Neospora caninum (filo Apicomplexa) é um parasita obrigatório intracelular como todos os membros deste filo, alguns reconhecidos por causarem doenças com impacto relevante na saúde humana (Plasmodium e Toxoplasma) e veterinária (Babesia, Eimeria e Cryptosporidium). Causador da neosporose, N. caninum vem emergindo como um dos maiores causadores de abortos infecciosos em bovinos, levando a consideráveis perdas econômicas na bovinocultura mundial. Devido à sua recente descoberta, o conhecimento sobre diversos processos bioquímicos de N.caninum ainda é limitado, demandando novas pesquisas para a compreensão de seus mecanismos de sobrevivência e consequente identificação de alvos para intervenção terapêutica. O processo de invasão celular é bastante investigado em pesquisas envolvendo apicomplexas, uma vez que a sobrevivência desses parasitas depende do sucesso de sua entrada na célula hospedeira. Proteínas secretadas de organelas filo-específicas (micronemas, roptrias e grânulos densos) estão intimamente envolvidas com a invasão celular. Elas são responsáveis pela interação inicial com a célula hospedeira, participam da junção de movimento formada no momento da invasão, e contribuem para a estabilização do vacúolo parasitóforo. Neste trabalho as proteínas secretadas por taquizoítas de N. caninum foram investigadas de duas formas: (1) por caracterização molecular de proteínas com domínio Apple; e (2) por estudo do secretoma do parasita. Os domínios proteicos do tipo Apple são caracterizados pela capacidade de interação proteína-proteína e proteína-carboidrato, e estão presentes em algumas proteínas micronêmicas com propriedades adesivas. Neste trabalho três proteínas de N. caninum contendo domínios Apple foram caracterizadas: MIC17A, MIC17B e MIC17C. A análise das sequências proteicas e das estruturas dos domínios Apple, obtidas por modelagem molecular, mostraram alta identidade sequencial e estrutural entre MIC17A e MIC17C. Apesar de ser paráloga às outras duas, MIC17B apresenta diferenças importantes em sua sequência e estrutura. Para MIC17B e MIC17C foram realizados experimentos de detecção das proteínas nativas nos extratos total e secretado do taquizoíta que sugerem diferentes formas de processamento entre essas proteínas no parasita. Para MIC17B foi confirmada a localização em micronemas, num padrão diferente do observado para MIC17C. Os ensaios de invasão combinados aos de localização indicam que estas proteínas estejam relacionadas ao processo de invasão celular, porém, suas funções permanecem desconhecidas. O secretoma é o conjunto de proteínas secretadas pelo parasita e, para explorar a composição deste extrato (ESA) no taquizoíta de N. caninum, duas abordagens complementares foram utilizadas. Na primeira abordagem foram identificadas as proteínas presentes no ESA por espectrometria de massas. Na segunda abordagem realizou-se uma ii quantificação relativa das proteínas, marcadas por dois isótopos, nos extratos totais de taquizoítas submetidos ou não ao estímulo secretório. O resultado esperado seria com as proteínas secretadas diminuídas no parasita estimulado. Em ambas as abordagens foram utilizadas técnicas de espectrometria de massas de alta resolução (nanoLC-MS/MS), o que resultou num alto número de identificações; 615 proteínas no ESA e 2011 proteínas quantificadas. A comparação das duas abordagens permitiu o reconhecimento de proteínas com maior probabilidade de secreção. Uma rede de interação entre as proteínas diferencialmente expressas foi predita, gerando resultados que, associados às informações sobre as proteínas aumentadas, permitiram uma investigação sobre proteínas potencialmente envolvidas com a regulação do metabolismo relacionado à secreção. Os resultados obtidos por ambos os estudos aqui demonstrados somam conhecimento acerca do parasita N. caninum e demonstram ser úteis para guiar a busca e seleção de alvos a serem investigados para o desenvolvimento de terapêutica contra a neosporose. / Neospora caninum (Apicomplexa phylum) is an obligatory intracellular parasite like all members from this phylum, some causing diseases with relevant impact on human (Plasmodium and Toxoplasma) and veterinary (Babesia, Eimeria and Cryptosporidium) health. Causative agent of neosporosis, N. caninum has emerged as one of the leading causes of infectious abortion in cattle, generating huge economical losses in worldwide livestock. Due to its recent discovery, knowledge of N. caninum biochemical processes remains scarce, demanding new research for comprehending its survival mechanisms and, consequently, identifying new targets for therapeutic intervention. The invasion process has often been investigated in apicomplexans since their survival depends on the success of their entry into the host cell. Proteins secreted from phylum-specific organelles (micronemes, rhoptries and dense granules) are deeply involved with invasion. They are responsible for the initial interaction with the host cell; participate of the moving junction formed in the moment of invasion; and contribute for the stabilization of the parasitophorus vacuole. In this study, the proteins secreted by N. caninum tachyzoites were investigated in two ways: (1) the molecular characterization of Apple domaincontaining proteins; and (2) exploring the parasite secretome. The Apple protein domains are characterized by the ability to interact as protein-protein and proteincarbohydrate, and are present in some microneme proteins with adhesive properties. Here three N. caninum proteins containing Apple domains were characterized: MIC17A, MIC17B and MIC17C. Analyses of the Apple domains sequences and structures, obtained by molecular modeling, revealed high sequential and structural identities between MIC17A and MIC17C. Although being a paralog of the other two proteins, MIC17B presents significant differences in its sequence and structure. Experiments were performed for native MIC17B and MIC17C detection in the total and secreted tachyzoite extracts, suggesting different processing forms for these proteins in the parasite. For MIC17B, the microneme localization was confirmed, differently from the pattern observed for MIC17C. Invasion and localization assays indicated that these proteins are related to the cell invasion process; nevertheless, their functions remain unknown. The secretome is the set of proteins secreted by the parasite and, to explore this extract (ESA) composition in N. caninum, two complementary approaches were used. Firstly proteins present in ESA were identified by mass spectrometry. In the second approach, a relative quantification was performed on the proteomes of ethanol stimulated/non stimulated tachyzoites, expecting that the secreted proteins would be down regulated at the stimulated parasite. Both approaches were performed with high resolution mass spectrometry techniques (nanoLC-MS/MS), reaching a high number of identifications: 615 proteins iv in ESA and 2011 quantified proteins. The comparison between both approaches allowed the recognition of the most likely secreted proteins. An interaction network was predicted, involving the differentially expressed proteins. These results, associated with the information of up regulated proteins, allowed the investigation of proteins potentially involved with the secretion metabolism regulation. The findings from our two studies add up knowledge about N. caninum and demonstrate to be useful in guiding the search and selection for new targets for therapeutic development against neosporosis.

Depuis plusieurs décennies, la communication intercellulaire par jonctions gap (CIJG) est connue pour être impliquée dans la cancérogenèse. Cette implication semble complexe par le fait que les connexines pourraient augmenter la capacité d’invasion des cellules cancéreuses tout en diminuant leur prolifération. Ceci était particulièrement observé pour la connexine 43 (Cx43) dans le cas de cellules de gliomes. Or, les propriétés d’invasion des gliomes de haut grade, les glioblastomes multiformes (GBM), les rendent difficiles à supprimer par résection chirurgicale et favorisent leur récidive.<br/> Afin de préciser le rôle de la Cx43 dans le contrôle des capacités invasives de cellules de GBM, nous avons utilisé une lignée de cellules de glioblastome humaine U251 exprimant par shRNA des niveaux, en ARNm et protéiques, de Cx43 réduits. Ces clones shRNA des cellules U251 montrent une corrélation entre le niveau d’expression de la Cx43 et le processus d’invasion. Au cours de ce travail, nous avons montré, pour la première fois, que la Cx43 est localisée dans les structures protéolytiques permettant l’invasion, les invadopodes. Nous avons démontré aussi que, par sa localisation, la Cx43 favorise la formation des invadopodes en agissant comme une protéine d’échafaudage qui permet l’interaction de Src de la Cortactine. De plus, l’activité hémicanal de la Cx43, probablement inhibée par le Bisphénol A, possède des effets négatifs sur la cinétique de développement des invadopodes. Une étude du protéome et du sécrétome des cellules U251 et des clones shRNA a permis l’identification des protéines impliquées dans l’invasion et la formation et fonction des invadopodes.<br/> En conclusion, la Cx43 participe au processus invasif des cellules de GBM en favorisant la formation et la fonction des invadopodes. Cette nouvelle fonction de la Cx43 semble être la conséquence de ses propriétés de protéines d’échafaudage et hémicanal, et non de son rôle principalement décrit dans la CIJG. / Since several decades, the gap junction intercellular communication (GJIC) is known to be involved in carcinogenesis. This involvement seems complicated by the fact that connexins could increase cancer cells invasion ability while decreasing their proliferation. This was especially observed for connexin 43 (Cx43) in the case of glioma cells. But high-grade gliomas, glioblastoma multiform (GBM) has invasion properties that make it difficult to remove surgically and promote their recurrence.<br/> To clarify the Cx43 role in the control of GBM cells invasive capacities, we used the GBM U251 cell line expressing Cx43 levels, mRNA and protein, reduced by shRNA strategy. Through this approach, we confirmed that Cx43 expression level is associated with the invasive capacity of GBM cells. Furthermore we have shown, for the first time, that Cx43 is localized in invasive proteolytic structures, the invadopodia. We also show that, by its location, Cx43 promotes invadopodia formation by acting as a scaffolding protein that allows Src and Cortactin interaction. Moreover, Cx43 hemichannel activity, probably inhibited by Bisphenol A, has negative effects on invadopodia kinetics development. A proteome and secretome study of U251 cells and shRNA clones allowed the identification of proteins involved in invasion and invadopodia formation and function.<br/>In conclusion, Cx43 participates in the invasive process of GBM cells by promoting invadopodia formation and function. This new function of Cx43 seems to be the result of its scaffold proteins and hemichannel properties, but not its role described mainly in CIJG.

Le complexe Arp2/3 génère des réseaux d’actine branchés, qui produisent une forcée de poussée permettant à la cellule de remodeler ses membranes. Le complexe WASH active le complexe Arp2/3 à la surface des endosomes et facilite ainsi la scission membranaire des intermédiaires de transports contenants des récepteurs internalisés tels que les intégrines α5β1. De ce fait, le complexe WASH en favorisant le recyclage des intégrines, joue un rôle crucial dans l’invasion des cellules tumorales durant la progression tumorale. Cependant, le mécanisme d’assemblage du complexe WASH est inconnu. Dans cette étude, nous rapportons l’identification du premier facteur d’assemblage du complexe WASH. Nous avons identifié la protéine HSBP1 grâce à un crible des protéines qui se lient aux formes précurseurs des sous-unités mais plus au complexe une fois assemblé. La reconstitution biochimique et la modélisation moléculaire nous a permis de montrer que HSBP1 est associé avec le précurseur trimérique CCDC53, le dissocie et forme un hétérotrimère qui va éventuellement libérer une forme monomérique de CCDC53 pour l’assemblage du complexe WASH. Le rôle de HSBP1 dans l’assemblage du complexe WASH est conservé. En effet, WASH est déstabilisé dans des cellules mammaires par le knock-down de HSBP1 et dans l’amibe Dictyostelium par le knock-out de HSBP1. La déstabilisation du complexe WASH par le knock-out de HSBP1 phénocopie la déplétion de WASH dans l’amibe Dictyostelium. Dans des cellules humaines de carcinomes mammaires l’inhibition de l’expression de HSBP1 altère le recyclage des intégrines à la membrane plasmidique. Il en résulte des adhésions focales défectueuses et des capacités invasives réduites. De plus, HSBP1 est localisé aux centrosomes et est requis pour la polarité des cellules lors de la migration. Enfin, nous avons trouvé que la surexpression de HSBP1 dans des tumeurs mammaires est associée à une augmentation des niveaux du complexe WASH et à un mauvais pronostic pour les patientes atteintes de cancer du sein. En conclusion, HSBP1 est un facteur d’assemblage conservé qui contrôle les niveaux du complexe WASH. / The Arp2/3 complex generates branched actin networks, which produces a pushing force that helps the cell to remodel its membranes. The WASH complex activates the Arp2/3 complex at the surface of endosomes and thereby, facilitates the membrane scission of the transport intermediates containing internalized receptors such as α5β1 integrins. Hence, by promoting integrin recycling, the WASH complex plays a crucial role in tumor cell invasion during cancer progression. However, how cells assemble the WASH complex at first is unknown. Here we report the identification of the first assembly factor of the WASH complex. We identified HSBP1 in a proteomics screen for proteins binding to precursor forms of subunits, but not to the fully assembled WASH complex. Through biochemical reconstitution and molecular modeling, we found that HSBP1 associates with the precursor CCDC53 trimer, dissociates it and forms a heterotrimer that will eventually contribute a single CCDC53 molecule to the assembling WASH complex. The role of HSBP1 in WASH complex assembly is well conserved since WASH is similarly destabilized upon HSBP1 knock-down in mammalian cells or upon HSBP1 knock-out in Dictyostelium amoeba. In line with the defective assembly of the WASH complex, the HSBP1 knock-out closely phenocopies WASH knock-out in amoeba. In human mammary carcinoma cells, HSBP1 depletion results in impaired integrin recycling to the plasma membrane leading to the defective development of focal adhesions and reduced invasion abilities. Moreover, HSBP1 was found to localize at the centrosome and was required for the polarization associated with the migration. On the other end, in mammary breast tumors, we found that HSBP1 was often overexpressed and that its overexpression was associated with increased levels of the WASH complex and with poor prognosis for breast cancer patients. Hence, HSBP1 is a conserved assembly factor that controls the levels of the WASH complex.

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Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit symmetrischem Befall der Gelenke. Die genaue Ätiologie ist bisher unbekannt. Aktivierte synoviale Fibroblasten sollen durch gesteigerte Adhäsion und Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Matrix-lysierenden Proteasen maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues in-vivo-Knorpeldestruktions-Modell zu etablieren, in welchem unter immunkompetenten Bedingungen, die Invasion und Destruktion von Gelenkknorpel durch die Fibroblasten-Zelllinie LS48 über einen längeren Zeitraum simuliert werden kann. Die am Institut für klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig etablierte Zelllinie LS48 wurde in die ipsilateralen Kniegelenke von BALB/c-Mäusen injiziert. Die dadurch induzierte Gewebsdestruktion wurde über zehn Wochen in zweiwöchigem Abstand histopathologisch beurteilt und klassifiziert. Als vergleichende Fibroblasten-Zelllinie wurden nicht-invasive NIH/3T3-Zellen eingesetzt. An Hand der Score-Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion wurde eine mäßige bis schwer-wiegende Gewebsdestruktion durch die LS48-Zellen bereits ab der zweiten Untersuchungswoche lichtmikroskopisch nachgewiesen, ohne dass dabei pathologische Effekte in den kontralateralen Kniegelenken aufgetreten sind. Polarisationsmikroskopisch wurden für den Parameter Knorpeldestruktion vergleichbare Ergebnisse erzielt. Damit wurde gezeigt, dass das Modell BALB/c LS48 ein erfolgversprechendes Instrument darstellt, das zur Testung neuer therapeutischer Strategien gegen die Gelenkdestruktion verwendet werden kann. Inwieweit die Auseinandersetzung der LS48-Zellen mit dem spezifischen Immunsystem der BALB/c-Maus Auswirkungen auf den Verlauf der Gewebsdestruktion hat, sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.

Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit symmetrischem Befall der Gelenke. Die genaue Ätiologie ist bisher unbekannt. Aktivierte synoviale Fibroblasten sollen durch gesteigerte Adhäsion und Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Matrix-lysierenden Proteasen maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues in-vivo-Knorpeldestruktions-Modell zu etablieren, in welchem unter immunkompetenten Bedingungen, die Invasion und Destruktion von Gelenkknorpel durch die Fibroblasten-Zelllinie LS48 über einen längeren Zeitraum simuliert werden kann. Die am Institut für klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig etablierte Zelllinie LS48 wurde in die ipsilateralen Kniegelenke von BALB/c-Mäusen injiziert. Die dadurch induzierte Gewebsdestruktion wurde über zehn Wochen in zweiwöchigem Abstand histopathologisch beurteilt und klassifiziert. Als vergleichende Fibroblasten-Zelllinie wurden nicht-invasive NIH/3T3-Zellen eingesetzt. An Hand der Score-Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion wurde eine mäßige bis schwer-wiegende Gewebsdestruktion durch die LS48-Zellen bereits ab der zweiten Untersuchungswoche lichtmikroskopisch nachgewiesen, ohne dass dabei pathologische Effekte in den kontralateralen Kniegelenken aufgetreten sind. Polarisationsmikroskopisch wurden für den Parameter Knorpeldestruktion vergleichbare Ergebnisse erzielt. Damit wurde gezeigt, dass das Modell BALB/c LS48 ein erfolgversprechendes Instrument darstellt, das zur Testung neuer therapeutischer Strategien gegen die Gelenkdestruktion verwendet werden kann. Inwieweit die Auseinandersetzung der LS48-Zellen mit dem spezifischen Immunsystem der BALB/c-Maus Auswirkungen auf den Verlauf der Gewebsdestruktion hat, sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.:Bibliographische Zusammenfassung II Inhaltsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis IV 1 Einleitung 1 1.1 Rheumatische Erkrankungen 1 1.2 Die rheumatoide Arthritis 2 1.2.1 Immunologische Grundlagen der rheumatoiden Arthritis 2 1.2.1.1 Hypothese der Fibroblasten-Abhängigkeit 3 1.2.1.2 Hypothese der T-Zell-Abhängigkeit 4 1.3 Allgemeine Anatomie und Histologie des Kniegelenks 6 1.4 Die Histopathologie der rheumatoiden Arthritis 9 1.4.1 Verschiedene Synovialmembrantypen bei rheumatoider Arthritis 10 1.5 Tiermodelle zur Untersuchung der rheumatoiden Arthritis 11 1.5.1 Das Tiermodell der Fibroblasten-induzierten Gelenkdestruktion in der BALB/c-Maus 12 1.6 Histopathologische Score-Systeme der rheumatoiden Arthritis in Tiermodellen 13 1.7 Ziel 13 1.7.1 Fragestellungen 14 2 Material und Methoden 16 2.1 Zelllinien und Versuchstiere 16 2.1.1 Die Fibroblasten-Zelllinie NIH/3T3 16 2.1.2 Die Fibroblasten-Zelllinie LS48 16 2.1.3 Die BALB/c-Maus 17 2.2 Tierversuchsplan 18 2.3 Zellkultur 19 2.3.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 19 2.3.2 Reagenzien 20 2.3.3 Durchführung 21 2.4 Isolation der murinen Kniegelenke 22 2.5 Histologische Aufarbeitung 23 2.5.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 23 2.5.2 Reagenzien 24 2.5.3 Entkalkung, Entwässerung, Einbettung und Schneiden der Präparate 26 2.5.4 Azanfärbung nach Heidenhain (Kernechtrubin-Anillinblau-Orange G-Färbung) 27 2.6 Klassifikation mit dem Durchlichtmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (Balb/c-LS48) 29 2.7 Klassifikation mit dem Polarisationsmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (Balb/c-LS48) 29 2.8 Statistik 30 3 Ergebnisse 31 3.1 Score-Erhebung mit dem Lichtmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 31 3.1.1 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Zellinvasion 32 3.1.2 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Pannusformation 35 3.1.3 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Knorpeldestruktion 38 3.2 Datenanalyse der lichtmikroskopisch untersuchten Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 41 3.2.1 Zellinvasion 41 3.2.2 Pannusformation 45 3.2.3 Knorpeldestruktion 48 3.2.4 Gesamtscore 51 3.3 Score-Erhebung mit dem Polarisationsmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 56 3.3.1 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Knorpeldestruktion 56 3.4 Datenanalyse des polarisationsmikroskopisch untersuchten Parameters Knorpel-destruktion für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 59 3.5 Statistischer Vergleich der licht- und polarisationsmikroskopischen Analysemethoden für den Parameter Knorpeldestruktion 62 3.6 Statistischer Vergleich der medialen und lateralen histologischen Sagittalschnitte der Kniegelenke 63 4 Diskussion 64 4.1 Die Bedeutung der histopathologischen Score-Parameter für das Modell der Fibroblasten-induzierten Gelenkdestruktion in der BALB/c-Maus 65 4.1.1 Der Score-Parameter Zellinvasion 65 4.1.1.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Zellinvasion 67 4.1.1.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Zellinvasion für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 69 4.1.2 Der Score-Parameter Pannusformation 70 4.1.2.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Pannusformation 71 4.1.2.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Pannusformation für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 73 4.1.3 Der Score-Parameter Knorpeldestruktion 74 4.1.3.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Knorpeldestruktion 75 4.1.3.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Knorpeldestruktion für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 76 4.1.4 Interpretation des lichtmikroskopisch erhobenen Gesamtscores für das Knorpeldestruktionsmodell (BALB/c-LS48) im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 78 4.1.4.1 Verlaufsvergleich zu anderen Tiermodellen 81 4.2 Die histopathologischen Auswirkungen der Zelllinien LS48 und NIH/3T3 im ipsilateralen Kniegelenk der BALB/c-Maus im Vergleich 83 4.3 Vergleich der medialen und lateralen Sagittalebenen der histologischen Präparate der Kniegelenke 85 4.4 Beurteilung histopathologischer Veränderungen in den kontralateralen Kniegelenken im Verlauf von zehn Wochen 86 4.5 Vergleich der licht- und polarisationsmikroskopischen Untersuchungsergebnisse 87 4.6 Schlussfolgerungen und Ausblick 89 Zusammenfassung 94 Literaturverzeichnis 99 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 116 Eigenständigkeitserklärung VIII Danksagung IX