Malgré l’évolution des outils de bio-ingénierie tissulaire et la sophistication des recherches visant à développer de nouveaux substituts cutanés, la prise en charge clinique des brûlures sévères a relativement peu évolué depuis plus de 30 ans. Si la survie est quasiment garantie par l’utilisation de cultures d’épidermes autologues (CEA), le traitement des grands brûlés n’en reste pas moins traumatisant, avec l’émergence de séquelles physiques (cicatrices hypertrophiques, dyschromies, fragilité cutanée), pathophysiologiques (désordres métaboliques et immunitaires), et neuropsychologiques (neuropathies, douleurs chroniques, syndrome de stress post-traumatique). Depuis leur découverte dans les années 1960, les Cellules Stromales Mésenchymateuses (CSM) ont suscité un intérêt grandissant dans le domaine de la thérapie cellulaire, en raison de leurs propriétés trophiques et immunomodulatoires. La découverte de leur haute plasticité face à divers stimuli environnementaux a plus récemment ouvert le champ de nouvelles stratégies de thérapie ciblée appelées « préconditionnement ». Ainsi, cette thèse a pour objet l’évaluation d’une stratégie de préconditionnement de CSM, afin d’en potentialiser l’action thérapeutique, dans le cadre du traitement de brûlures par CEA. Ce travail de thèse a été partagé en trois unités expérimentales. Tout d’abord la stratégie de préconditionnement a été mise au point sur des modèles de cicatrisation in vitro, permettant ainsi de souligner le rôle intéressant de l’interleukine-1β (IL-1β) et de la substance P (SP). Ensuite, l’efficacité et les mécanismes d’action de ces facteurs de préconditionnement ont été évalués in vitro, puis in vivo sur un modèle de plaie excisionnelle, en utilisant les CSM ou leurs produits de sécrétion. Il a ainsi pu être démontré que l’IL-1β améliorait l’efficacité des CSM en promouvant leur activité anti-inflammatoire, pro-migratoire et de remodelage. Il a également été montré que cet effet était en partie lié à un mécanisme impliquant la voie du TGF-β1. Enfin, la plus-value de cette stratégie thérapeutique a fait l’objet d’une étude in vivo sur un modèle de brûlure profonde mimant la prise en charge du patient sévèrement brûlé. Malgré divers problèmes techniques limitant la prise de greffe de CEA dans ce modèle, l’effet anti-inflammatoire et pro-angiogénique des CSM a pu être confirmé. Ces résultats semblent donc montrer l’intérêt d’une thérapie par CSM préconditionnées. Des études précliniques complémentaires sont maintenant requises pour vérifier la plus-value d’une telle thérapie dans le contexte de la brûlure cutanée. / Since the 1980’s, little progress has been made in the management of major burns, in spite of several research advances in the field of skin tissue engineering and regenerative medicine. Developed in 1975, Cultured Epithelial Autografts (CEA) are the last-in-date significant breakthrough, allowing patient survival in most critical cases. However, patients still have to cope with debilitating sequelae including hypertrophic scars, skin fragility, immunometabolic dysfunctions, chronic pain and post-traumatic stress disorder. Mesenchymal Stromal Cells (MSC) have raised an increasing interest during the past 50 years due to their trophic and immunomodulatory properties. Recent findings about their high plasticity to external stimuli have fostered the development of new targeted therapies known as “preconditioning strategies”. This PhD work thus aimed to assess a MSC preconditioning strategy for the treatment of major burns using CEA. The present work was divided into three main experimental parts. First, in vitro experiments were developed in order to set up the preconditioning strategy, and revealed the interesting role of both interleukin-1β (IL-1β) and substance P (SP). Then, both effectiveness and mechanism of action of these preconditioning modalities were assessed in vitro and in vivo, either using MSC or their secretory products. It was thus shown that IL-1β could potentiate MSC effectiveness through the promotion of pro-migratory, anti-inflammatory and pro-remodeling activities. This effect was shown to be partly mediated by the TGF-β1 signaling pathway. At last, this preconditioning strategy was evaluated in a third degree burn rat model mimicking the surgical treatment applied to severe burn patients. Despite technical hurdles limiting CEA engraftment, anti-inflammatory and pro-angiogenic properties of MSCs were confirmed in this model. These preliminary results underline the potential of a preconditioned MSC therapy in wound healing. Additional preclinical studies are now required to corroborate the benefit of such a therapy in major burns.

Dans cette thèse, nous avons combiné les approches des cultures single-cell, de cytométrie en flux,des analyses de métabolisme énergétique et de génétique moléculaire afin d’explorer les effets del’Acétate d’α-Tocopherol (α-TOA) sur les cellules stromales mésenchymateuses (MStroC) et leurs souspopulations fonctionnelles (cellules souches et progénitrices mésenchymateuses). L’autre but était de tester une molécule de miR-210 par rapport à son utilisation potentielle comme « hypoxia mimicking molecule ». Après avoir démontré l’hétérogénéité de la population MStroC et conclu que la population de premier passage est appropriée pour des expérimentations ultérieures, nous avons trouvé que l’α-TOA présentait un effet positif sur le maintien de la capacité proliférative élevée des cellules souches mésenchymateuses. Cet effet est accompagné d’une atténuation de l’activité de la chaîne de transport d’électrons (ETC) qui pourrait d’autre part expliquer l’accroissement modéré du niveau des Reactive Oxygen Species mitochondriales (mtROS) que nous avons détectées. L’augmentation du niveau de mtROS pourrait être associée à une dégradation de protéine HIF-1 dans la population MStroC exposée à l’α-TOA. Bien que nous n’ayons pas détecté d’augmentation compensatoire de la glycolyse, les phénomènes observés représentent en partie la réponse cellulaire complexe au faible niveau d’O2. Il a été établi que ce phénomène était relié au maintien de primitivité des cellules souches. Le mécanisme exact reste à clarifier ainsi que son potentiel translationnel. En outre, nous avons apporté la preuve que miR-210 fait partie intégrante de la réponse des MStroC à la faible concentration en O2. Dans cette étude, nous avons montré que l’augmentation de l’expression de miR-210 sur une période courte (jusqu’à 24 heures) et après une période étendue (jusqu’à 72 heures) d’exposition des MStroC à une faible concentration en O2. De plus, nous avons prouvé que ce micro ARN pouvait être régulé par les deux facteurs transcriptionnels HIF-1 et HIF-2, nous laissant penser que ceci faisait partie intégrante de la réponse des MStroC à une faible concentration en O2. Jusqu’à présent, nos données suggèrent que miR-210 est digne d’intérêt en tant que bonne molécule « hypoxia mimicking ». / In this thesis, we combined approaches of single-cell cultures, flow-cytometry, energetic metabolismanalysis and molecular genetics in order to get insight in the effects of α-Tocopherol-Acetate (α-TOA)on Mesenchymal Stromal Cells (MStroC) and their functional subpopulations (mesenchymal stem and progenitor cells). The other aim was to test a miR-210 molecule with respect to its potential use as hypoxia mimicking molecule. After defining MStroC population heterogeneity and concluding that the first passage population is convenient for further experiments, we demonstrated that α-TOA exhibits a positive effect on the maintenance of high proliferative capacity of mesenchymal stem cells. This effect could be associated with an attenuation of electron transport chain (ETC) activity, which, on the other hand could explain moderate increase in the level of mitochondrial Reactive Oxygen Species (mtROS) we detected. The increase in mtROS level could be associated with a decreased HIF-1 alpha protein degradation in MStroC exposed to α-TOA. Although we did not detect a compensatory increase in glycolysis, the observed phenomena depict part of a complex cellular response to the low O2 that is demonstrated to be related with maintenance of stem cell primitiveness. The exact mechanism remains to be elucidated as well as its translational potential. In addition, we provided new evidences that miR-210 is integral part in MStroC response to low O2. In the study, we showed increased in miR-210 expression in a short-term (up to 24 hours) and after extended (up to 72 hours) MStroC exposed to low O2. Moreover, we demonstrated that this micro- RNA could be regulated by both HIF-1 and HIF-2 transcriptional factors, suggesting it as integral part of MStroC response to low O2. So far, our data suggest that miR-210 is worthy to be considered as good hypoxia mimicking molecule.

En raison de leur multipotence considérable, les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont été énormément utilisées en clinique dans le contexte de la médecine régénérative. Pourtant, la stimulation des CSM avec de faibles concentrations d'interféron-gamma (IFN-gamma) déclenche une augmentation du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I et II, et surtout une capacité de novo de présentation croisée des antigènes. Ainsi, malgré leurs propriétés immunosuppressives naturelles, les CSM peuvent être modulées pour devenir pro-inflammatoires. Comme le dérivé pyrimidoindole UM171 induit l’augmentation de l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la présentation antigénique dans les cellules souches hématopoïétiques humaines, nous avons étudié son potentiel pour le déclenchement de la présentation antigénique par les CSM. L'analyse par cytométrie en flux a montré une élévation des niveaux de H2-kB après le traitement avec le médicament, en corrélation avec une augmentation de la présentation de l'antigène, démontrée par une activation plus importante de la lignée de cellules T B3Z spécifique au peptide SIINFEKL. Cette présentation croisée de novo d'un peptide immunogène ne résulte pas d'une augmentation de l'absorption ou de la digestion enzymatiques des protéines, mais plutôt de l'expression du gène Psmb8 induit par le médicament. Comme le traitement avec plusieurs antioxydants et inhibiteurs des complexes de la chaîne de transport des électrons a réduit de manière significative les effets observés, nous concluons que la présentation croisée médiée par UM171 est dépendante des ROS. Dans le contexte de la vaccination thérapeutique, l'immunisation avec des CSM traitées par UM171 chez des souris présentant des tumeurs EG.7 préétablies a permis d'obtenir un taux de survie de 40%. Dans l'ensemble, notre étude révèle une nouvelle approche pharmacologique pour modifier les CSM afin qu'elles deviennent des cellules présentatrices d'antigènes, ce qui permet de développer de nouveaux vaccins anticancéreux innovants et puissants. / Due to their considerable multipotency, mesenchymal stromal cells (MSCs) have been tremendously employed in the clinic for regenerative medicine. Yet, stimulation of MSCs with low concentrations of interferon-gamma (IFN-gamma) triggers an increase in the major histocompatibility complex I and II, and most importantly, a de novo antigen cross-presentation capacity. Thus, despite their natural immunosuppressive properties, MSCs can be modulated to become pro-inflammatory. As the pyrimidoindole derivative UM171 induces the upregulation of several antigen presentation-involved genes in human hematopoietic stem cells, we investigated its potential for inducing antigen presentation by MSCs. Flow cytometry analysis showed an upregulation in H2-kB levels after treatment with the drug, correlating with an increase in antigen presentation indicated by higher activation of the SIINFEKL-specific B3Z T cell line. This de novo cross-presentation of an immunogenic peptide did not result from an increase in protein uptake or processing, but rather stemmed from the drug-induced expression of the Psmb8 gene. As treatment with multiple antioxidants and inhibitors of the electron transport chain complexes significantly reduced the observed effects, we conclude that UM171-mediated cross-presentation is ROS-dependent. In the context of therapeutic vaccination, immunization with UM171-treated MSCs in mice with pre-established EG.7 tumors resulted in 40% survival. Overall, our study reveals a new pharmacological approach in modifying MSCs to become antigen presenting cells, hence allowing the development of future innovative and potent anti-tumoral vaccines.

L'efficacité de la réponse antitumorale repose sur l'activité des cellules T cytotoxiques, qui peut être stimulée par des vaccins contenant des antigènes spécifiques aux tumeurs. Malgré le fait d'être les principales cellules présentatrices d'antigènes (CPA) responsables de l'activation des cellules TCD8, les cellules dendritiques (CD) ont rencontré des défis dans le développement de vaccins contre le cancer, notamment en ce qui concerne leur fabrication et efficacité. Pour combler ces problèmes, cette étude propose d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) comme plateforme de vaccination alternative, en exploitant les avantages des CSMs en matière de fabrication, de sécurité et de plasticité. La plasticité remarquable des CSMs leur permet d'acquérir une capacité de présentation croisée sous des stimuli spécifiques. Étant donné que la présentation croisée est essentielle pour induire l'activation des cellules T contre les antigènes tumoraux, cette étude vise à convertir les CSMs en cellules présentatrice d‘antigènes en améliorant l'exportation des antigènes des endosomes vers le cytosol - une étape critique du processus. Dans cette démarche, nous avons examiné une librairie de molécules dérivés de l’Accum, une molécule initialement conçue pour favoriser la destruction de la membrane endosomale. Après avoir évalué leur potentiel à induire la présentation croisée, nous avons sélectionné la molécule A1 pour des investigations subséquentes. Les études mécanistiques ont démontré qu'A1 déclenchait des processus cellulaires essentiels favorisant une présentation croisée efficace, notamment une augmentation de la capture, dégradation et évasion des antigènes des endosomes ainsi que la production de d’espèces oxygénés réactifs. L'efficacité thérapeutique des CSMs reprogrammées par A1 (ARM) en tant que vaccin anticancéreux a été évaluée chez des souris ayant des tumeurs, en monothérapie et en combinaison avec l’anti-PD-1. La thérapie combinée ARM a induit une régression tumorale et a augmenté les taux de survie dans les modèles de tumeurs solides. En conclusion, cette étude présente une stratégie innovante pour transformer les CSM en cellules à présentation croisée en déclenchant l'échappement endosomal de l'antigène. Les cellules ARMs en association avec des inhibiteurs des points de contrôle immunitaire présentent un potentiel en tant que plateforme de vaccination contre les tumeurs solides. De plus, ces résultats soulignent l'importance de l'évasion des endosomes dans la présentation croisée d‘antigènes et ouvrent la voie à de nouvelles plateformes de vaccins contre le cancer. / The effectiveness of antitumoral response relies on cytotoxic T-cell activity, which can be stimulated through vaccines carrying tumor-specific antigens. Despite being the primary antigen-presenting cells (APCs) responsible for CD8 T-cell activation, dendritic cells (DCs) have encountered challenges in cancer vaccine development, particularly in manufacturing and efficiency. To address this gap, this study proposes mesenchymal stromal cells (MSCs) as an alternative vaccine platform, leveraging the advantages in manufacturing, safety profile, and plasticity of MSCs. The remarkable plasticity of MSCs enables them to acquire cross-presentation capacity under specific stimuli. Given that cross-presentation is pivotal for inducing T-cell activation against tumor antigens, this study aims to convert MSCs into antigen cross-presenting cells by enhancing the export of antigens from endosomes to the cytosol—a critical step in the process. In this pursuit, we screened a library of Accum and variant molecules designed to promote endosomal disruption. After evaluating their potential to induce cross-presentation, we selected the molecule A1 for further investigation. Mechanistic studies demonstrated that A1 triggers essential cellular processes supporting efficient cross-presentation, including enhanced antigen uptake, processing, endosomal escape, and reactive oxygen species production. The therapeutic efficacy of A1-reprogrammed MSCs (ARMs) as an anticancer vaccine was evaluated in tumor-bearing mice, as monotherapy and combined with anti-PD-1. In solid tumor models, ARMs combination therapy induced tumor regression and increased survival rates. In conclusion, this study presents an innovative strategy to transform MSCs into cross-presenting cells by triggering antigen endosomal escape. ARM cells in combination with immune checkpoint inhibitors hold potential as a vaccination platform against solid tumors. These findings underscore the importance of endosomal escape on antigen cross-presentation and pave the way for new cancer vaccine platforms.

L’hématopoïèse est un processus finement régulé pour permettre sa pérennité et son adaptation aux contraintes physiologiques et pathologiques. Ce potentiel repose en grande partie sur les capacités de quiescence, auto-renouvellement, division asymétrique et multipotence des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Les CSH et progéniteurs hématopoïétiques (CSPH) sont principalement régulés de façon extrinsèque au sein des niches hématopoïétiques médullaires et cette régulation fait intervenir, des contacts intercellulaires et des facteurs diffusibles. Le phénotype « side-population » (SP), secondaire à l’efflux actif d’un colorant fluorescent (Hoechst 33342) par des pompes de type multidrugresistance, est une caractéristique des cellules souches de la plupart des tissus. Au sein de l’hématopoïèse, le phénotype SP est un excellent moyen pour identifier les CSH murines et est associé à leur quiescence et à leur adhésion à la niche endostéale, mais sa valeur comme marqueur des CSH est plus discutée chez l’homme. Les cellules SP, de par leur nature, sont également étudiées en oncologie, et sont associées aux cellules tumorales les plus résistantes et les plus tumorogènes. La compréhension des mécanismes régulant la fonctionnalité SP devrait permettre d’ouvrir des pistes en physiologie quand à la compréhension de la régulation des CSPH par les niches mésenchymateuses et en pathologie pour cibler les mécanismes de chimiorésistance.Dans ce travail nous montrons pour la première fois chez l’homme que l’acquisition du phénotype SP est un phénomène dynamique et versatile sous le contrôle du stroma médullaire. Le stroma médullaire est en effet capable de maintenir le phénotype SP de CSPH médullaires et d’induire le phénotype SP de CSPH circulants. L’acquisition du phénotype SP par les cellules circulantes nécessite à la fois un « nichage » au sein du stroma et des facteurs diffusibles. Les cellules circulantes capables d’acquérir le phénotype SP contiennent des CSPH au regard de (i) leur expression du CD34, (ii) leur richesse en cellules quiescentes, (iii) leur capacité clonogénique et proliférative en cultures secondaires, (iv) leur expression des gènes de « nichage » et de « souchitude », (v) leur capacité de migration en réponse à un gradient de CXCL12, (vi) leur activité LT-SRC in vivo. De plus nous avons mis en évidence, au sein de ces CSPH SP+CD34+ révélés par le stroma médullaire, une sous-population CD44-/faible qui pourrait contenir les cellules plus immatures en raison de sa quiescence et de l’intensité de son efflux du Hoechst 33342. Les études mécanistiques montrent que l’acquisition du phénotype SP par les cellules circulantes est sous la dépendance de l’intégrine VLA-4 et du CD44. La transduction du signal implique des protéines G et la famille des Src-kinases. Nous montrons également que le stroma médullaire peut induire/maintenir/amplifier la fonctionnalité SP de blastes circulants de leucémie aigüe myéloblastique de façon ß1-intégrine dépendante et que cette fonctionnalité est associée à une capacité d’efflux de Mitoxantrone. Ce mécanisme de modulation de l’activité d’ABC-transporteurs par l’adhésion au stroma correspond à un mécanisme encore jamais décrit de CAM-DR. / Hematopoiesis is a finely tuned process to allow its long-term efficiency and its adaptation to various physiological and pathological stresses. Hematopoietic stem cell (HSC) is the keystone of hematopoiesis through its multipotency, quiescence, asymmetrical division and self-renewing properties. HSC bone marrow (BM) niches mainly regulate hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) through intercellular contacts and diffusible factors. Side-population (SP) cells are characterized by their capability to actively efflux Hoechst 33342 dye through multidrug resistance-like pumps. SP phenotype is a characteristic of stem cells in many tissues and especially, it is a stringent criterion to purify murine HSCs. In mice, this phenotype has been demonstrated to be related to quiescence and resistance to drugs/environmental stresses and to be controlled by endosteal niche adhesion. SP cells are also studied in oncology and are associated to chemo-resistance and tumor initiating capacity. At steady state, SP cells are mainly present in the BM and are mostly absent from the circulation except in stress conditions, raising the hypothesis of the versatility of the SP functionality. Therefore, studying SP phenotype regulation is of importance to understand how BM niches regulate HSPC and how to interfere with cancer cells chemo-resistance.In this work, we demonstrate for the first time and in human that SP phenotype acquisition is a dynamic phenomenon under control of stromal BM cells. Stromal cells from healthy donors maintain SP phenotype of BM HSPC and promote SP phenotype acquisition in circulating ones. SP phenotype promotion depends of stroma nesting and of diffusible factors secretion. This stroma-induced circulating SP cell fraction contains HSPC, as ascertained by (i) CD34 expression, (ii) proportion of cells in G0, (iii) clonogenic and proliferative potential, (iv) nesting and “stemness” gene expression, (v) CXCL12-related migration capability and (vi) LT-SRC activity. Moreover, we describe an SP+CD34+CD44-/low sub-population that could contain most immature HSPCs with regards to their quiescence and Hoechst efflux intensity. Mechanistic studies show that the stoma-mediated SP promoting effect is VLA-4/4ß1-integrin and CD44 dependent, and implicate G-protein and Src-kinase pathways. We also demonstrate that BM stroma from healthy donors can induce/maintain/amplify in a ß1-integrin dependent manner an SP sub-population with mitoxantrone efflux capability in blast cells from acute myeloid leukemia. The existence of a similar mechanism in circulating leukemic blasts suggests the possibility to interfere with the chemo-resistant phenotype of blast cells through integrin/CD44 axis blockade.

Afin d’améliorer au mieux le greffon placentaire, nous suggérons de réaliser sa culture d’expansion ex vivo dans des conditions proches de l’environnement des cellules souches hématopoïétiques in vivo. Ainsi, nous proposons que la co-culture de cellules CD34+ placentaires avec des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) à basses concentrations d’O2 (BC-O2) pourrait contribuer à équilibrer les processus d’autorenouvellement et de différenciation afin d’obtenir un greffon optimisé. Sur le plan fonctionnel, nos résultats confirment un effet bénéfique de notre modèle expérimental par rapport aux conditions où figure la culture simple et/ou l’oxygénation atmosphérique (20%) en termes du maintien de progéniteurs (PH) primitifs (pré-CFC) et de cellules souches Scid-Repopulating Cells (SRC). Sur le plan quantitatif, l’amplification des cellules CD34+ et des PH engagés, bien qu’elle soit en retrait dans nos conditions de référence par rapport à la condition de 20% d’O2, elle demeure néanmoins importante. Par ailleurs, le rôle de l’IL-3 exogène se montre crucial à BC-O2 notamment en co-culture à 1,5% d’O2 où elle permet non seulement de préserver mais aussi d’amplifier le taux de SRC par rapport au témoin de cellules CD34+ de J0. Enfin, l’étude de la sécrétion des facteurs solubles et l’expression des marqueurs phénotypiques sur les CSM montre que l’IL-6, le VEGF et l’IL-8 sont plus sécrétés et les CD146, CD49a, CD54, CD200 et CD105 sont plus exprimés après incubation à 5% d’O2. Cependant, l’implication réelle de ces facteurs et antigènes dans l’effet paracrine et/ou de contact cellulaire direct menés par les CSM dans notre protocole requiert de nouvelles investigations / To optimize at best the hematopoietic engraftment, we suggest in this work to improve the ex vivo expansion conditions by moving them closer to physiology. Indeed, we propose to culture placental CD34+ (HSC/PH) on MSC layer in combination with LO2-C to ensure the amplification of HP together with the maintenance/expansion of HSC. Compared to the single culture and/or atmospheric oxygenation, our experimental model allows a better maintenance of primitive HP (Pre-CFC) and HSC together with a quite good amplification of total cells, CD34+ cells and committed HP despite of lower than control condition. Moreover, exogenous IL-3 shows crucial effect in co-culture at LO2-C (1.5% O2) since its addition better preserves and even increases the number of HSC compared to the CD34+ cells control from D0. We then studied the secretion of soluble factors in culture supernatants and found that IL-6, VEGF and IL-8 were present in larger quantities at LO2-C in both co-culture and MSC culture. Finally, the CD146, CD49a, CD54, CD200 and CD105 membrane antigens appear to be up-regulated in MSCs when incubated at 5% O2. However, the involvement of these factors and antigens in paracrine effect and/or direct cell to cell contact mechanisms at LO2-C requires further investigations. In conclusion, the combination of LO2-C and MSC would be promising in the field of HSC/PH grafts expansion to achieve its main objective of reducing the post-transplant cytopenia period together with maintaining the long-term graft potential

La reconnaissance de l’implication du système immunitaire dans le cancer a guidé l’industrie vers de développement d’immunothérapies nombreuses et prometteuses. Or, à l’ère de l’immuno-oncologie, on constate un manque criant de modèles précliniques capables de simuler les interactions immunitaires entre un patient et sa tumeur. Pour remédier à cette situation, nous avons développé des modèles de souris humanisées combinant la reconstitution immunitaire de souris immunodéficiente et l’injection de lignées tumorales issues d’un même donneur. L’utilisation de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) a permis notamment le développement de multiples lignées tumorales à partir d’un seul donneur sain, facilitant ainsi l’accès aux cellules immunitaires nécessaires à l’humanisation des souris. La transformation des cellules primaires ou dérivées d’iPSC a été faite par la transduction lentivirale des proto-oncogènes de la télomérase (hTERT), de Ras oncogénique (HRASV12) et de la région précoce du viruse simen 40 (SV40ER) encodant les gros et petits antigènes T (LgT et SmT). Cette approche permis de générer des tumeurs de haut grade, agressives et peu différenciées à l’aide de fibroblastes primaires et de cellules hépatiques, de cellules souches neurales et d’astrocytes dérivés d’iPSC. Dans tous les cas, les tumeurs ainsi générées ont été efficacement reconnues, infiltrées et souvent rejetées par le système immunitaire autologue implanté. Le rejet partiel de la plupart de ces tumeurs ouvre toutefois la porte à l’évaluation préclinique d’immunothérapies diverses reposant sur les réactions immunitaires anti-tumorales de l’hôte. Par exemple, nous avons pu étudier l’impact d’un traitement d’inhibition du point de contrôle immunitaire PD-1 sur la croissance de tumeurs d’origine fibroblastique où une augmentation marquée du taux d’infiltration immunitaire humaine a été observé sans toutefois mener à une réduction significative du fardeau tumoral. Nous avons aussi pu produire, de façon autologue, des lymphocytes T exprimant un récepteur d’antigène chimérique (CAR) contre le ganglioside GD2, un antigène tumoral préalablement identifié et détecté sur les tumeurs de cellules souches neurales générées par notre approche. L’efficacité cytotoxique de ces CAR a ainsi pu être validée in vitro dans un système autologue. Finalement, nous avons utilisé le modèle de tumeurs fibroblastiques dans des contextes immunitaires autologues et allogéniques pour déterminer si le potentiel immunomodulateur des cellules stromales mésenchymateuses (MSC) pouvait affecter la croissance tumorale. Selon nos résultats, les MSC n’auraient aucun effet ni sur le taux d’émergence et de croissance tumoral, ni sur l’infiltrat immunitaire, suggérant que leur utilisation thérapeutique serait sécuritaire en ce qui concerne ce type de tumeurs ayant préalablement un microenvironnement tumoral immunosuppresseur. En somme, les modèles innovateurs décrits dans cette thèse visent à améliorer la qualité prédictive des modèles murins précliniques en immuno-oncologie en récapitulant certaines interactions immunitaires entre un patient et sa tumeur. La grande flexibilité de cette approche permettra d’adapter aisément le modèle aux problématiques d’intérêt, tant fondamentales que précliniques. / Identification of the human’s immune system implication in cancer has guided the biotech industry towards the development of numerous and promising cancer immunotherapies. However, in the era of immuno-oncology, a distinct lack preclinical models can simulate the interactions between a patient’s tumor and immune cells. To tackle this issue, we developed humanized mouse models combining immune reconstitution of immunodeficient mice and injection of tumor cells lines from the same human donor. The use of induced pluripotent stem cells (iPSC) allowed the generation of multiple tumorigenic cell lines from a single donor, facilitating access to autologous immune cells necessary for mouse immune humanization. The transformation of primary or iPSC-derived cell lines was done using lentiviral transduction of proto-oncogenes telomerase (hTERT), oncogenic Ras (HRASV12) and simian virus 40 early region (SV40ER) encoding large and small T antigens (LgT and SmT). This approach allowed to generate high grade, aggressive and undifferentiated tumors from primary fibroblasts and iPSC-derived hepatic cells, neural stem cells and astrocytes. In all cases, such tumors were efficiently recognized, infiltrated and often rejected by the implanted autologous immune system. However, partial rejection of most tumors allows for preclinical evaluation of targeted immunotherapies relying on the hosts’ pre-existing immune response. For instance, we could study the impact of PD-1 checkpoint blockade inhibition on tumor growth in fibroblastic tumors where a significant increase in tumor infiltration was observed, but without an associated decrease in tumor burden. We could also produce autologous chimeric antigen receptor (CAR)-expressing T lymphocytes against GD2 ganglioside, a previously described tumor antigen detected on our neural stem cell-derived tumor cells. Cytotoxic efficiency of these autologous CAR T cells could thus be validated in vitro. Finally, we used our fibroblast-derived tumor models in autologous and allogeneic settings to determine if mesenchymal stem cells’ (MSC) immunomodulatory potential could impact tumor growth. Our results showed that MSC had no effect neither on tumor emergence and growth nor on immune infiltration, suggesting therapeutic use of these cells should be safe regarding such tumors already harboring a strongly immunodeficient microenvironment. Overall, the novel models described in this thesis aim at improving the predictive capacity of mouse pre-clinical models in immuno-oncology by recapitulating some immune interactions between a patient and its tumor. The great flexibility of this approach will allow for easy adaptation to many research problematics both preclinical and fundamental.

La FAK est une tyrosine kinase cytoplasmique qui régule divers processus cellulaires, dont la survie, la prolifération, la différenciation et la motilité. Bien que diverses études aient démontré l'importance du FAK dans la pathogenèse du SMD et de la LAM, le rôle de cette molécule dans le microenvironnement des tumeurs du SMD et de la LAM reste à déterminer davantage. En examinant les CSM de la moelle osseuse qui dérivent de patients atteints de SMD et de LAM, nous avons observé une augmentation continue de l'expression et de l'activation de la FAK pendant la progression du SMD vers de la LAM, semblable à celle observée chez les patients hémopoïétiques. Dans le SMD à faible risque, on a constaté que les CSM se caractérisaient par une faible expression et une faible activation du FAK. Ils présentaient une morphologie modifiée, un immunophénotype, une différenciation et l'expression de facteurs favorables à l'hématopoïèse. Il convient de noter que ces caractéristiques pourraient être largement reproduites dans les CSM saines par inhibition FAK. De plus, l'appauvrissement en FAK dans la lignée cellulaire stromale pourrait induire une expansion massive et l'apoptose des CSH normaux. Nos résultats mettent en évidence le rôle crucial du FAK dans le maintien des fonctions des CSM et fournissent la preuve que la dysrégulation du FAK dans les CSM contribue à la perturbation de l'hématopoïèse et éventuellement à la progression des tumeurs malignes myéloïdes. Une meilleure compréhension du rôle que joue le microenvironnement du SMD et de la LAM permettra de mieux reconnaître les patients à faible risque et de mettre au point des traitements ciblant les CSM défectueuses, améliorant ainsi le résultat clinique / FAK is a cytoplasmic tyrosine kinase that regulates diverse cellular processes, including survival, proliferation, differentiation, and motility. Though various studies have demonstrated the importance of FAK in MDS and AML pathogenesis, the role of this molecule in MDS and AML tumor microenvironment remained to be further determined. By examining BM MSCs derived from MDS and AML patients, we have observed a continues increase of FAK expression and activation during MDS progression to AML, similar to those detected in hemopoietic counterparts. In LR-MDS, MSCs were found to be characterized by low FAK expression and activation. They exhibited altered morphology, immunophenotype, differentiation, and expression of hematopoiesis-supporting factors. Of note, these features could be largely reproduced in normal MSCs by FAK inhibition. Furthermore, FAK depletion in BM stromal cell line could induce massive expansion and apoptosis of normal HSPCs. Our results highlight a critical role of FAK in maintaining the functions of BM MSCs and provide evidence that dysregulation of FAK in MSCs contribute to the disturbed hematopoiesis and possibly the progression of myeloid malignancies. A greater understanding of the role that BM microenvironment plays in MDS and AML will enable an increased recognition of poor-risk patients and the development of therapies that target the defected MSCs, thereby improving the clinical outcome