Thèse d'exercice : Pharmacie : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

La production de protéines recombinantes, d’anticorps, de vaccins, … est de plus en plus réalisée par culture de cellules animales. Le bioréacteur classiquement utilisé en industrie pour réaliser ces cultures est le bioréacteur à cuve agitée. Ce bioréacteur présente un volume important ce qui rend difficile le développement d’un bioréacteur à usage unique dans l’optique de réduire les risques de contaminations entre deux cultures consécutives. L’intensification du procédé et le développement de bioréacteur à usage unique sont donc deux défis intéressants dans la réalisation de cultures cellulaires à l’échelle industrielle. Un bioréacteur particulièrement prometteur pour l’intensification de culture cellulaire est le bioréacteur lit-fixe. Dans cette thèse, nous étudions le bioréacteur lit-fixe à usage unique iCELLis développé par Artelis S.A.<p>Le lit-fixe du bioréacteur iCELLis est composé d’un empilement de porteurs maintenu entre deux grilles perforées. Ces porteurs sont utilisés comme support par les cellules au cours de la culture. Le bioréacteur est équipé d’un système de transfert gaz-liquide par film tombant afin d’oxygéner le milieu de culture en continu. Une pompe centrifuge plongée dans un bac d’immersion assure la circulation du milieu de culture à travers l’ensemble du bioréacteur. Les cultures se déroulent en trois phases :une phase d’adhérence des cellules aux porteurs du lit-fixe, une phase de croissance cellulaire et une phase de production.<p>Les avantages d’un bioréacteur lit-fixe sont nombreux :une concentration cellulaire élevée impliquant une productivité élevée, un petit volume de bioréacteur, une faible exposition des cellules aux contraintes de cisaillement, Les bioréacteurs lits-fixes présentent cependant certains inconvénients qui freinent leur développement à l’échelle industrielle. Le lit-fixe se présente comme un réacteur piston ce qui implique l’apparition de gradients de concentrations de cellule et d’espèces extracellulaires (nutriments et produits) le long du lit-fixe. L’intérieur du lit-fixe est également difficilement accessible au cours de la culture. Le suivi des concentrations de cellules et d’espèces dans cette zone est donc problématique.<p>Une modélisation globale du bioréacteur lit-fixe nous permet de mieux comprendre les différents phénomènes qui prennent place dans le bioréacteur. Grâce à cette modélisation, nous sommes donc capables d’identifier les phénomènes clés contrôlant le procédé et ainsi fournir des pistes de travail pour l’optimisation et la montée en échelle du bioréacteur, ceci sur base de critères rationnels.<p>Nous choisissons de développer un modèle à compartiments du bioréacteur lit-fixe. Dans ce type de modèle, le bioréacteur est représenté par un réseau de compartiments interconnectés. Nous définissons trois compartiments :un premier pour la pompe, un deuxième pour les cellules et le lit-fixe, et un troisième pour le système de transfert gaz-liquide.<p>Pour le premier compartiment, nous souhaitons caractériser divers paramètres identifiés comme pertinents pour une sélection adéquate de la pompe. Dans cette thèse, nous présentons une méthode pour caractériser ces paramètres pour une pompe de référence (celle du bioréacteur iCELLis) et pour une pompe en similitude géométrique à la pompe de référence (dans le but d’étudier la montée en échelle).<p>La pompe de référence est étudiée numériquement (grâce aux logiciels Gambit 2.4 et Fluent 6.3) et expérimentalement. Nous mettons en évidence les liens entre les paramètres de la pompe déterminés numériquement et ceux déterminés expérimentalement. Ces liens définissent notre modèle. En intégrant au modèle les résultats de la simulation numérique de l’écoulement du milieu de culture dans le bac d’immersion contenant la pompe en similitude géométrique à la pompe de référence, nous déterminons entièrement les paramètres recherchés de la seconde pompe sans avoir recours à un prototype. Ceci permet donc de tester différentes échelles avant de choisir la version finale de la seconde pompe.<p>Le deuxième compartiment du modèle caractérise les cellules et le lit-fixe. La sélection de certains paramètres opératoires dépend du métabolisme cellulaire. Nous souhaitons développer un outil de surveillance en ligne de l’évolution des concentrations de certaines espèces extracellulaires sur base de la connaissance de la concentration cellulaire dans le bioréacteur. Cet outil est développé sur base d’un modèle structuré du métabolisme des cellules animales. Dans un tel modèle, nous établissons des bilans de matière sur les espèces extra- et intracellulaires en considérant les voies métaboliques intracellulaires. Un paramètre requis pour l’emploi de cet outil est la connaissance de la concentration cellulaire au cours de la culture. Or, la surveillance de cette concentration est l’un d’un problème évoqué dans les bioréacteurs lits-fixes. Nous développons donc un modèle ségrégé de culture cellulaire en bioréacteur lit-fixe. Dans ce modèle, nous considérons l’entièreté du lit-fixe. Le modèle comprend différentes populations de cellules :les cellules en suspension dans le milieu au début de la culture et les cellules adhérentes au lit-fixe. Le modèle inclut une distribution spatiale de la concentration d’espèces extracellulaires dans le lit-fixe. Par conséquent, le modèle rapporte les gradients potentiels de concentration de cellules et d’espèces extracellulaires dans le lit-fixe.<p>Le troisième compartiment du modèle du bioréacteur caractérise le système de transfert gaz-liquide. L’oxygénation est très souvent un paramètre clé dans la conception d’un bioréacteur. Dans le bioréacteur iCELLis, le système de transfert gaz-liquide est un film liquide tombant turbulent. Dans cette thèse, nous proposons une méthode pour caractériser le transfert d’oxygène à travers ce type de film tombant. Notre méthode, basée sur une approche numérique (grâce à Gambit 2.4 et Fluent 6.3), est scindée en deux parties. Premièrement, nous calculons la forme de l’interface gaz-liquide. Une simulation de l'écoulement est réalisée avec le modèle Volume of Fluid (VOF). A partir de cette simulation, la forme de l'interface est traquée. Deuxièmement, la forme de l'interface est générée dans un nouveau domaine de calcul afin de simuler le transfert d’oxygène. Grâce à cette seconde simulation, le coefficient de transfert d’oxygène de la phase gazeuse vers le milieu de culture est déterminé. Grâce à notre méthode, nous caractérisons ce coefficient pour différentes conditions opératoires. Nous étudions notamment l’influence du débit et de la température du milieu de culture sur le coefficient de transfert d’oxygène. / Doctorat en Sciences de l'ingénieur / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les bioprocédés ont connu un essor considérable au cours de ces dernières années et sont promis à un bel avenir. Qu'il s'agisse de la production de vaccins, de la fermentation de levures pour l'industrie alimentaire ou encore de l'épuration biologique des eaux usées, les applications sont nombreuses et les produits sont d'un intérêt capital pour l'être humain. Étant donnés le coût et le temps de mise en oeuvre de ces procédés, il est particulièrement utile de construire des simulateurs permettant de reproduire le comportement macroscopique des cultures cellulaires utilisées. Ces simulateurs peuvent servir à déterminer des conditions optimales de fonctionnement (en fonction des critères de l'utilisateur) et à tester certains outils (régulateurs, capteurs logiciels, etc.). Par ailleurs, il est nécessaire, pour le suivi et la régulation de ces procédés, de disposer de grandeurs mesurées (concentrations cellulaires, en substrats, en le produit d'intérêt, etc.). Les problèmes liés à la mesure matérielle de ces grandeurs sont nombreux: coût des capteurs, destruction des échantillons, longues périodes d'échantillonnage, temps d'analyse élevés, etc. Il est dès lors utile de construire des observateurs d'états (ou capteurs logiciels) fournissant une estimation en temps continu de grandeurs non mesurées sur la base d'un modèle mathématique et de certaines mesures matérielles. Les modèles mathématiques sont nécessaires pour la synthèse des deux types d'outils envisagés dans ce travail (simulateurs et capteurs logiciels). Les modèles utilisés consistent en les bilans massiques des constituants apparaissant dans le schéma réactionnel, ce dernier contenant les réactions essentielles pour la description des phénomènes à l'échelle macroscopique. Au sein de ces bilans massiques, une nouvelle structure générale de modèle cinétique est proposée, possédant un certain nombre de propriétés intéressantes, telles l'interprétation physique des paramètres cinétiques, les concentrations définies positives sous certaines conditions, la garantie de stabilité entrées bornées - états bornés, ou encore la possibilité de linéarisation en les paramètres à estimer. Une méthodologie générale d'estimation paramétrique est proposée, afin d'identifier les coefficients pseudo-stoechiométriques, les coefficients cinétiques et certains paramètres expérimentaux (concentrations initiales des cultures). Cette méthodologie possède un caractère systématique, prend en compte les erreurs de mesure sur l'ensemble des signaux (y compris à l'instant initial), fournit à l'utilisateur la covariance des erreurs d'estimation paramétrique, prend en compte intrinsèquement les contraintes de signe sur les paramètres, fournit une estimation des erreurs de simulation, permet de réduire le nombre d'équations différentielles au sein du modèle, etc. La mise en oeuvre et l'intérêt de ces outils sont illustrés en simulation (cultures bactériennes) et dans le cas d'une application réelle (cultures de cellules animales CHO). La première catégorie d'observateurs d'états étudiée dans ce travail est celle des observateurs utilisant pleinement le modèle cinétique. L'observation d'états basée sur l'identification des conditions initiales les plus vraisemblables est plus particulièrement analysée. Elle consiste à estimer en temps continu l'entièreté de l'état par intégration d'un modèle de simulation au départ des conditions initiales les plus vraisemblables. Ces dernières sont identifiées à chaque nouvel instant de mesure sur la base de toute l'information disponible jusqu'à cet instant. Certaines propriétés mathématiques sont étudiées (dont une comparaison avec le filtre de Kalman) et un certain nombre d'extensions de la méthode sont proposées (dont une version récurrente qui ne nécessite plus de résoudre un problème d'optimisation non linéaire à chaque nouvel instant de mesure). Ces outils sont à nouveau illustrés dans le cadre des cultures de cellules animales CHO, et se basent sur les modèles de simulation développés dans la première partie du travail. Étant donné les risques de divergence des observateurs de cette première catégorie lorsque la qualité du modèle cinétique n'est pas suffisante, une seconde catégorie est envisagée, constituée des observateurs utilisant partiellement le modèle cinétique. Dans ce contexte, un nouvelle technique est proposée consistant en un observateur hybride entre le filtre de Kalman étendu (utilisant pleinement le modèle cinétique) et l'observateur asymptotique de Bastin et Dochain (n'utilisant pas du tout le modèle cinétique). Cette structure estime (conjointement avec l'état du système) un degré de confiance en le modèle cinétique. Elle est capable d'évoluer de façon progressive, en fonction de ce degré de confiance, entre les deux solutions extrêmes (filtre de Kalman et observateur asymptotique), tirant ainsi parti des avantages respectifs de ces deux méthodes selon les conditions opératoires et la qualité du modèle cinétique. Ces outils sont validés sur des cultures bactériennes simulées.

Les bioprocédés industriels mettant en œuvre la culture de cellules animales sont devenus incontournables pour la production d’anticorps monoclonaux (AcM). Cependant, l'état physiologique des cellules et la qualité des AcM produits, en particulier leur glycosylation, sont tributaires des variations intervenant au cours du procédé. Il en découle des risques d'altération de l'efficacité et de la sûreté des AcM. C'est pourquoi, depuis quelques années, l'initiative Process Analytical Technology (PAT) encourage le développement du suivi en ligne de ces procédés, avec l'objectif de mieux les maîtriser et d'assurer la qualité finale des produits. Dans ce contexte, cette thèse propose des approches innovantes pour le suivi en ligne de procédés de culture de cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) en bioréacteur, basées sur l'utilisation de trois types de spectroscopies in situ (diélectrique, Raman, proche infrarouge(NIR)). Le premier chapitre présente une nouvelle démarche permettant de prédire en temps réel l'état physiologique des cellules, au travers de la vitesse spécifique de croissance cellulaire (μ). A partir de la mesure en ligne de la permittivité grâce à la spectroscopie diélectrique, la µ a été calculée en temps réel, permettant de détecter le moment critique correspondant au moment où μ diminue. Comparée à une démarche hors ligne, l'utilisation de cette méthode pour le pilotage de cultures en mode recharge-récolte, permet d’assurer à la fois la quantité et la qualité de glycosylation des AcM. Le second chapitre aborde l'utilisation des spectroscopies NIR et Raman in situ combinées à des méthodes chimiométriques. Les performances de ces deux spectroscopies ont été comparées en parallèle. Des modèles en ligne ont été développés pour prédire la concentration de différents paramètres (cellules viables, glucose, lactate, glutamine, ions ammonium, anticorps). L'évaluation de ces modèles par facteurs de mérite (FOM), a révélé certains avantages de la spectroscopie Raman. La combinaison de ces deux spectroscopies par diverses stratégies de fusion de données a été également évaluée. Dans le troisième chapitre, l'intérêt de la spectroscopie Raman a été démontré pour le suivi en ligne, non seulement, de la concentration, mais aussi, de la glycosylation des AcM. Des modèles ont été développés pour la prédiction en ligne, à la fois, de la macro-hétérogénéité (sites de glycosylation), et de la micro-hétérogénéité (structures glycanniques) de la glycosylation des AcM dans le cas de cultures en mode discontinu et recharge-récolte. Le dernier chapitre a utilisé les spectroscopies NIR et diélectrique, en les intégrant à un « capteur logiciel » combinant des équations de bilans de matière. Ce « capteur logiciel », mis en œuvre au cours d'une culture en mode semi-continu pour le contrôle automatique du débit d'alimentation, a conduit à une augmentation de la productivité du procédé ainsi qu'à une meilleure glycosylation des AcM produits / Bioprocesses of mammalian cell culture have become essential for the production of therapeutic recombinant proteins, such as monoclonal antibodies (mAb). However, the physiological state of the cells and the quality of the mAb produced, in particular their glycosylation, may vary during the process, and may lead to the alteration of the safety and efficacy of the final product. Consequently, the Process Analytical Technology (PAT) initiative has encouraged the development of online monitoring techniques, with the aim to better control the process and ensure the quality of the final product. In this context, this thesis proposes innovative approaches for online monitoring of CHO (Chinese Hamster Ovary) cells bioreactor cultures, by using three types of in situ spectroscopic measurements (dielectric, Raman, near infrared (NIR)). The first chapter presents a novel approach to predict in real-time one of the major cell physiological state parameters, the specific growth rate (µ). Based on online permittivity measured by in situ dielectric spectroscopy, the cell concentration was estimated and µ was calculated in real-time, making possible to detect the critical moment when µ begins to decrease significantly. Compared to an offline approach, this online approach allowed to maintain the cells in a stable physiological state, ensuring the glycosylation of the mAb produced in feed-harvest cultures. The second chapter shows the use of in situ NIR and Raman spectroscopies combined with chemometric methods. For the first time, the performances of these two spectroscopies were compared in parallel in the same cultures. Online models were developed to predict in real-time the concentration of different parameters (viable cells, glucose, lactate, glutamine, ammonium ions and antibodies). The evaluation of these models by the multivariate Figures of Merit (FOM) revealed some of the advantages of Raman spectroscopy. The combination of the two spectroscopies by various data fusion strategies has also been evaluated. In the third chapter, the interest of Raman spectroscopy for the online monitoring of both the quantity and the glycosylation of the mAb was demonstrated. Models were developed for online prediction of both macroheterogeneity (glycosylation site occupancy) and microheterogeneity (glycan structures) of mAb glycosylation in batch and feed-harvest cultures. The last chapter used models previously developed for NIR and dielectric spectroscopies, to integrate into a “soft sensor” by combining with cell metabolic and mass balance equations. This “soft sensor”, implemented in a fed-batch cell culture for the automatic control of the feed rate, leads to an increased mAb productivity and better mAb glycosylation

Ce travail étudie l'intérêt de l'ajout d'hydrolysats de levure dans un procédé de culture de cellules CHO productrices d'anticorps en vue, d'une part, de déterminer leur condition d'utilisation et leur rôle, et, d'autre part, de caractériser les composés actifs. Pour répondre à ces objectifs, une démarche intégrant des études cinétiques, des stratégies de fractionnement et l'analyse biochimique des hydrolysats et de leurs fractions a été développée. En premier lieu, il a été montré que les hydrolysats de levure présentent des effets significatifs sur les cultures selon leur composition et les conditions d'ajout. De même, des effets synergiques ont été mis en évidence par le mélange d'hydrolysats générés à partir de différents procédés. D'autre part, des études cinétiques ont permis de corréler l'influence positive des hydrolysats sur la croissance cellulaire à l'amélioration du métabolisme énergétique. Dans un deuxième temps, la nature biochimique et le rôle des composés actifs ont été étudiés par la mise en oeuvre d'un procédé de nanofiltration membranaire et la reconstitution de mélanges de molécules contenues dans un extrait de levure (EXL). Ces résultats ont mis en évidence l'intérêt des di- et tri-peptides pour approvisionner le métabolisme énergétique et de molécules non nutritives, de poids moléculaire supérieur à 500 Da, pour stimuler la vitesse spécifique de croissance des cellules. Finalement, le rétentat issu de la nanofiltration de l'EXL a été fractionné à l'aide de divers procédés chromatographiques, unitaires ou associés, pour caractériser les propriétés physico-chimiques des composés actifs. L'effet des fractions sur la culture de cellules a alors souligné l'intérêt des molécules chargées positivement, et plus particulièrement, des peptides hydrophiles et cationiques pour stimuler la croissance des cellules. Ainsi, nos travaux permettent de mieux appréhender les mécanismes d'action des hydrolysats de levure sur les cellules CHO productrices d'anticorps et proposent des voies d'optimisation pour la simplification d'additifs complexes dans les milieux de culture dédiés à la culture de cellules animales / This work studies the interest of the addition of yeast hydrolysates in culture medium of CHO cell producing antibody, to determine the operating conditions and their role, but also to improve the characterization of active compounds. In this way, an integrated approach including kinetic studies, fractionation strategies and biochemical analysis of hydrolysates and of their fractions was developed. First, we showed that yeast hydrolysates exhibited various properties depending on their composition and the operating conditions. In addition, synergistic effects were observed with different hydrolysate mixtures. Besides, kinetic studies underlined that the positive influence of hydrolysates on cell growth is correlated with energetic metabolism improvement. Then, the biochemical nature and the role of active compounds were studied by the implementation of a nanofiltration process and the reconstitution of mixtures of molecules contained in a yeast extract (YE). The results highlighted the interest of di- and tri-peptides to supply energetic metabolism, and of non-nutritive molecules, exhibiting a molecular weight greater than 500 Da, to stimulate the specific cell growth rate. Finally, the retentate fraction of nanofiltrated YE was fractionated by various chromatographic processes to characterize the physico-chemical properties of active compounds. The effect of fractions on cell culture emphasized the positive effect of positively charged molecules, especially hydrophilic and cationic peptides, to stimulate the cell growth. Thus, our work provides important insights in yeast hydrolysate mechanisms on CHO cells and suggests procedures to simplify such a complex additive of media dedicated to mammalian cell culture

La réponse globale de cellules animales à des contraintes hydrodynamiques lors de leur culture en suspension dans des réacteurs agités a été étudiée grâce à une approche intégrative couplant les outils du génie biochimique à ceux de la mécanique des fluides numérique. En premier lieu, la description de l’hydrodynamique moyenne et locale de deux systèmes de culture agités de laboratoire, spinner et bioréacteur, a été réalisée. Puis, l'étude des cinétiques macroscopiques de cellules CHO cultivées en suspension, en milieu sans sérum et sans protéine, a été réalisée avec différentes vitesses d’agitation, pour évaluer l'impact de l'agitation sur les vitesses de croissance et de mort cellulaires, ainsi que de consommation des substrats et de production des métabolites et de l'interféron-gamma recombinant. Des caractérisations supplémentaires des cellules (apoptose, protéines intracellulaires) et de l'interféron ont également été réalisées. Les effets de l'intensification de l'agitation ont été représentés avec plusieurs corrélations globales reliant : (i) en milieu contenant du pluronic, l'intégrale des cellules viables au nombre de Reynolds, et la proportion de cellules lysées à la valeur moyenne de l'énergie de dissipation, <[epsilon]? (ii) en milieu sans pluronic, les vitesses spécifiques de croissance et de mort cellulaires à <[epsilon]. De plus, l'analyse par CFD de la distribution spatio-temporelle des contraintes indique que la lyse cellulaire, observée dans le réacteur aux conditions extrêmes d'agitation, serait plutôt liée à des valeurs locales très élevées de [epsilon], ainsi qu’à la fréquence d'exposition des cellules dans ces zones énergétiques. Un modèle hydro-cinétique original, couplant l’hydrodynamique locale aux cinétiques cellulaires de croissance et de mort, et basé sur l’intermittence de la turbulence permet la prédiction de la lyse massive observée en réacteur sous certaines conditions. Pour confirmer le fait que les effets liés à l'intensification de l'agitation sont bien le résultat d'une augmentation des contraintes hydrodynamiques, et non d'une amélioration du transfert d'oxygène, ce dernier a été mesuré et modélisé par couplage avec une simulation numérique de type Volume Of Fluid , concluant en une absence de limitation d'oxygène. Enfin, la conception, le dimensionnement et la caractérisation hydrodynamique d'un réacteur innovant de type Couette-Taylor, sont proposées pour la mise en œuvre de cultures perfusées dans un environnement hydrodynamique mieux contrôlé / The global response of animal cells to hydrodynamic stress when cultivated in suspension in stirred tank reactors was studied. To do this, an integrative approach coupling biochemical engineering and fluid mechanics tools were used. First, the description of the global and local hydrodynamics of two bench-scale agitated reactors, a spinner flask and a bioreactor, was carried out. Then, macroscopic kinetics of CHO cells cultivated in a serum and protein-free medium were obtained at various agitation rates, in order to evaluate the impact of agitation on cellular growth and death, as well as substrates consumption and metabolites and recombining IFN-[gamma] production. IFN-[gamma] and cells physiological state were more precisely characterised by glycosylation, apoptosis state and intracellular proteins measurements. The effects of the agitation increase were represented by several global correlations that related: (i) in a medium containing Pluronic F68, the Integral of the Viable Cells Density to the Reynolds number, and the proportion of lysed cells with the average value of energy dissipation rate <[epsilon]? (ii) in a medium without pluronic, specific cell growth and death rates to <[epsilon]. Moreover, CFD analysis of the stress distribution indicated that the cellular lysis observed in the bioreactor at the highest agitation rate, would be related to very high local values of [epsilon], and to the exposure frequency of the cells in these energetic zones. An original hydro-kinetic model based on the intermittency of turbulence and coupling the local hydrodynamics with cell growth and death kinetics, allowed the prediction of the massive cell lysis observed in the bioreactor under some mixing conditions. To decouple shear stress effects from oxygen transfer improvement, the oxygen transfer coefficient was experimentally measured and modelled using a Volume Of Fluid numerical simulation. Our results indicated the absence of an oxygen limitation, which confirmed that this cell response resulted from the hydrodynamic stress increase alone. Lastly, an innovative continuous and perfused Couette-Taylor reactor, allowing a better-controlled hydrodynamic environment was designed and sized. Its hydrodynamic description was carried out using CFD calculations

L'oxydation de l'acide férulique et de son ester (le férulate d'éthyle) par la laccase de Myceliophtora thermophila a été étudiée en milieu aqueux et dans des conditions expérimentales douces (30 °C et pH 7,5) afin de synthétiser de nouvelles molécules naturelles grâce à un procédé vert. L'oxydation enzymatique a permis l'obtention d'intermédiaires colorés pour l'acide férulique et incolores pour le férulate d'éthyle. En outre, le férulate d'éthyle a été plus rapidement totalement oxydé que l'acide férulique. De plus, cette procédure a abouti à des produits majoritairement dimériques avec MM = 443 g/mol et MM = 386 g/mol pour le férulate d'éthyle et l'acide férulique, respectivement. Les nouvelles molécules synthétisées ont présenté des propriétés antioxydantes importantes avec de faibles propriétés antibactériennes et cytotoxiques. En présence du chitosane insoluble dans le milieu réactionnel, la laccase a été protégée de l'inhibition liée aux produits d'oxydation et le degré de polymérisation de ces produits a été contrôlé. De plus, les produits d'oxydation ont réagi avec les groupements NH2 libres permettant la formation de liaisons covalentes de type base de Schiff (C=N) au niveau du C2 sur le chitosane. La majorité des produits d'oxydation greffés sur le chitosane était de forme dimérique. Cette procédure a permis d'obtenir du chitosane coloré avec l'acide férulique et incolore avec le férulate d'éthyle tout en présentant de nouvelles propriétés dues au greffage de composés phénoliques. Ces chitosanes dérivés ont présenté des propriétés fonctionnelles intéressantes telles que antioxydantes, physico-chimiques (stabilisation thermique) et biologiques (adhésion cellulaire) ainsi que la conservation des propriétés antibactériennes du chitosane natif / Oxidation of ferulic acid and its ester (ethyl ferulate) by Myceliophtora thermophila laccase has been studied in aqueous medium under mild experimental conditions (30°C and pH 7.5) as a green process to synthesize natural neo-molecules. Enzymatic oxidation led to colored and colorless intermediaries for ferulic acid and ethyl ferulate, respectively. Additionally, ethyl ferulate was oxidized faster than ferulic acid. This procedure has led to dimeric major products with MM = 443 g/mol and MM = 386 g/mol for ethyl ferulate and ferulic acid, respectively. New synthesized molecules demonstrated important antioxidants properties with weak antibacterial and cytotoxic properties. With insoluble chitosan particles in the reaction medium, laccase was protected from inhibition due to oxidation products and the polymerization degree of these products was checked. In addition, the oxidation products reacted with the free NH2 groups forming covalent bonds of Schiff base type (C=N) at C-2 region. The majority of the oxidation products grafted onto chitosan was of dimeric form. This procedure led to colored and colorless chitosans by ferulic acid and ethyl ferulate, respectively, with new properties due to grafting of phenolic compounds. These chitosan derivatives presented interesting functional properties such as antioxidant, physico-chemical (thermal stability) and biological (cell adhesion) as well as the preservation of antibacterial properties of native chitosan

Les bioprocédés ont connu un essor considérable au cours de ces dernières années et sont promis à un bel avenir. Qu'il s'agisse de la production de vaccins, de la fermentation de levures pour l'industrie alimentaire ou encore de l'épuration biologique des eaux usées, les applications sont nombreuses et les produits sont d'un intérêt capital pour l'être humain. Étant donnés le coût et le temps de mise en oeuvre de ces procédés, il est particulièrement utile de construire des simulateurs permettant de reproduire le comportement macroscopique des cultures cellulaires utilisées. Ces simulateurs peuvent servir à déterminer des conditions optimales de fonctionnement (en fonction des critères de l'utilisateur) et à tester certains outils (régulateurs, capteurs logiciels, etc.). Par ailleurs, il est nécessaire, pour le suivi et la régulation de ces procédés, de disposer de grandeurs mesurées (concentrations cellulaires, en substrats, en le produit d'intérêt, etc.). Les problèmes liés à la mesure matérielle de ces grandeurs sont nombreux: coût des capteurs, destruction des échantillons, longues périodes d'échantillonnage, temps d'analyse élevés, etc. Il est dès lors utile de construire des observateurs d'états (ou capteurs logiciels) fournissant une estimation en temps continu de grandeurs non mesurées sur la base d'un modèle mathématique et de certaines mesures matérielles.<p><p>Les modèles mathématiques sont nécessaires pour la synthèse des deux types d'outils envisagés dans ce travail (simulateurs et capteurs logiciels). Les modèles utilisés consistent en les bilans massiques des constituants apparaissant dans le schéma réactionnel, ce dernier contenant les réactions essentielles pour la description des phénomènes à l'échelle macroscopique. Au sein de ces bilans massiques, une nouvelle structure générale de modèle cinétique est proposée, possédant un certain nombre de propriétés intéressantes, telles l'interprétation physique des paramètres cinétiques, les concentrations définies positives sous certaines conditions, la garantie de stabilité entrées bornées - états bornés, ou encore la possibilité de linéarisation en les paramètres à estimer.<p><p>Une méthodologie générale d'estimation paramétrique est proposée, afin d'identifier les coefficients pseudo-stoechiométriques, les coefficients cinétiques et certains paramètres expérimentaux (concentrations initiales des cultures). Cette méthodologie possède un caractère systématique, prend en compte les erreurs de mesure sur l'ensemble des signaux (y compris à l'instant initial), fournit à l'utilisateur la covariance des erreurs d'estimation paramétrique, prend en compte intrinsèquement les contraintes de signe sur les paramètres, fournit une estimation des erreurs de simulation, permet de réduire le nombre d'équations différentielles au sein du modèle, etc. La mise en oeuvre et l'intérêt de ces outils sont illustrés en simulation (cultures bactériennes) et dans le cas d'une application réelle (cultures de cellules animales CHO).<p><p>La première catégorie d'observateurs d'états étudiée dans ce travail est celle des observateurs utilisant pleinement le modèle cinétique. L'observation d'états basée sur l'identification des conditions initiales les plus vraisemblables est plus particulièrement analysée. Elle consiste à estimer en temps continu l'entièreté de l'état par intégration d'un modèle de simulation au départ des conditions initiales les plus vraisemblables. Ces dernières sont identifiées à chaque nouvel instant de mesure sur la base de toute l'information disponible jusqu'à cet instant. Certaines propriétés mathématiques sont étudiées (dont une comparaison avec le filtre de Kalman) et un certain nombre d'extensions de la méthode sont proposées (dont une version récurrente qui ne nécessite plus de résoudre un problème d'optimisation non linéaire à chaque nouvel instant de mesure). Ces outils sont à nouveau illustrés dans le cadre des cultures de cellules animales CHO, et se basent sur les modèles de simulation développés dans la première partie du travail.<p><p>Étant donné les risques de divergence des observateurs de cette première catégorie lorsque la qualité du modèle cinétique n'est pas suffisante, une seconde catégorie est envisagée, constituée des observateurs utilisant partiellement le modèle cinétique. Dans ce contexte, un nouvelle technique est proposée consistant en un observateur hybride entre le filtre de Kalman étendu (utilisant pleinement le modèle cinétique) et l'observateur asymptotique de Bastin et Dochain (n'utilisant pas du tout le modèle cinétique). Cette structure estime (conjointement avec l'état du système) un degré de confiance en le modèle cinétique. Elle est capable d'évoluer de façon progressive, en fonction de ce degré de confiance, entre les deux solutions extrêmes (filtre de Kalman et observateur asymptotique), tirant ainsi parti des avantages respectifs de ces deux méthodes selon les conditions opératoires et la qualité du modèle cinétique. Ces outils sont validés sur des cultures bactériennes simulées.<p><p> / Doctorat en sciences appliquées / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ce travail apporte une contribution au développement de la stratégie PAT pour les procédés de culture de cellules animales. Il propose l'amélioration de la compréhension et de la maîtrise de la culture de cellules Vero, dédiées à la production de vaccins viraux, et cultivées sur microporteurs dans un milieu sans sérum. Une première partie a permis de cribler les effets de certains groupes de composés du milieu de culture par le suivi de la croissance en microplaques. Puis, des études cinétiques et métaboliques plus approfondies, réalisées en spinners, ont montré que le métabolisme carboné des cellules Vero est saturé par l'accumulation intracellulaire de pyruvate et qu’il est peu orienté vers la croissance. Alors que le renouvellement du milieu ou l'ajout ponctuel de glutamine amélioraient la croissance cellulaire sans ré-équilibrer le métabolisme, la substitution du glucose et de la glutamine a permis de réduire l’apoptose et d'améliorer les performances métaboliques et de croissance. Par ailleurs, les spectroscopies diélectrique et proche-infrarouge ont été évaluées pour le contrôle en-ligne du procédé, en prenant en compte les particularités des cellules adhérentes. Nous avons montré leur capacité à évaluer les concentrations de cellules, de composés du milieu, et à détecter l'apoptose. Enfin, les principales améliorations par substitution de la glutamine ont été appliquées en bioréacteurs, à la production d'un vaccin prototype contre la dengue, dans des conditions proches de celles d'un procédé industriel. Ceci a permis de limiter les renouvellements de milieu pendant l’expansion cellulaire, sans compromettre la production de particules virales infectieuses / This work contributes to the development of the PAT strategy for animal cell culture processes. The aim of this study was to improve the understanding and the control of Vero cell culture, dedicated to the production of viral vaccines, and grown on microcarriers in serum-free medium. An initial study was performed to screen the effects of certain groups of compounds of the culture medium, by the cell growth monitoring in microplates. Then, kinetic and metabolic studies conducted in spinners flasks allowed to go further and to show that the Vero cell metabolism is saturated through the pyruvate intracellular accumulation and that it is not oriented toward growth. While media renewal or punctual addition of glutamine improve the cell growth without improving the metabolism balance, the substitution of glucose and glutamine allowed to reduce apoptosis and to improve growth and metabolic performances.Furthermore, dielectric and near-infrared spectroscopies have been evaluated for the in-line process monitoring, taking into account the particularities of adherent cells. We have demonstrated their ability to quantify cell concentrations, medium component concentrations, and to detect apoptosis. Finally, major improvements by substitution of glutamine have been applied to bioreactor culture to produce a dengue vaccine prototype, with culture conditions close to industrial process. In these cases, medium renewal during the cell expansion was removed without compromising the production of infectious viral particles