Le cancer gastrique (CG) est une maladie multifactorielle, fréquemment associée à l’infection chronique par des souches CagA+ d’Helicobacter pylori. La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est un processus réversible dans lequel une cellule épithéliale polarisée acquiert un phénotype mésenchymateux. L’EMT est à l’émergence de cellules souches cancéreuses (CSC) qui expriment CD44 et présentent une activité ALDH élevée. L’infection des cellules épithéliales gastriques humaines (CEGs) par CagA+ H. pylori induit des cellules CD44+ avec des propriétés des CSCs via une EMT. La voie Hippo est composée par les kinases MST et LATS, et leurs cibles, les YAP1 et TAZ. Suite à la phosphorylation, YAP1 et TAZ sont inhibés. YAP1 et TAZ activés lient les facteurs TEAD pour promouvoir la croissance cellulaire et l’inhibition de l’apoptose.Notre premier objectif était de rechercher si H. pylori change l’état d’activation de la voie Hippo et l'effet sur l’EMT et les CSC in vitro et in vivo. Le deuxième but est la caractérisation du rôle de YAP1/TEAD dans les propriétés de CSCs gastriques in vitro et les conséquences de son inhibition dans la croissance tumorale in vivo.Pour étudier la régulation de la voie Hippo pendant l’infection par H. pylori, LATS2, YAP1 et CD44 ont été évalués dans la muqueuse gastrique de sujets non-infectés et infectés par H. pylori, qui ont été augmentés avec l’infection et leur surexpression a été associée avec la gastrite et la métaplasie intestinale. Dans les CEGs l’expression de gènes de la voie Hippo a été altérée par l’infection. La régulation de la voie Hippo par H. pylori a une cinétique diphasique et dépendante de CagA. Dans l’infection précoce, H. pylori déclenche l’activité transcriptionelle de YAP1. Cette période d’inactivité de la voie Hippo est suivi de son activation progressive, soutenue par l’accumulation de LATS2 et la phosphorylation inhibitrice de YAP1. La répression de LATS2 avec siRNAs a accéléré l’acquisition du phénotype mésenchymateux après l’infection, l’augmentation de marqueurs de l’EMT (Zeb1 et Snail1), et la diminution des miR-200 épithéliaux. Les CSC induites par H. pylori ont été potentialisées par l’inhibition de LATS2, ce qui suggère que LATS2 limite l’EMT et le phénotype de CSC acquis pendant l’infection. L’inhibition de LATS2 ou YAP1 diminue l’expression de ces deux protéines, révélant ainsi une boucle de régulation positive. Dans des coupes de tissu de CG, l’expression de LATS2 et YAP1 est hétérogène et positivement corrélée, fait qui a été confirmé dans 38 CEGs de la CCLE. L’expression LATS2 est fortement corrélée à celle de CTGF et CYR61, ce qui suggère que LATS2 peut aussi être un gène cible de YAP1/TEAD.La verteporfine (VP) est capable d’interrompre l’interaction YAP1/TEAD, et donc d’inhiber son activité transcriptionelle. In vitro, utilisant CEGs et des cellules de tumeurs de patients amplifiées chez la souris (patient-derived xenograft PDX), le traitement à la VP a diminué la croissance cellulaire, l’expression de gènes cible de YAP1/TAZ/TEAD, l’activité du rapporteur TEAD-luciférase et la capacité de formation de sphères. L’activité de la VP a été testée in vivo par injection péri-tumorale dans un modèle de greffe sous-cutanés des CEGs MKN45 et MKN74 et le PDX GC10 chez la souris NSG. La croissance tumorale a été diminuée. Le poids des tumeurs, l’analyse par IHC (CD44, ALDH, Ki67) et la capacité de formation de sphères des CSCs résiduelles ont été diminuées. Ces résultats montrent une activité inhibitrice de la VP sur les CSCs gastriques in vitro et in vivo.Ce travail montre pour la première fois que l’axe LATS2/YAP1/TEAD est précocement activé pendant l’infection chronique avec H. pylori et que celui-ci contrôle l’EMT et les propriétés de CSC. Le ciblage de la voie Hippo a été montré comme étant efficace dans la prévention de la croissance tumorale, mettant en évidence le potentiel de son inhibition dans le traitement du cancer gastrique. / Gastric cancer (GC) is a multifactorial disease, most frequently associated to chronic infection with CagA-positive Helicobacter pylori strains. Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is reversible process in which polarized epithelial cells acquire a mesenchymal phenotype. EMT is at the origin of cancer stem cells (CSC). In GC, CSCs express CD44 and high aldehyde-dehydrogenase (ALDH) activity. Infection with H. pylori of human gastric cancer cell lines (hGECs) in vitro induces the emergence of a population of CD44+ cells with CSC-properties through an EMT process in a CagA-dependent manner. The Hippo pathway is composed by the kinases MST and LATS, and their phosphorylation targets,YAP1 and TAZ. Upon phosphorylation by LATS, YAP1 and TAZ are inhibited. Active YAP1 and TAZ bind to TEAD transcription factors to promote the expression of genes that regulate cell growth and apoptosis.The first aim of this work was to investigate whether H. pylori affects the activation state of the Hippo pathway, and its effect on the EMT process and the CSCs. Second, we intended to characterize the role of YAP1/TEAD in gastric CSC properties in vitro and the consequences of its pharmacological inhibition on tumor growth in vivo.To study the Hippo pathway regulation during infection, LATS2, YAP1 and CD44 were evaluated in gastric mucosae of non-infected or H. pylori-infected patients. They were upregulated in infected mucosae and were associated to pathology. Hippo pathway regulation by H. pylori infection has biphasic kinetics and is CagA-dependent. Early in infection, H. pylori transiently triggered YAP1 expression and co-transcriptional activity, along with LATS2. This period of Hippo pathway inactivity is followed by a progressive activation, sustained by LATS2 accumulation and inhibitory YAP1Ser127-phosphorylation. LATS2 siRNA-mediated repression accelerated the acquisition of the EMT-phenotype upon infection, the up-regulation of EMT-markers ZEB1 and Snail1, and the decrease of the epithelial miR-200. H. pylori-induced CD44 upregulation, invasion and sphere-forming capacity were further enhanced upon LATS2 knockdown, suggesting that LATS2 restricts the EMT and CSC-like phenotype in hGECs upon H. pylori infection. Inhibition of either LATS2 or YAP1 reduced the expression of both proteins, revealing a positive feedback loop. In tissue sections of GC, LATS2 and YAP1 were heterogeneous and co-expressed. The positive correlation between LATS2 and YAP1 was confirmed in the 38 hGECs of the CCLE. The expression of CTGF and CYR61 was also strongly correlated to LATS2, suggesting that LATS2 could also be a YAP1/TEAD target gene.hGECs of the CCLE. The expression of CTGF and CYR61 was also strongly correlated to LATS2, suggesting that LATS2 could also be a YAP1/TEAD target gene.Verteporfin (VP) disrupts the YAP1/TEAD interaction inhibiting its transcriptional activity. In vitro, using hGECs and cells from patient derived primary tumor xenogratfs (PDXs), we showed that treatment with VP decreased cell growth, expression of YAP1/TAZ/TEAD target genes, TEAD-luciferase reporter activity and sphere-forming capacity. The activity of VP was tested in vivo, by peritumoral injection in a model of subcutaneous graft of hGECs (MKN45 and MKN74) and PDX (GC10) in NGS mice. Tumor growth was followed and a decrease was observed. Tumor weight measurement, IHC analysis (CD44, ALDH and Ki67), and CSCs were decreased in treated tumors. These results show the CSC-inhibitory activity of VP both in vitro and in vivo.We showed for the first time that the LATS2/YAP1/TEAD axis is early activated during the carcinogenesis process induced by chronic H. pylori infection and controls the subsequent EMT and CSC-like features. Targeting the Hippo pathway efficiently prevented tumor growth in a PDX model, highlighting the potential of its inhibition to be implemented in gastric cancer therapy.

Les Cellules Souches Hématopoïétiques sont à l’origine de la production de toutes les cellules sanguines et immunitaires, grâce à leur double capacité à s’auto-renouveler et se différencier en progéniteurs puis en cellules matures fonctionnelles. Du fait de leur importance, leur physiologie est contrôlée par de nombreux signaux qui assurent un équilibre entre quiescence, prolifération, auto-renouvellement et différenciation. Mes travaux s’intéressent au rôle du facteur de transcription PLZF dans la régulation des CSH grâce à l’utilisation du modèle murin Zbtb16lu/lu, qui porte une mutation spontanée inactivant PLZF. En cas de stress régénératif, les souris Zbtb16lu/lu présentent des défauts de reconstitution de l’hématopoïèse caractérisés par un biais myéloïde, une forte expansion des LT-HSC et des dérégulations du cycle cellulaire, un phénotype similaire au vieillissement physiologique des CSH. De plus, lors d'expositions répétées au Lipopolysaccharide, un composant des bactéries à Gram négatif, les souris Zbtb16lu/lu montent une réponse pro-inflammatoire excessive qui induit un remodelage du compartiment CSH, ce qui suggère qu’elles ne parviennent pas à mettre en place de tolérance au LPS. Ainsi, nos résultats semblent positionner PLZF comme un régulateur central du destin des CSH. / Hematopoietic stem cells (HSCs) are responsible for the production of all blood cells and possess the dual ability to self-renew and differentiate into progenitor and into mature cells. Given their importance, their physiology is tightly controlled by a plethora of signals that balance quiescence, proliferation, self-renewal and differentiation. In the present Phd work, I focused on the role of the transcription factor PLZF in HSC fate using the Zbtb16lu/lu mouse model, harbouring a spontaneous mutation inactivating PLZF. In a context of regenerative stress, Zbtb16lu/lu mice showed a decreased repopulation capacity characterized by a myeloid bias, expansion of LT-HSC and cell cycle dysregulation, features that seem to recapitulate HSC physiological aging. Furthermore, repeated injections of LPS, a component of Gram Negative bacteria, induced a strong pro-inflammatory response in Zbtb16lu/lu mice, that resulted in the reshaping of the HSC compartment and the failure to induce endotoxin tolerance. Taken together, our results suggest that PLZF is a central regulator of HSC fate.

Malgré sa complexité, le cerveau intègre en permanence de nouvelles cellules – à la fois neuronales et gliales – au-delà du développement embryonnaire et ce, tout le long de la vie. La période postnatale est caractérisée par une gliogenèse intense. A l’âge adulte, de nouveaux neurones et cellules gliales sont produits dans des régions restreintes à partir de cellules souches/progénitrices (CSP) localisées dans des niches. Les deux niches de CSP adultes les mieux décrites sont la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux, qui produit de nouveaux interneurones olfactifs, et la zone sous-granulaire du gyrus denté de l’hippocampe, où de nouveaux neurones en grain sont produits localement. Des travaux menés ces dernières années ont montré qu’une neuro- et une gliogenèse avaient aussi lieu dans l’hypothalamus postnatal, une petite région du diencéphale ventral qui régule des processus physiologiques vitaux tels que le métabolisme, la reproduction, le sommeil et la thermorégulation. Si l’identité des CSP hypothalamiques reste débattue, de nombreux travaux s’accordent sur l’importance de la neurogenèse hypothalamique postnatale dans le contrôle du métabolisme. Cependant, la possibilité que la genèse postnatale de cellules contribue aussi au contrôle de la fonction de reproduction, une autre fonction clé de l’hypothalamus, restait à explorer. L’objectif premier de mon travail de thèse était de rechercher si la genèse de cellules dans l’hypothalamus postnatal est impliquée dans le contrôle de la reproduction, une fonction physiologique qui requière un haut degré de plasticité. La fonction de reproduction est orchestrée par une petite population de neurones produisant la neurohormone Gonadotrophin-Releasing Hormone (GnRH). Ces neurones, qui naissent en dehors du cerveau, sont en place dans la région préoptique (RPO) de l’hypothalamus à la naissance. Cependant, ils doivent subir une maturation postnatale pour acquérir le profil de sécrétion qui leur permettra d’initier la puberté et d’assurer la fertilité de l’individu. Dans une première étude, grâce à une combinaison d’approches in vitro et in vivo, nous avons mis en évidence une vague d’astrogenèse dans l’environnement des neurones à GnRH au sein de la RPO au cours des deux premières semaines de vie postnatale chez la ratte. Nos résultats suggèrent que les neurones à GnRH utilisent la prostaglandine D2 pour attirer les progéniteurs environnants et que ce recrutement est important pour la maturation sexuelle. Dans une deuxième étude, nous avons recherché si de nouvelles cellules naissent à l’âge adulte dans des régions hypothalamiques qui contrôlent la fonction de reproduction. Nous montrons que des cellules sont produites dans la RPO chez la ratte adulte et que leur taux varie au cours du cycle oestral, suggérant une régulation par les stéroïdes sexuels. De plus, nous montrons que la survenue d’une gestation stimule la néogenèse cellulaire dans une zone de la RPO qui contrôle le comportement maternel. Si la néogenèse hypothalamique adulte a surtout été étudiée chez les rongeurs de laboratoire, il reste à déterminer si ce phénomène existe aussi chez l’homme. Pour aborder cette question, nous avons évalué dans une troisième étude l’expression de marqueurs de CSP dans l’hypothalamus humain adulte, comparativement au rongeur (souris, rat) et à un primate lémurien, le microcèbe. Nous montrons que l’hypothalamus humain adulte contient des populations de cellules au profil antigénique de CSP, dont certaines semblent propres à l’homme. Au total, ces travaux montrent que de nouvelles cellules naissent dans des régions hypothalamiques qui contrôlent la fonction de reproduction au cours de la vie postnatale et à l’âge adulte chez la ratte, et que ce phénomène est important pour la maturation sexuelle. L’observation de CSP putatives dans l’hypothalamus humain adulte suggère que la capacité de l’hypothalamus à produire de nouvelles cellules à l’âge adulte existe aussi dans notre espèce. / Despite its complexity, the brain keeps adding new cells – both neuronal and glial – beyond embryonic development and throughout life. The postnatal period is characterized by intense and widespread gliogenesis. During adulthood, both glio- and neurogenesis occur in restricted locations from stem/progenitor cells (NPC) residing in niches. The two best-described niches of adult NPC are the subventricular zone of the lateral ventricles, which provides new interneurons to the olfactory bulb, and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus that locally produces new granule cells. The last decade has seen an accumulation of studies showing that neuro- and gliogenesis also occur in the postnatal hypothalamus, a small portion of the ventral forebrain surrounding the third ventricle that regulates essential physiological processes such as metabolism, reproduction, sleep and thermoregulation. Even though the identity of hypothalamic NPC remains a matter of debate, a growing body of evidence points to postnatal hypothalamic neurogenesis relevance for the control of metabolism. However, a possible contribution of postnatal hypothalamic cell generation to the central control of reproduction, another key function of the hypothalamus, remained to be explored.The main aim of my doctoral researches was to evaluate whether the generation of new cells in the postnatal hypothalamus contributes to the central control of reproduction, a physiological function known to require a high degree of plasticity. The reproductive function is controlled by a small population of neurons producing the neurohormone Gonadotrophin-Releasing Hormone (GnRH). These neurons, which are born in the nasal placodes, are in place at birth in the preoptic area (POA) of the hypothalamus. However, they need a postnatal maturation to reach a mature secretory pattern that will trigger puberty and subsequent fertility.In a first study, using a combination of in vitro and in vivo experiments, we showed that a wave of astrogenesis occurs in the POA from local progenitors in the environment of GnRH neurons during the first weeks of postnatal life in the female rat. We identified prostaglandin D2 as a factor used by GnRH neurons to attract progenitors in their vicinity and showed that impaired progenitor recruitment alters sexual maturation.In a second study, we evaluated whether cell neogenesis still occurs during adulthood in hypothalamic regions relevant for the reproductive function. Our results showed that new cells are born in the POA of adult female rats. The rate of cell neogenesis varies across the estrus cycle, suggesting a regulatory influence of gonadal steroids. Moreover, we showed that gestation impacts the rate of cell neogenesis in a POA region implicated in the control of maternal behavior.While cell neogenesis in the adult hypothalamus has been mainly studied in laboratory rodents, it remains to be known whether this phenomenon also occurs in humans. To start addressing this question, we evaluated in a third study the expression of a panel of NPC markers in the adult human hypothalamus and compared it to that found in rodents (mouse, rat) and a lemur primate, the grey mouse lemur. Our results showed that the adult human hypothalamus contains populations of cells with an antigenic profile of NPC, some of which appear specific to humans.Altogether, this work shows that new cells are born in hypothalamic regions controlling reproduction throughout postnatal and adult life in female rats, and that this process is required for sexual maturation. The identification of NPC marker-expressing cells in the adult human hypothalamus suggests that the capacity for cell neogenesis also exists in the hypothalamus of our species.

L’arthrose est une maladie ostéoarticulaire fréquente et sans traitement curatif. Elle se manifeste par une dégénérescence du cartilage, associée à une altération des autres tissus de l’articulation. Dans ce contexte, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) démontrent un effet thérapeutique. Afin d’identifier de nouveaux médiateurs de l’homéostasie articulaire, nous avons analysé le secrétome des CSM en nous focalisant sur les membres de la famille du facteur de croissance transformant β (TGFβ), une voie centrale dérégulée dans l’arthrose.Cette approche nous a permis d’identifier la protéine induite par le TGFβ (TGFβI ou βIGH3), pour laquelle nous avons évalué le rôle dans la différenciation des CSM et comparé l’expression dans les tissus articulaires de patients arthrosiques et de sujets sains.Nous montrons l’importance du TGFβI dans la régulation des processus de différenciation osseuse et chondrogénique des CSM. Nous mettons également en évidence une dérégulation au niveau transcriptionnel et protéique de ce facteur dans le cartilage, l’os sous-chondral ainsi que les CSM de patients arthrosiques. En testant son implication dans l’effet thérapeutique des CSM sur des modèles d’arthrose in vitro et in vivo, nous montrons que la diminution de son expression dans les CSM annule leur effet thérapeutique dans les modèles d’arthrose. Cet effet chondroprotecteur du TGFβI est associé à une inhibition du remodelage osseux et de la calcification des tissus mous articulaires.L’ensemble de nos résultats démontrent l’importance de la régulation de la voie TGFβ, et plus particulièrement du TGFβI, dans l’homéostasie articulaire. En parallèle, nos travaux illustrent le rôle de ce facteur dans l’effet thérapeutique des CSM, et suggèrent que l’altération de son expression dans les CSM de patients arthrosiques soit à l’origine d’une diminution de leur potentiel régénératif. / Osteoarthritis (OA) is the most common form of joint diseases without curative treatments. The disease is mainly characterized by the degradation of articular cartilage which is associated with other pathological changes in joint tissues. In this context, mesenchymal stem cells (MSC) have demonstrated a therapeutic effect. In order to identify new mediators involved in articular homeostasis, we analyzed MSC secretome, focusing on the transforming growth factor β (TGFβ) members, a central pathway dysregulated in OA.This approach allows us to identify the TGFβ induced protein (TGFβI or βIGH3). In the present study, we evaluated its role in the differentiation of MSC and compared its expression in articular tissues from OA patients and healthy donors.We highlight the importance of TGFβI in the regulation of differentiation of MSC towards bone and cartilage. We also demonstrate its dysregulation at both transcript and protein level in cartilage, bone and MSC from OA patients. We then evaluated its role in the therapeutic effect of MSC in vitro and in vivo and demonstrated that its decreased expression in MSC is associated with a loss of their therapeutic effect in OA models. The chondroprotective effect of TGFβI is associated with an inhibition of bone remodeling and calcification of soft articular tissues.Together, our results highlight the importance of the TGFβ pathway, and specially of TGFβI regulation, in joint homeostasis. Moreover, our work demonstrates its role in the therapeutic effect of MSC, suggesting that its dysregulation in OA MSC could lead to a decreased regenerative potential.

L’objectif de ce travail de thèse est de réaliser des substrats et des dispositifs de culture cellulaire pour des applications à grande échelle. En utilisant à la fois des techniques de lithographie conventionnelles et non conventionnelles, nous avons d'abord fabriqué des matrices denses de piliers élastomère avec un gradient de hauteur pour les études de migration cellulaire et nous avons observé un allongement cellulaire remarquable et une migration cellulaire dirigée, tout dépendant du gradient de rigidité. Les micropiliers élastomères pourraient également être organisés en gradient de hauteur oscillant, montrant des comportements cellulaire similaires. Sur la base d'une approche biomimétique, nous avons produit des nanofibres à deux côtés d'une membrane avec des trous traversants pour l’adhésion et la migration tridimensionnelles de cellules. Nos résultats ont montré qu'un tel substrat peut favoriser l'infiltration et la prolifération des cellules dans un environnement 3D. Enfin, nous avons utilisé des réseaux micropiliers de différentes hauteurs en tant que substrat de rigidité contrôlée pour la différenciation des cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes l'homme. À l'aide d'un stencil en élastomère, des embryons uniformes pourraient être obtenus et dérivés vers les cellules de ciblage sur le substrat de différentes rigidité, montrant clairement une dépendance de rigidité des substrats. / The purpose of this work is to develop manufacturable cell culture substrates and devices for large scale applications. By using both conventional and non-conventional lithography techniques, we firstly fabricated dense elastomer pillar arrays with height gradient for cell migration studies and we observed remarkable cell elongation and directed cell migration, all depending on the strength of the stiffness gradient. Elastomer micropillars could also be organized in ripple-like height gradient patterns, showing similar cell behaviors. Based on a biomimetic approach, we produced nanofibers on both side of a membrane with through holes for three-dimensional cell adhesion and migration. Our results showed that such a 3D scaffold can promote the cell infiltration and proliferation. Finally, we used micropillar arrays of different height as stiffness controlled substrate for cardiomyocytes differentiation from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). With the help of an elastomer stencil, uniform embryoids could be obtained and derived to the targeting cells on the substrate of different stiffness, showing a clear stiffness dependence of the substrates.

L'objectif de ce travail est de développer une méthode d'ingénierie de scaffolds multidimensionnels pour la culture cellulaire et l’ingénierie tissulaire. Nous avons d'abord appliqué une technique d'impression 3D pour produire un scaffold en PEGDA et ensuite rempli l'espace libre du scaffold avec du gel de gélatine. Après la congélation et le séchage, un scaffold hybride en PEGDA avec des structures fine de gélatine a été obtenu, qui a été ensuite valisé par la culture et la différenciation des cellules progénitrices neuronales. Pour intégrer plus facilement dans un dispositif microfluidique, nous avons également conçu un scaffold 2D sous forme d’une couche mince de nid d'abeilles de PEGDA rempli des structures poreuses auto-assemblée de PCL. Ce scaffold 2D a été utilisé pour la culture cellulaire et la transfection des gènes, montrant des avantages par rapport aux méthodes classiques en termes d'absorption des nutriments et des facteurs solubles. Enfin, nous avons fabriqué un scaffold mous constitué d’une couche mince de nid d'abeilles en élastomère de PDMS et d’une monocouche de nanofibres de gélatine pour faciliter la différenciation cardiaque à partir des cellules souches pluripotentes humaine. Comme prévu, nous avons réalisé une génération cardiaque avec une contraction plus forte et une homogénéité de battement plus élevée par rapport aux approches classiques. Tous ensemble, nous avons démontré l'utilité des scaffolds hybrides pour l'ingénierie micro-tissulaire qui pourraient avoir un impact sur les études futures dans les domaines de l'ingénierie tissulaire, du criblage des médicaments et de la médecine régénératrice. / The objective of this work is to develop a method of engineering multi-dimensional scaffolds for cell culture and tissue formation. We firstly applied a 3D printing technique to produce the designed frame in PEGDA and then filled the free-space of the frame with a gelatin gel. After freezing and drying, a hybrid 3D scaffold made of gelatin porous structures and PEDGA backbone was obtained, which supported culture and differentiation of neural progenitor cells. To more easily integrate into a microfluidic device, we also designed a 2D scaffold in form of a thin layer of honeycomb frame of PEGDA and self-assembled porous structure of PCL. Such a patch form scaffold could be used for cell culture and gene transfection, showing advantages over the conventional methods in terms of nutrients and soluble factors uptake. Finally, we fabricated a soft patch made of an elastic frame in PDMS and a monolayer of gelatin nanofibers to facilitate cardiac differentiation from human induced pluripotent stem cells. As expected, we achieved a cardiac generation with higher contraction strength and a higher beating homogeneity comparing to the conventional approaches. All together, we demonstrated the utility of hybrid scaffolds for micro-tissue engineering which could impact the future studies in the fields of tissue engineering, drug screening and regenerative medicine.

En 2006 et 2007, les équipes de Yamanaka et Thomson réalisent la reprogrammation de cellules somatiques murines et humaines en cellules souches pluripotentes à partir de deux cocktails de gènes : OCT4, SOX2, KLF4, cMYC (OSKM) et OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 (ONSL). Les cellules souches à pluripotence induite générées (iPS) partagent les propriétés fondamentales des cellules souches embryonnaires : l’auto-renouvèlement, le maintien de la pluripotence et la capacité de différenciation. Ces cellules laissent entrevoir des applications considérables tant en recherche fondamentale (compréhension des mécanismes de développement et de pathologies, développement de modèles) qu’en recherche appliquée (médecine régénérative, toxicologie prédictive, criblage de médicaments). L’avantage majeur de l’utilisation des iPS réside dans leur origine non embryonnaire. Les contraintes d’ordre éthique sont écartées et une grande diversité de types cellulaires à partir de n’importe quel donneur a priori est disponible pour une reprogrammation. L’établissement d’une banque d’hiPS issus de donneurs sains ou de patients, serait d’une grande utilité pour la communauté scientifique se consacrant à l’étude des mécanismes physiopathologiques ou de développement et une source considérable pour la dérivation à des fins de thérapie cellulaire. Dans le but de mettre en place une telle banque, nous avons développé avec la société Vectalys des rétrovirus de reprogrammation contenant les cassettes polycistroniques ONSL et OSKM. Dans un premier temps, nous avons établi un protocole de reprogrammation robuste à l’aide des rétrovirus RV-ONSL. Nous avons ensuite mis en évidence la synergie entre les facteurs ONSL et OSKM, la combinaison équimolaire de RV-ONSL et RV-OSKM permettant d’atteindre 2% d’efficacité de reprogrammation. Nous avons également entrepris la reprogrammation propre par transfections d’ARNm polycistroniques ONSL et OKM mettant à profit cette incroyable synergie. / In 2006 and 2007, Yamanaka and Thomson teams achieved the reprogramming of mouse and human somatic cells into pluripotent stem cells through the transfection of two cocktails of genes: OCT4, SOX2, KLF4, cMYC (OSKM) and OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 (ONSL). The generated cells, called induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) share the same fundamental properties of ESC : self-renewing, pluripotency maintenance and capacity of differentiation into the three germ layers and suggest the same application potential in basic research (developmental and epigenetic biology) as well as in therapy (regenerative medicine, disease modeling for drug development). One of the major advantages of iPSC lies in their non-embryonic origin. Indeed, the use of iPSC resolves the ethical constraints and offers the possibility to work with extensive cell types directly from the patient to treat. Stéphane Viville’s research team aims to develop a hiPSC bank from patient suffering from genetic or other diseases which will be available for the scientific community. We are experienced in human primary fibroblasts reprogramming especially with the use of two polycistronic cassettes: ONSL encoding Thomson’s cocktail and OSKM encoding Yamanaka’s cocktail separated with 2A peptides. Thanks to the combination of RV-ONSL and RV-OSKM retroviral vectors (developed with Vectalys) we are yielding more than 2% of reprogramming efficiency in a highly reproducible way. Indeed, we demonstrated the reprogramming synergy of ONSL and OSKM combination. We are now focusing our effort on non-integrative strategies (ie mRNA) which are more appropriate for clinical usage.

Des mises au point de nouvelles stratégies d’expansion ex vivo des cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont développées depuis quelques années afin de pallier le problème du faible nombre de ces cellules pour le traitement des hémopathies ou de certaines tumeurs solides. Notre équipe avait établi un modèle d’expansion des CSH via leur exposition aux homéoprotéines HOXB4 ou HOXC4. L’étude comparative des transcriptomes de ces cellules a permis l’identification de cibles précoces des facteurs HOXB4/C4 parmi lesquels les gènes codant les régulateurs post-transcriptionnels Pumilio (de la famille PUF). Les facteurs PUF sont impliqués en particulier dans le maintien des cellules souches germinales dans différents modèles animaux, chez les vertébrés ou les invertébrés. Cependant, le rôle des facteurs PUF humains (hPum1 et hPum2) dans les cellules hématopoïétiques humaines n’avait jamais été étudié.Mon travail de thèse exposé ici a consisté, d’une part, en l’étude du profil d’expression des facteurs hPum1 et hPum2 dans différentes lignées hématopoïétiques et au cours de l’hématopoïèse humaine, démontrant une expression plus importante de ces gènes dans les cellules les plus immatures ainsi que dans les progéniteurs dont la prolifération est activée. D’autre part, l’étude fonctionnelle des facteurs hPum1 et hPum2 a mis en évidence leur implication dans l’expansion et la survie des cellules CD34+. L’inhibition spécifique de hPum1 ou de hPum2 in vitro par des shARN, induit une diminution significative du nombre absolu des cellules ainsi qu’une augmentation de leur apoptose. Cela corrèle avec une accumulation des CSH en phase G0-G1 du cycle cellulaire. Par ailleurs, la répression de l’expression de hPum1 ou de hPum2 diminue la reconstitution de l’hématopoïèse in vivo dans des souris immunodéficientes NOD-SCID-γC-/-. L’analyse des ARNm cibles des facteurs Pum par une étude comparative des transcriptomes des CSH transduites ou non par des vecteurs lentiviraux contenant des shARN hPum1 ou hPum2, a permis l’identification de nombreux gènes impliqués dans le contrôle de la croissance, de la survie ou du cycle cellulaire. L’ensemble de nos résultats montre l’indispensable implication des facteurs Pumilio dans le maintien de l’état souche, la prolifération et la survie des CSH humaines. Nous avons démarré des études fonctionnelles dans les cellules leucémiques myéloïdes primaires afin d’évaluer le rôle éventuel des facteurs Pumilio dans la leucémogenèse. Ultérieurement, la caractérisation de hPum1 et hPum2 comme de nouvelles molécules impliquées dans l’expansion des CSH permettra d’envisager leur étude dans la perspective de nouvelles stratégies thérapeutiques. / Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells (HSCs) could improve new therapeutic strategies for the treatment of hematopoietic malignancies and solid tumors. Our team had developed an original method to expand human HSCs, consisting in the transfer into these cells of active HOXB4 or HOXC4 homeoproteins. The comparative transcriptomic analysis of CD34+ cells exposed or not to HOXB4 or HOXC4 proteins induced over-expression of Pumilio (PUF) genes. PUF proteins are post-transcriptional regulators of gene expression. They are involved in different biological functions among which the maintenance of stem cells. However, the function of human PUF factors (hPum1 and hPum2) in hematopoietic stem cells has never been investigated. The work that I developed during my thesis first consisted in analyzing the expression of PUF factors in different hematopoietic cell lines and during human hematopoiesis. The results highlighted a high expression of the hPum1 en hPum2 genes in the most immature cells and in the proliferating active progenitors. The study of human PUF factors by inducing their inhibition using specific shRNAs revealed their involvement in proliferation and survival of CD34+ cells. In vitro, inhibition of hPum1 or hPum2 decreases the expansion of human HSCs and increases cell apoptosis. The hPum1 or hPum2 repression also increases the number of HSCs in G0-G1 phase of the cell cycle. Moreover, the inhibition of hPum1 or hPum2 reduces the capacity of human HSCs to reconstitute in vivo hematopoiesis of immunodeficient NOD-SCID-γC-/- mice. The identification of PUF target mRNAs by a comparative transcriptomic analysis of human HSCs infected or not with lentiviral vectors containing hPum1/2 shRNAs, revealed a large number of genes involved in the regulation of cell growth, survival or cell cycle. On the whole, our results demonstrate the involvement of Pumilio factors in stemness maintenance, expansion and survival of human HSCs. Functional studies in primary myeloid leukemic cells are in progress to assess the potential role of the Pum factors in the leukemogenic process. Later on, identification of Pumilio factors as new regulators of HSCs expansion will allow consider them as new tools for therapeutic perspectives.

L'infection congénitale par le cytomégalovirus humain (HCMV) est la première cause de séquelles acquises du système nerveux central (CNS). Elle est responsable de surdités neurosensorielles, de paralysies cérébrales ou d'anomalies neuro-développementales graves (0,1% des naissances) telles que des microcéphalies ou des anomalies de gyration. Pour étudier les effets de l'infection par le HCMV sur le développement cérébral, nous utilisons des cellules souches neurales (NSC) humaines dérivées de cellules souches embryonnaires (ES), ainsi que des coupes histologiques de cerveaux fœtaux infectés. Notre travail a porté sur l'analyse des conséquences de l'infection sur un facteur de transcription essentiel lors du développement cérébral, le Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARg). Nous avons démontré que l'infection par le HCMV diminuait la neuronogénèse, en association avec une augmentation des niveaux d'expression et d'activité de PPARg. En accord avec ces résultats, nous avons montré que le niveau d'expression de l'acide 9-hydroxyoctadecadienoique (9-HODE), un agoniste connu de PPARg était augmenté dans les NSC infectées. En outre, l'ajout de 9-HODE dans les NSC reproduit l'effet de l'infection sur PPARg conduisant à une augmentation du nombre de cellules positives pour l'antigène viral IE parmi les NSC infectées. De plus, nous avons démontré que : (1) l'activation pharmacologique ou l'expression ectopique de PPARg suffisent pour perturber la neuronogénèse de NSC non infectées ; (2) le traitement de NSC non infectées par le 9-HODE diminue la différenciation des NSC ; (3) le traitement de NSC infectées par du T0070907, un inhibiteur de PPARg restaure un taux normal de différenciation. Le rôle crucial de PPARg dans les pathologies fœtales liées à l'infection a été souligné par la mise en évidence de sa translocation nucléaire au sein des zones germinatives de cerveaux fœtaux infectés congénitalement par le HCMV (N=20), mais pas dans les cas contrôles. Nous avons également identifié un des gènes cibles de PPARg dans le cerveau infecté: LIS1, le gène de la lissencéphalie classique, dont l'expression est également augmentée dans les NSC infectées, de façon dépendante de l'activité de PPARg. Nous avons mis en évidence que l'expression de LIS1 était augmentée de façon massive dans les cerveaux fœtaux infectés congénitalement par le HCMV (N=6) par rapport aux cas contrôles (N=3). Ceci pourrait jouer un rôle central dans la physiopathologie, car il est connu que toute perturbation de l'expression de LIS1 conduit à des anomalies importantes de la migration neurale et au développement d'un phénotype dit "lissencephaly-like". L'ensemble de nos données révèle le rôle clé de PPARg dans la neuronogénèse et la pathophysiologie de l'infection congénitale par le HCMV. Elles ouvrent la voie à une meilleure compréhension des mécanismes régissant les phénotypes pathologiques, notamment concernant le rôle de LIS1 dans les anomalies de la migration neurale. / Congenital infection by human cytomegalovirus (HCMV) is a leading cause of permanent sequelae of the central nervous system, including sensorineural deafness, cerebral palsies or devastating neurodevelopmental abnormalities (0.1 % of all births). To gain insight on the impact of HCMV on neuronal development, we used both neural stem cells from human embryonic stem cells (NSC) and brain sections from infected fetuses. We investigated the outcome of infection on Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARg, a transcription factor critical in the developing brain. We observed that HCMV infection dramatically impaired the rate of neuronogenesis and strongly increased PPARg levels and activity. Consistent with these findings, levels of 9-hydroxyoctadecadienoic acid (9-HODE), a known PPARg agonist, were significantly increased in infected NSCs. Likewise, exposure of uninfected NSCs to 9-HODE recapitulated the effect of infection on PPARg activity. It also increased the rate of cells expressing the IE antigen in HCMV-infected NSCs. Further, we demonstrated that (1) pharmacological activation of ectopically expressed PPARg was sufficient to induce impaired neuronogenesis of uninfected NSCs, (2) treatment of uninfected NSCs with 9-HODE impaired NSC differentiation and (3) treatment of HCMV infected NSCs with the PPARg inhibitor T0070907 restored a normal rate of differentiation. The role of PPARg in the disease phenotype was strongly supported by the immunodetection of nuclear PPARg in brain germinative zones of congenitally infected fetuses (N=20), but not in control samples. We also identified LIS1 as one of the target genes for PPAR??in the infected brain. Levels of LIS1, the gene of classical lissencephaly, were strongly increased in infected NSC, presumably resulting from increased PPAR? activity. The relevance of this finding was further supported by our demonstration of a massive increase in the immunodetection in LIS1 fetal brains congenitally infected with HCMV (N = 6), relative to control cases (N = 3). Indeed, it is well known that overexpression of LIS1 is responsible for significant abnormalities of neural migration and development of a lissencephaly-like phenotype. Altogether, our findings reveal a key role for PPARg in neurogenesis and in the pathophysiology of HCMV congenital infection. They also pave the way to the identification of PPARg gene targets in the infected brain.

Avec près d’un million de nouveaux cas par an à travers le monde, le cancer colorectal est un problème de santé publique majeur. Il est la 2ème cause de mortalité par cancer en France, ce fort taux de mortalité étant relié à un pourcentage important de récidives et de métastases. L’hétérogénéité tumorale, la dissémination, la résistance aux traitements et la récidive seraient notamment dues à une population particulière de cellules tumorales appelées cellules souches cancéreuses (CSC). Ces cellules sont dotées d’une capacité d’adaptation extraordinaire et la compréhension des mécanismes moléculaires sous-tendant cette plasticité cellulaire est un objectif majeur pour concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques les ciblant spécifiquement. La synthèse protéique joue un rôle clé dans la carcinogénèse : d’une part, une synthèse protéique élevée est nécessaire à la prolifération des cellules tumorales, d’autre part, la traduction sélective favorise l’expression de protéines pro-oncogéniques. Considéré pendant des années comme un acteur passif de la traduction, le ribosome semblerait jouer un rôle majeur dans la régulation de la synthèse protéique. En effet, des études récentes ont montré que la composition du ribosome était « flexible » et permettrait de favoriser la traduction de certains ARN messager (ARNm). De plus, l’expression de certaines protéines ribosomiques (PR) varie entre le tissu sain et le tissu cancéreux, parfois même entre la tumeur initiale et la métastase. Ce projet vise à déterminer de quelle manière le contrôle traductionnel intervient dans plusieurs étapes clé du cancer colorectal, en se focalisant tout particulièrement sur l’acquisition ou la perte de propriétés propres aux CSC. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires exploités par les CSC afin de résister aux traitements et s’adapter à leur environnement. De plus, ce projet pourrait mettre en évidence un rôle exercé par certaines protéines ribosomiques dans le contrôle traductionnel, à travers la filtration des ARNm par le ribosome. A plus long terme, il pourrait déboucher sur le développement de nouveaux traitements permettant de cibler spécifiquement la machinerie traductionnelle des CSC. / Despite significant advances in diagnostics and treatment, colorectal cancer (CRC) remains a major cause of mortality worldwide and occurrence of metastasis represents the primary cause of death. Metastasis process, chemoresistance and tumor recurrence is powered by a minor subpopulation of tumor cells endowed with self‐renewal and multi‐lineage differentiation ability: the cancer stem cells (CSC).Translation of mRNA into protein is the final step in gene-expression process, which mediates the formation of the translatome from genomic information. Several mechanisms, such as signaling pathways, translation factors availability, alternative open reading frame and alternative initiation pathways account for real time translatome remodeling. Moreover, an emerging concept suggests that ribosome is heterogeneous and can be "reprogrammed". These "specialized ribosomes" would preferentially engage certain mRNA at the expense of others and therefore drive cell phenotype and favor cell adaptation. Many studies have correlated deregulation of both translation machinery composition and activity with cancer initiation and evolution. From that perspective, CSC might well represent a perfect model to test whether the translation apparatus takes an active part in tumor initiation, progression, and metastasis. Our goal is to demonstrate that protein synthesis is differentially regulated depending on cancer cell subpopulation and determine whether ribosomal heterogeneity could influence tumoral evolution and plasticity. In a long run, we envision the development of novel therapies based on specific targeting of translational control in CSC.