La thérapie cellulaire utilisant une greffe d’hépatocytes est une stratégie prometteuse pour traiter les maladies du foie. Cependant, plusieurs limitations freinent leur transfert pour des applications cliniques, comprenant la production à haut débit d'hépatocytes fonctionnels, leur survie en culture, l’âge du donneur et la source des cellules souches hépatiques (CS). Les avancées scientifiques réalisées à ce jour ont permis d’identifier de nouveaux marqueurs moléculaires et les voies de signalisation impliquées dans la différenciation des CS en hépatocytes fonctionnels. En effet, la voie de signalisation Wnt a montré être importante pour réguler de nombreux processus biologiques des CS permettant de contrôler leur différenciation hépatique dont l’activation des GTPases et les gènes ciblant la voie de signalisation de Lgr5. Récemment, des études ont montré que le marqueur Lgr5 (récepteur 5 couplé à la protéine G contenant une répétition d’acides aminés riche en leucine) est décisif pour maintenir une expansion à long terme des CS hépatiques in vitro. En outre, Lgr5 fonctionne principalement comme un effecteur de la Cdc42 (cycle de division cellulaire 42) qui est un membre de la famille des Rho-GTPase. Une forte expression de la Cdc42 a montré être corrélée avec le vieillissement des SCs hématopoïétiques. Néanmoins, cette corrélation n'a jamais été étudiée à ce jour dans les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (hADSCs).Au cours de nos travaux de thèse, nous nous sommes intéressés (i) à proposer une nouvelle technologie de reprogrammation d’hépatocytes matures murins en progéniteurs endodermiques (mEndoPCs) exprimant Lgr5 capables de générer des organoïdes spécifiques du foie et de se différencier en hépatocytes et cholangiocytes in vitro et en des structures biliaires et hépatiques in vivo (ii) à étudier l’activité de Cdc42 dans les hADSCs âgées et l'impact de son inhibition sélective par le ML141 sur leur potentiel de différenciation hépatique in vitro.Nous montrons qu’il a été possible de générer des mEndoPCs et à améliorer la différenciation hépatique des hADSCs âgés. Nous montrons également que Lgr5 et Cdc42 sont régulés de façon distincte par la voie de signalisation Wnt. De plus, nos résultats ont révélé que les voies LIFR/STAT3 et Lgr5/WNT sont essentielles pour l’auto renouvellement des mEndoPCs permettant leur expansion illimitée in vitro en présence d’activateur de STAT3. Les voies MAPK/PKA, WNT/ β-caténine et la production d'exosomes ont montré avoir rôle majeur dans l’âge des hADSCs. Nous montrons qu’une transition mésenchymato-épithéliale était nécessaire pour différencier les hADSCs en hépatocytes fonctionnels. D’autre part, ML141 est proposé comme un nouvel outil pharmacologique permettant de reverser l’âge des hADSC âgés et d’amplifier le taux de prolifération, d’adhésion et de fonctionnalité hépatique à un niveau équivalent aux hADSCs jeunes. Enfin, le transfert de ces méthodologies à l’homme pourrait servir pour la médecine régénératrice du foie, comme outil pour évaluer la toxicité hépatique des médicaments et pour l'ingénierie et la reconstitution d’un foie entier par des approches de « bio printing ». / Hepatocytes cell-based transplantation is a promising strategy for treating liver diseases. However, there are still several limitations for their use in clinical applications among them the generation of highthrouput of functional hepatocytes, their life span in culture, the age of the donor age and the source of hepatic stem cells (SCs). At present, the challenge lies to develop approaches aiming the identification of the new molecular markers signaling pathways involved in the differentiation of SCs toward functional hepatocytes. In fact, Wnt(s) pathways governs multiple biological processes controlling the differentiation fate of SCs into hepatocytes, some of them result in the activation of small GTPase and the Lgr5 pathway regulators. Indeed, Lgr5 (a target gene of Wnt, the Leucine-rich-repeat-containing G protein-coupled Receptor 5) was shown to be crucial for maintaining long-term expansion of hepatic SC in vitro. In addition, Lgr5 primarily functions as an effector of the Cdc42 GTPases (a RhoGTPase protein, the cell division cycle 42). Higher activity of Cdc42 was reported to be correlated to hematopoietic SCs aging. However, this correlation has never been studied before in adipose tissue Mesenchymal Stem Cells (ADSCs) which were proposed recently as a promising tool for liver regeneration.In this study, we were interested (i) to propose a novel method of reprogramming mouse mature hepatocytes into murine endodermic progenitors (mEndoPCs) that express Lgr5, generate liver-specific organoids and can differentiate into hepatocytes and cholangiocytes in vitro and give arise to bile duct structures and into functional hepatocytes in vivo, and (ii) to study the activity of Cdc42 in human aged-derived hADSCs and the impact of its selective inhibition by ML141 on their hepatic differentiation potential in vitro.In our study we succeeded to generate mEndoPCs and to improve the functionality of the aged-hADSCs derived-hepatocytes. We showed that both Lgr5 and Cdc42 are regulated distinctly by Wnt signaling pathways. In addition, our results revealed that LIFR/STAT3 and LGR5/WNT pathways are important to maintain the unlimited expansion of mEndoPCs in vitro when STAT3 pathway is activated. MAPK/PKA, WNT/ β-catenin pathways and the exosome’s production were shown to be deregulated with hADSCs aging. We showed also that a mesenchymal to epithelial transition was crucial to transdifferentiate hADSCs into functional hepatocytes. On the other side, ML141 is proposed as a new pharmacological tool to rejuvenate aged-hADSCs toward functionally younger-like cells thus by promoting cell proliferation, doubling and cell adherence. Finally, the transfer of these methodologies to human could serve the regenerative medicine of the liver as a good tool for hepatocyte-based drug toxicity screening systems and for the liver engineering using a « bio printing » approach.

Les tendinites sont des lésions communes chez le cheval athlète, ayant un impact financier et sportif considérable. Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) de moelle osseuse (MO) sont empiriquement utilisées en clinique pour améliorer la guérison des affections myoarthrosquelettiques. Cependant, il est nécessaire de standardiser les protocoles d’isolement des CSMs équines et d’analyser leurs effets sur la guérison tendineuse pour ajuster leur dose. Les objectifs de cette étude étaient de comparer 3 méthodes d’isolement des CSMs équines et d’établir un modèle de guérison tendineuse minimal invasif pour analyser l’effet des CSMs sur cette guérison. Des CSMs de MO du sternum de juments étaient isolées par 3 protocoles couramment utilisés (adhérence au pétri (Classique) et 2 méthodes par gradient de densité (Percoll et Ficoll)). La viabilité des cellules après isolement, le rendement d’isolement, le nombre de CSMs obtenues après 14 jours de culture et leurs caractéristiques fonctionnelles (renouvellement et différentiation) étaient comparés entre les 3 protocoles. Les résultats suggéraient que le Percoll était le meilleur protocole en termes de rendement et de capacité de renouvellement des cellules. La différence n’était pas significative pour leur viabilité et leur capacité de différentiation. Un modèle de guérison tendineuse, consistant en une ténectomie du tendon extenseur latéral du doigt fut ensuite développé. Cependant, la grande variabilité interindividuelle de qualité de guérison dans le groupe pilote implique une ré-évaluation du modèle. Des études futures, avec des CSMs isolées par le Percoll dans de nouveaux modèles de guérison tendineuse devraient permettre de déterminer la dose adéquate de CSMs. / In equine athletes, tendinitis lesions are common and lead to substantial financial losses. Bone marrow (BM) mesenchymal stem cells (MSCs) are employed clinically empirically to enhance healing of musculoskeletal injuries. However, there is a need to standardize equine MSC isolation protocols, to analyze the effects of MSCs on tendon healing and to optimize dosage. The objectives of the study were to compare 3 methods of equine MSC isolation and develop a minimally invasive model of tendon healing to analyze the effects of MSCs on tendon healing. BM MSCs from the sternum of mares were isolated by 3 protocols (adherence to a plastic culture dish (Classic) and two gradient density separation protocols (Percoll and Ficoll)) to compare for cell viability, MSC yield, number of MSCs attained after 14 days of culture and functional characteristics (self-renewal and multilineage differentiation) of the MSCs. The results suggested that the Percoll protocol was the best of those assessed in terms of MSC yield and self-renewal potential and that MSCs retrieved with the Ficoll protocol had the lowest self-renewal. There were no significant differences in terms of cell viability and differentiation capacity. A tendon healing model was then developed and consisted of a 0.5 cm tenectomy of the lateral digital extensor tendon. However, interanimal variation of healing quality was so high within the pilot group that the model should be re-evaluated. Further studies using MSCs isolated with Percoll in other novel models of tendon healing would allow determination of the adequate dosage of MSCs.

L'ingénierie tissulaire est une discipline récente aux enjeux ambitieux et prometteurs : la régénération de tissus ou d'organes lésés voire détruits en mettant à profit des connaissances et compétences dans différents domaines à l'interface de la chimie et de la biologie. Pour répondre à la demande d'alternatives aux techniques chirurgicales actuelles de réparation du ligament antérieur croisé, nous avons décidé d'appliquer l'ingénierie tissulaire à ce tissu en associant matrices en polymères dégradables et cellules souches mésenchymateuses (CSM). Dans un premier temps, nous avons donc travaillé à la synthèse de polymères adaptés à l'application en cherchant à mettre l'accent sur l'obtention de propriétés élastiques. De nouveaux élastomères dégradables obtenus par des approches originales de photoréticulation chimique de poly(lactide) (PLA) et de poly(ε-caprolactone) (PCL) par voie nitrène ou thiol-yne ont notamment été développés avec des résultats prometteurs. En parallèle, des copolymères thermoplastiques multiblocs à base de PLA et poloxamine ou poloxamère nous ont permis de mener une étude plus appliquée. Ces copolymères ont en effet montré, en particulier au cours d'une étude de dégradation in vitro de 7 semaines, des propriétés, notamment thermiques et mécaniques, qui en font d'eux des candidats intéressants pour le conception d'une matrice ligamentaire. C'est pourquoi ils ont été utilisés pour la conception de prototypes de matrices de régénération textiles dont les propriétés mécaniques se sont révélées être très proches de celles du ligament. Après avoir démontré l'excellente cytocompatibilité de ces matrices avec des CSM, nous avons finalement mené des expériences de différenciation in vitro de ces CSM et sommes parvenus à favoriser leur orientation vers un phénotype ligamentocytaire, notamment grâce à un procédé de stimulation mécanique cyclique des cellules ensemencées sur les matrices textiles. / Tissue engineering is a recent discipline with ambitious and promising stakes: the regeneration of wounded or destroyed tissues or organs by taking advantage of knowledge and skills in various fields at the interface of chemistry and biology. In order to meet the need for alternatives to current surgical techniques of anterior cruciate ligament repair, we decided to apply the tissue engineering approach to this tissue by associating degradable polymer scaffolds and mesenchymal stem cells (MSCs). At first we worked on the synthesis of biodegradable polymers suitable for the application and focused on getting elastic properties. New degradable elastomers obtained by chemical photocrosslinking of poly(lactide) (PLA) and poly(ε-caprolactone) (PCL) were developed by following nitrene or thiol-yne strategies and yielded promising results. In parallel, a more in depth and practical study was performed with PLA based thermoplastic multiblock copolymers embedding poloxamer or poloxamine. These copolymers exhibited properties that make them attractive candidates for the design of ligament regeneration scaffolds, and especially their thermal and mechanical properties during a 7 week in vitro degradation test. That is why they were used to design prototypes of textile scaffolds whose mechanical properties were found to be very close to the ligament's ones. After demonstrating the excellent cytocompatibility of these scaffolds with MSCs, we finally carried out in vitro differentiation experiments on these MSCs and managed to induce their orientation towards a ligamentocyte phenotype, particularly through a process of cyclic mechanical stimulation of cells seeded on the textile scaffolds.

Le silicium poreux est un biomatériau prometteur pour l'ingénierie tissulaire car il est non toxique et biorésorbable. Des modifications de surface permettent de contrôler sa vitesse de dégradation et peuvent favoriser l'adhésion cellulaire. Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) sont des cellules souches mésenchymateuses retrouvées dans la pulpe dentaire, à l'intérieur des dents, et constituent une source accessible de cellules souches. Regrouper les capacités de prolifération et différenciation des DPSC avec les propriétés morphologiques et biochimiques du pSi représente une approche intéressante pour des applications thérapeutiques de médecine régénératrice. Dans cette thèse, nous avons étudié le comportement de DPSC humaines sur des supports de pSi, avec des pores variant de quelques nanomètres à plusieurs centaines de nanomètres. Nous avons travaillé sur différentes fonctionnalisations chimiques afin d'optimiser l'adhésion cellulaire et de stabiliser le matériau : oxydation thermique, silanisation et hydrosilylation. L'adhésion, la prolifération et la différenciation osseuse ont été évaluées par microscopie à fluorescence, microscopie électronique à balayage, activité enzymatique, tests de prolifération (activité mitotique), immunofluorescence et spectroscopie FTIR. Le pSi avec des pores de 30 à 40 nm de diamètre s'est révélé être le plus approprié pour l'adhésion, la prolifération cellulaire et la différenciation ostéoblastique. De plus, la structure nanométrique et le relargage d'acide silicique par le pSi a démontré un effet positif sur l'induction osseuse et la formation d'une matrice minéralisée. Le pSi est donc apparu comme un matériau prometteur pour l'adhésion de cellules souches mésenchymateuses, que ce soit pour une transplantation immédiate in vivo ou pour expansion et différenciation in vitro. / Porous silicon (pSi) is a promising biomaterial for tissue engineering as it is both non-toxic and bioresorbable. Moreover, surface modification can offer control over the degradation rate of pSi and can also promote cell adhesion. Dental pulp stem cells (DPSC) are mesenchymal stem cells found within the teeth and constitute a readily source of stem cells. Coupling the good proliferation and differentiation capacities of DPSC with the textural and chemical properties of the pSi substrates provides an interesting approach for therapeutic use. In this thesis, the behavior of human DPSC is analyzed on pSi substrates presenting pore of various sizes, from few to hundreds nanometers. We investigated different chemical surface treatments, in order to enhance cell adhesion and stabilize the material: thermal oxidation, silanization and hydrosilylation. DPSC adhesion, proliferation and further osteodifferentiation were followed for up to 3 weeks by fluorescence microscopy, scanning electron microscopy (SEM), enzymatic activity assay, BrdU assay for mitotic activity, immunostaining and FTIR spectroscopy. Porous Silicon with pore size ranging from 30 to 40 nm was found to offer the best adhesion, the fastest growth rate for DPSC and the highest osteoinductive effect. Moreover, the pSi nanostructure and the release of silicic acid had a positive effect on precursor cells osteodifferentiation and mineralized matrix formation. Porous silicon appeared to be an appropriate biomaterial for mesenchymal stem cells adhesion and immediate in vivo transplantation, or for long term in vitro culture, for stem cells proliferation and differentiation.

Résumé français manquant / Scientific background: GAGs mimetics properties on regenerative process.Glycosaminoglycans (GAGs) are sulfated polysaccharides actually considered as major structural components of the extracellular matrix as well as regulators of cells functions during homeostatic and pathological processes. These GAGs activities are based on their ability to interact with heparin binding growth-factors (HBGF), chemokines and enzymes, to protect them from proteolytic degradation and to potentialyze their interaction with cell surface specific receptors and/or other components of the ECM. GAGs are characterized by their extensive structural diversity, based on the number and location of sulfate or acetylate groups, that would determine specific biological interactions.As comparative tool to study the relationship between the complexity of GAGs chemical structures and their biological functions, we used synthetic GAGs mimetics, derivate from a polymer of dextran and functionalized with carboxylate, sulfate and/or acetate groups. They are structurally and functionally related to natural heparan sulfates. These compounds improved both the rate and quality of regenerative process in numerous animal models of injury after topical treatment.Our hypothesize is that specific HS cooperative interactions with HBGF and ECM compounds could influence both therapeutic progenitors and stem cells properties by compartmentalizing them to specific microenvironment niches, and protecting them against deleterious signals. Such abilities to modulate stem cell biology could be a new way to explain and to take advantage of regenerative properties of these compounds. The principal aim of this work was to demonstrate the effects of GAGs mimetics on Mesenchymal Stem Cells (MSC) properties for application in bone repair. GAGs mimetics as new potentializing agents of mesenchymal stem cells propertiesDuring osteogenesis, a controlled expression of functional HS is required to interact and regulate the activity of growth promoting and osteogenic differentiation factors. However effects of GAGs on MSC properties remain to be analyzed. We focus on two GAGs mimetics leader molecules [OTR4131] and [OTR4120], with distinct chemical characteristics, since sulfated mimetic [OTR4120] was previously shown to stimulate bone repair in vivo. We demonstrate that its acetylated and sulfated counterpart [OTR4131] enhances proliferation, whereas [OTR4120] clearly stimulates migration and osteogenic differentiation properties of rat MSC in vitro, that could explain its bone regenerative effect in vivo. This indicates that GAGs mimetics would be of great interest for potential application in therapy, since according to their structural signature they could modulate specific activities of progenitors and stem cells, and represent an alternative to exogenous growth factor treatments. New matricial strategy for bone repair associating GAGs mimetics to biomaterials and human MSCCell based therapy associated to biomaterials for repair of bone defects are promising but not enough efficient. We proposed to develop matricial strategy, associating efficient micro-environment molecules such as GAGs mimetics, to optimize cell therapeutic approaches. First we validated that GAGs mimetics are effective on human MSC proliferation, migration and differentiation properties in vitro. We demonstrated that colonization efficiency of hydroxyapatite/β-tricalcium phosphate biomaterial scaffolds by human MSC was improved when scaffolds are functionalized with GAGs mimetics in vitro. Finally osteoformation in vivo was evaluated after ectopic transplantation of functionalized and/or cellularized biomaterials in nude mice: few effects were observed on bone formation, whereas osteoclastogenesis and vascularization were clearly modulated by GAGs mimetics immobilized. GAGs mimetics as new mobilizing agents of stem cells...

Ce travail de thèse avait pour objectif le développement de systèmes de culture cellulaire, en 2D et en 3D, en mettant à profit les propriétés d’un transporteur d’oxygène marin, HEMOXCell®. Notre approche générale était articulée selon deux grands axes : un premier concernant l’évaluation de l’utilisation d’HEMOXCell® dans la culture de deux modèles cellulaires, et un second, utilisant les résultats obtenus à des fins d’ingénierie tissulaire. Dans le premier axe, l’évaluation de l’effet dose-réponse d’HEMOXCell® dans la culture des cellules CHO-S et des cellules souches mésenchymateuses (CSM), a permis de déterminer des concentrations de travail optimales, favorisant la viabilité et la prolifération cellulaire. Le modèle cellulaire CHO-S a contribué à la mise en place d’un test de performance de la molécule, et encouragé son utilisation dans des systèmes de bioproduction. Les essais menés sur les CSM ont quant à eux permis de valider l’innocuité de la molécule à de faibles doses et le maintien de l’état « souche ». L’idée d’associer les CSM à des supports poreux est prometteuse pour des applications d’ingénierie tissulaire, mais est soumise aux problèmes liés à l’oxygénation en profondeur des supports. Dans le second axe de ce projet, nous avons oeuvré à améliorer la colonisation de substituts osseux et méniscaux, en culture statique et dynamique, en présence d’HEMOXCell®. Parallèlement, une étude a été menée pour tenter de caractériser les cellules méniscales. Les analyses de la colonisation des biomatériaux suggèrent un effet bénéfique d’HEMOXCell® lorsqu’il est utilisé en complément des milieux de différenciation cellulaire. Ce travail a contribué à améliorer la compréhension de ce transporteur d’oxygène et à l’élargissement de ses potentiels champs d’utilisation notamment dans un cadre thérapeutique. / This work aimed to develop cell culture systems, in 2D and 3D, based on the properties of HEMOXCell®, a marine oxygen carrier. Our approach was articulated in two main parts: the first one dealing with the assessment of the use of HEMOXCell® in the culture of two cellular models, and the second one, exploiting the results obtained for tissue engineering purposes. In this first axis, the dose-response effect of HEMOXCell® in the CHO-S cells and mesenchymal stem cells (MSC) in vitro culture, allowed the identification of optimal working concentrations, which can promote cell viability and proliferation. The CHO-S model has contributed to the establishment of a performance test of the molecule, and encouraged its use for bioproduction stimulation. The tests performed on MSCs were used to validate the harmlessness of the molecule at low doses and the maintenance of "stemness". The idea to associate MSCs with porous scaffolds is a promising approach for tissue engineering applications, but it is confronted to the lack of oxygen in the depth of the substitutes. In the second part of this project, we worked at improving the cellularization of bone and meniscal substitutes, under static and dynamic culture systems, w/ and w/o HEMOXCell®. In parallel, a study was conducted to attempt to characterize the meniscal cells. Analyses of cellularized biomaterials suggest a beneficial effect of HEMOXCell® when used as a differentiation media supplement. This work contributed to improve this oxygen carrier understanding and to extend the field of its potential uses particularly for therapeutic applications.

Parmi les facteurs de risque environnementaux de l'arthrose, la consommation de tabac occupe une place importante, mais reste encore controversée. Parmi les 4000 composés présents dans la cigarette, la nicotine est l'une des molécules les plus actives physiologiquement. Au cours de ce travail, nous avons étudié l'impact de la nicotine sur les chondrocytes humains et la prolifération et la différenciation chondrogénique des cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton (CSM-GW). Nous avons trouvé que la nicotine aux concentrations utilisées n’a pas d’effet sur la prolifération cellulaire, mais induit une augmentation de l’expression de la métalloproteinase matricielle (MMP13) dans les chondrocytes humains. Ces données suggèrent que la nicotine a un effet pro-catabolique sur les chondrocytes humains, en stimulant la dégradation des composants matriciels. Chez des patients arthrosiques fumeurs, les voies de synthèse et de dégradation des composants matriciels sont plus activées dans les chondrocytes par rapport aux non fumeurs. De plus, la nicotine inhibe la prolifération et la migration cellulaire de CSM-GW, et présente un effet délétère sur la chondrogénèse de CSM-GW. Elle stimule la réaction inflammatoire et la différenciation hypertrophique. Nous avons montré, pour la première fois, l'expression du nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), en particulier de la sous unité α7 dans les CSM-GW aux niveaux transcriptionnel et traductionnel. L’effet délétère de la nicotine sur les CSM-GW serait probablement médiée par la sous unité α7 nAChR, De façon intéressante, l’α-Bungarotoxin (α-BTX), inhibiteur spécifique de α7 nAChR, peut réverser cet effet partiellement. En conclusion, nous suggérons que la nicotine pourrait altérer l’ontogenèse du cartilage, et induire potentiellement l’augmentation de la prévalence de l’arthrose chez l’adulte / Among the environmental risk factors for osteoarthritis (OA), tobacco consumption features prominently but is still controversial today. Among the 4,000 compounds present in cigarette smoke, nicotine is one of the most physiologically active molecules. The aim of the study is to measure the impact of nicotine on human chondrocytes and on the proliferation and chondrogenic differentiation of Wharton’s Jelly stem cells (WJ-MSC). We found that nicotine at the concentrations used had no effect on the proliferation of primary human OA chondrocytes, but induced an increase in the expression of matrix metalloproteases (MMP13). It unravels the catabolic effects of nicotine in the joint by stimulating matrix degradation. This result suggests a pro-catabolic effect of nicotine in the joint by stimulating matrix degradation. In smokers, the synthesis as well as the degradation pathways in chondrocytes are stimulated, when compared to no smokers. In addition, the cell proliferation and migration of WJ-MSC were significantly impaired by nicotine, and it also had an adverse effect on the chondrogenesis of WJ-MSC by stimulating the inflammatory response and hypertrophic differentiation. We have shown, for the first time, the expression of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), in particular that of the α7 subunit in the WJ-MSC at the transcriptional and translational levels. The adverse effect of nicotine on WJ-MSC was probably mediated by α7 nAChR. Interestingly, α-Bungarotoxin (α-BTX), a specific inhibitor of α7 nAChR, could partially reverse this effect. In conclusion the results show that nicotine has an adverse effect on the ontogenesis of cartilage, and potentially induces an increase in the prevalence of osteoarthritis in adults

Les vésicules extracellulaires nanométriques (nEVs) issues de cellules souches mésenchymateuses (CSMs) et les nanovésicules synthétiques sont au centre de nombreuses recherches pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques en médecine régénérative. La mise en place d’une méthode standardisée pour isoler les nEVs à partir de milieu conditionné de CSMs et de pouvoir les caractériser a été nécessaire. Nous nous sommes concentrés sur leur taille qui se situe entre 30 et 150 nm ainsi que la présence de certains de leur marqueurs membranaires (CD9, CD63 et CD81). Durant ce travail, deux méthodes d’isolement ont été testées. Les résultats obtenus par les analyses physiques (Nanosight®, microscopie électronique à transmission) et biologiques (cytométrie en flux) des différents échantillons ont permis de standardiser la méthode d’isolement des nEVs par centrifugations et ultracentrifugations successives. Ensuite, nous nous sommes intéressés à l’utilisation de ces nEVs sécrétées par les CSMs en culture cellulaire. Il a été mis en évidence que des interactions existent entre ces nEVs et des cellules endothéliales (CEs) in vitro. Ces interactions vont entraîner des modifications dans le comportement cellulaire des CEs en augmentant leur potentiel de formation de réseaux vasculaires. En parallèle de ces travaux sur les nEVs, une étude a été réalisée sur l’utilisation de nanovésicules synthétiques, des nanoliposomes (NLPs), élaborées à partir de lécithine d’agro-ressource (saumon) comme transporteur de TGF-ß1 pour une application en médecine régénérative. Après leur caractérisation physico-chimique, cette étude préliminaire a montré que ces NLPs ne présentent pas de cytotoxicité pour les CSMs in vitro. Il existe un potentiel important d’utilisation des nEVs de CSMs ainsi des NLPs pour développer de nouvelles stratégies innovantes en thérapie « cell-free » dans le domaine de la médecine régénérative / Nanoscale extracellular vesicles (nEVs) derived from mesenchymal stem cells (MSCs) and synthetic nanovesicles are at the centre of many research studies for the development of new therapeutic strategies in regenerative medicine. A standardized method was used to isolate nEVs from conditioned media of CSMs and to characterize them. We focused on their size with a range of 30 to 150 nm and the presence of some of their membrane markers (CD9, CD63 and CD81). During this work, two isolation methods were tested. The results obtained by the physical (Nanosight®, transmission electron microscopy) and biological (flow cytometry) analyses of the different samples allowed to standardize the method of isolation of the nEVs by successive centrifugation and ultracentrifugation. Then, we studied the use of these nEVs derived from MSCs in cell culture. Interactions between these nEVs and endothelial cells (ECs) have been demonstrated in vitro. These interactions lead to changes in the cellular behaviour of ECs by increasing their potential to form vascular networks. In parallel of this work on nEVs, we studied the use of synthetic nanovesicles, called nanoliposomes (NLPs) prepared from agro-resource derived lecithin (salmon) as TGF-β1 transporters for applications in regenerative medicine. After their physicochemical characterization, this preliminary study showed that these NLPs do not exhibit cytotoxicity for MSCs in vitro. There is an important potential for the use of nEVs derived from MSCs as well as NLPs to develop new cell-free therapy innovative strategies in the field of regenerative medicine

Ce travail a pour objet de déterminer les conditions optimales de production de substituts allogéniques capables de combler les lésions cartilagineuses dans le cadre du traitement de l’arthrose. Il s’oriente particulièrement sur la composante cellulaire de ces substituts. L’usage de cellules souches mésenchymateuses issues de cordons ombilicaux (CSM-GW) implique de déterminer quels facteurs obstétricaux, liés à l’environnement direct et indirect des CSM-GW, peuvent influencer leur prolifération ainsi que leur différenciation chondrocytaire. Dans une première partie de ce travail, trois types de facteurs ont été étudiés : les facteurs liés à l’enfant donneur, au déroulement de l’accouchement et de la délivrance, à la grossesse et à la mère. Nos données montrent que les CSM-GW ont des capacités prolifératives améliorées lorsque l’accouchement s’est déroulé à terme et sans complication, avec utilisation de Syntocinon® pendant le travail. Sur la base de ces résultats, nous avons utilisé les CSM-GW les plus efficaces dans le cadre de l’ingénierie du cartilage. Il a ensuite été essentiel d’élucider le profil d’action des CSM-GW dans un contexte allogénique. Le deuxième temps de ce travail a donc consisté à chercher le profil de stimulation le plus performant, au regard de la viabilité des cellules et de l’évolution de la sécrétion des facteurs solubles responsables des propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la différenciation chondrocytaire. Nous avons alors mimé, in vitro et en biomatériaux d’Alginate/Acide hyaluronique (Alg/HA) une telle situation en stimulant les CSM-GW avec différentes doses d’IFN-γ et de TNF-α. Selon nos résultats, la stimulation par IFN-γ et TNF-α sur les CSM-GW en biomatériaux d’Alg/HA est plus efficace lorsque ces deux cytokines sont utilisées conjointement et n’est pas délétère pour la viabilité cellulaire aux concentrations respectives de 20 et 30 ng/mL. Cette double stimulation induit une augmentation de la sécrétion d’IL-6 et de PGE-2 par les CSM-GW, ne modifie pas leur sécrétion de TGF-β, et diminue la sécrétion de VEGF. Nous avons confirmé ces données lors d’une mise en situation fonctionnelle : des cocultures avec des cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC) de donneurs sains nous ont permis d’évaluer la réponse des CSM-GW lors d’une situation allogénique. Ces mises en situations allogéniques ont été étudiées à différents temps afin d’évaluer les propriétés immunologiques des CSM-GW au cours du temps passé en biomatériaux. Nos résultats montrent que les CSM-GW peuvent exprimer des molécules HLA-G ainsi qu’IDO, mais ces expressions sont limitées en biomatériaux d’Alg//HA. Les CSM-GW en biomatériaux d’Alg/HA en situation allogénique ne sont pas immunogènes, quel que soit le temps de différenciation. En revanche, leurs capacités immunomodulatrices décroissent au cours du temps et sont plus fortes à J0 et J3 de la différenciation chondrocytaire, ce qui oriente vers une utilisation précoce de ces cellules. Les conclusions de ce travail permettent de (i) sélectionner les cordons idoines à l’ingénierie cellulaire et l’ingénierie du cartilage, (ii) définir les conditions permettant de mimer une situation allogénique in vitro, (iii) connaitre les propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la culture en biomatériaux d’Alg/HA, y compris en situation allogénique / The purpose of this work is to determine the optimal conditions for allogeneic substitutes production, adapted to filling the cartilaginous lesions in osteoarthritis treatment. It focuses on the cellular component of these substitutes. The use of mesenchymal stem cells from umbilical cords (WJ-MSC) involves determining which factors, related to direct and indirect environment of the WJ-MSC, can influence their proliferation and chondrogenic differentiation. In a first part of our work, three types of factors were studied: related to the donor child, the course of labor and delivery, pregnancy and the mother. Our results show that WJ-MSC have enhanced proliferative capacities when coming from full-term birth and without complications, with the use of Syntocinon® during labor. On this basis, we used the most effective WJ-MSC for cartilage engineering. It was then essential to elucidate their action profile in allogeneic context. We stimulated WJ-MSC embedded in Alginate/Hyaluronic Acid (Alg/HA) scaffolds with different concentrations of IFN-γ and TNF-α in order to determine the most effective stimulation profile, with regard to viability of the cells and evolution of immunomodulatory soluble factors secretion. According to our results, the stimulation by IFN-γ and TNF-α on WJ-MSC in Alg/HA scaffolds is more effective when these two cytokines are used together and is not deleterious for cell viability at the concentrations of 20 and 30 ng/mL, respectively. This double stimulation induces an increase in the secretion of IL-6 and PGE-2 by the WJ-MSC, a decrease in the secretion of VEGF and does not modify the secretion of TGF-β. We confirmed these data during a functional study: cocultures with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors allowed us to evaluate the response of WJ-MSC in an allogeneic situation. These allogeneic situations have been studied at different times to evaluate the immunological properties of WJ-MSC during the time of chondrogenic differentiation. Our results show that WJ-MSC can express HLA-G molecules as well as IDO, but these expressions are limited in Alg/HA biomaterials. Finally, the WJ-MSC in Alg/HA biomaterials in allogeneic conditions are not immunogenic, regardless of the time of differentiation. On the other hand, their immunomodulatory capacities decrease over time and are stronger at day 0 and day 3 of chondrogenic differentiation, which leads to an early use of these cells. Finally, this work allows us to (i) select the umbilical cords suitable for cellular and cartilage engineering, (ii) define the conditions mimicking in vitro an allogeneic situation, (iii) elucidate the immunomodulatory properties of WJ-MSC during Alg/HA biomaterials chondrogenic differentiation, including allogeneic situations

La thérapie cellulaire et les médicaments de thérapie innovante sont des solutions prometteuses pour la régénération des tissus ou organes présentant des défauts fonctionnels ou organiques. Avant le stade de l'insuffisance cardiaque terminale (stade IV NYHA) suite à un infarctus du myocarde, l'implantation d'un patch de fibrine cellularisé avec des progéniteurs myocardiques sur le site de nécrose de l'infarctus, est l'une des perspectives qui permettrait de régénérer un muscle cardiaque fonctionnel et apparait comme étant une alternative nouvelle avec notamment un essai clinique de phase I en cours (ESCORT : NCT02057900). Cependant, cette thérapie innovante présente de réelles contraintes, parmi lesquelles, un protocole nécessitant, i) une utilisation pour la production de cellules progénitrices myocardiques CD15+, de DMSO, de sérum foetal bovin, de trypsine porcine, de fibroblastes murins pouvant être la source d'une contamination chimique ou microbiologique, ii) une caractérisation importante des cellules produites, pour déterminer leur viabilité, leur pureté, leur état de différenciation, iii) d'implanter le patch de fibrine cellularisé dans un délai limité avant l'obtention des résultats de stérilité et d'endotoxines, iv) d'inciser le péricarde et de former une poche, geste chirurgical très invasif, afin d'implanter le patch cellularisé. Avec l'objectif de limiter ces contraintes et de renforcer la sécurisation pharmaceutique de ce médicament de thérapie innovante, les différents axes de ce travail ont porté sur i) l'ajout, juste avant l'implantation, d'une étape de cryoconservation des cellules dans un milieu sans sérum et sans DMSO, mais avec des agents cryoprotectants de qualité pharmaceutique. L'avantage apporté par la cryoconservation étant de rendre possible une production par lot, et la réalisation des contrôles sans contrainte de temps avant l'implantation, ii) la vectorisation des cellules par une encapsulation dans des microsphères formant une suspension injectable et permettant une implantation directement au travers du péricarde et immédiatement après la décongélation, iii) l'utilisation de polymères bioadhésifs afin de maintenir les microsphères au site d'implantation. Dans un premier temps, ce travail a permis d'identifier l'alginate de sodium de faible viscosité à 1,2% comme polymère pour réaliser l'encapsulation à l'aide d'une buse vibrante de 120 µm de diamètre. La nature et la concentration d'agents cryoprotectants ont également été définies. Les agents cryoprotectants ont été sélectionnés parmi les oses (glucose, saccharose, tréhalose), les polyols (glycérol, mannitol, sorbitol) et l'urée, à une concentration permettant d'atteindre une osmolarité totale de 500 mOsm/L pour abaisser le point de congélation de l'eau. Enfin le chitosane de faible viscosité à 0,5% a été utilisé comme polymère bioadhésif de surface pour maintenir les propriétés mécaniques et la forme des microsphères après la congélation. Dans un second temps, une évaluation biologique a permis de mesurer l'impact des étapes du procédé d'encapsulation et de cryoconservation, sur des cellules souches mésenchymateuses humaines utilisées comme modèle. Il a ainsi été possible d'optimiser le protocole ce qui a eu pour effet d'augmenter la viabilité, évaluée après encapsulation et congélation par une analyse en cytométrie de flux avec le 7AAD, de moins de 5% à environ 35%. / Cell therapy and advanced therapy medicinal products are promising solutions for the regeneration of tissues or organs with functional or organic defects. Before the terminal heart failure stage (stage IV NYHA) following a myocardial infarction, the implantation of a cellularized fibrin patch with myocardial progenitors at the location of the infarct necrosis, is one of the perspectives that would allow a functional heart muscle to regenerate and appears to be a new alternative, in particular, with an ongoing Phase I clinical trial (ESCORT : NCT02057900). However, this innovative therapy presents real constraints, among which, a protocol requiring, i) the use for the production of CD15+ myocardial progenitor cells of, DMSO, bovine fetal serum, porcine trypsin, and murine fibroblasts which may be the source of chemical or microbiological contamination, ii) an important characterization of the produced cells, to determine their viability, purity, and state of differentiation, iii) to implant the cellularized fibrin patch within a limited time frame before getting the results of sterility and endotoxins, iv) to incise the pericardium and to form a pouch, a very invasive surgical gesture, in order to implant the cellularized patch inside. With the objective of limiting these constraints and strengthening the pharmaceutical safety of this innovative therapy medication, different axes of this work have focused on i) the addition, just before the implantation, of a step of cryopreservation of the cells in a medium without serum and without DMSO, but with pharmaceutical-grade cryoprotectants. The advantages of cryopreservation is to allow production in batches, and controls to be carried out without time constraints before the implantation, ii) the vectorization of the cells by encapsulation in microspheres forming an injectable suspension and allowing direct implantation through the pericardium immediately after thawing, iii) the use of bioadhesive polymers to maintain the microspheres at the location of the implantation. This study initially enabled to identify a low-viscosity sodium alginate at 1.2% as a polymer being used for the encapsulation with the use of a vibrating nozzle which diameter is of 120 µm. The nature and the concentration of the cryoprotectants have also been defined. The cryoprotectants were selected from oses (glucose, sucrose, trehalose), polyols (glycerol, mannitol, sorbitol) and urea, at a concentration which achieves a total osmolarity of 500 mOsm/L in order to lower the freezing point of water. Finally, low viscosity chitosan at 0.5% was used as a bioadhesive polymer at the surface of the microspheres to maintain their shapes and mechanical properties after freezing. In a second step, a biological evaluation allowed to measure the impact of the encapsulation and the cryopreservation processes, on human mesenchymal stem cells used as a model. It was thus possible to optimize the protocol, which in return increased the viability ; evaluation made after encapsulation and freezing by a flow cytometry analysis with 7AAD ; from less than 5% to about 35%.