O sistema colinérgico possui papel importante na modulação dos processos de aprendizagem e memória. Nesse trabalho, avaliamos a evocação da memória de ratos de 3, 6, 12, 18 e 22 meses em esquiva inibitória e, também, analisamos a densidade dos receptores nicotínicos a7 e da subunidade b2 no hipocampo, além de enzimas colinérgicas, a colina acetiltransferase e a acetilcolinesterase. Os grupos com 18 e 22 meses apresentaram uma redução na evocação da memória de longa duração (MLD) e um aumento na densidade de receptores a7 nas piramidais de CA3 e nas células de PoDG, este apenas em 22 meses. Em contrapartida, os demais marcadores colinérgicos estavam inalterados nas diferentes idades. Assim, a redução na evocação da MLD dos animais de 18 e 22 meses acompanhada do aumento na densidade de receptores a7 pode ser caracterizada como: 1) estratégia adaptativa do envelhecimento (plasticidade colinérgica em neurônios glutamatérgicos) ou 2) modulação nos interneurônios GABAérgicos desencadeando, assim, um bloqueio no processamento da informação e o declínio da memória. / The cholinergic system plays an important role in modulating learning and memory. In this work, we evaluated the memory recall of 3, 6, 12, 18 and 22 months old rats in passive avoidance apparatus and we also evaluated, in the hippocampus, the density of a7 nicotinic receptors, b2 subunit receptor, choline acetiltransferase (ChAT) and acetilcholinesterase (AChE). The 18 and 22 months old showed a deficit in long-term memory (LTM) and an increase in a7 density in CA 3 pyramidals cells (py CA3) and polymorphic cells of Dentate Gyrus (PoDG).On the other hand, the other cholinergic markers were unchanged with aging. Thus, the deficit in LTM observed in 18 and 22 months combined with the increased a7 receptors in PoDG and py CA 3 in the hippocampus could be explained by: 1) as an adaptative strategy of aging (cholinergic plasticity in glutamatergic neurons) or 2) as a modulation in GABA interneurons triggering inhibition in the memory evocation.

A peçonha de anêmonas do mar é uma fonte conhecida de compostos bioativos, incluindo peptídeos, que atuam em canais voltagem-dependentes. Foram descritos 4 tipos de neurotoxinas de anêmonas do mar, que atuam em canais NaV e 4 tipos que atuam em canais KV. Essas toxinas têm permitido discriminar subtipos de canais voltagem-dependentes, estreitamente relacionados, e constituem poderosas ferramentas para estudar o funcionamento e estrutura desses canais. Neste estudo, foram isolados e caracterizados três peptídeos da fração neurotóxica da anêmona do mar Anthopleura cascaia. Esses peptídeos foram nomeados como AcaIII1425, AcaIII2970 e AcaIII3090, onde Aca faz referência a espécie e os números seguem os resultados obtidos nas etapas de purificação. A peçonha foi extraída por meio de estímulos elétricos e purificada por gel-filtração (Sephadex G-50) e fase reversa por HPLC (C-18). As massas moleculares foram obtidas por meio de MALDI-TOF, apresentando 3337,4 Da para a AcaIII1425, 4881,7 Da para a AcaIII2970 e 4880,5 Da para AcaIII3090. Através da técnica de voltage-clamp, esses peptídeos foram testados em diferentes subtipos de canais NaV e KV expressados em ovócito de Xenopus. As toxinas AcaIII2970 e AcaIII3090 retardam, de maneira seletiva, a inativação rápida dos subtipos rNaV1.3, mNaV1.6 e hNaV1.5, enquanto que as outras isoformas testadas permaneceram inalteradas. É importantemente salientar que, a AcaIII2970 e AcaIII3090 também foram examinadas no canal de inseto DmNaV1, revelando uma clara \"filo-seletividade\" na eficácia da atividade das toxinas. A AcaIII2970 e AcaIII3090 inibem fortemente a inativação do canal NaV de inseto, resultando em um aumento na amplitude do pico da corrente e removendo completamente a inativação rápida. Para quantificarmos essa \"filo-seletividade\", foram construídas curvas da dependência da concentração no retardo da inativação induzida pelas toxinas AcaIII2970 e AcaIII3090 nos canais em que apresentaram maior eficácia. Os IC50 foram obtidos após a plotagem dos dados em uma curva sigmoidal. Para a AcaIII2970, os seguintes valores de IC50 foram obtidos: DmNaV1 = 162,19 ± 11,22 nM, mNaV1.6 = 645,92 ± 18,52 nM, rNaV1.3 = 572,56 ± 44,96 nM. Para a AcaIII3090, os seguintes valores de IC50 foram obtidos: DmNaV1 = 99,03 ± 9,25 nM, mNaV1.6 = 158,30 ± 33,86 nM, rNaV1.3 = 371,60 ± 6,48 nM. A AcaIII1425 atua, bloqueando, de modo seletivo os subtipos rKV1.1, rKV1.6 e rKV4.3, enquanto que as outras isoformas testadas permaneceram inalteradas. Devido à maior especificidade da toxina AcaIII1425 pelos subtipos rKV1.1 e rKV1.6, foram realizados ensaios de bloqueio da corrente do canal em função da concentração da toxina (curva dose-resposta). Os valores de IC50 para os subtipos rKV1.1 e rKV1.6 são de 7642,98 ±1601,65 nM e 241,65 ±4,27 nM, respectivamente. Desta forma, a AcaIII1425 é cerca de 32 vezes mais potente em canais do subtipo rKV1.6 do que em relação aos canais do subtipo rKV1.1. A estrutura primária das toxinas foram determinadas por degradação de Edman. A sequência parcial da AcaIII2970 e AcaIII3090 revelou que estas são similares a toxinas de canal de sódio do tipo1 de anêmonas do mar. A sequência completa da AcaIII1425 não apresenta similaridade com toxinas de anêmonas do mar, mas é similar a toxinas de Conus e aranha que possuem um motivo estrutural conhecido como ICK. Dessa forma, propomos que a AcaIII1425 seja um novo grupo de toxinas de anêmonas do mar que bloqueiam KV. Dado o ineditismo da toxina AcaIII1425, foram feitos experimentos in silico para obtermos um maior refinamento do mecanismo de interação entre a toxina e o canal rKV1.6. Estes experimentos indicaram que diferentes regiões dos canais KV são importantes para a seletividade e potência da toxina, corroborando com as propostas que vem sendo descritas / The venom of sea anemones is a known source of bioactive compounds, including peptides that act on voltage-gated ion channels. Four types of neurotoxins from sea anemones, acting on NaV channels, and four types acting on KV channels, have been reported. These toxins have developed the ability to discriminate closely related subtypes of voltage-gated channels, making them powerful tools to studying the function and structure of these channels. In this study, we isolated and characterized three peptides of the neurotoxic fraction from the venom of the sea anemone Anthopleura cascaia. These peptides were named as AcaIII1425, and AcaIII2970 AcaIII3090, where Aca refers to the species and the following numbers refer to results obtained in the purification steps. The venom was milked by electric shock and purified by molecular exclusion (Sephadex G-50) and reverse phase HPLC (C-18). Their molecular weights are 3337.4 Da to AcaIII1425, 4881.7 Da to AcaIII2970 and 4880.5 Da to AcaIII3090, obtained through a MALDI-TOF. Using the voltage-clamp technique, we have assayed the effects of these peptides on different subtypes of NaV and KV channels expressed in Xenopus oocytes. AcaIII2970 and AcaIII3090 toxins selectively slow down the fast inactivation of rNaV1.3, mNaV1.6 and hNaV1.5 subtypes, while the other mammalian isoforms remained unaffected. Importantly, AcaIII2970 and AcaIII3090 were also examined in insect DmNaV1 channel, revealing a clear phyla-selectivity with regards to the efficacy of the toxin. AcaIII2970 and AcaIII3090 strongly inhibit the inactivation of the insect NaV channel, resulting in an increase in the amplitude of the peak current, and complete removal of the fast and steady-state inactivation. In order to quantify this \"phyla-selectivity\", curves of the concentration dependence of the delayed inactivation induced by AcaIII2970 and AcaIII3090 toxins channels with higher efficacy, were built. After plotting the data on a sigmoidal curve the IC50 values were obtained. For AcaIII2970, the following IC50 values were obtained: DmNaV1 = 162.19 ± 11.22 nM, mNaV1.6 = 645.92 ± 18.52 nM and rNaV1.3 = 572.56 ± 44.96 nM. For AcaIII3090, the following IC50 values were obtained: DmNaV1 = 99.03 ± 9.25 nM, mNaV1.6 = 158.30 ± 33.86 nM and rNaV1.3 = 371.60 ± 6.48 nM. AcaIII1425 acts, selectively, blocking rKV1.1, rKV1.6 and rKV4.3 subtypes, while the others isoforms tested remained unaltered. Due the higher specificity of AcaIII1425 to rKV1.1 and rKV1.6 subtypes, assays were performed to evaluate the blocking channel current versus toxin concentration (dose-response curve). IC50 values for the subtypes rKV1.6 and rKV1.1 are 7642.98 ± 1601.65 nM and 241.65 ± 4.27 nM, respectively. Thus, AcaIII1425 is about 32 times more potent in the rKV1.6 than in the rKV1.1 channel. The primary structure of the toxins was determined by the Edman degradation. The partial sequence of AcaIII2970 and AcaIII3090 revealed that these toxins are similar to the type 1 sodium channel sea anemones neurotoxins. The complete sequence of AcaIII1425 has no similarity with other sea anemone toxins, but is similar to the Conus and spider neurotoxins which have a structural motif known as ICK. Thus, we propose that AcaIII1425 comprises a new group of sea anemones toxins that block KV channels. Given the unprecedented nature of the toxin AcaIII1425, in silico assays were carried out in order to further refining the proposed mechanism underlying the interaction between the toxin and the rKV1.6 channel. The results indicate that, in agreement to what has been proposed elsewhere, different regions of the KV channels are important for the toxin selectivity and potency

Os efeitos inibitórios do eugenol (EUG) em canais para Na+ ativados por voltagem (NaV) mostrados anteriormente não são totalmente compatíveis com nossos resultados. Nós estudamos os efeitos do EUG em correntes macroscópicas de Na+ e os comparamos aos da lidocaína, um anestésico local, para referência. O EUG bloqueou, rápida e reversivelmente, correntes de Na+ mistas (TTX-S+TTX-R) assim como as correntes de Na+ TTX-R. As IC50 para a inibição das correntes mistas e TTX-R pelo EUG foram de 2,28 e 2,27 mmol/L, respectivamente. O bloqueio depende da freqüência de despolarizações. Nas correntes mistas, o EUG desloca a curva de ativação para a direita, a de inativação para a esquerda, não altera a cinética de inativação e retarda a recuperação da inativação, rápida e lenta, dos canais. Nas correntes TTX-R, o efeito é semelhante, exceto na curva de ativação, que não é deslocada. Nós concluímos que o EUG bloqueia os NaV por se ligar a estados conformacionais de repouso e inativados, rápido e lento. Os efeitos são semelhantes, mas não idênticos aos da lidocaína. / The previously described inhibitory effects of eugenol (EUG) on voltage-activated Na+ channels (Nav) are not compatible with our results. We have studied the effects of EUG on macroscopic Na+ currents and compared them to the effects of lidocaine, a local anesthetic. EUG blocked both mixed (TTX-S and TTX-R) and TTX-R Na+ currents in a fast and reversible manner. The values of IC50 for the inhibition of mixed and TTX-R currents were 2.28 and 2.27 mmol/L respectively. The blockade depends on frequency of depolarizing pulses. In mixed currents EUG displaced the activation curve to the right, the inactivation curve to the left, does not alter the inactivation kinetics and retards the recovery from inactivation, fast and slow, of the Na+ channels. In TTX-R currents, EUG effects were similar, except on the activation curve, which was not shifted. In conclusion, EUG blocks Nav by binding to the resting and inactivated conformational states of channels, fast and slow. EUG effects resembles lidocaine ones, but are not identical.

Orientadores: Jose Wilson Magalhães Bassani, Rosana Almada Bassani / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Eletrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:41:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_BeatrizMariaRomano_D.pdf: 5549589 bytes, checksum: 7e1426139b8d8802dcd3f7caf52c2e1f (MD5) Previous issue date: 2004 / Doutorado

Introdução: As extrassístoles ventriculares e supraventriculares (EV e ESSV) são frequentes e muitas vezes sintomáticas. O íon magnésio (Mg) desempenha um papel importante na fisiologia do potencial de ação transmembrana celular e do ritmo cardíaco. Objetivo: Avaliar se a administração do Pidolato de Magnésio (PMg) em pacientes com EV e ESSV é superior ao placebo (P) na melhora dos sintomas e densidade das extrassístoles(DES). Métodos: Estudo duplo-cego, randomizado, com 90 pacientes sintomáticos consecutivos, com mais de 240/EV ou ESSV ao Holter de 24 horas e selecionados para receber P ou PMg. Para avaliar a melhora da sintomatologia, foi feito um questionário categórico e específico de sintomas relacionado às extrassístoles. Foi considerada significante uma redução de mais de 70% na DES por hora após o tratamento. A dose do PMg foi de 3,0g/dia por 30 dias, equivalente a 260mg do elemento Mg. Nenhum paciente tinha cardiopatia estrutural ou insuficiência renal. Resultados: Dos 90 pacientes estudados, 49 eram do sexo feminino (54,4%). A faixa etária variou de 16 a 70 anos. No grupo PMg, 77,8% dos pacientes tiveram redução maior que 70%, 6,7% deles entre 50% a 70% e, somente 13,3% dos pacientes com redução menor que 50% na DES . No grupo P, 44,4% dos pacientes tiveram melhora de apenas 30% na frequência de extrassístoles (p<0,001). A melhora dos sintomas foi alcançada em 91,1% dos pacientes do grupo PMg, comparada com somente 15,6% do grupo P(p<0,001). Conclusão: A suplementação de Mg por via oral reduziu a DES, resultando em melhora dos sintomas. Estudos clínicos e moleculares são necessários para avaliar o Mg intracelular e orientar quanto às necessidades diárias deste íon, evidenciar as prováveis deficiências e esclarecer melhor como prevenir e tratar pacientes com extrassístoles sintomáticas e sem cardiopatia estrutural. / Introduction: Premature ventricular and supraventricular complexes (PVC and PsVC) are frequent and often symptomatic. The magnesium (Mg) ion plays a role in the physiology of cell membranes and cardiac rhythm. Objective: We evaluated whether the administration of Mg Pidolate (MgP) in patients with PVC and PsVC is superior to placebo (P) in improving symptoms and arrhythmia frequency. Methods: Randomized double-blind study with 90 consecutive symptomatic patients with more than 240 PVC or PsVC on 24-hour Holter monitoring who were selected to receive placebo or MgP. To evaluate symptom improvement, a categorical and a specific questionnaire for symptoms related to PVC and PsVC was made. Improvement in premature complex density (PCD) per hour was considered significant if percentage reduction was >=70% after treatment. The dose of MgP was 3.0 g/day for 30 days, equivalent to 260mg of Mg element. None of the patients had structural heart disease or renal failure. Results: Of the 90 patients, 49 were female (54,4%). Ages ranged from 16 to 70 years old. In the MgP group, 77.8% of patients had a PCD reduction >70%, 6,7% of them from 50% to 70%, and only 13.3% <50%. In the P group, 44,4% showed slight improvement, <30%, in the premature complexes frequency (p<0.001). Symptom improvement was achieved in 91.1% of patients in the MgP group, compared with only 15.6% in the P group (p<0.001). Conclusions: Oral Mg supplementation decreases PCD, resulting in symptom improvement. Clinical and molecular studies are needed to evaluate intracellular Mg and develop better targets for the daily needs of this ion, show probable deficiencies, and explain how to prevent and better treat patients with symptomatic premature ventricular, and supraventricular complexes and no apparent heart disease.

Os escorpiões são um dos grupos de animais mais antigos da Terra. Eles são artrópodes e pertecem a classe Arachinida e Ordem Scorpionida. A família Buthidae compreende as espécies responsáveis pelos acidentes graves em humanos, incluindo a espécie Tityus serrulatus, o maior responsável por esses acidentes no Brasil. A peçonha do T. serrulatus contém diversas neurotoxinas que agem especificamente em canais para sódio, potássio e cálcio da membrana plasmática de células excitáveis, causando massiva liberação de neurotransmissores.As toxinas escorpiônicas podem ser usadas como ferramentas nos estudos de estrutura e função desses canais iônicos sensíveis a voltagem e também no estudo de liberação e captação de neurotransmissores. As toxinas escôrpionicas específicas para canais para sódio sensíveis a voltagem são as principais responsáveis pelos efeitos do envenenamento por estes artrópodes e podem ser classificadas em duas classes: toxinas e . As -toxinas retardam a inativação desses canais induzindo assim um prolongamento na fase de repolarização do potencial de ação. As - toxinas alteram a dependência de voltagem de ativação dos canais para sódio para potenciais mais negativos provocando potenciais de ação espontâneos e repetitivos. As toxinas específicas para canais para potássio (KTx) são geralmente peptídeos pequenos e de caráter básico, formados por 23-43 aminoácidos estabilizados por 3-4 pontes dissulfeto. As KTx são classificadas em 4 subfamílias:, , , . Neste trabalho, uma nova neurotoxina do escorpião T. serrulatus foi isolada e caracterizada bioquímica e funcionalmente. A toxina foi testada em ampla variedade de canais incluindo 5 subtipos de canais para sódio (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 e DmNav1) e 12 diferentes tipos de canais para potássio (Kv1.1 a Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR e hERG). A peçonha bruta solúvel foi fracionada em cromatografia de troca iônica em coluna CM-Celulose-52 (2,5 cm x 63 cm), previamente equilibrada e eluída com tampão NH4HCO3 (pH 7,8). Essa primeira etapa cromatográfica permitiu a separação de 13 frações nomeadas de I XIII. A fração X foi submetida à cromatografia de fase reversa em sistema de cromatografia líquida de alta eficiência em que a toxina pura Ts15 pode ser obtida. Seu sequenciamento amino-terminal demonstrou que esse peptídeo possui 36 resíduos de aminoácidos estabilizados por 3 pontes dissulfeto. A massa molecular obtida por espectrometria de massa foi de 3956 e o pI predito pelo programa ProtParam foi de 8,86, no entanto, o pI determinado por focalização isolelétrica foi maior que 9,3. Os experimentos de eletrofisiologia utilizando as técnicas patch clamp e two microelectrode voltage clamp mostraram que a toxina Ts15 bloqueia preferencialmente os subtipos de canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 com IC50 de 196 ± 25 nM e 508± 67 nM respectivamente. Os ensaios de captação de neurotransmissores em sinaptosomas de cérebro de rato foram realizados adicionando 3H-GABA e 3H-Glu na presença e ausência de diferentes concentrações da toxina Ts15. Não foram observados efeitos nos canais para sódio em todas as concentrações testadas assim como na captação do GABA. Porém, foi observado aumento significante na captação do glutamato em todas as concentrações testadas, provavelmente como resultado de efeito secundário da ação da Ts15 em canais para potássio sensível a voltagem. Em conclusão, a Ts15 pode ser considerada um autêntico novo tipo de toxina escorpiônica, com afinidade para canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 e capaz de aumentar a captação de glutamato. Essa toxina é o único membro da nova subfamília -Ktx21 e portanto nomeada -Ktx21.1 / Scorpions are one of the most ancient groups of animals on earth. They are arthropods and belong to the class Arachinida and Order Scorpionida. The Buthidae family comprises the species that are really dangerous for human, including Tityus serrulatus that is responsible for most severe accidents in Brazil. T. serrulatus venom contains several neurotoxins that specifically act on sodium, potassium or calcium channels in excitable membranes, causing a massive release of neurotransmitters and leading to the stimulation of the autonomic nervous system. Since ion channels play important roles in many physiological processes, scorpion toxins have been used as tools for studies of the neurophysiological mechanisms involving voltage-gated ion channels and neurotransmitter release/uptake. Voltage-gated Na+ channel (Nav channel) toxins are mainly responsible of the harmful effects of scorpion venom and can be classified into two classes: and -neurotoxins. The -toxins retard Nav channel inactivation and induce a prolongation of the repolarization phase of the action potential. The -toxins shift the voltage dependence of Nav channel activation to more negative potentials that result in an increased tendency of the cell to fire spontaneously and repetitively. Voltage-gated potassium channel toxins (KTxs) are basic short chain peptides comprising 23-43 amino acid residues that can be cross-linked by 3 or 4 disulfide bridges. KTxs are classified into four large families: , , and . These peptides display varying selectivity and affinity for different Kv channel subtypes. In this work, a novel toxin from the T. serrulatus venom was isolated, biochemistry and pharmacologically characterized using a wide electrophysiological screening on 5 different subtypes of Nav channels (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 and DmNav1) and 12 different subtypes of Kv channels (Kv1.1 - Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR and hERG). The crude soluble T. serrulatus venom was fractionated by ion exchange chromatography on a CM-cellulose-52 column (2.5 cm x 63.0 cm), which was equilibrated and eluted with NH4HCO3 buffer (pH 7.8). This chromatography allowed the separation of 13 fractions which were named I to XIII. Fraction X was submitted to a reverse-phase C18 (0.46 cm x 25 cm) high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and the pure toxin, Ts15, could be obtained. The amino acid sequence of this novel peptide showed that it contains 36 amino acids and is cross-linked by 3 disulfide bridges. The molecular mass of Ts15 (3956) was obtained by electrospray (ESI) triple-quadrupole mass spectrometry and its pI value (8,86) was predicted by ProtParam program. However, the pI determined by isoeletric focusing was greater than 9,3. Electrophysiological experiments using patch clamp and the two electrode voltage clamp technique, showed that Ts15 preferentially blocks Kv1.2 and Kv1.3 channels with IC50 value of 196 ± 25 and 508 ± 67 nM, respectively. Uptake assays were performed by adding 3H-GABA and 3H-Glu, in the absence (controls) or presence of different concentrations of Ts15, on isolated rat brain synaptosomes. No effect on Nav channels was observed, in all tested concentrations, as well as for GABA uptake. However, Ts15 induced a significant increase of the glutamate uptake, probably as a secondary effect of its action on Kv channels. In conclusion, Ts15 can be considered a bonafide novel type of scorpion toxin that presents high affinity by Kv1.2 and Kv1.3 channels and was able to increase the glutamate uptake. It is the unique member of the new -Ktx21 subfamily and therefore was named -Ktx21.1

Submitted by Clebson Anjos (clebson.leandro54@gmail.com) on 2016-03-30T17:14:42Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2235188 bytes, checksum: a2603a546030491976e0045d622aff17 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-30T17:14:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2235188 bytes, checksum: a2603a546030491976e0045d622aff17 (MD5) Previous issue date: 2013-11-11 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke (Fabaceae) is a typical tree of Caatinga, popularly known as “jurema-branca”, “jurema-malícia-da-serra”, “carcará” and “calumbi” and is popularly used as heling agent and antiinflamatory. From its aerial parts was isolated the flavonoid 4’,5,7-triidroxi-3,6-dimetoxiflavona (FGAL) that, in previous studies, inhibited both CCh- and histamine-induced phasic contractions on guinea pig ileum. Thus, the aim of this work was to characterize its relaxant mechanism of action. Isotonic and isometric contractions were recorded to determine and compare the relative efficacy and potency. The myocites viability was measured by the MTT assay, and the cytosolic Ca2+ levels by the analysis of fluorescence of fluo-4. The flavonoid relaxed the ileum pre-contracted with KCl 40 mM (EC50 = 2.6 ± 0.5 x 10-6 M) or CCh 10-5 M (EC50 = 1.8 ± 0.4 x 10-6 M), being more potent when the ileum was pre-contracted with histamine 10-6 M (EC50 = 1.9 ± 0.4 x 10-7 M). In addition, the flavonoid righward shifted the cumulative concentration-response curves of histamine in a non-parallel manner, with maximum effect (Emax) reduction, presenting a profile of non-competitive pseudoirreversible antagonism. To verify if FGAL would inhibit the Ca2+ influx through the voltage-sensitive Ca2+ channels (CaV), cumulative concentration-response curves of CaCl2 in depolarizing medium (70 mM KCl) nominally without Ca2+ were obtained in both the absence (control) and presence of different concentrations of FGAL. The flavonoid righward shifted the CaCl2 contraction curves in a non-parallel manner, with Emax reduction. Moreover, FGAL relaxed the pre-contracted ileum with S-(-)-Bay K8644 (3 x 10-7 M), a CaV1 agonist, but with lower potency than with KCl or histamine, indicating an indirect blockade of these channels. Then, in order to verify whether FGAL would be positivelly modulating the K+ channels to, indirectally, block the CaV1, it was employed CsCl, a non-selective K+ channels blocker. The relaxant potency of FGAL was attenauted in the presence of CsCl (EC50 = 1.1 ± 0.3 x 10-6 M) suggesting the involvement of these channels on this relaxant effect. In contrast, the relaxant potency of FGAL was not modified in the presence of apamin, SKCa blocker (EC50 = 1.6 ± 0.3 x 10-7 M), or TEA+ 1 mM, BKCa blocker (EC50 = 2.0 ± 1.0 x 10-7 M), discarding the participation of these subtypes of K+ channels. However, in the presence of 4-AP, KV blocker (EC50 = 1.8 ± 0.2 x 10-6 M), and glibenclamide, KATP blocker (EC50 = 1.5 ± 0.5 x 10-6 M), the relaxant potency of FGAL was attenuated about 10 and 8 times, respectively, confirming that FGAL positivelly modulates these subtypes of K+ channels to relax the guinea pig ileum. In the cellular experiments, the viability of intestinal myocytes was not altered in the presence of FGAL (10-4 M). Furthermore, the fluorescence intensity emmited by fluo-4 of myocytes stimulated with histamine was attenuated by FGAL as a result of [Ca2+]c reduction. Therefore, the relaxant mechanism of action of FGAL on guinea pig ileum involves the positive modulation of KV and KATP, which, indirectly, reduces the Ca2+ influx through CaV1, leading to the reduction of the cytosolic levels of this ion. / Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke (Fabaceae) é uma árvore típica da Caatinga, conhecida popularmente como “jurema-branca”, “jurema-malícia-da-serra”, “carcará” e “calumbi” e é popularmente utilizada como cicatrizante e anti-inflamatório. De suas partes aéreas foi isolado o flavonoide 4’,5,7-triidroxi-3,6-dimetoxiflavona (FGAL) que, em estudos anteriores, inibiu as contrações fásicas induzidas por carbacol (CCh) ou por histamina em íleo de cobaia. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi caracterizar seu mecanismo de ação relaxante. As contrações isotônicas e isométricas foram monitoradas para determinar e comparar a eficácia e a potência relativas. A viabilidade dos miócitos do íleo foi medida utilizando o ensaio de MTT, e os níveis de Ca2+ citosólicos por meio da análise de fluorescência do fluo-4. FGAL relaxou o íleo pré-contraído com 40 mM de KCl (CE50 = 2,6 ± 0,5 x 10-6 M) ou com 10-5 M de CCh (CE50 = 1,8 ± 0,4 x 10-6 M), sendo mais potente quando o íleo foi pré-contraído com 10-6 M de histamina (CE50 = 1,9 ± 0,4 x 10-7 M). Além disso, o flavonoide deslocou para a direita as curvas concentração-resposta da histamina, de maneira não paralela com redução do efeito máximo (Emax), apresentando um perfil de antagonismo não competitivo pseudoirreversível. Para verificar se FGAL inibiria o influxo de Ca2+ pelos canais de cálcio dependentes de voltagem (CaV), foram obtidas curvas concentração-resposta cumulativas ao CaCl2 em meio despolarizante (KCl 70 mM) nominalmente sem Ca2+ na ausência (controle) e na presença de diferentes concentrações de FGAL. O flavonoide deslocou as curvas de contração do CaCl2 para a direita de maneira não paralela com redução do seu Emax. Além disso, FGAL relaxou o íleo pré-contraído com 3 x 10-7 M de S-(-)-Bay K8644, agonista dos CaV1, porém com menor potência do que com KCl ou histamina, indicando um bloqueio indireto desses canais. Assim, para verificar se FGAL modularia positivamente os canais de K+ para, indiretamente, bloquear os CaV1, utilizou-se o CsCl, bloqueador não seletivo dos canais de K+. FGAL teve sua potência relaxante atenuada na presença desse bloqueador (CE50 = 1,1 ± 0,3 x 10-6 M), sugerindo a participação desses canais no seu efeito relaxante. Diferentemente, a potência relaxante de FGAL não foi alterada na presença de apamina, bloqueador dos SKCa (CE50 = 1,6 ± 0,3 x 10-7 M), ou de TEA+ 1 mM, bloqueador dos BKCa (CE50 = 2,0 ± 1,0 x 10-7 M), descartando-se a participação desses subtipos de canais de K+. No entanto, na presença de 4-AP, bloqueador dos KV (CE50 = 1,8 ± 0,2 x 10-6 M), e de glibenclamida, bloqueador dos KATP (CE50 = 1,5 ± 0,5 x 10-6 M), a potência relaxante de FGAL foi atenuada cerca de 10 e 8 vezes, respectivamente, confirmando que FGAL modula positivamente esses subtipos de canais de K+ para relaxar o íleo de cobaia. Nos experimentos celulares, a viabilidade dos miócitos intestinais não foi alterada na presença de FGAL (10-4 M). Além disso, a intensidade de fluorescência emitida pelo fluo-4 complexado ao Ca2+ dos miócitos estimulados com histamina foi atenuada por FGAL, indicando que o flavonoide reduz a [Ca2+]c. Assim, o mecanismo de ação relaxante de FGAL em íleo de cobaia envolve a modulação positiva dos KV e dos KATP, o que, indiretamente, reduz o influxo de Ca2+ pelos CaV1, levando à redução dos níveis citosólicos desse íon.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5097_1.pdf: 1368862 bytes, checksum: f59a1ce92f075a02e7efa696e12f6583 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Um modelo biofísico é uma representação simplificada e/ou abstrata de processos ou sistemas biológicos. Objetivando ampliar o conhecimento sobre a modelagem biofísica, esta Tese enfoca prioritariamente os modelos que desenvolvemos, visando contribuir com os estudos biológicos. Proteínas transportadoras do tipo canal iônico encontram-se presentes na membrana plasmática de todos os seres vivos e o primeiro modelo biofísico é uma membrana plasmática artificial, na qual há um controle da memória em canais iônicos voltagem-dependentes. No segundo modelo, em uma estrutura que apresenta superfície com circunvoluções e contendo em seu interior sítios de ligação, é simulada a estrutura molecular de proteínas. No terceiro modelo é simulado um processo de formação de padrões elétricos de ocorrência em redes neuronais que tenham conectividade lateral, os quais são similares aos padrões registrados em diferentes áreas do córtex cerebral. No quarto modelo é simulado o efeito da heterogeneidade na reentrada de ondas espirais em tecido cardíaco. Ondas espirais de atividade elétrica são relacionadas com arritmias cardíacas reentrantes, tais como a taquicardia ventricular e a fibrilação ventricular, sendo esta última a principal causa de morte súbita cardíaca. No quinto modelo foram feitas simulações com o método de Monte Carlo, possibilitando a análise de seqüências de números aleatórios em métodos terapêuticos e diagnósticos, bem como em estudos que simulam o funcionamento de sistemas biológicos, já que na área biomédica há inúmeros experimentos que não podem ser repetidos com acurácia, mesmo em condições supostamente idênticas. A osteoporose é um problema mundial de saúde pública, sendo caracterizada por uma redução na densidade mineral óssea e, através da computação gráfica, no sexto modelo é estimada a densidade mineral óssea do corpo humano, com o uso de uma função matemática interpolante. Pode-se concluir que a presente Tese traz contribuições pioneiras para os estudos biológicos

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6489_1.pdf: 1208262 bytes, checksum: c1b40f981f11c014c773e3922d544d81 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A caracterização de canais iônicos em células tronco é importante pelo fato destas estruturas atuarem no controle da proliferação e diferenciação destas células. Há poucos trabalhos focados nos canais iônicos presentes nas membranas plasmáticas das células tronco e nenhum deles trata das células tronco mesenquimais da geléia de Wharton do cordão umbilical humano (whMSC). O cordão umbilical é uma fonte importante de células tronco para tão esperada terapia celular. Estes fatos motivaram o estudo dos canais iônicos das whMSC como objetivo maior do presente trabalho. Foi utilizada a técnica de patch-clamp na configuração whole-cell e a atuação de inibidores específicos para identificar os canais iônicos presentes nas whMSC. Os inibidores escolhidos foram: tetraetilamonio (TEA) e 4-aminopiridina (4-AP) como inibidores de canais de potássio dependentes de voltagem e de Ca2+, Glibenclamida (GB) um inibidor de canais de potássio dependentes de ATP, canais aniônicos dependentes de volume celular e CFTR e 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) ácido benzóico (NPPB) um potente bloqueador dos canais de cloreto, mas que também é capaz de bloquear os canais de potássio dependentes de Ca2+ de condutância intermediária. Os resultados mostraram que as correntes iônicas ativadas por voltagem das whMSC podem ser bloqueadas consideravelmente por TEA (10 mM), 4-AP (5 mM) e NPPB (100 &#956;M) indicando a presença dos canais de K+ dependentes de voltagem e de Ca2+ e de canais de Cl- dependentes de voltagem conforme descrito para células tronco de outras origens. Utilizando GB (100 &#956;M) observamos um aumento (estimulação) significativo da corrente. Este é um resultado inédito, pois estudos anteriores demonstram que o GB atua inibindo a corrente iônica transmembrana. Em todos os casos, com todos os inibidores testados, os efeitos foram reversíveis. Estes resultados demonstram que as membranas citoplasmáticas das whMSC possuem canais de K+ dependentes de voltagem e de Ca2+ e canais de Cl- dependentes de voltagem. O surpreendente efeito da glibenclamida indica a presença de canais iônicos desconhecidos nas membranas das whMSC

Os escorpiões são um dos grupos de animais mais antigos da Terra. Eles são artrópodes e pertecem a classe Arachinida e Ordem Scorpionida. A família Buthidae compreende as espécies responsáveis pelos acidentes graves em humanos, incluindo a espécie Tityus serrulatus, o maior responsável por esses acidentes no Brasil. A peçonha do T. serrulatus contém diversas neurotoxinas que agem especificamente em canais para sódio, potássio e cálcio da membrana plasmática de células excitáveis, causando massiva liberação de neurotransmissores.As toxinas escorpiônicas podem ser usadas como ferramentas nos estudos de estrutura e função desses canais iônicos sensíveis a voltagem e também no estudo de liberação e captação de neurotransmissores. As toxinas escôrpionicas específicas para canais para sódio sensíveis a voltagem são as principais responsáveis pelos efeitos do envenenamento por estes artrópodes e podem ser classificadas em duas classes: toxinas e . As -toxinas retardam a inativação desses canais induzindo assim um prolongamento na fase de repolarização do potencial de ação. As - toxinas alteram a dependência de voltagem de ativação dos canais para sódio para potenciais mais negativos provocando potenciais de ação espontâneos e repetitivos. As toxinas específicas para canais para potássio (KTx) são geralmente peptídeos pequenos e de caráter básico, formados por 23-43 aminoácidos estabilizados por 3-4 pontes dissulfeto. As KTx são classificadas em 4 subfamílias:, , , . Neste trabalho, uma nova neurotoxina do escorpião T. serrulatus foi isolada e caracterizada bioquímica e funcionalmente. A toxina foi testada em ampla variedade de canais incluindo 5 subtipos de canais para sódio (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 e DmNav1) e 12 diferentes tipos de canais para potássio (Kv1.1 a Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR e hERG). A peçonha bruta solúvel foi fracionada em cromatografia de troca iônica em coluna CM-Celulose-52 (2,5 cm x 63 cm), previamente equilibrada e eluída com tampão NH4HCO3 (pH 7,8). Essa primeira etapa cromatográfica permitiu a separação de 13 frações nomeadas de I XIII. A fração X foi submetida à cromatografia de fase reversa em sistema de cromatografia líquida de alta eficiência em que a toxina pura Ts15 pode ser obtida. Seu sequenciamento amino-terminal demonstrou que esse peptídeo possui 36 resíduos de aminoácidos estabilizados por 3 pontes dissulfeto. A massa molecular obtida por espectrometria de massa foi de 3956 e o pI predito pelo programa ProtParam foi de 8,86, no entanto, o pI determinado por focalização isolelétrica foi maior que 9,3. Os experimentos de eletrofisiologia utilizando as técnicas patch clamp e two microelectrode voltage clamp mostraram que a toxina Ts15 bloqueia preferencialmente os subtipos de canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 com IC50 de 196 ± 25 nM e 508± 67 nM respectivamente. Os ensaios de captação de neurotransmissores em sinaptosomas de cérebro de rato foram realizados adicionando 3H-GABA e 3H-Glu na presença e ausência de diferentes concentrações da toxina Ts15. Não foram observados efeitos nos canais para sódio em todas as concentrações testadas assim como na captação do GABA. Porém, foi observado aumento significante na captação do glutamato em todas as concentrações testadas, provavelmente como resultado de efeito secundário da ação da Ts15 em canais para potássio sensível a voltagem. Em conclusão, a Ts15 pode ser considerada um autêntico novo tipo de toxina escorpiônica, com afinidade para canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 e capaz de aumentar a captação de glutamato. Essa toxina é o único membro da nova subfamília -Ktx21 e portanto nomeada -Ktx21.1 / Scorpions are one of the most ancient groups of animals on earth. They are arthropods and belong to the class Arachinida and Order Scorpionida. The Buthidae family comprises the species that are really dangerous for human, including Tityus serrulatus that is responsible for most severe accidents in Brazil. T. serrulatus venom contains several neurotoxins that specifically act on sodium, potassium or calcium channels in excitable membranes, causing a massive release of neurotransmitters and leading to the stimulation of the autonomic nervous system. Since ion channels play important roles in many physiological processes, scorpion toxins have been used as tools for studies of the neurophysiological mechanisms involving voltage-gated ion channels and neurotransmitter release/uptake. Voltage-gated Na+ channel (Nav channel) toxins are mainly responsible of the harmful effects of scorpion venom and can be classified into two classes: and -neurotoxins. The -toxins retard Nav channel inactivation and induce a prolongation of the repolarization phase of the action potential. The -toxins shift the voltage dependence of Nav channel activation to more negative potentials that result in an increased tendency of the cell to fire spontaneously and repetitively. Voltage-gated potassium channel toxins (KTxs) are basic short chain peptides comprising 23-43 amino acid residues that can be cross-linked by 3 or 4 disulfide bridges. KTxs are classified into four large families: , , and . These peptides display varying selectivity and affinity for different Kv channel subtypes. In this work, a novel toxin from the T. serrulatus venom was isolated, biochemistry and pharmacologically characterized using a wide electrophysiological screening on 5 different subtypes of Nav channels (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 and DmNav1) and 12 different subtypes of Kv channels (Kv1.1 - Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR and hERG). The crude soluble T. serrulatus venom was fractionated by ion exchange chromatography on a CM-cellulose-52 column (2.5 cm x 63.0 cm), which was equilibrated and eluted with NH4HCO3 buffer (pH 7.8). This chromatography allowed the separation of 13 fractions which were named I to XIII. Fraction X was submitted to a reverse-phase C18 (0.46 cm x 25 cm) high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and the pure toxin, Ts15, could be obtained. The amino acid sequence of this novel peptide showed that it contains 36 amino acids and is cross-linked by 3 disulfide bridges. The molecular mass of Ts15 (3956) was obtained by electrospray (ESI) triple-quadrupole mass spectrometry and its pI value (8,86) was predicted by ProtParam program. However, the pI determined by isoeletric focusing was greater than 9,3. Electrophysiological experiments using patch clamp and the two electrode voltage clamp technique, showed that Ts15 preferentially blocks Kv1.2 and Kv1.3 channels with IC50 value of 196 ± 25 and 508 ± 67 nM, respectively. Uptake assays were performed by adding 3H-GABA and 3H-Glu, in the absence (controls) or presence of different concentrations of Ts15, on isolated rat brain synaptosomes. No effect on Nav channels was observed, in all tested concentrations, as well as for GABA uptake. However, Ts15 induced a significant increase of the glutamate uptake, probably as a secondary effect of its action on Kv channels. In conclusion, Ts15 can be considered a bonafide novel type of scorpion toxin that presents high affinity by Kv1.2 and Kv1.3 channels and was able to increase the glutamate uptake. It is the unique member of the new -Ktx21 subfamily and therefore was named -Ktx21.1