Les cellules souches cancéreuses (CSC) représentent une sous-population de cellules tumorales à l’origine de l’hétérogénéité et de la croissance tumorale. Les CSC sont plus résistantes aux traitements, et à l’origine de la rechute et des métastases. L’identification des CSC constitue actuellement un enjeu majeur dans le développement de nouvelles thérapies ciblées pour inhiber la croissance tumorale et éradiquer le cancer. Dans ce travail, nous avons cherché à identifier, caractériser, et cibler les CSC dans l’adénocarcinome gastrique. Des modèles murins de xénogreffe de tumeurs primaires de patients atteints d'adénocarcinome gastrique hors cardia de types intestinal et diffus ont été développés, ainsi qu’un modèle de tumorsphere in vitro afin d’évaluer les capacités tumorigéniques de sous-populations tumorales. Nous avons identifié CD44 et l'aldéhyde déshydrogénase (ALDH) comme marqueurs d’enrichissement des CSC dans les 2 types d’adénocarcinomes gastriques, l’ALDH représentant un marqueur plus spécifique que CD44. Nous avons ensuite étudié l'effet de l’acide rétinoïque tout trans (ATRA), et nous avons montré que l'ATRA inhibe la formation et la croissance des tumorspheres in vitro ainsi que la croissance tumorale in vivo. Cet effet de l’ATRA passe par l’inhibition de l’expression des marqueurs souches et des capacités d'auto-renouvèlement des CSC. En conclusion, CD44 et ALDH sont des marqueurs de CSC dans les adénocarcinomes gastriques hors cardia de types intestinal et diffus, et le traitement par l’ATRA constituerait une stratégie commune de traitement pour cibler spécifiquement les CSC et inhiber la croissance tumorale dans ces deux types de cancer gastrique. / Cancer stem cells (CSCs) are a subpopulation of tumor cells at the origin of the heterogeneity and growth of tumors. CSCs are more resistant to treatment, and are responsible for relapse and metastasis. The identification of CSCs is a major challenge for the development of new targeted therapies to inhibit tumor growth and eradicate cancer. In this work, we aimed to identify, characterize, and target CSCs in gastric adenocarcinoma. Mouse models of primary tumor xenografts from intestinal and diffuse type non-cardia gastric adenocarcinomas from patients were developed, as well as an in vitro tumorsphere assay, to assess the tumorigenic capacity of subpopulations of tumor cells. We identified CD44 and aldehyde dehydrogenase (ALDH) as CSC enrichment markers in the two types of gastric adenocarcinoma, ALDH representing a more specific marker than CD44. We then studied the effect of All-trans retinoic acid (ATRA), and showed that it inhibited the formation and growth of tumorspheres in vitro and tumor growth in vivo. This effect of ATRA is due to the inhibition of stem marker expression and the self-renewal capacity of CSCs. In conclusion, CD44 and ALDH are effective CSC markers in intestinal and diffuse type non-cardia gastric adenocarcinomas, and treatment with ATRA provides a common treatment strategy to specifically target CSCs and inhibit tumor growth in both subtypes of this gastric cancer.

L’infection chronique par Helicobacter pylori touche plus de la moitié de la population mondiale et est la principale cause connue de l’adénocarcinome gastrique. La metformine, un antidiabétique oral, est de plus en plus étudiée pour ses propriétés antitumorales dans de nombreux types de cancers. Cependant, ses effets potentiels ont très peu été étudiés dans le cancer gastrique. Des expériences réalisées sur des lignées cellulaires cancéreuses gastriques et des tumeurs de patients amplifiées par xénogreffe chez la souris (PDX), ont permis de confirmer les propriétés antitumorales de la metformine. La metformine, en traitement préventif et curatif, diminue la capacité de formation des tumorsphères, l’expression des marqueurs de CSC gastriques, et la capacité d’auto-renouvellement propre aux CSC. Dans un second temps, nous avons montré que la metformine est capable d’inhiber la croissance bactérienne de H. pylori invitro et in vivo. Enfin, les effets de l’infection par H. pylori ont été étudiés sur la voie de signalisation mTOR par la réalisation d’une analyse transcriptomique et de western-blots sur des lignées cellulaires gastriques. Ceci a permis de démontrer que H. pylori inhibe le complexe mTORC1.Pour conclure, ce travail de thèse a permis i) de démontrer la capacité de la metformine à cibler les CSC gastriques, ii) de découvrir une nouvelle propriété antibactérienne de la metformine vis-à-vis de H. pylori, iii) de démontrer que H. pylori inhibe la voie de signalisation mTOR. / Chronic infection with Helicobacter pylori affects more than half of the world's population and is the main known cause of gastric adenocarcinoma. Metformin is an oral antidiabetic drug used to treat type 2 diabetes patients, and is being increasingly studied for its antitumoral properties in several cancer types. However, its potential effects in gastric cancer have not been thoroughly studied. Experiments performed on gastric cancer cell lines and patient-derived gastric carcinoma xenografts (PDX), have confirmed the antitumoral properties of metformin. Metformin, in preventive and curative treatment, decreases the tumorsphere formation, the expression of gastric CSC markers and the self-renewal capacity of CSC. In a second time, we have shown that metformin is able to inhibit the bacterial growth of H. pylori in vitro and in vivo. Finally, the effects of the H. pylori infection have been studied on the mTOR signaling pathway using a transcriptomic analysis and western blots, performed on gastric cancer cell lines. These show the ability of H. pylori to inhibit mTORC1.To conclude, this thesis work allowed i) to demonstrate the ability of metformin to target gastric CSCs, ii) to discover a new antimicrobial property of metformin against H. pylori, iii) to demonstrate that H. pylori inhibits the mTOR signaling pathway.

Die vorliegende Habilitationsschrift "Neue Serummarker bei urologischen Malignomen mit dem Schwerpunkt Prostatakarzinom und Anwendung von Proteinase-Inhibitoren in der Therapie des Prostatakarzinoms" faßt Ergebnisse zusammen, die ich in den Jahren von 1996 bis 2000 als Erstautor in wissenschaftlichen Artikeln von peer reviewed Zeitschriften veröffentlicht habe. Zusätzlich werden 14 Arbeiten mit ihren Aussagen eingeschlossen, bei denen ich als Koautor beteiligt war. Gegenstand der Habilitationsschrift sind Untersuchungen zur diagnostischen Optimierung des Tumormarkers Prostataspezifisches Antigen (PSA) und zum Expressionsverhalten von CD44-Proteinen bzw. Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) als potentielle, neue Marker bei urologischen Karzinomen. Die nachgewiesene Bedeutung der MMPs bei der Tumorprogression und -metastasierung hat mich dazu veranlaßt, tierexperimentelle Studien zur Hemmung der MMP-Aktivität mit synthetischen Inhibitoren in meine Arbeit aufzunehmen. Zielstellung war hierbei die Evaluierung neuer Therapieoptionen beim fortgeschrittenen Tumor. Im Mittelpunkt der Untersuchungen steht das Prostatakarzinom (PCa) als häufigster maligner Tumor des Mannes. 1. Das PSA ist ohne Zweifel der beste Tumormarker in der Diagnostik des PCa. Der Optimierung dieses Markers wird große Bedeutung zugemessen. Dabei werden verschiedene Konzepte verfolgt, wobei die Bestimmung der Isoformen des PSA die zur Zeit erfolgreichste Richtung zu sein scheint. Die Ergebnisse meiner u.a. im Rahmen von Multizenterstudien durchgeführten Untersuchungen belegen den diagnostischen Nutzen der zusätzlichen Bestimmung des f-PSA%, um PCa-Patienten früher zu erkennen und besser gegenüber Patienten mit benigner Prostatahyperplasie (BPH) abgrenzen zu können. Ein weiteres Ergebnis der Untersuchungen zur diagnostischen Validität anderer PSA-Isoformen ist die Feststellung, daß die Bestimmung des gebundenen PSA keinen Vorteil gegenüber dem f-PSA% hat. Widersprüchliche Angaben in der Literatur konnten damit ausgeräumt werden. Diese Ergebnisse veranlaßten die Firma Roche als Kooperationspartner, die Weiterentwicklung eines ACT-PSA Prototyp-Testsystems einzustellen. Die Ergebnisse meiner Untersuchungen zu den PSA-Isoformen haben inzwischen Eingang in den klinischen Alltag gefunden und werden in der Urologischen Klinik der Charité genutzt. Es wurden Entscheidungsgrenzen für den f-PSA%-Wert zur Indikationsstellung von Stanzbiopsien der Prostata als Klinikstandard erarbeitet. 2. Bei verschiedenen urologischen Tumoren wurde das Expressionsverhalten von CD44-Proteinen und MMPs bzw. deren Inhibitoren bestimmt, um eine mögliche Bedeutung bei der Tumorprogression zu erfassen. Diese Untersuchungen sind gleichzeitig Voraussetzung für eine mögliche Anwendung der Komponenten in der Diagnostik und Therapiekontrolle bei diesen Tumorentitäten. Im Gegensatz zu anderen menschlichen Tumoren konnten bei den untersuchten urologischen Tumoren keine veränderten Serumkonzentrationen der CD44-Proteine einschließlich der Varianten nachgewiesen werden. Daher habe ich weiterführende Studien zu den CD44-Proteinen nicht durchgeführt. 3. Im Tumorgewebe sowie im Plasma von Patienten mit PCa und Nierenzellkarzinom konnte ich signifikante Veränderungen von MMPs und deren Inhibitoren nachweisen. Die Situation im Gewebe spiegelt sich zum Teil im Blut der Patienten wider. Diese Beobachtungen beweisen die Bedeutung der MMPs bei der Tumorprogression und -metastasierung. Prinzipiell kann die Bestimmung einzelner MMPs bzw. TIMPs in der Diagnostik von urologischen Tumoren genutzt werden. Die niedrige Sensitivität in der individuellen Erfassung des einzelnen Tumorpatienten schränkt jedoch die praktische Anwendung ein. 4. Die veränderte MMP-Expression bzw. die Dysbalance zwischen MMPs und TIMPs hat mich veranlaßt, synthetische Inhibitoren zur Blockierung der MMP-Aktivität in einem Standardtiermodell des menschlichen PCa einzusetzen. In einer ersten Untersuchung am Dunning-Tumor der Ratte wurde nachgewiesen, daß dieser Tumor MMP9 exprimiert und die Serumkonzentration mit der Tumorgröße korreliert. In weiteren tierexperimentellen Untersuchungen wurde der Einfluß von Batimastat, einem Breitspektrum-Inhibitor der MMPs und einem neuentwickelten, selektiveren Inhibitor (Icol) auf das orthotope Tumorwachstum ermittelt. Beide Substanzen führten zu einer Hemmung des lokalen Tumorwachstums. Durch Applikation von Icol wurde eine Reduzierung des Tumorgewichtes um 90% im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren erreicht. Diese Beobachtungen haben eine doppelte Bedeutung. Zum einen beweist die Hemmwirkung von synthetischen MMP-Inhibitoren im Tiermodell die Funktion der MMPs bei der lokalen Tumorprogression. Zum anderen werden durch diese erfolgreichen tierexperimentellen Studien mit neuen Substanzen Voraussetzungen für die klinische Anwendung bei Patienten mit hormonrefraktärem PCa geschaffen. / The aim of my "habilitation thesis" was to evaluate the diagnostic validity of prostate-specific antigen (PSA) in serum and tissue, the serum pattern of CD44 proteins and of the matrix metalloproteinases (MMPs) in serum and tissue of urological malignancies. As MMPs seem to play an important role in tumor progression and metastasis, animal studies were additionally initiated in order to investigate the influence of synthetic inhibitors of MMPs on prostate cancer. 1. PSA is the most important and accurate tumor marker in prostate cancer diagnosis. However, PSA is an organ-specific marker, but is not tumor-specific. Elevated PSA concentrations are seen with non-malignant prostatic diseases like benign prostatic hyperplasia (BPH). Moreover, not all patients with prostate cancer have elevated PSA concentrations. In order to optimize the diagnostic validity of PSA, several concepts have been developed. Determination of the PSA isoforms in serum could help discriminate between prostate cancer and BPH. In various own studies, including a multicenter clinical trial, the determination of free PSA and the calculation the ratio of free PSA to total PSA (fPSA/tPSA) has proven to be a promising tool in prostate cancer diagnosis. Regarding the diagnostic validity of the complexed PSA conflicting data exist. Our results, using a newly developed alpha-1-antichymotrypsin-PSA (ACT-PSA) assay by Roche are contradictory to recent published data. Based on data of a multicenter trial, the determination of ACT-PSA as well as the ACT-PSA to tPSA ratio did not improve the differential diagnostic impact in patients undergoing evaluation for prostate cancer compared to the ratio fPSA/tPSA. 2. In various malignant diseases characteristic alterations in the expression of CD44 proteins and their variants have been observed. In contrast to those observations in other carcinomas, the determination of soluble CD44 proteins in serum is not suitable for detecting and staging patients with urological malignant tumors. Therefore, further investigation have not been performed. 3. Matrix-metalloproteinases (MMP) form a group of endogenous proteases with the common ability to degrade various components of the extracellular matrix. It could be demonstrated that increased levels of MMP are associated with the invasive and metastatic potential in human malignant tumors. However, little is known about the role of MMPs in renal cell carcinoma. In own study significant changes of MMP expression have been observed. Although changes in specific MMPs might be characteristic for renal carcinoma tissues and might be partly reflected in the blood, data shown that even MMP-9 as the best plasma marker, had a low sensitivity in detecting renal cell carcinoma. Increased concentrations of MMP-9 in tumor tissue may have important implications for the therapeutic potential of synthetic inhibitors of MMPs. 4. The importance of inhibitors of MMPs in cancer has been demonstrated in various studies. In own investigations, altered levels of MMPs and their specific inhibitors have been elucidated in prostate cancer. Therefore, a study to evaluate the efficacy of synthetic MMP inhibitors (batimastat, Icol) in a standard prostate cancer animal model was performed. Previously, the high expression of MMP-9 in this prostate cancer (Dunning tumor) compared with normal prostatic tissue could be demonstrated. Batimastat and the newly developed inhibitor Icol reduced the orthotopic tumor weights up to 90% in a dose-dependent manner. This results confirmed the importance of MMPs and their inhibitors in tumor progression. It can be concluded that selective inhibition of MMP activity is a novel therapeutic approach, which bears promise for studies in patients with hormone-refractory prostate cancer.

Im ersten Teil dieser Dissertation wurde der Einfluss des mitochondrialen Proteins TCAIM (T cell activation inhibitor, mitochondrial) auf die T-Zellaktivierung untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einem T-zellspezifischen knock-in (KI) von Tcaim in den Rosa26 Lokus generiert. Die Tcaim-Überexpression beeinflusste die Fission und Umverteilung von Mitochondrien und reduzierte die T-Zellrezeptor (TZR)-induzierte Bildung mitochondrialer, radikaler Sauerstoffspezies. In vitro stimulierte CD4+ Tcaim KI T-Zellen zeigten eine geringere Aktivierung, Proliferation und IL-2 Sekretion als Kontrollzellen. T-Zellen aus Tcaim KI Mäusen, die in Rag-1 knock-out Mäuse transferiert wurden, waren nicht fähig ein allogenes Haut-Transplantat abzustoßen und behielten einen naiven Phänotyp. Diese Ergebnisse zeigen, dass TCAIM als mitochondriales Protein wichtige Schritte in der Zellaktivierung und der Bildung von Gedächtnis-T-Zellen beeinflusst. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigte sich mit dem Einfluss der CD44-Oberflächenexpression auf die Differenzierung von T-Helfer (TH)-Zellen. Eine hohe CD44-Expression unterscheidet Effektor- von naiven T-Zellen. Durch die allogene Stimulation von CD4+ T-Zellen bildeten sich drei verschiedene Populationen: CD44+, CD44++ und CD44+++. Sowohl in vitro als auch in vivo generierte alloreaktive TH17-Zellen wurden in der CD44+++ Population, TH1-Zellen hingegen in der CD44++ Population, detektiert. Es wurde beschrieben, dass sowohl eine geringe TZR- als auch eine geringe CD28-Stimulation eher die Bildung von TH17- als TH1-Zellen unterstützen. Unter genau diesen Bedingungen kann CD44 als kostimulatorisches Molekül die Signaltransduktion verstärken. Tatsächlich zeigten allogenreaktive CD44+++ TH-Zellen eine höhere ZAP-70-Phosphorylierung als CD44++ TH-Zellen. Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass CD44 durch die Verstärkung der Signaltransduktion die TH17-Differenzierung fördern kann. / Within the first part of this thesis, the influence of the mitochondrial Protein TCAIM (T cell activation inhibitor, mitochondrial) on T cell activation was investigated. Tcaim expression correlated negatively with the rejection of allografts and it is down-regulated during T cell activation. To study effects of TCAIM during T cell activation, we generated a T cell-specific mouse strain with a Tcaim knock-in (KI) targeted to the Rosa26 locus. Tcaim overexpression changed the mitochondrial morphology and reduced the T cell receptor (TCR)-induced mitochondrial reactive oxygen species production. In vitro activation of Tcaim KI CD4+ T cells resulted in a decreased activation, proliferation and cytokine release. Importantly, Rag-1 knock-out mice, reconstituted with Tcaim KI T cells, tolerated allogeneic skin grafts. Thus, by regulating TCR-induced mitochondrial distribution and ROS production, TCAIM controls important steps during T cell activation and memory formation. The second part dealt with the influence of CD44 surface expression level for T helper cell (Th cell) differentiation. By association with lymphocyte-specific protein kinase (LCK) it can enhance T cell signaling. Allogeneic stimulation of CD4+ T cells resulted in the formation of three distinguishable populations: CD44+, CD44++ and CD44+++. In vitro and in vivo generated allo-reactive TH17 cells were mainly CD44+++. This is in contrast to TH1 cells which were dominantly CD44++. Titration experiments revealed that low TCR- and co-stimulation supports TH17 rather than TH1 development. Under exactly these conditions it was reported that CD44 can act as co-stimulatory molecule and replace CD28. Indeed, CD44+++CD4+ T cells contained already more phosphorylated ZAP-70 as compared to CD44++ cells. Our results support the notion that CD44 enhances TCR signaling strength by delivering LCK, which is required to support TH17 development.

Hyaluronan is a ubiquitous glycosaminoglycan which is an important constituent of the extracellular matrix (ECM). In addition to organizing the extracellular matrix and regulating tissue homeostasis, hyaluronan, by binding to its main cell surface receptor CD44, is involved in intracellular signaling pathways regulating major cellular processes during development, wound healing, inflammation and cancer. Accumulation of hyaluronan in cancer promotes progression of the disease and correlates with poor prognosis. This thesis focuses on the regulation of hyaluronan synthesis and its signaling in normal and cancer cells. Cancer cells in solid tumors are surrounded by stroma, which has an essential role in the growth and metastasis of tumors. Prominent members of the tumor stroma are fibroblasts, which synthesize ECM components, such as hyaluronan, and secrete growth factors, and activate intracellular signaling pathways. We demonstrate a cross-talk between the receptors for platelet-derived growth factor BB (PDGF-BB), transforming growth factor β (TGFβ) and CD44 in dermal fibroblasts. We found that PDGF-BB can activate the Smad signaling pathway downstream of the TGFβ receptor I (TβRI), and that PDGF-BB-induced migration depends on TβRI. CD44 forms a ternary complex with the receptors for PDGF-BB and TGFβ, and negatively regulates their signaling. Furthermore, we demonstrate that TGFβ stimulation of mammary epithelial cells transcriptionally upregulates hyaluronan synthase 2 (HAS2), which is essential for TGFβ-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT); in this process, polarized epithelial cells adapt a mesenchymal phenotype which facilitates migration and invasion. HAS2 protein activity and stability is regulated by posttranslational modifications, including ubiquitination. We investigated the ubiquitination of HAS2 in aggressive breast cancer cells, whose metastasizing capability depends on HAS2-synthesized hyaluronan. We identified two deubiquitinating enzymes, USP4 and USP17, which target HAS2 and affect its activity and stability. In summary, these studies increase the knowledge about the regulation of hyaluronan production and its role in cancer progression.

T cell activation is supposed to require two signals via engagement of the TCR and a costimulatory molecule. However, the signaling cascade of costimulatory molecules has remained elusive. Here, I provide evidence that CD44 supports proliferation as well as apoptosis mainly, if not exclusively, by enhancing signal transduction via the TCR/CD3 complex. Blockade of CD44 interferes with mounting of an immune response. This has been demonstrated by the significantly decreased IL-2 production of a T helper line, when stimulated in the presence of a competing CD44 receptor globulin. To evaluate the underlying mechanism, CD44 was cross-linked by an immobilized antibody (IM7). Cross-linking of CD44 induces proliferation of peripheral T cells and apoptosis of thymocytes and a T helper line in the presence of subthreshold levels of anti-CD3. CD44-induced proliferation was accompanied by an upregulation of the activation markers CD25 and CD69 and an increased cytokine production. TCR-mediated apoptosis was accompanied by an upregulation of CD95 ligand and CD95 receptor, which could be greatly enhanced by costimulation via CD44. On the level of signal transduction, coligation of CD44 with CD3 resulted in a strong and sustained increase of early tyrosine phosphorylation events and upregulated downstream signal transduction pathways, such as the ras/ERK and the JNK signaling cascades. These pleiotropic effects of CD44 are due to its involvement in the most proximal events in TCR signaling, as demonstrated by a strong increase in the phosphorylation of the TCR z-chain and ZAP-70. Notably, cross-linking of CD44 was binding-site dependent and was only effective when supporting colocalization of the TCR/CD3 complex and CD44. Cross-linking of CD44 via immobilized IM7 also induced profound changes in cell morphology, characterized by strong adhesion, spreading and development of surface extensions, which were dependent on a functional tubulin and actin cytoskeleton. These cytoskeletal rearrangements were mediated by rac1, a small GTPase of the rho subfamily, and src-family kinases, two of which, fyn and lck, were found to be associated with CD44. By cross-linkage of CD44 these kinases were redistributed into so called lipid rafts. It is supposed that for T cell activation a relocation of the TCR/CD3 complex into the same membrane microdomains is required. The data are interpreted in the sense that the costimulatory function of CD44 relies on its cooperativity with the TCR. Most likely by recruitment of phosphokinases CD44 significantly lowers the threshold for the initiation of signaling via the TCR. The requirement for immobilized anti-CD44, the necessity for neighbouring anti-CD3 and the dependence on the binding site of CD44 strongly suggest that the costimulatory mechanism involves cytoskeletal rearrangements, which facilitate recruitment and redirection of src-family protein kinases in glycolipid enriched membrane microdomains. / Es ist bekannt, dass die Aktivierung von T-Zellen zwei Signale erfordert, die Bindung des T-Zell-Rezeptors (TZR) an den Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex und die Bindung sogenannter kostimulatorischer Moleküle an ihren Liganden. Über diese Rezeptor-Liganden-Interaktionen wird eine Kettenreaktion von Signalen ausgelöst, die die Aktivierung einer ganzen Reihe von Genen bewirken. Die Signale die über die Liganden Bindung des TZR in Gang gesetzt werden, sind weitgehend bekannt. Hingegen ist unser Wissen über das Funktionsprinzip kostimulatorischer Moleküle äußerst lückenhaft. In der vorliegenden Arbeit wird aufgezeigt, dass und auf welche Weise CD44, eines dieser kostimulatorischen Moleküle, maßgeblich zur Verstärkung der über den TZR transduzierten Signale beiträgt. Ausgangspunkt der vorgelegten Studie war der Befund, dass eine Blockade von CD44, z.B. mittels eines kompetitiven löslichen CD44 Moleküls, die Antigen-induzierte Aktivierung einer T-Zelllinie blockieren kann. Zur Klärung des zugrunde liegenden Mechanismus wurde CD44 mittels immobilisierter Antikörper quervernetzt. Bei gleichzeitiger, suboptimaler Stimulation des T-Zell-Rezeptors induzierte die Quervernetzung von CD44 zum einen die Proliferation reifer T-Zellen, zum anderen den apoptotischen Zelltod von Thymozyten beziehungsweise einer T-Helferzelllinie. Erwartungsgemäß war die CD44-induzierte Proliferation mit der Expression sogenannter Aktivierungsmarker wie CD25 und CD69 und einer erhöhten Zytokinproduktion verbunden. Dementsprechend wurde bei CD44-induzierter Apoptose eine deutlich gesteigerte Expression des CD95 Moleküls und seines Liganden beobachtet. Die kostimulatorische Aktivität von CD44 war mit einer gesteigerten Tyrosinphosphorylierung und einer Hochregulation der ras/ERK und JNK Signalkaskaden verbunden. Da von allen beobachteten Veränderungen bekannt ist, dass sie auch über die Besetzung des TZR mit einem geeigneten Stimulus ausgelöst werden können, war es naheliegend anzunehmen, dass sich die kostimulatorische Funktion von CD44 auf eine Verstärkung der TZR-vermittelten Signale zurückführen läßt. Der Befund einer gesteigerten Phosphorylierung der TZR-z-Kette und der ZAP-70 Kinase, über die die Aktivierung von T-Zellen eingeleitet wird, unterstützt nachhaltig diese Hypothese. Hinzu kommen zwei weitere Befunde: 1. Die Quervernetzung von CD44 führt nur unter der Voraussetzung einer räumlichen Annäherung von CD44 und dem TZR zu einer Unterstützung der T-Zellaktivierung. Diese findet in sogenannten "Rafts" statt; 2. Die Quervernetzung von CD44 führt zu Adhäsion und Zellspreitzung, bedingt durch ein Rearrangement des Zytoskeletts an dem die GTPase rac1 und die src-Kinasen fyn und lck beteiligt sind. Diese beiden Kinasen sind konstitutiv mit CD44 assoziiert. Bei Quervernetzung des Moleküls und Reorganisation des Zytoskeletts wird eine deutliche Anreicherung von fyn und lck in den Rafts, also in direkter Nachbarschaft zum TZR, beobachtet. Diese Daten unterstützen nachhaltig meine Arbeitshypothese, dass sich die kostimulatorische Funktion von CD44 auf eine kooperative Aktivität mit dem TZR zurückführen läßt. Es ist wahrscheinlich, dass durch Rekrutierung der Kinasen lck und fyn der Schwellenwert für die Initiierung von Signalen über den TZR signifikant erniedrigt wird. Die Rekrutierung dieser Kinasen wird durch eine Reorganisation des Zytoskeletts, die mit der Einbringung dieser Kinasen in den Bereich der Rafts einhergeht, ermöglicht. Inwieweit die erhobenen Befunde zur kostimulatorischen Aktivität des Adhäsionsmoleküls CD44 im Sinne eines Verstärkungs-mechanismus eingeleitet durch räumliche Annäherung generelle Gültigkeit haben, kann noch nicht abschließend beantwortet werden. Die Mehrheit der in jüngster Zeit erhobenen Befunde zur Klärung des Funktionsprinzips kostimulatorischer Moleküle bestätigt jedoch das Prinzip nachbarschaftlicher Kooperation.

Orientador: Maria cecilia Rui Luvizotto / Banca: Gisele Fabrino Machado / Banca: Sandra Helena Penha de Oliveira / Resumo: Os tumores mamários são as mais freqüentes neoplasias em cadelas, representando cerca de 50% dos tumores diagnosticadas nesta espécie e tem maior incidência em fêmeas de meia idade a idosas. Têm sido utilizadas como modelo de estudo para neoplasias mamárias de mulher devido às várias características comuns como as similaridades histológicas e imuno- histoquímicas. Na última década, estudos baseados nos perfis moleculares das neoplasias mamárias, tornaram possível a identificação de algumas células neoplásicas com características de células tronco - as células tronco tumorais (CTT). Uma das moléculas putativas para marcação das CTTs é o CD44. A telomerase, que vem sendo relatada como marcador tumoral, é potencialmente expressa também em CTTs. Estudos recentes estabeleceram um elo crucial entre a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e a aquisição de propriedades moleculares e funcionais de células-tronco. Por este motivo analisamos a expressão das proteínas CD44, Citoqueratinas AE1/AE3 e Vimentina, e da enzima telomerase, em tumores mamários de cadelas a fim de investigar o potencial de marcação de CTTs e sua relação com a EMT. Para tal foram utilizados métodos de imuno-histoquímica em tecidos parafinizados tanto in vivo quanto in vitro, fazendo-se uso de técnicas como Tissue MicroArrays (TMA), citoinclusão de tecidos tumorais e cultivos celulares. A expressão da telomerase nas células de tumores mamários cultivadas foi analizada por PCR em tempo real. Nas amostras de tecido parafinizado in vivo, a imunomarcação da citoqueratina demonstrou diferença significativa entre tumores benignos e malignos (p˂0,05), mostrando-se mais intensa em tumores malignos. Já a vimentina apresentou maior intensidade de marcação em tumores benignos, porém não apresentando diferença significativa (p˂0,05)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:Mammary tumors are the most frequent cancers in dogs, representing about 50% of tumors, and have a higher incidence in females of middle aged and elderly. These tumors have been used as a model for breast cancer in women due to several common characteristics such as histological and immunohistochemical similarities. In the last decade, studies based on molecular profiles of breast cancer, made possible the identification of some neoplastic cells with characteristics of stem cells - cancer stem cells (CSC). One of the putative molecules of CSCs is CD44. Telomerase, which has been reported as a tumor marker, is potentially also expressed in CSCs. Recent studies have established a crucial link between the epithelial- mesenchymal transition (EMT) and the acquisition of molecular and functional properties of stem cells. For that reason we analyzed the expression of proteins CD44, Cytokeratins AE1/AE3 and Vimentin, and the telomerase enzyme, in dogs mammary tumors, to investigate the potencial for CSC markers, and its relation with the EMT using immunohistochemistry in paraffin embedded tissues in both in vivo and in vitro, making use of techniques such as Tissue MicroArrays (TMA), cell blocks from tumors and cell cultures. Besides that, we analyzed the telomerase expression in mammary tumor cultivated cells by quantitative real time PCR. Immunostaining of cytokeratin had no significant difference between benign and malignant tumors (p ˂ 0,05), being more intense in malignant tumors. However vimentina showed higher staining intensity in benign tumors, but with no significant difference (p ˂ 0,05). The expression of CD44 was higher in malignant tumors that have greater proliferative and metastatic potencial, however its relation with EMT was not detected in the analyzed tumors. Telomerase expression was positive in the neoplastic cultivated cells, however without significant difference... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Errata slip inserted at back "August 2001." Includes bibliographical references (leaves 254-296)

Errata slip inserted at back / "August 2001." / Includes bibliographical references (leaves 254-296) / xxviii, 296, [9] leaves : charts (some col.), plates (some col.) ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Medicine, 2001

<p>The glycosaminoglycan hyaluronan is an essential component of the extracellular matrix in all higher organisms, affecting cellular processes such as migration, proliferation and differentiation. Hyaluronan is synthesized by a plasma membrane bound hyaluronan synthase (HAS) which exists in three genetic isoforms. This thesis focuses on the understanding of the hyaluronan biosynthesis by studies on the expression and regulation of the HAS proteins.</p><p>In order to characterize the structural and functional properties of the HAS isoforms we developed a method to solubilize HAS protein(s) while retaining enzymatic activity. The partially purified HAS protein is, most likely, not asscociated covalently with other components. Cells transfected with cDNAs for HAS1, HAS2 and HAS3 were studied and all three HAS isozymes were able to synthesize high molecular weight hyaluronan chains in intact cells. The regulation of the hyaluronan chain length involves cell specific elements as well as external stimulatory factors. HAS3 transfected cells with high hyaluronan production exhibit reduced migration capacity and reduced amounts of a cell surface hyaluronan receptor molecule (CD44) compared to wild-type cells.</p><p>The three HAS isoforms were studied and shown to be differentially expressed and regulated in response to external stimuli. Platelet derived growth factor (PDGF-BB) and transforming growth factor (TGF-<i>β</i>1) are important regulators of HAS at both the transcriptional and translational level. The HAS2 isoform is the isoform most susceptible to external regulation.</p><p>The role of the UDP-glucose dehydrogenase in mammalian glycosaminoglycan biosynthesis was assessed. The enzyme is essential for hyaluronan, heparan sulfate and chondroitin sulfate biosynthesis, but does not exert a rate-limiting effect.</p>