A utilização do vírus adeno-associado recombinante (AAVr) como vetor de transferência gênica em células tumorais está crescendo. Neste trabalho, o promotor gênico de E2F-1, um promotor ativo durante a divisão celular, foi inserido no AAVr e utilizado para dirigir a expressão do HSV-tk ou luciferase e, simultaneamente, eGFP afim de direcionar a expressão viral para células em proliferação. Em paralelo, foram construídos vetores portadores do promotor constitutivo CMV para servir como controles. O promotor gênico de E2F-1 não foi eficiente em dirigir a expressão dos transgenes na linhagem celular HT1080, enquanto o promotor CMV apresentou uma alta expressão dos repórteres e do gene terapêutico. A baixa eficiência do promotor E2F-1 ainda não foi explorada, mas poderia ser relacionada com o desempenho intrínseco deste promotor, a biologia do vetor AAVr e especificidade celular. Contudo, o bom desempenho do vetor AAVr contendo o promotor CMV abre a possibilidade de realizar novos ensaios de transferência gênica para tratamento e visualização de células tumorais / The utilization of recombinant adeno-associated virus (AAVr) as a gene transfer vector in tumor cells is increasing. In this work, the promoter of the E2F-1 gene, active during cell division, was inserted in an AAVr vector and used to drive the expression of HSV-tk or luciferase and, simultaneously, eGFP with the intent of limiting viral expression to proliferating cells. Also, vectors with the constitutive CMV promoter were constructed to be used as controls. The E2F-1 promoter was not efficient in driving the expression of the transgenes in the HT1080 cell line, while the CMV promoter shows high level expression of the reporter and the therapeutic genes. The low efficiency of E2F promoter has not yet been explored, though this problem could be related to the intrinsic performance of this promoter, the biology of the vector AAV and cell-specific factors. However, the performance of the AAVr containing the CMV promoter creates the possibility of performing new gene transfer protocols for the treatment and visualization of tumor cells.

Um dos principais componentes envolvidos no processo de divisão celular bacteriana é FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica. FtsZ polimeriza no interior da célula formando um anel ao qual dá-se o nome de anel Z, responsável pelo recrutamento de diversas outras proteínas de divisão, formando o divisomo. Como meio de sobrevivência sob condições adversas, alguns procariotos, como B. subtilis, podem sofrer um tipo de diferenciação celular que forma um organismo em estado latente, conhecido como esporo. A primeira etapa da formação do esporo é a mudança da posição do anel Z para mais próximo a um dos pólos da célula, produzindo duas células com tamanhos diferentes. SpoIIE é uma proteína fosfatase integral de membrana, que se localiza especificamente no septo assimétrico de uma célula em processo de esporulação. Além de um papel na ativação do fator de transcrição de esporulação σF, SpoIIE se liga a FtsZ e a auxilia na formação do septo assimétrico. Para definirmos a região de FtsZ responsável pela interação com SpoIIE, neste trabalho foram realizados ensaios de duplo-híbrido utilizando vetores com domínios de ativação e de ligação ao DNA do fator de transcrição GAL4 de levedura fusionados a diferentes porções de FtsZ, bem como a SpoIIE. Esses experimentos não forneceram informações sobre interação entre essas proteínas, já que através deles não foi possível reproduzir o resultado positivo descrito na literatura. Como alternativa ao duplo-hibrido para identificarmos o sítio de interação entre as duas proteínas, criamos uma triagem genética capaz de identificar mutantes de FtsZ que não interagem com SpoIIE, fazendo uso de uma biblioteca de mutantes de FtsZ já disponível no laboratório. Foi padronizada uma técnica de microscopia em larga escala em placas de 96 poços, que permitiu a triagem de mais de mil de mutantes de FtsZ, em busca de um em que SpoIIE-GFP induzido não localizasse no anel Z em célula vegetativa. Porém todos os mutantes triados ainda localizavam SpoIIE-GFP. Paralelamente, foi realizada uma triagem de supressão, utilizando como ponto de partida um mutante de SpoIIE que perdeu capacidade de interagir com FtsZ e buscando mutações em FtsZ que reestabelecessem a interação com SpoIIE mutante. Foram triados cerca de 35000 mutantes nesse ensaio, dentre os quais dezoito apresentaram o fenótipo esperado para um supressor. No entanto, todos os candidatos selecionados tratavam-se de falsos-positivos. O motivo que leva esses candidatos a apresentarem o fenótipo esperado sem reestabelecer a interação entre as duas proteínas ainda é desconhecido. A fim de confirmar se não haveria outras proteínas do divisomo responsáveis por intermediar a interação entre FtsZ e SpoIIE, foram feitos experimentos de co-localização de FtsZ e SpoIIE na ausência de DivIB e FtsA. Em ambos os casos SpoIIE ainda localiza no divisomo, descartando a possibilidade de que DivIB e FtsA sejam mediadores da interação FtsZ-SpoIIE. Por fim, foram realizados experimentos de co-localização de SpoIIE com mutantes de FtsZ previamente identificados em outros experimentos em nosso laboratório. Nesse experimento foi identificado que a expressão de SpoIIE-GFP induzida por IPTG é capaz de reestabelecer a frequência de divisão no mutante FtsZ-R376T, que normalmente é deficiente na formação de divisomos. Esse resultado reforça a idéia de que essas proteínas interagem diretamente, e sugere que SpoIIE é capaz de reestabelecer a atividade de FtsZ em um mutante que apresente falhas na polimerização. / One of the major components involved in bacterial cell division is FtsZ, a protein homologous to the eukaryotic tubulin. FtsZ polymerizes inside the cell forming a ring to which is given the name Z ring, wich is responsible for the recruitment of several other proteins division, forming the divisome. As a means of survival under adverse conditions, some prokaryotes such as B. subtilis may undergo a type of cell differentiation that results in an organism in a latent state, known as a spore. The first stage of the spore formation is to change the Z ring position closer to the poles of the cell, producing two cells of different sizes. SpoIIE is an integral membrane phosphatase protein, which is specifically located in the septum of an asymmetric cell in sporulation process. In addition to a role in the activation of the sporulation transcription factor σF, SpoIIE binds to FtsZ and assists in the formation of the asymmetric septum. To define the FtsZ region responsible for interaction with SpoIIE, in this work we performed tests using two-hybrid vectors with activation and DNA binding domains of the yeast transcription factor GAL4 fused to different portions of FtsZ and SpoIIE. These experiments did not provide information on the interaction between these proteins, since through them it was not possible to reproduce the positive results reported in the literature. As an alternative to the two-hybrid to identify the site of interaction between the two proteins, we created a genetic screening that can identify FtsZ mutants that cannot interact with SpoIIE, using a library of FtsZ mutants already available in the laboratory. We standardized a large scale microscopy using 96-well plates, allowing the screening of over a thousand mutants of FtsZ in search of a induced SpoIIE-GFP which would no longer localize at the vegetative cell Z ring. However, all the screened mutants still localized SpoIIE-GFP. In parallel, we performed a screening of suppression, using as a starting point a SpoIIE mutant that lost the ability to interact with FtsZ and searching for mutations in FtsZ that would reestablish interaction with the SpoIIE mutant. We screened approximately 35,000 mutants in this essay, eighteen of which showed the phenotype expected for a suppressor. However, all selected candidates were false positives. The reason why such candidates do show the expected phenotype without reestablishment of the interaction between the two proteins is still unknown. In order to confirm whether there would be other divisiome proteins responsible for mediating the interaction between FtsZ and SpoIIE, co-localization experiments were made using FtsZ and SpoIIE in the absence of DivIB and FtsA. In both cases SpoIIE still located in divisome, ruling out the possibility that DivIB and FtsA are essencial mediators of the SpoIIE-FtsZ interaction. Finally, co-localization experiments were carried out with SpoIIE and FtsZ mutants previously identified in other experiments in our laboratory. In this experiment it was identified that the expression of IPTG-induced SpoIIE-GFP is able to restore the division frequency in the FtsZ-R376T mutant, which normally is deficient in the formation of divisomes. This result reinforces the idea that these proteins interact directly, and suggests that SpoIIE is able to restore the activity of FtsZ in a mutant that presents defect in polymerization.

A maioria dos tumores sólidos apresentam características aneuplóides. Porém a relação entre aneuploidia e transformação maligna, ainda não está definida. Nos últimos anos diversas proteínas têm sido descritas como reguladoras de eventos durante a divisão celular, principalmente as relacionadas com a formação do fuso bipolar e segregação equacional dos cromossomos. Neste estudo propomo-nos a analisar os efeitos da interferência em dois pontos críticos da mitose, a segregação cromossômica e a citocinese, em relação à aneuploidia e à instabilidade genética tumoral. Nossos dados mostraram que o tratamento sequencial de Monastrol e Blebistatina determinou o surgimento de fusos mitóticos anormais, amplificação centrossômica, localização ectópica de Aurora A e aumento de micronúcleos. Esta interferência pode levar a um quadro de instabilidade genética e, consequentemente a progressão tumoral, abrindo novas possibilidades para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na regulação do ponto de checagem mitótico e resistência a quimioterápicos. / Most solid tumors have aneuploid feature. Therefore the relationship between aneuploidy and malignant transformation is not yet understood. In the last years it has been described many proteins involved in regulation of mitosis, mainly those related to bipolar spindle and chromosome segregation. In this work we propose to study the effects of the interference on two mitotic critical points, the chromosome segregation and cytokinesis, in relation to aneuploidy and genetic tumor instability. Our data showed that sequential treatment with Monastrol and Blebbistatin led to abnormal mitotic spindle, centrosome amplification, Aurora A ectopic and micronucleus increased. This interference can lead to genetic instability and may be involved in a tumor progression, opening news possibilities to study the molecular mechanisms involved in regulation the checkpoint mitotic and resistance to chemotherapy found in genetically unstable cells.

La taille du fruit et la morphologie des tissus du fruit sont des caractères clés définissant la qualité finale du fruit. Parmi la grande diversité de fruits observée dans la nature, la domestication et la sélection ont entrainé d’importantes modifications de la taille et de la morphologie des tissus du fruit. Jusqu'à présent, seuls quelques régulateurs génétiques ont été identifiés, et les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels la morphologie des tissus du fruit est définie restent imprécis. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse est d'identifier et de caractériser de nouveaux régulateurs impliqués dans la morphologie des tissus du fruit. Pour cela, j'ai utilisé une collection de mutants EMS de tomate comme source de diversité génétique et phénotypique et j'ai sélectionné deux mutants présentant des tendances opposées et extrêmes d'épaisseur du péricarpe. Grace à une stratégie de cartographie par séquençage, j’ai identifié une région génétique du chromosome 10, associée au phénotype péricarpe épais. J'ai également étudié le rôle de la Guanylate Binding Protein (GBP) à l’origine du phénotype péricarpe fin chez la tomate. La GBP est une grosse GTP binding protein qui n’a jamais été caractérisée chez les plantes. Afin d'approfondir l’étude de cette protéine, j'ai étudié en parallèle son rôle dans les modèles tomate et Arabidopsis" thaliana. J'ai démontré que les deux protéines homologues sont localisées dans le noyau. La mutation de la GBP chez la tomate induit de fortes altérations de la division et de l'expansion cellulaire à l'intérieur du péricarpe ainsi qu'une altération de la croissance des racines latérales chez la tomate et Arabidopsis, une caractéristique classiquement retrouvée chez les mutants altérés dans la mitose. Cette étude suggère que le GBP joue un rôle dans le contrôle précis des divisions cellulaires dans le péricarpe de tomate. / Fruit size and morphology are key characters defining the final fruit quality. Among the large fruit diversity observed in the nature, human domestication and selection has induced changes in fruit size and tissue morphology. Only a few genetic regulators have been identified so far, thus cellular and molecular mechanisms by which fruit tissue morphology is defined remain incomplete. In this context, the aim of my thesis is to identify and characterize new regulators of fruit tissue morphology. For this purpose, I used a collection of tomato EMS mutants as a source of genetic and phenotypic diversity. I selected two mutants presenting opposite trends of pericarp thickness. Through a mapping-by-sequencing strategy, I identified a genetic region on chromosome 10, associated with an extreme thick pericarp phenotype. I also investigated the role of the Guanylate Binding Protein (GBP) at the origin of a thin pericarp phenotype. The GBP is a large GTP binding protein that was never characterized in plants so far. In order to go deeper into its functional characterization in plants, I studied in parallel the role of the protein in tomato and Arabidopsis "thaliana" models. I showed that both homolog proteins are localized at the nucleus. Mutation of GBP in tomato induced strong alterations in cell division and cell expansion inside the pericarp and altered lateral root growth in tomato and Arabidopsis, a classical feature for mutants impaired in mitosis. This study suggests a role for the GBP in the fine control of cell division in the tomato pericarp.

A divisão celular nas bactérias requer a formação do divisomo, um complexo protéico que tem como o primeira etapa a polimerização da proteína FtsZ, seguida pela associação de 15 outras proteínas conhecidas. Os mecanismos envolvidos na regulação espacial do divisomo são bem caracterizados, mas o controle temporal da divisão celular em relação a outros eventos do ciclo, como a replicação do cromossomo, segue controversa. Neste trabalho, aplicamos a metodologia de microscopia de série temporal para estudar duas questões fundamentais do processo de divisão: a montagem do complexo que executa a divisão e a possibilidade da oscilação periódica na expressão de um ou mais genes envolvidos em divisão possa participar do controle temporal da montagem do divisomo. Para investigar se há oscilação da expressão gênica, construímos inicialmente variantes instáveis GFP através da adição de sequências peptídicas C-terminais que encaminham para a degradação em B. subtilis e utilizamos estes repórteres para criar fusões transcricionais sob o controle de promotores de genes centrais do processo de divisão. Depois de otimizar as condições de microscopia de série temporal com fusões transcricionais usando a variante instável GFPAISV, observamos que a autofluorescência de B. subtilis interferia nas nossas quantificações. Como forma de contornar a autofluorescência, construímos então fusões transcricionais com duas variantes de YFP (proteína fluorescente amarela) e optamos por trabalhar com Ypet-AISV. A análise de filmes de células individuais, tanto com fusões a GFPAISV como a Ypet-AISV, indicou que apenas o promotor do operon ftsL-pbpB apresentava um padrão de oscilação significativamente diferente de um promotor artificial usado como controle negativo. Esta hipótese, no entanto, não foi confirmada por medidas estáticas de populações de células nas quais correlacionamos intensidade de fluorescência com posição no ciclo celular. Portanto, nossos dados não foram capazes de evidenciar flutuações na expressão dos genes ftsL-pbpB, minCD, ftsZ, ftsA e zapA ao longo do ciclo celular. Para estudar a cinética de montagem divisomo foram realizados experimentos de microscopia de série temporal de FtsZ-mCherry e Pbp2B-GFP, onde observamos que a associação de Pbp2B ao divisomo ocorre 3 minutos após a formação do anel de FtsZ em meio rico e 4 minutos em meio mínimo. Também realizamos experimentos de microscopia de série temporal com uma cepa contendo FtsZ-YFP e DivIVA-CFP, determinando que DivIVA é incorporado ao divisomo 16 minutos após a formação do anel de FtsZ em meio rico e 20 minutos em meio mínimo. Estes dados confirmam que a montagem do divisomo ocorre em três etapas, e não duas, como anteriormente proposto. / Cell division in bacteria requires the formation of the divisome, a protein complex that has as the first step polymerization of FtsZ, followed by the assembly of 15 other known proteins. The mechanisms that underlie spatial regulation of divisome assembly have been largely elucidated, but the temporal control that ties the timing of cell division to other cell cycle events, such as chromosomal replication, remains surrounded by controversy. In this work, we use time-lapse microscopy to address two issues in B. subtilis cell division: the timing of divisome assembly, and the possibility that a periodic oscillation in expression of one or more genes essential for divisome assembly may play a role in defining the timing of cell division. To study the possibility of oscilation in gene expression, we have first built unstable variants of GFP by adding to its C-terminus peptide sequences that target the protein for degradation and used those variants to build transcriptional fusions to access the promoter activity of core cell division genes. After optimizing time-lapse conditions with transcriptional fusions to cell divison genes with the unstable GFPAISV, we observed that B. subtilis autofluorescence was an issue to our quantifications. To improve our signal-to-noise ratio, we built transcriptional fusions with two variants of YFP (Yellow Fluorescent Protein), and decided to work with Ypet. In our single-cell analysis for GFPAISV and for Ypet-AISV, only the ftsL operon promoter presented an oscilating pattern different from our negative control. This was not confirmed, however, when we attempted to correlate fluorescence signal with cell cycle position in static single-cell measurements. Thus, we conclude that that there are no fluctuations in ftsL, pbpB, minCD, ftsZ, ftsA or zapA gene expression throughout the cell cycle. To study divisome assembly we performed time-lapse microscopy of FtsZ-mCherry and Pbp2B-GFP, and determined that the association of Pbp2B occurs 3 minutes after FtsZ polymerization in rich medium and 4 minutes in minimal medium. We also performed time-lapse microscopy with FtsZ-YFP and DivIVA-CFP, determining that DivIVA is incorporated to the divisome in 16 minutes after FtsZ polymerization in rich medium and 20 minutes in minimal medium. This data confirms the assembly of the divisome in three steps rather than two, as previously proposed.

A divisão celular bacteriana é orquestrada por FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica que possui a capacidade de polimerizar e gerar uma estrutura chamada de anel Z. O local onde esta estrutura citoesquelética contrátil é formada determina o futuro sítio de divisão. O complexo MinCD é um dos principais reguladores da posição da divisão, favorecendo a montagem do anel Z precisamente na região medial da bactéria. MinCD age como um inibidor sítio específico da polimerização de FtsZ, atuando preferencialmente nos polos celulares. MinC é a proteína do complexo que atua diretamente sobre FtsZ e inibe sua polimerização. Essa tese elucida a interação entre FtsZ e MinC e sugere o mecanismo exercido por MinC em Bacillus subtilis. Foi triada uma biblioteca de mutantes randômicos de FtsZ para identificação de mutantes resistentes à ação de MinC. Dentre estes, as substituições K243R e D287V, quando caracterizados usando espalhamento de luz e espectroscopia de fluorescência impediram a interação com MinC. Como as mutações estavam localizados em torno das hélices H-9 e H-10 no domínio C-terminal de FtsZ, concluímos que esta região representa o sítio de interação com MinC desta proteína. Como complemento ao mapeamento do sitio de ligação de MinC em FtsZ, identificamos a região de MinC que interage com FtsZ. Para tanto, escolhemos resíduos de MinC para mutagênese e caracterização. A escolha priorizou os resíduos conservados entre espécies Gram-positivas, experimentos de RMN, carga e exposição ao solvente dos mesmos. Dentre os resíduos de MinC mutados que afetaram sua capacidade de inibir a polimerização de FtsZ in vitro foram: Y8 e K12 (β-1), K15 (alça-2), H55 (β-3) , H84 (β-4) e K149 (C-terminal). Sendo assim, podemos concluir que a face de interação para FtsZ em MinC de B. subtilis é a única folha β do domínio N-terminal desta proteína. Com base nos sítios mapeados das duas proteínas experimentalmente, criamos um modelo in silico do complexo MinC-FtsZ por docking molecular. De acordo com o modelo gerado, MinC interage com a porção lateral de polímeros de FtsZ. Isto sugere que MinC atue na inibição da formação de feixes de filamentos de FtsZ, impedindo assim a formação de anéis Z funcionais. Esse mecanismo de ação do sistema Min é diferente do proposto para E. coli, no qual MinC interage com a face de polimerização FtsZ-FtsZ e impede a formação de protofilamentos de FtsZ. / Bacterial cell division is orchestrated by FtsZ, a protein homologous to eukaryotic tubulin that has the ability to polymerize and generate a cytoplasmic structure called the Z ring. The subcellular location where this cytoskeletal structure is formed determines the future division site. The MinCD complex is one of the main regulators of the position of cell division, driving the assembly of Z-ring precisely at the medial region of the cell. MinCD acts as a site-specific inhibitor of FtsZ polymerization, blocking Z ring formation at the cell poles. MinC is the protein of the complex that acts directly on FtsZ and inhibits its polymerization. This thesis elucidates the interaction between FtsZ and MinC and suggests the MinC mechanism in Bacillus subtilis. An ftsZ randomly mutagenized library was screened to identify mutants that are resistant to MinC action. Using right-angle light scattering and fluorescence spectroscopy we showed that substitutions K243R and D287V lost the interaction to MinC. These substituted residues clustered around the H-9 and H-10 helices in the C-terminal domain of FtsZ, thus, we conclude that this region is the binding site for MinC. In addition to mapping the MinC binding site on FtsZ, we also identified the FtsZ binding site in MinC. Based on residue conservation, NMR experiments and exposure to solvent, we chose residues of MinC for mutagenesis and characterization. The substituted residues that di srupted MinC ability to inhibit FtsZ polymerization in vitro were: Y8 and K12 (β-1), K15 (turn-2) , H55 (β-3), H84 (β-4) and K149 (C-terminal). Thus, we conclude that the binding site of MinC for FtsZ is located on the β only sheet at the N-terminal domain of MinC from B. subtilis. Finally, based on the binding sites of the two proteins mapped experimentally, we created a model of the complex between MinC and FtsZ by molecular docking. According to the generated model, MinC interacts with the lateral portion of FtsZ polymers. This indicates that MinC should inhibit assembly of higher order FtsZ polymers, thereby preventing the formation of a functional Z-ring. This mechanism of Min is different from that proposed in E. coli, in which MinC interacts with FtsZ polymerization interface and inhibits FtsZ protofilament formation.

O mecanismo de divisão mais comum entre procariotos é a divisão binária, na qual a célula- mãe reparte seu genoma e conteúdo citoplasmático de forma igual entre duas células filhas. Esse processo é mediado por um complexo protéico especializado, chamado divisoma, composto por cerca de 20 proteínas, que promovem a constrição da parede celular e membrana citoplasmática, formando o septo de divisão. O complexo é organizado em torno do anel Z, uma estrutura em anel composta pela proteína FtsZ, um homólogo de tubulina presente na maioria dos procariotos e em algumas organelas de eucariotos. Partindo de um levantamento detalhado da distribuição dos genes do divisoma em genomas completos de procariotos, aplicamos métodos de máxima verossimilhança para inferência de estados ancestrais e reconstruímos o conteúdo gênico do divisoma no ultimo ancestral comum das bactérias atuais. Estendendo essas análises com a aplicação de métodos filogenéticos, inferimos os eventos responsáveis pelas variações de composição deste complexo, observadas entre os diferentes grupos de bactérias. Nossos resultados mostram que o último ancestral comum de todas as bactérias já possuía a maior parte dos componentes conhecidos do divisoma, sugerindo a existência de uma parede de peptideoglicano e a presença de um aparato molecular tão ou mais complexo que o observado nas linhagens atuais, incluindo a presença de componentes considerados acessórios e de distribuição relativamente restrita, como as proteínas envolvidas na localização do anel Z (sistema Min) e alguns efetores positivos da polimerização de FtsZ. Observamos também que a evolução do complexo não foi muito afetada por eventos de transferência lateral, mas apresenta vários exemplos de perda de genes, em especial em linhagens com genoma reduzido, o que sugere a redundância de vários componentes já presentes no ancestral e a freqüente redução da complexidade, pelo menos dos componentes centrais do divisoma. Episódios de expansão de famílias de componentes do divisoma em linhagens específicas e os mecanismos evolutivos responsáveis pela incorporação de tais variações são discutidos. A caracterização da história evolutiva detalhada do divisoma, aqui apresentada, poderá servir como ponto de partida para novas análises evolutivas e como base para elaboração de experimentos funcionais. / The most common cell division mechanism among prokaryotes is binary fission, where a mother cell partitions its cytoplasm and genome equally among two daughter cells. This process is mediated by a specialized protein complex, known as the divisome, composed of around 20 proteíns, that promotes constriction of the cell wall and cytoplasmic membrane, thus forming the division septa. The complex is organized around the Z-ring, a ring-shaped struture composed by FtsZ, a tubulin homolog present in most prokaryotes and some eukaryotic organelles. After a detailed revision of the distribution of divisome genes among completely sequenced prokaryotic genomes, we applied maximum likelihood methods for the inference of ancestral states and reconstructed the gene content of the divisome in the last common ancestor of all extant bacteria. We then performed phylogeneticanalysis of all cell division genes and inferred the series of events responsible for the observed variations of the complex´s composition among bactérial lineages and their common ancestor. Our results show that the last common ancestor of all bacteria already possessed most of the known divisome components, thus suggesting the existence of a peptidoglycan cell wall and the presence of a molecular apparatus, perhaps more complex than those found in extant bacteria, including the presence of some accessory components with a somewhat restricted distribution, like the proteíns involved in the localization of the Z-ring (Min sistem) and some positive effectors os FtsZ polimerization. We also observed that the complex´s evolution was almost never the subject of horizontasl gene transfer events, but shows several examples of gene loss, specially in lineages displaying clear signs of genome reduction, thus suggesting the redundancy of several components in the ancestral divisome and a certain degree complexity reduction, at least for core components of the divisome. Lineage specific expansion of divisome component and the evolutionary mechanisms behind such processes are discussed. This characterization of the detailed evolutionary history of the divisome might serve as a starting point for new evolutionary analysis and as a basis for the design of functional experiments.

No description available.

Abstract not available

DivIVA is a Gram-positive cell division protein involved in chromosome segregation, midcell placement of the cell division machinery, complete septum closure, and polar growth and morphogenesis. Although well conserved across various Gram-positive species, DivIVA is believed to be relatively species specific. One similarity among DivIVA homologues is the ability to oligomerize through coiled-coil interaction into complexes comprising 10-12 monomers. To date, the importance of DivIVA oligomerization and the N-terminal coiled-coil for its proper function in bacterial cell division has not been reported. This study examined the biological significance of DivIVA oligomerization and the N-terminal coiled-coil in bacterial cell division. This research provides evidence that the N-terminal coiled-coil and oligomerization is essential for the proper biological function of DivIVA_Ef in <i>Enterococcus faecalis</i> cell division. Introduction of point mutations into chromosomal <i>divIVA</i>_Ef known to disrupt either the N-terminal coiled-coil or the two central coiled-coils, involved in oligomerization, were found to be lethal unless rescued by <i>in trans</i> expression of wild type DivIVA_Ef. Using this rescue method, the N-terminal <i>divIVA</i>_Ef mutant strain, <i>E. faecalis</i> MWMR5, and the mutant strain with partial disruption of oligomerization, <i>E. faecalis</i> MWMR10, were successfully rescued. Differential Interference Contrast (DIC) and Transmission Electron Microscopy (TEM) were utilized to determine the phenotypes of <i>divIVA</i>_Ef mutant strains <i>E. faecalis</i> MWMR5 and MWMR10. Both these strains showed asymmetrical division, loss of normal lancet shape, and irregular chains. Full disruption of oligomerization with point mutations in both central coiled-coils resulted in a dominant lethal phenotype. These results demonstrate the essentiality of the N-terminal coiled-coil and oligomerization of DivIVA_Ef for its proper biological function in <i>E. faecalis</i> cell division.<p> Previous detection of DivIVA interaction with a novel cell division protein, MLJD1, by screening a Yeast Two-Hybrid (Y2H) was weak. GST-pulldown and immunoprecipitation did indicate DivIVA_Ef interaction with MLJD1, but another in vivo assay was required to support these results. In this study I demonstrate a strong interaction, using an in vivo Bacterial Two-Hybrid (B2H) assay, between DivIVA_Ef and a fragment of MLJD1 containing two cystathionine-beta-synthase (CBS) domains. The <i>in vitro</i> and <i>in vivo</i> results thus confirm interaction between DivIVA_Ef and MLJD1.<p> Another objective of this study was to determine the localization of DivIVA and MLJD1 in <i>E. faecalis</i>. Localization of DivIVA_Ef in <i>E. faecalis</i> was found to be similar to DivIVA localization in <i>Bacillus subtilis</i> and <i>Streptococcus pneumonia</i>. DivIVA_Ef was diffused along the cell membrane and, as chromosome replication and segregation and cell division proceeded, DivIVA_Ef migrated to the cell poles and then concurrently to the division site. Intriguingly, MLJD1 was found to localize in the same pattern as DivIVA_Ef in <i>E. faecalis</i>, further implicating MLJD1 as a bacterial cell division protein.<p> Since MLJD1 has potential DNA binding capabilities a proposed model of its role in cell division has been proposed. I hypothesize that MLJD1 could be forming a bridge between DivIVA_Ef and the chromosome to aid in proper chromosomal replication and segregation. This model could explain how DivIVA_Ef is involved in chromosome replication. This model is similar to the role of RacA in sporulation in <i>B. subtilis</i> where RacA directs the chromosome during sporulation through direct interaction with DivIVA_Bs and Spo0J.<p> This study has set some important and essential ground work for developing a novel model of cell division for the elusive Gram-positive coccal bacterial strains.