese do efeito hipernociceptivo. / Phospholipase A2 (Lys49, catalytically-inactive and Asp49, catalytically active), isolated from Bothrops asper snake venom, induce pain. The present studies examined the molecular, structural and central mechanisms involved in hypernociception induced by both PLA2s. These PLA2s induced mechanical hyperalgesia, whereas only PLA2-Lys49 evoked allodynia. The C-terminal region of the PLA2-Lys49 seems to be responsible for hyperalgesia, whereas the enzymatic activity of PLA2-Asp49 contributes to such an effect. Calcium and sodium channels are involved in PLA2s-induced hyperalgesia. In the spinal cord, NK1 and CGRP receptors, glutamate ionotropic receptors, NO, IL-1, prostanoids and adenosine contribute to hyperalgesia caused by PLA2s. Additionally, metabotropic glutamate receptors and TNF are involved in hyperalgesia induced by PLA2-Asp49. NK1, NK2 and CGRP receptors, glutamate receptors, TNF and prostanoids mediate allodynia. Activation of spinal astrocytes and microglia contribute to the generation of hyperalgesia and allodynia induced by both toxins.

Neste trabalho desenvolvemos e exploramos modelos markovianos aplicados a canais iônicos presentes em membranas celulares / In this work we made markovian models for simulate the ionic channels activity in cell membranes

A ocorrência de status epileticus (SE) desencadeia algumas alterações no sistema nervoso central. O giro denteado (GD) do hipocampo sofre com modificações na expressão gênica dos canais iônicos das células granulares (CGs) e essas células sofrem alterações morfológicas. Essas alterações se manifestam com o brotamento de fibras musgosas, redução no número de espinhas dendríticas, encurtamento e estreitamento da arborização dendrítica. As modificações na expressão gênica dos canais iônicos afetam suas densidades máximas de condutância. Este estudo utilizou 40 modelos computacionais realistas para simular alterações nas condutâncias de canais iônicos e seus efeitos sobre dois grupos de CGs do GD. Os modelos foram construídos com base em reconstruções tridimensionais de 20 CGS com morfologia alterada após SE induzido por pilocarpina (CG-PILO) e 20 de morfologia normal (CG-controle). Foram dotados dos canais iônicos de sódio rápido (Na), canal de potássio de retificação tardia rápido (fKdr), canal de potássio de retificação tardia lento (fKdr), canal de potássio de tipo A (KA), canal de potássio dependente de cálcio e de voltagem de alta condutância (BK), canal de potássio dependente de cálcio de baixa condutância (SK) e canais de cálcio dos tipos T, N e L. As simulações foram realizadas no software Neuron. Foram realizados test t para detectar se ocorre diferenças significativas entre os grupos CG-controle e CG-PILO As alterações nas densidades máximas de condutância provocaram mudanças nos parâmetros de excitabilidade dos grupos CG-PILO e CG- controle, alterando valores de frequência de disparos, reobase e cronaxia. Os grupos apresentam respostas significativamente diferentes para as médias de reobase para a maioria dos valores de densidade máxima de condutância,, porém para cronaxia a maioria dos grupo não apresentou diferenças significativas. O grupo CG-controle apresentou médias maiores de frequência de disparos que o CG-PILO e o grupo CG-PILO apresentou valores de reobase maior para as alterações de densidade de condutância da maioria dos canais, sendo essas diferenças significativas. / The occurrence of status epilepticus (SE) triggers some changes in the central nervous system. The dentate gyrus (DG) of the hippocampus suffers from changes in gene expression of ion channels of granule cells (GCs) and these cells undergo morphological changes. These changes manifest themselves with mossy fiber sprouting, reduction in the number of dendritic spines, shortening and narrowing of dendritic branching. Changes in gene expression of ion channels affect their maximum densities of conductance. This study used 40 realistic computer models to simulate changes in conductance of ion channels and its effect on two groups of CGs of the GD. The models were built based on three-dimensional reconstructions of 20 CGS with morphology changed after pilocarpine-induced SE (CG-PILO) and 20 normal morphology (CG-control). The models were equipped with the ion channels of fast sodium (Na), fast delayed rectifying potassium channel (fKDR), slow delayed rectifying potassium channel (fKdr), potassium channel type A (KA), potassium channel dependent calcium and high voltage conductance (BK), potassium channel dependent calcium low conductance (SK) and the calcium channel types T, N and L. The simulations were performed at Neuron software.T tests were performed to p-values <0.05 for detecting significant differences between the GC-control group and GC-PILO. Changes in maximum densities conductance caused changes in excitability parameters CG-PILO and GC- control groups, by changing frequency values of spikes, rheobase and chronaxie. The groups have significantly different responses to the averages for the most rheobase maximum density values of conductance, but these differences were shortly found for chronaxie values. The CG-control group had higher average frequency of spikes than the CG-PILO group. The CG-PILO group had rheobase values higher for conductance density changes the most channels. These differences are significant.

Introdução: O hiperaldosteronismo primário (HP) é a causa mais comum de hipertensão arterial sistêmica (HAS) secundária, com prevalência de até 21% em pacientes com HAS resistente. Na última década, foram feitos consideráveis avanços na compreensão da patogênese do HP. Variantes patogênicas somáticas nos genes de canais iônicos KCNJ5, CACNA1D, ATP1A1 e ATP2B3, envolvidos na manutenção da homeostase iônica intracelular, foram descritas em 38%, 9,3%, 5,3% e 1,7% dos tumores, respectivamente. Variantes patogênicas somáticas no gene CTNNB1, fundamental para o desenvolvimento do córtex da suprarrenal, foram também identificadas em aproximadamente 5% dos aldosteronomas. Mais recentemente, uma variante germinativa no gene CACNA1H, que codifica a subunidade Alfa1H do canal de cálcio Cav 3.2, foi identificada em um paciente com aldosteronoma. Objetivos: O objetivo geral desse projeto foi investigar as bases genéticas do HP causado por aldosteronoma. Os objetivos específicos foram: 1) Investigar variantes patogênicas somáticas nos genes KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 em aldosteronomas de indivíduos com HP; 2) Sequenciar o exoma (pareado sangue e tumor) dos casos de HP causados por aldosteronoma, negativos para variantes nos genes citados acima; 3) Correlacionar o genótipo com os parâmetros clínicos e hormonais dos pacientes com aldosteronomas. Métodos: As regiões hot-spot dos genes KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 foram sequenciadas por Sanger em 62 tumores [56% mulheres; mediana de idade ao diagnóstico 50 anos (variação, 20 a 68)]. Pacientes sem variantes patogênicas somáticas nos genes descritos acima foram submetidos a genotipagem do exoma (pareado sangue e tecido) por sequenciamento paralelo em larga escala (HiSeq 2500, Illumina). Variantes germinativas raras (MAF < 0,01% no 1000 genomes, ExAC, gnomAD e AbraOM) em genes codificadores de canais iônicos ou associados a hiperplasia adrenal foram selecionadas para segregação familial. Resultados: Variantes patogênicas somáticas em heterozigose foram encontradas em 34 de 62 (54,8%) aldosteronomas. As variantes identificadas nos genes KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 eram previamente conhecidas. Variantes patogênicas no KCNJ5 foram detectadas em 28 de 62 (45,2%) aldosteronomas. Duas variantes recorrentes foram encontradas: p.Gly151Arg em 13 de 28 (46%) e p.Leu168Arg em 14 de 28 (50%) tumores. A variante patogênica p.Glu145Gln do KCNJ5 foi identificada em um (4%) aldosteronoma. Adicionalmente, a variante patogênica p.Leu104Arg do ATP1A1 foi detectada em 2 (3,2%) aldosteronomas; a variante patogênica p.Leu425_Val426del do ATP2B3 em um (1,6%) caso e a variante patogênica p.Ser45Pro do CTNNB1 em 2 (3,2%) aldosteronomas. Uma nova variante p.Leu276Pro somática em heterozigose no CACNA1D foi identificada em um aldosteronoma no exoma e classificada como provavelmente patogênica. Aldosteronomas com variantes patogênicas no KCNJ5 foram diagnosticados mais frequentemente em mulheres (p= 0,047) e em idades mais jovens (p= 0,002) quando comparado com tumores sem variantes no KCNJ5. O tamanho do nódulo foi maior em aldosteronomas com variantes patogênicas no KCNJ5 (p= 0,0001). O percentual de pacientes com tempo de HAS < 5 anos foi similar nos dois grupos. A remissão pós-operatória da HAS foi observada em 50% dos pacientes com tumor contendo variante patogênica no KCNJ5, enquanto apenas 15% dos pacientes com tumor sem variante no KCNJ5 tiveram remissão da HAS (p= 0,003). Na análise multivariada, somente a presença de variante patogênica somática no KCNJ5 foi um preditor independente de remissão da HAS (p= 0,03). Após filtragem das variantes encontradas no sequenciamento exômico, quatro variantes germinativas missense em heterozigose foram consideradas deletérias em mais de 3 algoritmos de predição in silico: 1) uma nova variante (p.Pro559Thr) no gene CACNA1H, já associado ao fenótipo de HP; 2) a variante p.Arg178Cys no gene CACNA1I, que codifica a subunidade Alfa 1I do canal Cav 3.3; 3) a variante p.Glu52Ala no gene ATP13A3, que codifica uma proteína transmembrana da família de proteínas ATPase do tipo P; 4) a variante p.Tyr507Ser no gene KCNC4, que codifica o canal de potássio Kv 3.4. Conclusão: Foi caracterizado o espectro de variantes patogênicas somáticas em uma coorte brasileira de tumores corticais adrenais produtores de aldosterona, bem como o impacto das variantes no KCNJ5 na predição de remissão da HAS após adrenalectomia. Além disso, foram identificados novos genes candidatos provavelmente relacionados a patogênese do HP causado por aldosteronomas / Introduction: Primary aldosteronism (PA) is the most common form of secondary hypertension (HT), with a prevalence of approximately 20% in patients with resistant hypertension. In the last decade, somatic mutations in KCNJ5, CACNA1D, ATP1A1 and ATP2B3 genes, which are involved in maintaining intracellular ionic homeostasis and cell membrane potential, were described in 38%, 9.3%, 5.3% and 1.7% of aldosterone-producing adenomas (APAs), respectively. All these mutations lead to the activation of calcium signaling, the major trigger for aldosterone production. Additionally, somatic activating mutations in exon 3 of CTNNB1 gene, which is involved in the adrenocortical development, were identified in approximately 5% of APAs. More recently, the germline p.V1951G CACNA1H variant was described in a PA patient with an APA. Aims: To investigate the genetics of APAs. The specific aims of this study were: 1) To investigate somatic variants in KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 and CTNNB1 genes in APAs from PA patients; 2) To perform exome sequencing of PA patients caused by APAs without mutations in those genes already associated with PA; 3) To correlate genetic findings and clinical parameters. Methods: Hot-spot regions of KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 genes were sequenced by Sanger in 62 APAs [56% women; median of age at diagnosis 50 yrs (range, 20 to 68)]. We performed whole exome sequencing (HiSeq 2500, Illumina) in paired blood and tumor DNA samples from 10 unrelated subjects with PA caused by APAs without somatic mutations in hot-spot regions of KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 and CTNNB1.We searched for rare germline coding variants (MAF < 0.01% in 1000 genomes, ExAC, gnomAD and AbraOM) in ionchannel genes, which are expressed in normal adrenal tissue, or in genes previously related to adrenal hyperplasia. Results: Pathogenic somatic heterozygous variants were identified in 34 out of 62 (54.8%) APAs. KCNJ5 pathogenic variants were detected in 28 out of 62 (45.2%) APAs. Two recurrent variants were found in KCNJ5: the p.Gly151Arg in 13 out of 28 (46%) and the p.Leu168Arg in 14 out of 28 (50%) APAs. KCNJ5 pathogenic variant p.Glu145Gln was identified in one (4%) APA. In addition, the p.Leu104Arg ATP1A1 mutation was detected in two APAs (3.2%); the p.Leu425_Val426del ATP2B3 mutation in one APA (1.6%); and the p.Ser45Pro CTNNB1 mutation in two APAs (3.2%). The novel CACNA1D somatic heterozygous variant p.Leu276Pro (likely pathogenic) was identified by exome sequencing in one APA. APAs with KCNJ5 pathogenic variants were diagnosed more often in women (p= 0.047) and at younger ages (p= 0.002) when compared to APAs without KCNJ5 variants. Nodule size was larger in APAs with KCNJ5 pathogenic variants (p= 0.0001). The frequency of PA patients com HT duration < 5 yrs was similar in both groups. HT remission was observed in 50% of patients with APAs harboring KCNJ5 pathogenic variants, whereas only 15% of patients with APAs without KCNJ5 pathogenic variants had HT remission (p= 0.003). In multivariate analysis, only the presence of a KCNJ5 pathogenic variant was an independent predictor of HT remission (p= 0.03). After exome sequencing analysis, four germline missense heterozygous variants predicted to be pathogenic in >=3 in silico tools were selected: 1) the novel p.Pro559Thr variant in CACNA1H gene, previously associated with PA phenotype; 2) the p.Arg178Cys variant in CACNA1I gene, which encodes the Alpha 1I subunit of Cav 3.3 channel; 3) the p.Glu52Ala variant in ATP13A3 gene, which is a member of the P-type ATPase family of membrane transport proteins; and 4) the p.Tyr507Ser variant in KCNC4 gene, which encodes the voltage-gated potassium channel Kv 3.4. Conclusion: We have characterized the spectrum of somatic pathogenic variants in a Brazilian cohort of APAs, and evaluated the impact of KCNJ5 somatic pathogenic variants in predicting HT remission after adrenalectomy. In addition, we identified potential novel gene candidates in the pathogenesis of PA caused by APAs

Neste trabalho desenvolvemos e exploramos modelos markovianos aplicados a canais iônicos presentes em membranas celulares / In this work we made markovian models for simulate the ionic channels activity in cell membranes

Fosfolipases A2 miotóxicas (Lys49, enzimaticamente inativa, e Asp49, com atividade) isoladas do veneno de Bothrops asper, induzem hipernocicepção. Assim, avaliamos os mecanismos estruturais, moleculares e mediadores centrais envolvidos neste efeito. A injeção intraplantar das FLA2s acarretou hiperalgesia, enquanto que apenas a FLA2-Asp49 induziu alodinia. A região C-terminal é a responsável pelo efeito da FLA2-Lys49, enquanto que a atividade catalítica da FLA2-Asp49 parece ser responsável pela indução de hipernocicepção. Canais de Ca2+ e Na+ participam deste efeito. Na medula espinhal, receptores NK1 e para CGRP, receptores ionotrópicos para glutamato, NO, IL-1, prostanóides e adenosina participam da hiperalgesia induzida pelas FLA2s. Adicionalmente, receptores metabotrópicos para glutamato e o TNF?, estão envolvidos na hiperalgesia induzida pela FLA2-Asp49. Receptores NK1 e NK2 e para CGRP, receptores para glutamato, TNF? e prostanóides medeiam a alodinia. A ativação de astrócitos e microglia, na medula espinhal, contribui para a gênese do efeito hipernociceptivo. / Phospholipase A2 (Lys49, catalytically-inactive and Asp49, catalytically active), isolated from Bothrops asper snake venom, induce pain. The present studies examined the molecular, structural and central mechanisms involved in hypernociception induced by both PLA2s. These PLA2s induced mechanical hyperalgesia, whereas only PLA2-Lys49 evoked allodynia. The C-terminal region of the PLA2-Lys49 seems to be responsible for hyperalgesia, whereas the enzymatic activity of PLA2-Asp49 contributes to such an effect. Calcium and sodium channels are involved in PLA2s-induced hyperalgesia. In the spinal cord, NK1 and CGRP receptors, glutamate ionotropic receptors, NO, IL-1, prostanoids and adenosine contribute to hyperalgesia caused by PLA2s. Additionally, metabotropic glutamate receptors and TNF are involved in hyperalgesia induced by PLA2-Asp49. NK1, NK2 and CGRP receptors, glutamate receptors, TNF and prostanoids mediate allodynia. Activation of spinal astrocytes and microglia contribute to the generation of hyperalgesia and allodynia induced by both toxins.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-01T12:26:27Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Doutorado. Tese de Lindalva Vieira. Ano 2015..pdf: 1577129 bytes, checksum: 08d435d57b1dfb816c8e6a8dcd551f50 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-01T12:26:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Doutorado. Tese de Lindalva Vieira. Ano 2015..pdf: 1577129 bytes, checksum: 08d435d57b1dfb816c8e6a8dcd551f50 (MD5) Previous issue date: 2015-07-02 / CAPEs / A Diabetes Mellitus (DM) é um grave problema de saúde pública, sendo uma das maiores causas de morbimortalidade na grande maioria dos países. Diferentes órgãos são acometidos pela DM; contudo, as doenças cardiovasculares são as maiores responsáveis pela elevada mortalidade vinculada à diabetes. A metformina é atualmente o principal fármaco utilizado para o tratamento da DM do tipo 2 (DM2), embora os riscos-benefícios cardiovasculares dessa droga não estejam totalmente elucidados. O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial arritmogênico da metformina em corações e cardiomiócitos de ratos saudáveis. No tratamento por 10 semanas com metformina os parâmetros biométricos e a glicemia plasmática não foram modificados, mas foi constatado um prolongamento dos intervalos PR, QT e QTc no eletrocardiograma, e uma redução da corrente transitória de saída de K+, Ito.Quando os cardiomiócitos foram incubados por 24 h com metformina, a amplitude da corrente Ito foi reduzida, enquanto aumentou a duração do potencial de ação cardíaco (DPA). A exposição de cardiomiócitos isolados à metformina por um período de 30 min, não reduziu a amplitude da corrente Ito, comprovando que a redução da corrente Ito em cardiomiócitos tratados por 10 semanas e incubados por 24 h com metformina, não ocorreu por uma ligação direta da droga ao canal. A corrente de cálcio tipo L (ICa-L) e a dependência de voltagem da inativação e recuperação da inativação da corrente Ito não foram afetadas em ambas as situações experimentais. Os níveis de RNAm que codifica as subunidades KV4.2, KV4.3 e KChIP2 do canal Ito não foram alterados, sugerindo que a redução da corrente Ito não ocorreria por uma menor síntese proteica das subunidades que compõem o canal Ito. Propõe-se que, esta redução seria resultante de uma acelerada degradação dos canais ou de uma deficiência funcional destes na membrana celular. A partir dos resultados obtidos na presente tese, conclui-se que a metformina apresenta potenciais efeitos arritmogênicos sobre o coração de animais saudáveis, capazes de levar eventualmente à morte súbita. / Diabetes Mellitus (DM) is a major public health problem, and is one of the biggest causes of morbidity and mortality in most countries. Many different human organs are affected by the DM, but cardiovascular diseases are the leading causes of mortality in patients with DM. Even today, the leading drug used to treat type-2 diabetes is metformin. However, its cardiovascular risk-benefits are not entirely clear. This study aimed to determine the potential arrhythmogenic effect of metformin in cardiomyocytes from healthy animals. Therefore, a 10 week treatment with metformin was performed, and it was proved that biometric and metabolic parameters were not affected. However, a lengthening of the PR, QT and QTc interval was found on the electrocardiogram, as well as a reduction in the output of the transitory potassium Ito current. When cardiomyocytes were incubated for 24 h with metformin, the amplitude of the Ito current was reduced and duration of cardiac action potential (APD) increased. Exposure of cardiomyocytes treated with metformin over a period of 30 min did not reduce the amplitude of the current Ito, demonstrating that the reduction in Ito current cardiomyocytes treated for 10 weeks and incubated for 24 h with metformin, does not occur by direct binding of the drug to the canal. The L-type calcium current (ICa-L) and the kinetic properties of voltage-dependent inactivation and recovery from inactivation of Ito current remained unchanged in both experimental conditions. RNAm levels of KV4.2, KChIP2 4.3 and Kv subunits remained unchanged. This suggests that the reduction of the Ito current may not be caused by a decrease in the protein synthesis subunit which is part of the Ito channel.Therefore, this reduction may be caused by a main degradation of the channels or by a worse operating performance in the cell membrane. Experiments accomplished during this thesis try to demonstrate that metformin causes arrhythmogenic effects in the heart of healthy animals.